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Summary

desafios críticos para o campo de pesquisa do diabetes estão a compreender os mecanismos moleculares que regulam a replicação de células β dos ilhéus e desenvolver métodos para estimular a regeneração de células-β. Aqui um método de alto teor de rastreio para identificar e avaliar a actividade de promoção da replicação de células β de moléculas pequenas é apresentada.

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Zhao, Z., Abdolazimi, Y., Armstrong, N. A., Annes, J. P. A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform. J. Vis. Exp. (113), e54298, doi:10.3791/54298 (2016).

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Abstract

Introduction

Diabetes engloba um conjunto de distúrbios que compartilham o ponto final comum de homeostase da glicose interrompido. Embora os mecanismos patogênicos dos subtipos de diabetes são distintos, eles compartilham a conseqüência da massa de células β diminuiu, ou seja, a perda de capacidade de produção de insulina 1,2. Atualmente, as estratégias de tratamento diabetes dependem de administração crônica de insulina exógena, a estimulação farmacológica da produção de insulina ou aumento da sensibilidade à insulina, e, raramente, o transplante de ilhotas pancreáticas ou toda 3,4 pâncreas. Infelizmente, o sucesso dessas estratégias é de curta duração e / ou falha de recapitular suficientemente a função da produção endógena de insulina. Apesar da utilidade de desenvolver um método para estimular a regeneração de células β, não existe tal abordagem. Por conseguinte, um dos principais objetivos diabetes pesquisa é desenvolver métodos para gerar novas células beta ou para expandir a massa de células β endógena 5 6,7. Importante, a fonte predominante de células beta novas in vivo é pré-existentes células beta, em vez de células progenitoras especializados 8,9. Embora células beta parecem ter capacidade limitada de replicação, um pequeno aumento na quantidade de células β (~ 30%) pode ser suficiente para restaurar a homeostase de glucose em muitos diabéticos. Além disso, na estimulação farmacológica in situ da massa de células β é uma estratégia de tratamento potencialmente barato e escalável. Aqui um método de rastreio de alto conteúdo para identificação e caracterização de moléculas pequenas que estimulam o crescimento de células β é apresentada.

Uma variedade de métodos experimentais in vitro pode ser utilizado para identificar produtos de genes e / ou moléculas de that promover a replicação de células-β primário. Os esforços iniciais para medir a indução da replicação em células β usado cultura roedor pancreata fetal ou intactos culturas isolado das ilhotas para medir a [3 H] timidina, a incorporação de BrdU ou corpos mitóticos dentro do aldeído-tionina ou insulina população corada em resposta às condições específicas de tratamento 10, 11. Estas abordagens in vitro e variantes próximas da mesma têm várias limitações. Deficiências proeminentes incluem (1) a utilização de células fetais, que, ao contrário de culas maduras, exibem uma elevada taxa de replicação de células basais e são β crescimento regulada de forma distinta 12; (2) a natureza subjetiva da adjudicação dependente do experimentador de eventos de replicação de células-β; (3) o trabalho e tempo natureza intensiva da contagem dependente do experimentador de eventos de replicação de células-β retarda o rendimento experimental; (4) o uso de armas nucleares incorporação / Mancha / aparência para identificar replicação mesmoTS e um corante citoplasmático não sobrepostos para identificar culas leva a misattribution de eventos de replicação de células não-β aproximadas a p-células.

Mais recentemente culas maduras primários têm sido usados ​​para avaliar o impacto da sobre-expressão do transgene, bem como o tratamento do produto do gene ou do composto na replicação de células β 13-16. No entanto, estes estudos também têm invocado contagem subjetiva de eventos de replicação, métodos staining- citoplasmática ou não-específicos para a identificação de células β e / ou etapas de trabalho intensivo que limitam o rendimento, por exemplo, cada slide-bem chapeamento de células ou ilhotas intactas inclusão em parafina e processamento 17. Notavelmente, uma célula-β humano metodologia de rastreio replicação baseada em imagem, semelhante ao aqui apresentada, foi publicado em 18 de; No entanto, a utilização bem sucedida deste ensaio não foi demonstrada e a utilização de ilhéus humanos para o rastreio primário pode não ser amplamente feasível.

Uma estratégia alternativa para a identificação de substâncias promotoras de replicação é para avaliar a indução do crescimento de linhas de células β. Os esforços iniciais usadas transformadas beta-linhas celulares tais como MIN6 células ou INS 832/13 células-14,19-21. No entanto, estas linhas celulares demonstram crescimento desenfreado e têm pouca semelhança com células beta bem diferenciados 22. Consequentemente, a capacidade de crescimento de indução é mínima, de relevância pouco clara e às vezes difícil de recapitular. Uma estratégia melhorado para o rastreio baseado em linha de célula utiliza "reversivelmente transformada" células que são presos de crescimento na ausência de tetraciclina (doxiciclina) de SV40 dependente de T a expressão de antigénio 23,24. No entanto, não é claro se estas células reverter para um estado de células-β como "normal", após a remoção de doxiciclina. Infelizmente, o uso dessas células produziu compostos que promovem o crescimento generalizadas que não parecem ter utilidade imediata24. Em geral, a utilização de linhas celulares para estudar a regulação do crescimento de um tipo celular exibindo actividade espontânea replicação mínima pode ter aplicabilidade limitada.

A replicação plataforma de triagem de células β aqui apresentada utiliza células p de rato primária maduros para reter na regulação do crescimento in vivo na medida do possível, as culturas de células das ilhotas de composição de tipo celular mista para permitir a identificação de actividades promotoras de crescimento de restrição de linhagem, multi -bem formatação para maximizar o rendimento e análise automatizada para eliminar o preconceito e facilitar a transferência. O sucesso no uso desta plataforma permitiu a identificação de vários compostos que promovem a replicação de células-β 25,26. Além disso, o ensaio foi usado para estudos de relação estrutura-actividade e experiências de epistasia químicos para fornecer informações mecanísticos para a regulação molecular da replicação de células β. A plataforma apresentada foi adaptado com sucesso foinvestigação baseada em RNAi r lentiviral da replicação de células-β vias 25. Limitações do ensaio compreendem uma restrição escalabilidade (uso de pilhas), uso de roedor, em vez de células das ilhotas humanos (embora o ensaio pode ser adaptados para estudos de ilhotas humanas), despesas associadas com a imagem baseada em anticorpos e à utilização de ilhotas primária, a utilização de ilhotas dispersas (interrompido arquitetura da ilhota) para facilitar a aquisição de imagem automatizada e dependência da disponibilidade de um microscópio automatizado, com aquisição de imagem e capacidade de análise. Embora uma fácil in vivo metodologia de rastreio para identificar produtos de genes ou compostos que estimulam a regeneração de células β in situ seria o ideal, uma tal plataforma ainda não está disponível 27. Consequentemente, a plataforma descrito é apropriado para pesquisador interessado em investigar maioria dos aspectos da replicação de células-β.

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Protocol

Este protocolo foi realizado em conformidade com o Comité Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Stanford University School of Medicine. O protocolo descrito é dimensionado para isolamento de ilhotas de seis 250-300 g (8 - 9 semanas de idade) ratos Sprague Dawley do sexo masculino, a qual é suficiente para gerar 228 poços de uma placa de 384 poços para análise da replicação de células dos ilhéus.

1. Preparação de Material

  1. Preparar composições de revestimento antes de se iniciar o isolamento dos ilhéus através da recolha do meio condicionado de células de carcinoma da bexiga de rato 804G mantida a confluência durante 3 dias (20 ml de RPMI 1640) em 15 cm de placa de cultura de tecido 28. Filtrar em condições estéreis e armazenar (-20 ° C) o meio condicionado para uma utilização posterior.
  2. Esterilizar instrumentos cirúrgicos (um 12 cm pinça dentada, um 11,5 cm tesoura fina, um 14,5 cm tesouras cirúrgicas, duas de 16 cm pinça curva, um de 12 cm hemostática curva, um de 12 cm bisturi punho) e um 30 peneira de malha de tecido antes para o initiating isolamento de ilhotas.
  3. Preparar a solução de digestão pancreática através da dissolução de 60%: mistura de 40% de classe I purificado: classe colagenases II (actividade total de colagenase de 300.000 - 400.000 unidades) em 60 ml de 1x Hank Equilibrada de Salt Solution (HBSS) suplementada com cálcio e magnésio. Carregar 10 ml de tampão de digestão pancreática em 10 ml seringas (seis) com uma agulha G 1 "22 e colocar em gelo.
    Nota: 10 ml de solução de digestão é injectado por rato. Escala em conformidade.
  4. Prepare a 4,5 ml de mistura de anestésico em uma capa ventilado através da mistura de 1,3 ml de cetamina (100 mg / ml), 0,2 ml de xilazina (100 mg / ml) e 3 ml de PBS. Prepara-se o cocktail de anestésico dentro de 1 hora de início isolamento de ilhotas.
  5. Preparar o tampão de lavagem através da adição de 25 ml de soro de vitelo recém-nascido a 500 ml de HBSS. Coloque tampão de lavagem em gelo para uso posterior.
  6. Prepare uma garrafa de meio ilhéu que fica a 500 ml de baixa glucose de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), 50 ml de soro fetal de bovino (FBS), 5000 unidades / ml de penicilina e 5000 ug / ml de estreptomicina.
  7. Prepare forma função das ilhotas de solução de funcionalidade / viabilidade (500 ml) com 2% de FBS, glutamina 2 mM, glucose a 5 mM, 5000 unidades / ml de penicilina e 5000 ug / ml de estreptomicina. Armazenar a função de meios de ilhotas (4 ° C) para uso posterior.
  8. Preparar 40 ml de tampão de bloqueio por adição de 2,5 ml de soro de burro e 0,12 ml de Triton X-100-37,38 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS). Loja tampão de bloqueio (4 ° C) para uso posterior.
  9. Obter os anticorpos necessários antes de iniciar o protocolo.
    Nota: PDX-1 (TRITC) e Ki-67 (FITC), o co-coloração é utilizado para rastreio a replicação de células β primária. Para a análise de replicação de linhagem específica, executar coloração por imunofluorescência de marcadores adicionais identidade da célula (insulina, glucagon, somatostatina; vimentina ou TRITC), juntamente com nuclear (DAPI), Ki-67 (FITC) coloração PDX (Cy5) e. rep alternativacação, por exemplo, marcadores, PCNA, também pode ser usado.
  10. Prepare um plano de tratamento 228 poços com cada condição de tratamento realizado em quadruplicado. Incluir (5-Iodotubercidin [1? M] ou o dipiridamol [15 mM]) e do veículo de controle-positiva (DMSO 1: 666 de diluição) poços.

2. Perfusão do Pâncreas

  1. Anestesiar ratos por injecção IP de solução anestésica de cocktail diluído (0,30 ml / 100 g de peso corporal). Uma vez que o rato é totalmente anestesiado e que não respondem a estímulos nocivos, execute deslocamento cervical.
  2. Coloque o rato sacrificados na posição (orientação crânio-caudal) em decúbito dorsal em uma pilha de papel toalha e pulverizar a área abdominal com 70% de etanol.
  3. Abrir a cavidade abdominal com um L-incisão (base na região púbica) e retrair a pele no sentido rostral sobre a caixa para expor a cavidade abdominal.
  4. Cuidadosamente pegar o duodeno usando dois pares de pinças curvas, localize a entrada duodenal do b comumduto ile (esfíncter de Oddi) e fixe a abertura duodenal na papila com uma pinça hemostática curva.
  5. Levante a pinça hemostática curva utilizado para fixar o ducto biliar comum papila e agarrar o ducto biliar perto de fígado usando um fórceps curvos. Use dissecção romba com as pinças curvas para isolar e expor o canal biliar.
  6. Reposicionar o rato com o proximal cabeça e os pés distal.
  7. Canular o ducto biliar comum (CBD) em ou imediatamente distai à junção dos ductos hepáticos císticos e comuns com uma solução de digestão pancreática -loaded seringa de 10 ml e injectar lentamente 10 ml da solução de digestão pancreática. Enquanto está a injectar, apoiar o CBD com um cabo de bisturi. Reposicionar a agulha se o duto e pâncreas não insuflar.
  8. Remover o pâncreas inflados usando as pinças curvas e tesouras finas para separá-lo do cólon descendente, intestinos, estômago e baço. Coloque o pâncreas infladas de gelo em um tubo de 50 ml contendo 5 ml de Nota: Para um rendimento máximo ilhéu, recolher todas pancreata dentro de 30 min e local apenas 1 ou 2 pancreata em cada tubo de 50 ml digestão.

3. A dissociação do Pâncreas

  1. Uma vez que todos os pâncreas são recolhidos, colocar os tubos de digestão em um banho de água a 37 ° C durante 15 min. Agite suavemente os tubos a cada 3 min.
  2. Após 15 min, agite (verticalmente) os tubos de 10 vezes e adicione 10 ml de tampão de lavagem frio. Agitar vigorosamente os tubos de um adicional de 5 vezes e colocar no gelo.
  3. Encher os tubos de digestão a 50 ml com tampão de lavagem frio e misture invertendo os tubos 5 vezes.
  4. Centrifugar os tubos a 97 xg, a 4 ° C durante 1 min e deitar fora o sobrenadante. Tenha cuidado para não deslocar o tecido peletizada.
  5. Adicionar 25 ml de tampão de lavagem e re-suspender o tecido em vortex suavemente. Repita os passos 3.4 e 3.5 vezes mais.
  6. Coloque uma peneira de malha de tecido 30 ao longo de um rerile 250 ml copo e despeje a suspensão de tecido para a peneira. Lavar o tubo de digestão com um adicional de 20 ml de tampão de lavagem e verter sobre a malha. Os tecidos pancreáticos e gordura não digerida são removidos nesta etapa.
  7. Verter o material filtrado em dois tubos de 50 ml fresco e peletizar o tecido por centrifugação a 97 xg durante 1 min a 4 ° C. Decantar tubos de sobrenadante e inverter para drenar o excesso de buffer.

4. Purificação de Ilhotas

  1. Adicionar 20 ml de solução de diatrizoato frio polissacarose / de sódio (1,119 g / ml de densidade) para o tecido pancreático sedimentadas. Homogeneamente re-suspender o conteúdo de cada tubo por suavemente pipetando para cima e para baixo cinco vezes.
  2. Delicadamente sobrepor a solução diatrizoato polissacarose / sódio com 10 ml HBSS. Manter uma interface líquido afiado adicionando lentamente o HBSS ao longo da parede do tubo.
  3. Centrifuga-se o pâncreas digerido a 560 xg durante 15 minutos (4 ° C), com aceleração lenta e sem travão.
  4. collect a camada de ilhotas a partir da interface usando um 10 ml de pipeta e colocar ilhotas no frescos tubos de 50 ml. Não piscina ilhotas nesta fase.
  5. Adicionar 40 ml de tampão de lavagem a cada tubo de 50 ml e centrifugação durante 1 min a 140 xg, a 4 ° C.
  6. Decantar o sobrenadante e re-suspensão ilhéus reunidas em 50 ml de tampão de lavagem por inversão dos tubos diversas vezes. Centrifugar os tubos durante 1 min a 97 xg, a 4 ° C para recolher ilhotas numa pelete.
  7. Decantar a solução de lavagem e repetir a lavagem. Traga ilhotas dentro do capuz de cultura de tecidos e aspirar o sobrenadante.
  8. Re-suspender cada tubo de ilhotas em 6 ml de meio de ilhotas.
  9. Transferir os ilhéus de cada tubo de 50 ml num poço de seis poços prato de cultura de tecidos. Agitar o prato de 6 poços para recolher as ilhotas para o meio do poço e observar a qualidade e pureza dos ilhéus sob um microscópio.
  10. coletar manualmente ilhotas usando uma pipeta de 1 mL e transferir as ilhotas colhidas no adjacentepoços contendo 6 ml de meio de ilhéus. Repita roda ilhéu e pegar até> 90% de pureza é alcançada.
  11. Transferir os ilhéus purificados para um prato de cultura de tecidos de 10 cm, que inclua 20 ml de meio de ilhota.
  12. Coloque ilhotas numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO 2) durante a noite (Figura 1A).
  13. Na preparação de placas em células de ilhéus, revestem-se as cavidades de uma placa de 384 poços com 40 ul de meio condicionado por poço 804G. Incubar durante a noite numa incubadora de cultura de tecidos.

5. Dispersão e chapeamento de células das ilhotas

  1. No dia seguinte, separar ilhéus gentilmente o prato de 10 centímetros com um raspador de células e transferir as ilhotas dentro de um tubo de 50 ml.
  2. Agregar as ilhotas por centrifugação durante 1 min a 22 xg à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante.
  3. Lavar as ilhotas com 20 ml de PBS quente e decanta-se como acima.
  4. Re-suspender as ilhotas em 0,25% de tripsina (150 ul por pâncreas de rato) E incubar a 37 ° C durante 10 min. Pipeta ilhotas cima e para baixo 10 vezes com 1 ml de pipeta após 5 e 10 minutos de incubação.
  5. Após 10 min, avaliar uma amostra de 20 ul dos ilhéus tratadas com tripsina sob o microscópio para assegurar uma digestão completa e a contagem das células das ilhotas utilizando um hemocitómetro. Se ilhotas não digeridos permanecem, continuar a incubação durante um adicional de 3-5 min e pipeta cima e para baixo 10 vezes mais. Repita conforme necessário.
    Nota: O rendimento típico é ~ 125.000 - 150.000 ilhotas células por rato.
  6. Remover 804G condicionado placa de 384 poços revestidos de mídia da incubadora e remover mídia usando um aspirador de 12 poços múltiplos.
  7. Suspender as células dos ilhéus, a uma densidade de 45.000 células por ml em meio de função Islet e placa 70 uL (3.150 células) por poço com uma pipeta de canais múltiplos (Figura 1B).
    Nota: Porque células p localizados nos poços exteriores tendem a migrar em direcção ao perímetro da placa de uso linhas C a N e 4 colunasa 21 para a chapa 228 poços com as células de ilhéus isolados a partir de 6 ratos.
  8. Colocar a placa na incubadora de cultura de tecidos durante 48 horas para permitir a aderência celular.

6. Cultura de células das ilhotas Tratamento, fixação e coloração

  1. Preparar 200 ul de veículo e compostos (condições de tratamento são realizadas em quadruplicado) a uma concentração de 2x em meio de função Islet. Providenciar compostos em uma placa de 96 poços estéreis para facilitar a pipetagem multi-poços.
  2. Cuidadosamente remover a forma de ilhotas com um aspirador de 12 poços colector e substitua com meio função das ilhotas (35 ul / cavidade) utilizando uma pipeta de 12 poços. Remover e substituir a mídia de uma linha de cada vez para limitar o risco de secagem (Figura 1C).
  3. Iniciar o tratamento através da transferência de 35 uL / ​​poço das soluções de composto de 2x. Retorno placa na incubadora durante a duração do tratamento de 48 h.
  4. Após 48 horas de tratamento, decanta-se o meio de tratamento por invertendo a placa. </ Li>
  5. Lavar suavemente as células das ilhotas com 50 ul por poço de PBS 1x (1 min). Adicionar o PBS utilizando uma pipeta multi-canal.
  6. Decanta-se o PBS e fixar as células por adição de 50 uL por poço de frio 4% de paraformaldeído (PFA) diluído em PBS 1x. Incubar as células durante 15 min a 4 ° C.
  7. Lavam-se as células três vezes (5 min cada), invertendo a placa para remover o PFA e suavemente adicionando 60 ul de PBS por poço, como anteriormente.
  8. Preparar a solução de recuperação de 15 ml de antigénio por mistura de 14,25 ml de formamida e 0,75 ml de 0,15 M de citrato de sódio (pH 6). Faça a solução de recuperação antigênica imediatamente antes da utilização.
  9. Remover PBS das cavidades invertendo a placa e adicionar solução de recuperação de antigénio de 60 ul a cada poço. Aquece-se a placa em 70 ° C banho-maria durante 45 min. Coloque um bloco de aquecimento em cima da placa durante esta incubação para evitar a deformação da placa multi-poços.
    Nota: A água deve ser a metade do caminho até a saia placa; a chapa não deve ser submerso.
  10. Lavam-se as células com 60 ul por poço de PBS 1x três vezes (5 min cada). Adicionar PBS com uma pipeta multi-canal e decantar PBS invertendo a placa.
  11. Usar uma pipeta de multi-canal para adicionar 40 ul por poço de tampão de bloqueamento e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Remover o tampão de bloqueio por inversão da placa e decantação.
  12. Adicionar 40 ul de ratinho anti-humano Ki-67 (1: 200) e anticorpo de cabra anti-humano PDX-1 (1: 100) anticorpos diluídos em tampão de bloqueio a cada poço e incubar a 4 ° C durante a noite.
  13. No dia seguinte, decanta-se a solução de anti-corpo e lavar as células com PBS 1x três vezes (5 min cada), tal como descrito acima. Decantar o PBS.
  14. Adicionar 40 ul por poço de diluído: IgG anti-rato (1 200) de burro biotinilada e IgG anti-cabra de burro conjugado com rodamina em tampão de bloqueio. Incubar durante 1 horaà temperatura ambiente.
  15. Lavam-se as células com PBS 1x três vezes, 5 minutos cada. Adicionar 40 ul de diluído (1: 400 em tampão de bloqueio) estreptavidina-fluoresceína conjugado a cada poço. Incubar 30 min a temperatura ambiente.
  16. Lavam-se as células com PBS 1x três vezes, 5 minutos cada. Adicionar 40 ul por poço de DAPI (300 nM em tampão de bloqueio) e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
  17. Lavar as células com PBS 1x duas vezes e deixam as células em 40 ul de PBS 1x. A placa é agora pronto para ser analisado.

Análise Replication 7. β-Cell

Nota: Um protocolo de ensaio deve ser estabelecida para o alto microscópio triagem de conteúdo usado para medir a replicação de células-β. Na sua composição mais simples, este protocolo é um ensaio de duas cores, onde um marcador de identidade é utilizada para definir culas (PDX-1 + -cells) e um marcador de replicação (Ki-67) é utilizado para definir os eventos de divisão celular.

  1. Identificar objectos (P-células), baseada no average intensidade de fluorescência de coloração de PDX-1 (549 nm, filtro) dentro de um círculo aproximada (comprimento: largura <1,6) dentro da área de pixel esperado de um núcleo de célula β (Figura 2A).
  2. Em seguida, estabelecer as definições para identificar eventos de replicação (Ki-67-de positividade) com base na intensidade média de fluorescência (485 nm) de filtro dentro de PDX-1 + a área (Figura 2B).
    Nota: Os tempos de exposição deve ser fixado para permitir comparações de intensidade de pixel em toda imagens. os parâmetros do protocolo de ensaio são ajustados de forma que as chamadas máquinas consistentemente excluir coloração, detritos e células agregados não específicos que poderiam afetar adversamente a qualidade dos dados.
  3. Analisar um mínimo de 500 células beta por poço para maximizar a precisão e limite de variabilidade.
    Nota: O índice basal de replicação de células β em culturas de ilhotas de ratos está prevista para ser de 0,5 - 3%. Tipicamente, 40 imagens por poço é mais do que suficiente para identificar a 500 células p.
  4. Antes de analisar oToda placa, analisar negativa selecionado (tratados com DMSO) e controle positivo (5-iodotubercidin [1? M] ou o dipiridamol [15 mM]) tenha sido tratada com poços para avaliar a validade do protocolo de ensaio. Quando o ensaio é estabelecida correctamente, compostos de controlo positivo induzir, pelo menos, um aumento de duas vezes na percentagem de culas replicantes.
  5. Ler a placa inteira uma vez que o protocolo de ensaio é validado.

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Representative Results

Para avaliar-célula β ou replicação de células α, um protocolo de ensaio de quatro cores é necessária. Em primeiro lugar, os objectos são identificados por coloração com DAPI (Canal 1, 386 nm). Em seguida, células beta (evento 1) são contadas: objetos que co-expressam PDX-1 + (canal 2, 650 nm) e insulina peri-nuclear (canal 3, 549 nm). Subsequentemente, replicando células beta (Evento 2) são contados: (Evento 1) que co-expressam o Ki-67 (canal 4, 485 nm) (Figura 3) culas. A percentagem de replicação de células-p é calculado: (caso 2 / evento 1) x 100. Para quantificar a replicação de células α, objectos totais são identificados por coloração com DAPI (canal 1) e, em seguida, as células a (1) evento são enumerados pela a ausência de PDX-1 coloração (canal 2) e a presença de coloração perinuclear glucagon (canal 3). Replicação de ct-células (Evento 2) são o número de a-células que co-expressam o Ki-67 (canal 4) (Figura 4).A percentagem de células alfa replicando é calculado: (evento de 2 / event 1) x 100.

Antes de iniciar o experimento, um plano de tratamento composto é feito (Tabela 1A). Aqui, um ensaio de pequena escala foi executado usando controlo negativo (DMSO-tratado) e controlo positivo ([15 ^ M] tratados com dipiridamol) condições para avaliar PDX-1, de células β e a replicação de células α em um formato de 384 poços ( 49 imagens por poço). Dados experimentais demonstram dipiridamol para promover selectivamente PDX-1 + e a replicação -cell-β célula mas não a replicação de células α. O número médio de identificadas PDX-1-células por poço era 5,541 ± 555 para tratados com DMSO e 6439 ± 363 para as condições tratados com dipiridamol (p <0,01); demonstrando um aumento dependente da dipiridamole no número de células PDX-1 (Tabela 1B, parte superior). A percentagem média de PDX-1 + -cell replicação (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + </ sup> / DMSO + PDX-1 +) é 3,35 ± 0,50% para os tratados com DMSO e 10,10 ± 0,98% para as condições tratados com dipiridamol (p <0,01) (Tabela 1B, parte inferior). Importante, existem taxas + -cell replicação semelhantes PDX-1 em poços posteriormente analisados ​​para células β (linhas CF) e replicação de células-α (linhas GJ): DMSO = 3,3 ± 0,66 (linhas CF) e 3,4 ± 0,23 (linhas GJ) (p = 0,80); dipiridamol = 9,8 ± 0,86 (linhas CF) e 10,4 ± 0.1.1 (linhas GJ) (p = 0,43). Assim, estes poços, embora coradas para diferentes marcadores de linhagem de células-(insulina e glucagon), responderam de forma semelhante ao tratamento medicamentoso.

Em seguida, as taxas de replicação de células beta e alfa-células foram calculados a partir dos dados brutos (Tabela 2). O número médio de células beta (um evento) foi aumentada em resposta ao tratamento com dipiridamole: DMSO 488 ± 3,930 vs. dipiridamol 4.589 ± 218 (p <0,05). Notavelmente, há uma redução significativa do número de células beta (3930 ± 488), em comparação com PDX-1 (células 5541 ± 555) (p <0,01). Este é um resultado da exclusão PDX-1 + -cells que são insulino - a partir da contagem de células β, por exemplo, δ células ou células progenitoras de células-β, e o rigor adicional de exigir células-p a ser insulina +. Notavelmente, o número de células alfa (caso 1) não aumentou com o tratamento com dipiridamole (DMSO 1465 ± 123 vs. 1467 ± dipiridamol 74,7; p = 0,93). Assim, dipiridamol aumenta selectivamente número de células-β. O número de replicação de células-p (caso 2) é aumentada em resposta ao tratamento com dipiridamole (DMSO 131 ± 31 vs dipiridamol 476,5 ± 39,6; p <0,01), mas o número de células a replicar-(caso 2) não é (DMSO 10,25 ± 3 vs dipiridamol 9,0 ± 1,6; p = 0,5). Finalmente, a percentagem de replicação β-cells e células alfa é calculada ((evento de 2 / event 1) x 100). Com efeito, o dipiridamol aumenta a percentagem de replicação de células beta, mas não células-a- (resumidos na Figura 5). Importante, a taxa de replicação de células β basal de uma cultura saudável varia entre experiências (0,5-3%), mas deve ser altamente consistente em cavidades dentro de uma experiência. Uma vez que a replicação basal é variável, a taxa de replicação de células β induzida pelo composto também é variável através de experiências; No entanto, a dobra-indução da replicação em células β é consistente em todos os experimentos e permite que a eficácia do composto a ser comparada de forma fiável através de experiências. Notavelmente, a taxa de replicação de células é α ~ 5 vezes mais baixa do que a taxa de replicação de células e as culturas contêm β ~ 1/3 como muitas células-alfa como células p; consequentemente, o índice de replicação de células α exibe uma variabilidade aumentada em comparação com o índice de replicação de células β. Para limitar a variabilidade, as imagens por poçoé aumentada de 49 (usado aqui) para um máximo de 81.

figura 1
Figura 1: Isolado e dispersos Rato Ilhotas. (A) Uma micrografia de ilhéus isolados de ratos saudáveis; bar 100 mm escala apresentada. (B) micrografias (5x e 10x objectivos) de ilhotas de ratos dispersos 1 hora após o plaqueamento; 100 mm (esquerda) e 200 mm (à direita) dimensionar barras apresentadas. (C) micrografias (5x e 10x objectivos) de rato dispersa ilhotas 48 horas após o plaqueamento; 100 mm (esquerda) e 200 mm (à direita) dimensionar barras apresentadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Identificação automática de PDX-1 + + células da ilhota. Células dos ilhéus (A) ratos tratados com o composto disperso coradas para PDX-1. PDX-1 + objetos são circuladas em azul; objetos excluídos são circulados em laranja. barra de escala de 150 mm mostrado. (B) O mesmo campo de ilhota células coradas para Ki-67. PDX-1 + ki-67 + células duplamente positiva estão circuladas em verde. Barra de escala de 150 mm mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Automatizado de Identificação de replicar células beta Replicando células beta são identificados por DAPI (canto esquerdo superior, círculos azuis), PDX-1 (canto superior direito, círculos verdes), insulina (da esquerda no canto inferior, magenta círculos) e Ki-67 (canto inferior direito, círculos vermelhos) co-expression. A imagem mesclada (à direita) mostra várias células beta replicantes. Barra de escala de 150 mm mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4:. Automatizado de Identificação de replicar as células alfa Replicando células-alfa são identificados por DAPI (canto esquerdo superior, círculos azuis), a ausência de PDX-1 (canto superior direito, círculos verdes), glucagon (esquerda-baixa canto, círculos magenta) e Ki-67 (canto inferior direito, círculo vermelho) co-expressão. A imagem mesclada (à direita) mostra um gibão replicante rara de células alfa (seta amarela). Barra de escala de 150 mm mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 5:. Dipiridamol Induz PDX-1 + - e a replicação de células β mas não replicação de células α representação gráfica de 1-célula PDX (superior esquerdo), β-célula (parte superior direita) e de células α (inferior esquerdo) replicação em DMSO e poços tratados com dipiridamol são mostrados. As barras representam a média de poços tratados de forma independente (a replicação PDX-1, n = 8; β-célula e célula-replicação α, n = 4). As barras de erro indicam o desvio padrão (* p <0,01). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<td> 3,77
UMA. Tratamento: coloração:
4 5
C DMSO DIPIRIDAMOL Insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67
D DMSO DIPIRIDAMOL Insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67
E DMSO DIPIRIDAMOL Insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67
F DMSO DIPIRIDAMOL Insulina, DAPI, PDX-1, Ki-67
G DMSO DIPIRIDAMOL Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
H DMSO DIPIRIDAMOL Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
Eu DMSO DIPIRIDAMOL Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
J DMSO DIPIRIDAMOL Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
B. Número de PDX-1 + células
DMSO DIPIRIDAMOL
4 5
C 5158 6249
D 6365 6795
E 4830 6974
F 5988 6408
G 5574 6532
H 5939 6411
Eu 5612 6387
J 4862 5759
Por cento do PDX-1 + Ki-67 Células +
DMSO DIPIRIDAMOL
4 5
C 3.04 9.99
D 3,91 10,57
E 2.51 8,58
F 10,14
G 3,44 10.1
H 3,06 10,69
Eu 3,58 9,07
J 3,52 11,74

Tabela 1: Plano Experimental Representante e PDX-1 + -cell replicação de dados. (A) Um esboço do plano de tratamento é mostrado. Os poços foram tratados com DMSO (coluna 4) ou dipiridamol (coluna 5). A coloração foi realizada com DAPI, anti-PDX-1, anti-insulina (rotulação normal) ou anti-glucagon (rotulação itálico) e o Ki-67 (B) Número total de PDX-1, células + (topo, DAPI +PDX-1 +) por poço e a percentagem de células replicantes PDX-1 (parte inferior, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / + DAPI PDX-1 + x 100) por cavidade são mostrados.

Evento 1:
DMSO DIPIRIDAMOL
4 5
C 3557 4352 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+)
D 4387 4542 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+)
E 3462 4879 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+)
F 4315 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+)
G 1594 1567 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
H 1477 1439 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
Eu 1491 1390 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
J 1298 1474 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
Evento 2:
DMSO DIPIRIDAMOL
4 5
C 113 425 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+)
D 152 511 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+)
E 97 466 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+)
F 163 504 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulina (+) Ki-67 (+)
G 13 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
H 10 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
Eu 6 11 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
J 12 </ Em> 7 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
% Replicação:
DMSO DIPIRIDAMOL
4 5
C 3.18 9,77
D 3,47 11,25
E 2.8 9.55
F 3,78 10,99
G 0,82 0,57
H 0,68 0,63
Eu 0,4 0,79
J 0,92 0,48

Tabela 2:-célula β representativas e de células α de replicação de dados O número total de células beta (Evento 1: DAPI + PDX-1 + insulina +; topo linhas da tabela CF, rotulação normal).), Α-células (Evento 1 : DAPI + PDX-1 + glucagon +; top linhas da tabela GH, letras em itálico), replicando células beta (Evento 2: DAPI + PDX-1 + Ki-67 + insulina +; linhas da tabela meio CF, lettering normal) e α -cells (Evento 2: DAPI + PDX-1 + Ki-67 + glucagon +; linhas da tabela meio GH, letras em itálico)por cavidade são mostrados. Além disso, a percentagem de replicação de células beta (DAPI + PDX-1 + insulina + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + insulina + x 100; fundo linhas da tabela CF, rotulação normal) e células alfa (DAPI + PDX -1 + glucagon + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + glucagon + x 100; as linhas da tabela inferior GJ, letras em itálico) por poço são mostrados.

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Discussion

métodos experimentais para estudar as vias moleculares que controlam o crescimento de células β e regeneração são ferramentas importantes para pesquisadores diabetes. Nisto, uma plataforma de rastreio baseado-rato-ilhota para identificar e caracterizar estimuladores de pequenas moléculas de replicação de células β é apresentada.

Enquanto a maioria dos aspectos deste protocolo são facilmente realizados por pesquisadores experientes, a poucos passos requerem técnica particular. Em primeiro lugar, durante o isolamento das ilhotas, canulação da bile-duto, sem perturbar a sua integridade requer prática. Uma estratégia útil é para inflar minimamente o ducto biliar para garantir o posicionamento adequado da agulha antes de dispensar completamente a solução de digestão pancreática. Em segundo lugar, eficiente isolamento de ilhotas de tecido exócrino requer muita atenção à duração da digestão e agitação adequada. Cuidados devem ser tomados para garantir a uniformidade de aquecimento durante todo o resumo através de roda intermitente. Em terceiro lugar, o sucesso experimental dependerás em cima da discriminação proficiente entre ilhotas e detritos exócrina durante a colheita ilhota manual; esta habilidade melhora com a prática. Em quarto lugar, a dispersão de ilhotas e de revestimento é feito de tal modo que todos os ilhéus são dispersos numa mistura de células simples e os pequenos agregados de dois ou três células. Sobre e sub-digestão de ilhotas antes do plaqueamento interferir com o desempenho experimental. -Células dos ilhéus recentemente plaqueadas deve ser de aproximadamente 50% confluentes antes de se espalhar e deixadas a aderir durante o 48 h, sem ser perturbado. A Figura 1 mostra a aparência das culturas das células dos ilhéus de sucesso em vários momentos após o plaqueamento. Em quinto lugar, mudanças de mídia para culturas de células das ilhotas são feito com cuidado para evitar a perturbação das células fracamente aderentes. Em sexto lugar, a recuperação do antigénio tem de ser feito com cuidado para evitar a deformação da placa de multi-poços, mas suficientemente para permitir sucesso Ki-67 de coloração, que é sensível a ambas sub- e sobre-exposição da elevação da temperatura; chapas deformadas não pode ser utilizado paraaquisição automatizada de imagem. Note, a digestão pâncreas excessiva, exposição a restos de tecido exócrina e / ou tripsinização são causas comuns para o fracasso da cultura de células da ilhota.

Uma limitação deste protocolo é a dependência de marcadores de expressão específica para a identidade de células β e eventos de replicação. Uso de marcadores individuais tem o potencial de ser enganosa. Por exemplo, PDX-1 é expressa por células beta, um subconjunto de Ô-células que expressam somatostatina e células progenitoras de células-β 29,30; Assim, compostos que aumentam a replicação de células-1-PDX pode ser especificamente agindo sobre uma população de células não-β. Em consequência, os estudos de confirmação que utilizam marcadores de células β alternativas são necessárias. Da mesma forma, Ki-67 não é um marcador ideal para a replicação e indicadores adicionais, tais como BrdU e fosfo-histona 3 deve ser utilizado 31. Uma segunda limitação deste ensaio é que os compostos que induzem a replicação de células β pode simultanéously aumentar a apoptose de células β ou diferenciação DE. Por isso, é importante para avaliar se um composto induz a um aumento absoluto no número de células β, e / ou induz a apoptose de células β e p-se as células tratadas com composto reter a função normal (secreção de insulina estimulada por glicose) 32. Uma terceira limitação deste ensaio é o rendimento modesto associado com o uso de células de ilhéus primárias; ilhotas de seis ratos gera 228 poços experimentais que permite que ~ 55 compostos a serem rastreados em quadruplicado (mais controlos positivos e negativos). Uma limitação adicional da plataforma de replicação de triagem de células β descrita é a utilização de ilhéus de ratos em vez de ilhéus humanos. As diferenças entre ilhotas humanas e de ratos são suficientes para exigir que todos os compostos que promovem a replicação identificados utilizando culturas de ilhotas de rato são confirmadas utilizando culturas de ilhotas humanas. No entanto, dada a limitada disponibilidade e alto custo de ilhotas humanas, a triagem primária com i humanaslets é impraticável para a maioria dos pesquisadores.

As principais vantagens deste protocolo são: 1) o uso de ilhotas primários isolados de fresco para manter a restrições normais de crescimento para a maior extensão possível, 2) o uso de um formato de 384 poços para permitir throughput screening moderada (tipicamente ilhéus isolados a partir de seis ratazanas são suficientes para 228 poços) e 3) o uso de aquisição de imagem automatizada e análise para acelerar o ritmo de experimentação e de limitar viés. Por outro lado, abordagens alternativas comumente usados ​​dependem de aquisição de imagem manual e avaliação subjetiva dos eventos de replicação de células-β ou toda incorporação ilhéu de timidina radioactiva que não discrimina entre células-linages, exemplo de fibroblastos contra a replicação de células-β 15,17. Assim, o protocolo apresentado representa uma ferramenta importante e melhorado para investigar o crescimento-regulação das células beta.

Nós prevemos uma variedade de adaptaçãousa para esta plataforma de triagem. Em primeiro lugar, um aumento absoluto no número de células β pode ser medida por contagem do número de PDX-1 + - + ou insulina -cells. Para levar em conta a variabilidade do número de células plaqueadas por cavidade de um maior número de repetições por condição pode ser incluído (tipicamente n = 8). Em segundo lugar, a plataforma pode ser adaptado para a sobre-expressão à base de lentivírus ou knock-out / para baixo experiências para identificar vias envolvidas na replicação de células β. Em resumo, a técnica experimental descrita em termos gerais é útil para a identificação de compostos e as vias moleculares que regulam a replicação de células β.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 g male Male Sprague Dawly Rat Charles River Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps Fine Science Tools 11021-12
11.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14058-11
14.5 cm surgical scissors Fine Science Tools 14001-14
16 cm curved forceps Fine Science Tools 11003-16
12 cm curved hepostat Fine Science Tools 13011-12
12 cm scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Tissue sieve-30 mesh Bellco Glass 1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units VitaCyte 005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) Gibco 24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml) JHP Pharmaceuticals NDC# 42023-113-10 to make anesthetic cocktail 
Xylazine (5 g/50 ml) LLOYD NADA# 139-236 to make anesthetic cocktail 
Histopaque 1077 Sigma H-1077 to make histopaque 1100
Histopaque 1119 Sigma H-1119 to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml Hyclone SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution Hyclone SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose  Hyclone SH30021.01
Functionality/Viability Solution  Mediatech 99-768-CV
RPMI1640 media  Hyclone SH30096.01 to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line Available upon request to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 26160
GlutaMax-I Gibco 35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)  MP Biomedicals 1670049
Formamide 500 ml Fisher BioReagents BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) Vector Laboratories H-3300 to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous EMD Chemicals DX0145-1 to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder) Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody BD Biosciences 556003
Goat anti-human PDX-1 antibody R&D Systems AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody Dako 2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody Dako 2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody Dako 2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody abcam ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated  Invitrogen S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG  Jackson ImmunoResearch 705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch 705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG Jackson ImmunoResearch 703-175-155
DAPI Millipore S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml Sorenson BioScience 39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate BD Falcon 353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate Costar 3603
Multi-channel pipettor Costar 4880
12-channel vaccume aspirator Drummond 3-000-096
Cell Scraper Falcon 353085
Isotemp Water Bath Model 2223  Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI Thermo Scientific

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