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1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

Medicine

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Summary

défis critiques pour le domaine de la recherche sur le diabète sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la réplication β-cellules d'îlots et de développer des méthodes pour stimuler la régénération β-cellulaire. Ici une méthode de criblage à haut contenu pour identifier et évaluer l'activité de réplication favorisant β-cellulaire de petites molécules est présenté.

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Zhao, Z., Abdolazimi, Y., Armstrong, N. A., Annes, J. P. A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform. J. Vis. Exp. (113), e54298, doi:10.3791/54298 (2016).

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Abstract

Introduction

Le diabète englobe un ensemble de troubles qui partagent le point final de la perturbation de l'homéostasie du glucose commun. Bien que les mécanismes pathogènes de sous - types de diabète sont distincts, ils partagent la conséquence de la masse β-cellulaire a diminué, soit la perte de la capacité de production d'insuline 1,2. À l' heure actuelle, les stratégies de traitement du diabète reposent sur ​​l' administration chronique de l' insuline exogène, une stimulation pharmacologique de la production d'insuline ou à l' amélioration de la sensibilité à l'insuline, et plus rarement, la transplantation d'îlots pancréatiques ou 3,4 du pancréas entier. Malheureusement, le succès de ces stratégies est de courte durée et / ou ne parvient pas à récapituler suffisamment la fonction de production d'insuline endogène. Malgré l'utilité de développer une méthode pour stimuler la régénération β-cellulaire, une telle approche existe. Par conséquent, un objectif majeur de la recherche sur le diabète est de développer des méthodes pour générer des cellules ß nouvelles ou pour développer la masse β-cellulaire endogène 5 6,7. Surtout, la principale source des cellules ß nouvelles in vivo les cellules ß pré-existantes plutôt que des cellules souches spécialisées 8,9. Bien que les cellules ß semblent avoir une capacité de replication limitée, une faible augmentation de la masse des cellules β (~ 30%) peut être suffisante pour rétablir l'homéostasie du glucose, dans de nombreux diabétiques. En outre, dans la stimulation pharmacologique in situ de la masse β-cellulaire est une stratégie de traitement potentiellement peu coûteux et évolutive. Ici un procédé de criblage à haut contenu pour identifier et caractériser les petites molécules qui stimulent la croissance des cellules β est présenté.

Une variété de méthodes expérimentales in vitro peuvent être utilisées pour identifier des produits et / ou des molécules tha gènest promouvoir la réplication β-cellule primaire. Les premiers efforts pour mesurer la β-cellulaire réplication induction utilisés culture rongeur pancreata foetal ou de cultures d'îlots isolés intacts pour mesurer [3 H] thymidine, l' incorporation de BrdU ou organismes mitotique au sein de l'aldéhyde-thionine ou de l' insuline population tachée en réponse à des conditions de traitement spécifiques 10, 11. Ces approches in vitro et variantes proches de celui - ci ont plusieurs limites. Déficiences notables figurent (1) l'utilisation de cellules fœtales qui, contrairement à cellules bêta matures, affichent un taux de réplication β-cellule basale élevée et sont la croissance régulée d'une manière distincte 12; (2) la nature subjective de expérimentateur dépendant arbitrage des événements de réplication β-cellulaire; (3) le travail et la nature intensive de temps de expérimentateur dépendant comptage des événements de réplication β-cellulaire retarde le débit expérimental; (4) l'utilisation de l'énergie nucléaire incorporation / tache / apparence pour identifier la réplication mêmets et une tache cytoplasmique non-chevauchement pour identifier les cellules ß conduit à mésattribution des événements de réplication non-β-cellulaire à proximité de ß-cellules.

Plus récemment , les cellules ß-primaires matures ont été utilisées pour évaluer l'impact du transgène sur-expression ainsi que le traitement du produit du gène ou d'un composé sur la réplication β-cellulaire 13-16. Cependant, ces études ont également compté sur le comptage subjective des événements de réplication, les méthodes de staining- cytoplasmique ou non spécifiques pour l' identification β-cellulaire et / ou étapes de main-d'œuvre qui limitent le débit, par exemple, individuelle plaquage slide-puits de cellules ou îlots intacts inclusion dans la paraffine et le traitement 17. En particulier, une méthode de criblage de réplication β-cellule humaine basée sur l' image, similaire à celui présenté ici, a été publiée 18; cependant, l'utilisation réussie de cet essai n'a pas été démontrée et l'utilisation d'îlots humains pour le dépistage primaire ne peut pas être largement feasible.

Une stratégie alternative pour l'identification des substances de réplication de promotion est d'évaluer l'induction de lignes β-cellulaires croissance. Les efforts initiaux utilisés ß-lignées cellulaires transformées telles que MIN6 cellules ou INS 832/13-cellules 14,19-21. Cependant, ces lignées cellulaires montrent une croissance effrénée et portent peu de ressemblance avec les cellules ß bien différenciées 22. Par conséquent, la capacité de croissance induction est minime, de la pertinence claire et parfois difficiles à récapituler. Une stratégie améliorée pour le criblage à base de cellules en ligne utilise des "réversiblement transformé" cellules qui sont la croissance arrêtée en l'absence de tétracycline (doxycycline) SV40 dépendante T expression de l' antigène 23,24. Cependant, il est difficile de savoir si ces cellules reviennent à un état β-cell-like "normal" lors du retrait de la doxycycline. Malheureusement, l'utilisation de ces cellules a donné des composés favorisant la croissance généralisée qui ne semblent pas avoir une utilité immédiate24. Dans l' ensemble, l'utilisation de lignées cellulaires pour étudier la régulation de la croissance d'un type de cellule présentant une activité de réplication spontanée minimale peut avoir une applicabilité limitée.

La plate - forme de criblage réplication β-cellule présentée ici utilise les cellules ß primaires de rat matures pour maintenir la régulation de la croissance in vivo dans la mesure du possible, les cultures d' îlots de cellules de composition de type mixte de cellules pour permettre l' identification des activités favorisant la croissance de la lignée restreinte, multi -Bien mise en forme afin de maximiser le débit et l'analyse automatisée afin d'éliminer les préjugés et faciliter le débit. L' utilisation réussie de cette plate - forme a permis l' identification de plusieurs composés qui favorisent la réplication β-cell 25,26. En outre, l'essai a été utilisé pour des études de structure-activité des relations et des expériences épistasie chimiques pour fournir des indications mécanistiques dans la régulation moléculaire de la réplication des cellules β. La plate-forme a été présentée adapté avec succès foenquête sur la réplication β-cellulaire à base d'ARNi r lentiviral pathways 25. Limites de l'essai comprennent l'évolutivité limitée (utilisation de cellules primaires), l'utilisation de rongeurs plutôt que des cellules d'îlots humains (bien que le dosage peut être adapté pour des études d'îlots humains), les frais associés à l'imagerie à base d'anticorps et l'utilisation des îlots primaire, l'utilisation des îlots dispersés (architecture des îlots perturbés) afin de faciliter l'acquisition d'image automatique et fonction de la disponibilité d'un microscope automatisé avec l'acquisition de l'image et la capacité d'analyse. Bien que facile in vivo méthode de criblage pour identifier des produits géniques ou des composés qui stimulent la régénération β-cellulaire in situ serait idéal, une telle plate - forme est pas encore disponible 27. Par conséquent, la plate-forme décrite est appropriée pour chercheur intéressé à enquêter sur la plupart des aspects de la réplication β-cellulaire.

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Protocol

Ce protocole a été réalisé conformément à la Commission institutionnelle animale soin et l'utilisation (IACUC) de l'École de médecine de l'Université Stanford. Le protocole décrit est redimensionnée pour l'isolement des îlots de six 250-300 g (8 - 9 semaines) mâles de rats Sprague-Dawley, ce qui est suffisant pour générer de 228 puits d'une plaque de 384 puits pour l'évaluation de la réplication des îlots de cellules.

1. Préparation du matériel

  1. Préparer des compositions de revêtement avant d'initier l' isolement des îlots en collectant le milieu conditionné de 804G cellules de carcinome de la vessie de rat maintenues à confluence pendant 3 jours (20 ml de RPMI1640) dans une 15 cm de boîte de culture 28 tissulaire. Filtre stérile et de stockage (-20 ° C) du milieu conditionné pour une utilisation ultérieure.
  2. Stériliser les instruments chirurgicaux (une 12 cm forceps de tissu à dents, un de 11,5 cm de ciseaux fins, l'un de 14,5 cm ciseaux chirurgicaux, les deux pinces courbe 16 cm, une 12 cm hémostatique courbe, une poignée de scalpel 12 cm) et un tamis de tissu à 30 mailles avant pour initialiseriating isolement des îlots.
  3. Préparer une solution de digestion du pancréas par dissolution de 60%: mélange de 40% de la classe I purifiée: classe collagénase II (activité totale de la collagénase de 300.000 - 400.000 unités) dans 60 ml de solution saline équilibrée de 1 x Hanks (HBSS) complétée avec du calcium et du magnésium. Charge 10 ml de tampon de digestion du pancréas dans 10 ml de seringues (six) avec une aiguille G 1 "22 et la place sur la glace.
    Nota: 10 ml de solution de digestion est injecté par rat. L'échelle en conséquence.
  4. Préparer 4,5 ml de cocktail anesthésiant dans une hotte ventilée par mélange de 1,3 ml de kétamine (100 mg / ml), 0,2 ml de xylazine (100 mg / ml) et 3 ml de PBS. Préparer le cocktail anesthésique à 1 h d'initier l'isolement des îlots.
  5. Préparer un tampon de lavage en ajoutant 25 ml de sérum de veau nouveau-né à 500 ml d'HBSS. Placez le tampon de lavage sur la glace pour une utilisation ultérieure.
  6. Préparer 1 bouteille de milieu d'îlots qui est de 500 ml de milieu Eagle modifié faible taux de glucose de Dulbecco (DMEM), 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS), 5000 unités / ml de pénicilline et 5000 pg / ml de streptomycine.
  7. Préparer îlot moyen de la fonction de la solution la fonctionnalité / viabilité (500 ml) avec 2% de FBS, 2 mM de glutamine, 5 mM de glucose, 5000 unités / ml de pénicilline et 5000 pg / ml de streptomycine. Rangez les médias de la fonction des îlots (4 ° C) pour une utilisation ultérieure.
  8. Préparer 40 ml de tampon de blocage par addition de 2,5 ml de sérum d'âne et 0,12 ml de Triton X-100 à 37,38 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS). Magasin tampon de blocage (4 ° C) pour une utilisation ultérieure.
  9. Obtenir les anticorps nécessaires avant d'engager le protocole.
    Note: PDX-1 (TRITC) et Ki-67 (FITC) co-coloration est utilisé pour le dépistage de la réplication β-cellule primaire. Pour l'analyse de réplication lignée spécifique, effectuer des immunofluorescence pour des marqueurs supplémentaires d'identité de cellules (insuline, glucagon, vimentine ou somatostatine; TRITC) ainsi que nucléaire (DAPI), PDX (Cy5) et Ki-67 (FITC) coloration. Alternative repdes marqueurs de publica-, par exemple, PCNA, peuvent également être utilisés.
  10. Préparer un plan de traitement 228 puits avec chaque condition de traitement effectué en quadruple. Inclure POSITIF (5-Iodotubercidin [1] iM ou dipyridamole [15 uM]) et le véhicule de contrôle (DMSO 1: 666 dilution) puits.

2. Perfusion du pancréas

  1. Anesthésier le rat par injection intrapéritonéale d'une solution de cocktail anesthésiant dilué (0,30 ml / 100 g de poids corporel). Une fois que le rat est entièrement anesthésié et ne répond pas à des stimuli nocifs, effectuer la dislocation cervicale.
  2. Placez le rat euthanasiés en position couchée (orientation cranio-caudale) sur une pile de serviettes en papier et pulvériser la zone abdominale avec 70% d'éthanol.
  3. Ouvrir la cavité abdominale avec une demi-entaille (base au niveau de la région pubienne) et se rétracter dans la direction de la peau rostrale au-dessus de la poitrine afin d'exposer la cavité abdominale.
  4. saisir délicatement le duodénum en utilisant deux paires de pinces incurvées, recherchez l'entrée duodénale du b communconduit ile (sphincter d'Oddi) et serrer l'ouverture du duodénum à la papille avec un hémostatique courbe.
  5. Soulevez le hémostatique incurvé utilisé pour bloquer la voie biliaire principale papille et de saisir le canal biliaire près de foie en utilisant une pince incurvées. Utilisez dissection avec la pince incurvées pour isoler et exposer le canal biliaire.
  6. Repositionner le rat avec le proximal de la tête et les pieds distale.
  7. Cathétériser le canal cholédoque (CDB) au niveau ou juste en aval de la jonction des canaux hépatiques kystiques et communs avec une solution de digestion pancréatique chargé en seringue de 10 ml et injecter lentement 10 ml de la solution de digestion du pancréas. Alors que l'injection, soutenir la CDB avec une poignée de scalpel. Repositionner l'aiguille si le conduit et le pancréas ne parviennent pas à gonfler.
  8. Retirer le pancréas gonflé à l'aide de la pince incurvées et des ciseaux fins pour le séparer du côlon descendant, des intestins, de l'estomac et de la rate. Placez le pancréas gonflés sur la glace dans un tube de 50 ml contenant 5 ml de Remarque: Pour obtenir un rendement maximal des îlots, recueillir toutes les pancreata dans les 30 minutes et lieu seulement 1 ou 2 pancreata dans chaque tube 50 ml de digestion.

3. Dissociation du Pancréas

  1. Une fois que tous les pancreata sont collectées, placer les tubes de digestion dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Remuer doucement les tubes toutes les 3 min.
  2. Après 15 min, agiter vigoureusement (verticalement) les tubes 10 fois et ajouter 10 ml de tampon de lavage à froid. secouer vigoureusement les tubes supplémentaires 5 fois et placer sur la glace.
  3. Remplir les tubes de digestion à 50 ml avec le tampon de lavage à froid et mélange en inversant les tubes 5 fois.
  4. Centrifuger les tubes à 97 xg à 4 ° C pendant 1 min et versez le surnageant. Veillez à ne pas déloger le tissu granulé.
  5. Ajouter 25 ml de tampon de lavage et remettre en suspension le tissu par vortex doucement. Répétez les étapes 3.4 et 3.5 fois plus.
  6. Placez un tamis de tissu de 30 mesh sur une sterile bécher de 250 ml et verser la suspension de tissu sur le tamis. Rincer le tube de digestion avec 20 ml supplémentaires de tampon de lavage et versez sur le maillage. Les tissus du pancréas et de la graisse non digérés sont éliminés à l'étape suivante.
  7. Verser le matériau filtré en deux frais tubes de 50 ml et sédimenter le tissu par centrifugation à 97 xg pendant 1 min à 4 ° C. tubes de surnageant et invertis Décanter pour drainer l'excès de tampon.

4. Purification de Islets

  1. Ajouter 20 ml de solution froide diatrizoate polysaccharose / sodium (1,119 g / ml) Densité du tissu pancréatique granulée. Remettre en suspension de façon homogène le contenu de chaque tube par pipetage vers le haut et vers le bas à cinq reprises.
  2. superposer délicatement la solution de diatrizoate polysucrose / sodium avec 10 ml de HBSS. Maintenir une interface liquide forte en ajoutant lentement la HBSS le long de la paroi du tube.
  3. Centrifuger le pancréas digéré à 560 g pendant 15 min (4 ° C) avec une faible accélération et aucun frein.
  4. Collect la couche d'îlots de l'interface en utilisant une pipette de 10 ml et placer des îlots dans 50 ml de nouveaux tubes. Ne pas mettre en commun des îlots à ce stade.
  5. Ajouter 40 ml de tampon de lavage à chaque tube de 50 ml et de spin pendant 1 min à 140 xg à 4 ° C.
  6. Verser le surnageant et remettre en suspension les îlots regroupés dans 50 ml de tampon de lavage par inversion des tubes à plusieurs reprises. Centrifuger les tubes pendant 1 min à 97 g, à 4 ° C pour collecter les îlots dans une pastille.
  7. Verser le tampon de lavage et répéter le lavage. Apportez des îlots dans la culture de tissus capot et aspirer le surnageant.
  8. Remettre en suspension dans chaque tube d'îlots dans 6 ml de milieu d'îlot.
  9. Transfert des îlots de chaque tube de 50 ml dans un puits de six puits boîte de culture de tissu. Agiter le plat à 6 puits pour recueillir des îlots au milieu du puits et observer la qualité de l'îlot et la pureté sous un microscope.
  10. Manuellement recueillir des îlots en utilisant une pipette ml 1 et transférer les îlots cueillis dans la adjacentepuits contenant 6 ml de milieu d'îlots. Répétition tourbillonnement des îlots et la cueillette jusqu'à ce que> 90% de pureté sont obtenus.
  11. Transférer les îlots purifiés dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 20 ml de milieu d'îlots.
  12. Placer les îlots dans un incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% CO2) pendant une nuit (figure 1A).
  13. En préparation de placage des cellules des îlots, enduire les puits d'une plaque à 384 puits avec 40 ul de 804G milieu conditionné par puits. Incuber une nuit dans un incubateur de culture tissulaire.

5. Dispersion et Placage des cellules des îlots

  1. Le lendemain, doucement détacher les îlots de la boîte de 10 cm avec un grattoir à cellules et transférer les îlots dans un tube de 50 ml.
  2. Sédimenter les îlots par centrifugation pendant 1 min à 22 g, à température ambiante. Aspirer le surnageant.
  3. Laver les îlots avec 20 ml de PBS chaud et transvaser comme ci-dessus.
  4. Re-suspendre îlots dans 0,25% de trypsine (150 pi par pancréas de rat) Et incuber à 37 ° C pendant 10 min. Pipette îlots haut et en bas 10 fois en utilisant pipette de 1 ml après 5 et 10 min d'incubation.
  5. Au bout de 10 min, évaluer un échantillon de 20 ul des îlots trypsinisées sous le microscope pour assurer une digestion complète et pour compter les cellules d'îlot à l'aide d'un hémocytomètre. Si îlots non digérés restent, continuer d'incubation pour un montant supplémentaire de 3 - 5 min et la pipette de haut en bas 10 fois plus. Répéter au besoin.
    Remarque: Le rendement typique est ~ 125.000 - 150.000 îlots-cellules par rat.
  6. Retirer 804G conditionné plaque 384 puits revêtue médias de l'incubateur et de supprimer les médias en utilisant un aspirateur à 12 puits collecteur.
  7. Suspendre les cellules des îlots à une densité de 45.000 cellules par ml dans un milieu de fonction Islet et de la plaque 70 pi (3.150 cellules) par puits avec une pipette multicanaux (figure 1B).
    Remarque: Comme les cellules ß se trouvant dans les puits extérieurs ont tendance à migrer vers le périmètre de l'utilisation de la plaque des lignes C à N colonnes 4 età 21 à la plaque 228 puits avec les îlots des cellules isolées à partir de 6 rats.
  8. Placer la plaque dans le tissu incubateur de culture pendant 48 heures pour permettre l'adhésion cellulaire.

6. Islet-cellule Culture Traitement, fixation et coloration

  1. Préparer 200 pi de véhicule et les composés (conditions de traitement sont effectuées en quatre exemplaires ) à une concentration 2x dans du milieu de la fonction des îlots. Disposer les composés dans une plaque de 96 puits stérile pour faciliter multi-puits pipetage.
  2. enlever soigneusement support d'îlots avec un aspirateur de 12 puits collecteur et le remplacer par un milieu de fonction des îlots (35 ul / puits) à l'aide d'une pipette de 12 puits. Retirer et remplacer les médias d'une rangée à la fois pour limiter le risque de séchage (figure 1C).
  3. Initier le traitement par transfert de 35 pl / puits des solutions de composé 2X. plaque Retour à l'incubateur pendant toute la durée de traitement de 48 heures.
  4. Après 48 heures de traitement, transvaser les médias de traitement en inversant la plaque. </ Li>
  5. Lavez délicatement les cellules des îlots pancréatiques avec 50 ul par puits de PBS 1x (1 min). Ajoutez le PBS en utilisant une pipette multi-canal.
  6. Décanter le PBS et fixer les cellules en ajoutant 50 ul par puits de froid paraformaldéhyde 4% (PFA) dilués dans PBS 1x. Incuber les cellules pendant 15 min à 4 ° C.
  7. Laver les cellules trois fois (5 min chacun) en inversant la plaque pour enlever le PFA et en ajoutant doucement 60 pi de PBS par puits comme ci-dessus.
  8. Préparer une solution d'extraction 15 ml d'antigène par mélange de 14,25 ml de formamide et 0,75 ml de citrate de sodium 0,15 M (pH 6). Faire la solution immédiatement avant l'utilisation de la récupération de l'antigène.
  9. Retirer du PBS dans des puits en inversant la plaque et ajouter une solution de récupération d'antigène 60 pi à chaque puits. Chauffer la plaque à 70 ° C bain d'eau pendant 45 min. Placer un bloc de chauffage au-dessus de la plaque pendant cette incubation pour empêcher la déformation de la plaque multi-puits.
    Remarque: L'eau doit être à mi-hauteur de la jupe de la plaque; la plaque ne doit pas être immergé.
  10. Laver les cellules avec 60 pi par puits de PBS 1x trois fois (5 min chacun). Ajouter du PBS avec une pipette à canaux multiples et décanter le PBS en retournant la plaque.
  11. Utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 40 pl par puits de tampon de blocage et on incube pendant 30 min à température ambiante. Retirez le tampon de blocage en inversant la plaque et décantation.
  12. Ajouter 40 ul d'anticorps de souris anti-humain Ki-67 (1: 200) PDX-1 et anti-humaine de chèvre (1: 100) les anticorps dilués dans un tampon de blocage dans chaque puits et incuber à 4 ° C pendant une nuit.
  13. Le lendemain, décante la solution anti-corps et laver les cellules avec 1 x PBS trois fois (5 min à chaque fois), comme décrit ci-dessus. Décanter le PBS.
  14. Ajouter 40 ul par puits de dilués (1: 200) à dos d'âne anti-souris biotinylé IgG d'âne conjugué à la rhodamine-IgG anti-chèvre dans un tampon de blocage. Incuber pendant 1 heureà température ambiante.
  15. Laver les cellules avec PBS 1x trois fois, 5 minutes chacun. Ajouter 40 ul de dilution (1: 400 dans un tampon de blocage) conjugué à la fluorescéine streptavidine à chaque puits. Incuber 30 min à température ambiante.
  16. Laver les cellules avec PBS 1x trois fois, 5 minutes chacun. Ajouter 40 ul par puits de DAPI (300 nM dans du tampon de blocage) et on incube pendant 15 min à température ambiante.
  17. Laver les cellules avec PBS 1x deux fois et laisser les cellules dans 40 ul PBS 1x. La plaque est maintenant prête à être analysé.

Analyse de la réplication 7. β-Cell

Remarque: Un protocole d'essai doit être établi pour le contenu microscope haute de dépistage utilisé pour mesurer la réplication β-cellulaire. Dans sa composition la plus simple, ce protocole est un essai de deux couleurs où un marqueur d'identité est utilisée pour définir les cellules ß (PDX-1 + -Cells) et un marqueur de réplication (Ki-67) est utilisé pour définir les événements de la division cellulaire.

  1. Identifier des objets (cellules ß) sur la base average intensité de fluorescence de la coloration PDX-1 (549 nm filtrant) à l' intérieur d' un cercle approximatif (longueur: largeur <1,6) dans la zone de pixels attendue d'un noyau β-cellules (figure 2A).
  2. Ensuite, établir des paramètres pour identifier les événements de réplication (Ki-67-positivité) en fonction de l'intensité de fluorescence moyenne (485 nm filtre) dans le PDX-1 + zone (figure 2B).
    Note: Les temps d'exposition doivent être fixés pour permettre des comparaisons d'intensité de pixel à travers les images. les paramètres du protocole de dosage sont ajustées de telle sorte que les appels de la machine excluent systématiquement les taches, les débris et les cellules agrégats non spécifiques qui pourraient nuire à la qualité des données.
  3. Analyser un minimum de 500 cellules ß par puits pour maximiser la précision et la limite de la variabilité.
    Note: L'indice de réplication β-cellules basales dans les cultures d'îlots de rat devrait être de 0,5 à 3%. En règle générale, 40 images par puits est plus que suffisante pour identifier les cellules ß-500.
  4. Avant d'analyser laplaque entière, analyser négative- (DMSO-traités) et positifs de contrôle sélectionné (5-iodotubercidin [1 uM] ou dipyridamole [15 uM]) a traité des puits pour évaluer la validité du protocole d'essai. Lorsque le dosage est mis en place correctement, les composés témoins positifs induisent au moins une augmentation de deux fois dans le pourcentage de la réplication des cellules ß.
  5. Lire l'ensemble de la plaque une fois que le protocole d'essai est validé.

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Representative Results

Pour évaluer β-cellulaire ou la réplication α-cellule, un protocole d'essai de quatre couleurs est nécessaire. Tout d'abord, les objets sont identifiés par coloration DAPI (canal 1, 386 nm). Ensuite, les cellules ß (événement 1) sont comptés: objets qui co-exprimer PDX-1 + (canal 2, 650 nm) et de l' insuline péri-nucléaire (canal 3, 549 nm). Par la suite, les cellules ß répliquant (événement 2) sont comptées: ß-cellules (événement 1) qui co-express Ki-67 (canal 4, 485 nm) (figure 3). Le pourcentage de la réplication des cellules bêta est calculée: (event 2 / événement 1) x 100. Pour quantifier la réplication α-cellules, objets totaux sont identifiés par coloration DAPI (canal 1), puis les cellules alpha (événement 1) sont énumérés par l'absence de PDX-1 coloration (canal 2) et la présence d'une coloration périnucléaire glucagon (canal 3). Réplication cellules a (event 2) sont le nombre d'a-cellules qui co-expriment Ki-67 (canal 4) (figure 4).Le pourcentage de cellules-a- répliquants est calculée: (event 2 / événement 1) x 100.

Avant de lancer l'expérience, un plan de traitement composé est fait (tableau 1A). Ici, un petit test à grande échelle a été effectuée en utilisant le contrôle négatif (DMSO-traité) et le contrôle positif ([15 uM] dipyridamole-traitée) conditions pour évaluer PDX-1, β-cellulaire et la réplication α-cellule dans un format de 384 puits ( 49 images par puits). Les données expérimentales montrent dipyridamole pour promouvoir sélectivement PDX-1 + -cell et la réplication β-cellulaire , mais la réplication ne α-cellule. Le nombre moyen de PDX-1-cellules par puits identifiés était 5541 ± 555 pour DMSO traitée et 6439 ± 363 pour les conditions de dipyridamole-traité (p <0,01); démontrant une augmentation de dipyridamole dépendante de PDX-1 nombre de cellules (Tableau 1B, en haut). La moyenne pour cent PDX-1 + -cell réplication (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + </ sup> / DMSO + PDX-1 +) est de 3,35 ± 0,50% de DMSO traitée et 10,10 ± 0,98% pour les conditions de dipyridamole traitées (p <0,01) (Tableau 1B, en bas). Surtout, il y a similaires PDX-1 Taux + -cell de réplication dans les puits analysés ultérieurement pour β-cellules (lignes CF) et la réplication α-cellules (lignes GJ): DMSO = 3,3 ± 0,66 (lignes CF) et 3,4 ± 0,23 (lignes GJ) (p = 0,80); dipyridamole = 9,8 ± 0,86 (lignes FC) et de 10,4 ± 0.1.1 (lignes GJ) (p = 0,43). Par conséquent, ces puits, bien que différents marqueurs colorés pour la lignée de cellules (insuline et de glucagon), a répondu de manière similaire à un traitement médicamenteux.

Ensuite , les taux de ß-cellules et cellules-alpha replication ont été calculées à partir des données brutes (tableau 2). Le nombre moyen de cellules ß (Evénement 1) est augmentée en réponse à un traitement de dipyridamole: DMSO 3,930 ± 488 vs. dipyridamole 4589 ± 218 (p <0,05). Notamment, on observe une réduction significative du nombre de cellules ß (3930 ± 488) par rapport à PDX-1 cellules (5541 ± 555) (p <0,01). Ceci est le résultat de l' exclusion PDX-1 + cellules ß qui sont insuline - à partir du comptage β-cellulaire, par exemple des cellules-δ ou progénitrices β-cellulaire et la sévérité supplémentaire de nécessiter des cellules ß à être insuline +. En particulier, le nombre de cellules a (cas 1) n'a pas augmenté avec le traitement par le dipyridamole (DMSO 1465 ± 123 vs 1467 ± dipyridamole 74,7; p = 0,93). Par conséquent, le dipyridamole augmente sélectivement nombre β-cellulaire. Le nombre de cellules en réplication ß (cas 2) est augmentée en réponse à un traitement par le dipyridamole (DMSO 131 ± 31 vs dipyridamole 476,5 ± 39,6 p <0,01) , mais le nombre de cellules en réplication a (cas 2) ne soit pas (DMSO 10,25 ± 3 vs dipyridamole 9,0 ± 1,6; p = 0,5). Enfin, le pourcentage de replication β-cells et les cellules-a est calculé ((event 2 / événement 1) x 100). En effet, le dipyridamole augmente le pourcentage de la réplication des cellules ß mais non les cellules alpha-(résumées dans la figure 5). Fait important, le taux de replication β-basocellulaire d'une culture saine varie entre les expériences (0,5 - 3%), mais devrait être très uniforme dans les puits à l'intérieur d'une expérience. Étant donné que la réplication de base est variable, le taux de réplication β-cellulaire induite par le composé est également variable selon les expériences; cependant, le pli-induction de la réplication β-cellulaire est cohérent à travers des expériences et permet une efficacité composé à fiable par rapport à travers des expériences. En particulier, le taux de réplication α-cellule est ~ 5 fois plus faible que le taux de replication des cellules β et les cultures contenant des cellules ~ 1/3 a- autant que les cellules ß; Par conséquent, la réplication α-cellule d'affichage d'index de la variabilité a augmenté par rapport à l'indice de la réplication des cellules β. Pour limiter la variabilité, les images par puitsest passé de 49 (utilisé ici) à un maximum de 81.

Figure 1
Figure 1: Isolé et Dispersed Rat Islets. (A) Une micrographie d'îlots isolés de rat sain; bar 100 um d'échelle indiquée. (B) micrographies (5X et 10X objectifs) des îlots de rat dispersées 1 h après placage; 100 um (à gauche) et 200 um (à droite) échelle barres affichées. (C) micrographies (5X et 10X objectifs) de rat dispersée îlots 48 heures après l' étalement; 100 um ( à gauche) et 200 um ( à droite) échelle barres affichées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Identification automatique de PDX-1 + + cellules des îlots. (A) des cellules d'îlots de rat dispersées composées traitées colorées pour PDX-1. PDX-1 + objets sont entourés en bleu; objets exclus sont entourés en orange. Barre d'échelle de 150 um montré. (B) Le même champ de cellules des îlots-colorées pour Ki-67. PDX-1 + ki-67 + cellules doubles-positives sont dans le cercle vert. Barre d'échelle de 150 um indiquées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Automated Identification des Réplication cellules ß Réplication cellules ß sont identifiés par DAPI (coin gauche supérieur, cercles bleus), PDX-1 (coin droit supérieur, des cercles verts), l' insuline (gauche-coin inférieur, magenta cercles) et Ki-67 (coin inférieur droit, cercles rouges) co-eXpression. L'image fusionnée (à droite) montre plusieurs cellules ß répliquant. Barre d'échelle de 150 um indiquées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Automated Identification des Réplication cellules-a Réplication des cellules alpha sont identifiées par DAPI (coin gauche supérieur, cercles bleus), l'absence de PDX-1 (coin droit supérieur, des cercles verts), le glucagon (gauche-bas coin, cercles magenta) et Ki-67 (coin inférieur droit, cercle rouge) co-expression. L'image fusionnée (à droite) montre une réplication doublet rare de cellules-a (flèche jaune). Barre d'échelle de 150 um indiquées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 5:. Dipyridamole Induit PDX-1 + - et réplication β-cellulaire , mais pas α-cellule réplication Représentation graphique de PDX-1-cellule ( en haut à gauche), β-cellule ( en haut à droite) et α-cellule ( en bas à gauche) réplication dans DMSO et les puits de dipyridamole traités sont présentés. Les barres représentent la moyenne des puits traités indépendamment (PDX-1 replication, n = 8; cellules β et la réplication des cellules α, n = 4). Les barres d'erreur indiquent l'écart - type (* p <0,01). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

<td> 3,77
UNE. Traitement: coloration:
4 5
C DMSO DIPYRIDAMOLE L'insuline, DAPI, PDX-1, Ki-67
DMSO DIPYRIDAMOLE L'insuline, DAPI, PDX-1, Ki-67
E DMSO DIPYRIDAMOLE L'insuline, DAPI, PDX-1, Ki-67
F DMSO DIPYRIDAMOLE L'insuline, DAPI, PDX-1, Ki-67
g DMSO DIPYRIDAMOLE Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
H DMSO DIPYRIDAMOLE Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
je DMSO DIPYRIDAMOLE Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
J DMSO DIPYRIDAMOLE Glucagon, DAPI, PDX-1, Ki-67
B. Nombre de PDX-1 + Cellules
DMSO DIPYRIDAMOLE
4 5
C 5158 6249
6365 6795
E 4830 6974
F 5988 6408
g 5574 6532
H 5939 6411
je 5612 6387
J 4862 5759
Pour cent de PDX-1 + Ki-67 + Cellules
DMSO DIPYRIDAMOLE
4 5
C 3.04 9.99
3.91 10,57
E 2.51 8,58
F 10.14
g 3,44 10.1
H 3.06 10,69
je 3,58 9.07
J 3.52 11,74

Tableau 1: Plan expérimental Représentant et PDX-1 + -Cell Data Replication. (A) Les grandes lignes du plan de traitement est indiqué. Les puits ont été traités avec du DMSO (colonne 4) ou le dipyridamole (colonne 5). La coloration a été réalisée avec DAPI, anti-PDX-1, anti-insuline (lettrage normal) ou anti-glucagon (lettrage italic) et Ki-67 (B) Nombre total de PDX 1 cellules + ( en haut, DAPI +PDX-1 +) par puits et le pourcentage de la réplication PDX-1 cellules ( en bas, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + x 100) par puits sont présentés.

Evénement 1:
DMSO DIPYRIDAMOLE
4 5
C 3557 4352 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+)
4387 4542 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+)
E 3462 4879 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+)
F 4315 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+)
g 1594 1567 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
H 1477 1439 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
je 1491 1390 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
J 1298 1474 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
Evénement 2:
DMSO DIPYRIDAMOLE
4 5
C 113 425 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) Ki-67 (+)
152 511 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) Ki-67 (+)
E 97 466 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) Ki-67 (+)
F 163 504 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insuline (+) Ki-67 (+)
g 13 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
H dix 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
je 6 11 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
J 12 </ Em> 7 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
% De réplication:
DMSO DIPYRIDAMOLE
4 5
C 3.18 9,77
3,47 11,25
E 2.8 9,55
F 3.78 10,99
g 0,82 0,57
H 0,68 0,63
je 0,4 0.79
J 0,92 0,48

Tableau 2: β-cellulaire représentant et α-cellule de réplication de données Le nombre total de cellules ß (Event 1: DAPI + PDX-1 + insuline +; dessus des lignes de table CF, lettrage normal).), Les cellules-α (Event 1 : DAPI + PDX-1 + glucagon +; dessus des lignes de table GH, lettrage italic), la réplication des cellules bêta (de l' événement 2: DAPI + PDX-1 + insuline + Ki-67 +, lignes de la table centrale CF, lettrage normal) et α -Cells (Event 2: DAPI + PDX-1 + glucagon + Ki-67 +, lignes de la table centrale GH, lettrage italiques)par puits sont indiqués. En outre, le pourcentage de replication cellules ß (DAPI + PDX-1 + insuline + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + insuline + x 100, en bas des lignes de table CF, lettrage normal) et les cellules alpha (DAPI + PDX -1 + glucagon + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + glucagon + x 100; la table inférieure lignes GJ, lettrage italiques) par puits sont présentés.

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Discussion

Les méthodes expérimentales pour étudier les voies moléculaires qui contrôlent la croissance β-cellulaire et la régénération sont des outils importants pour les chercheurs sur le diabète. Ici, une plate-forme de criblage à base de rat-îlot pour identifier et caractériser les stimulateurs de petites molécules de réplication β-cellulaire est présenté.

Alors que la plupart des aspects de ce protocole sont facilement réalisées par des chercheurs expérimentés, quelques étapes nécessitent technique particulière. Tout d'abord, lors de l'isolement des îlots, canulation du canal cholédoque sans perturber son intégrité exige de la pratique. Une stratégie efficace consiste à gonfler peu le canal biliaire pour assurer un bon positionnement de l'aiguille avant de distribuer complètement la solution de digestion du pancréas. Deuxièmement, efficace isolement des îlots du tissu exocrine nécessite une attention particulière à la durée de la digestion et l'agitation appropriée. Des précautions doivent être prises pour assurer un chauffage dans toute la digestion par tourbillonnant intermittente. Troisièmement, le succès expérimental dépends sur la discrimination entre les îlots et compétents débris exocrine pendant manuel îlot cueillette; cette compétence améliore avec la pratique. Quatrièmement, la dispersion des îlots et le placage est effectué de telle sorte que tous les îlots sont dispersés dans un mélange de cellules individuelles et de petits groupes de deux ou trois cellules. Sur- et sous-digestion des îlots avant le placage interférer avec la performance expérimentale. Cellules d'îlots fraîchement plaqué doit être d' environ 50% de confluence avant de se propager et a permis de fixer sur 48 heures sans être dérangé. La figure 1 montre l'apparition de cultures de cellules d'îlots de succès à plusieurs reprises après le placage. Cinquièmement, les changements de supports pour les cultures d'îlots de cellules sont réalisées avec soin pour éviter la perturbation des cellules faiblement adhérentes. Sixièmement, la récupération de l'antigène doit être fait avec précaution pour éviter le gauchissement de la plaque multi-puits, mais suffisamment pour permettre la réussite Ki-67 coloration qui est sensible à la fois sous et sur-exposition à l'élévation de la température; plaques gauchies ne peuvent pas être utilisées pouracquisition d'image automatisée. Remarque, excessive digestion du pancréas, l'exposition à des débris et / ou trypsinisation tissu exocrine sont des causes fréquentes de l'échec de la culture des îlots de cellules.

Une limitation de ce protocole est le recours à l'expression des marqueurs spécifiques de l'identité β-cellulaire et les événements de réplication. L'utilisation de marqueurs simples a le potentiel d'induire en erreur. Par exemple, PDX-1 est exprimé par les cellules ß, un sous - ensemble de delta-cellules exprimant la somatostatine et des progéniteurs de cellules β 29,30; Par conséquent, des composés qui augmentent la réplication PDX-1 cellules peuvent être agissant spécifiquement sur une population non-β-cellules. Par conséquent, des études de confirmation qui utilisent des marqueurs β-cellulaires alternatives sont nécessaires. De même, Ki-67 expression est pas un marqueur parfait pour la réplication et d' autres indicateurs tels que BrdU et phospho-histone 3 doit être utilisé 31. Une deuxième limite de ce test est que les composés qui induisent la réplication β-cellules peuvent effet que tousdemment augmenter l'apoptose β-cellulaire ou dé-différenciation. Par conséquent, il est important d'évaluer si un composé induit une augmentation du nombre absolu de cellules β, et / ou induit l' apoptose des cellules β , et si les cellules ß traités avec le composé conservent une fonction normale (glucose stimulée par la sécrétion d' insuline) 32. Une troisième limite de ce test est le débit modeste associé à l'utilisation de cellules d'îlots-primaires; îlots de six rats génère 228 puits expérimentaux qui permet ~ 55 composés à cribler en quatre (plus les contrôles positifs et négatifs). Une limitation supplémentaire de la plate-forme de criblage de réplication β-cellule décrite est l'utilisation d'îlots de rat plutôt que des îlots humains. Les différences entre les îlots humains et de rat sont suffisantes pour exiger que tous les composés de réplication favorisant identifiés en utilisant des cultures d'îlots de rat sont confirmées en utilisant des cultures d'îlots humains. Toutefois, étant donné la disponibilité limitée, et le coût élevé des îlots humains, le dépistage primaire avec i humaineslets est impossible pour la plupart des chercheurs.

Les principaux avantages de ce protocole sont les suivants: 1) l'utilisation d'îlots primaires fraîchement isolés pour maintenir les restrictions de croissance normales dans toute la mesure du possible, 2) l'utilisation d'un format de 384 puits pour permettre le criblage à modérée (typiquement îlots isolés à partir de six rats sont suffisantes pour 228 puits) et 3) l'utilisation de l'acquisition automatique d'images et d'analyse pour accélérer le rythme de l'expérimentation et de limiter la partialité. En revanche, d' autres approches couramment utilisées reposent sur ​​l' acquisition d'image manuelle et l' évaluation subjective des événements de réplication β-cellulaire ou toute incorporation d'îlots de thymidine radioactive qui ne font pas de distinction entre les cellules-lignages, par exemple fibroblaste par rapport à la réplication β-cell 15,17. Par conséquent, le protocole présenté représente un outil important et amélioré pour étudier la croissance régulation des cellules ß.

Nous envisageons une variété de adaptéeutilise pour cette plateforme de criblage. Tout d' abord, une augmentation absolue du nombre de cellules β peut être mesuré en comptant le nombre de PDX-1 + - + insuline ou les cellules ß. Pour tenir compte de la variabilité du nombre de cellules étalées par puits un nombre plus élevé de répétitions par condition peuvent être inclus (typiquement n = 8). D'autre part, la plate-forme peut être adaptée à la surexpression ou à base de lentivirus knock-out / décomptage des expériences pour identifier les voies impliquées dans la réplication des cellules β. En résumé, la technique expérimentale décrite est généralement utile pour identifier les composés et les voies moléculaires qui régulent la replication des cellules β.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 g male Male Sprague Dawly Rat Charles River Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps Fine Science Tools 11021-12
11.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14058-11
14.5 cm surgical scissors Fine Science Tools 14001-14
16 cm curved forceps Fine Science Tools 11003-16
12 cm curved hepostat Fine Science Tools 13011-12
12 cm scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Tissue sieve-30 mesh Bellco Glass 1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units VitaCyte 005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) Gibco 24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml) JHP Pharmaceuticals NDC# 42023-113-10 to make anesthetic cocktail 
Xylazine (5 g/50 ml) LLOYD NADA# 139-236 to make anesthetic cocktail 
Histopaque 1077 Sigma H-1077 to make histopaque 1100
Histopaque 1119 Sigma H-1119 to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml Hyclone SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution Hyclone SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose  Hyclone SH30021.01
Functionality/Viability Solution  Mediatech 99-768-CV
RPMI1640 media  Hyclone SH30096.01 to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line Available upon request to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 26160
GlutaMax-I Gibco 35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)  MP Biomedicals 1670049
Formamide 500 ml Fisher BioReagents BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) Vector Laboratories H-3300 to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous EMD Chemicals DX0145-1 to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder) Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody BD Biosciences 556003
Goat anti-human PDX-1 antibody R&D Systems AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody Dako 2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody Dako 2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody Dako 2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody abcam ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated  Invitrogen S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG  Jackson ImmunoResearch 705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch 705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG Jackson ImmunoResearch 703-175-155
DAPI Millipore S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml Sorenson BioScience 39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate BD Falcon 353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate Costar 3603
Multi-channel pipettor Costar 4880
12-channel vaccume aspirator Drummond 3-000-096
Cell Scraper Falcon 353085
Isotemp Water Bath Model 2223  Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI Thermo Scientific

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