लेजर की मदद से पशुधन युग्मनज में cytoplasmic microinjection

1Department of Animal Science, University of California, Davis
Published 10/05/2016
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Genetics

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Summary

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Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

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Abstract

Introduction

1-सेल भ्रूण के cytoplasmic microinjection एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है। यह भ्रूण में किसी भी समाधान प्रदान करने के लिए, उदाहरण के लिए, जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए या जीन से संपादित जानवरों उत्पन्न करने के लिए उत्पादन जीन दस्तक बहिष्कार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अधिकांश कृषि प्रासंगिक खेत पशु युग्मनजों एक बहुत ही उच्च फैटी एसिड संरचना है कि उनके कोशिका द्रव्य अपारदर्शी और अंधेरे 1 बनाता है। उन्होंने यह भी एक काफी लोचदार प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) है। इन विशेषताओं पारंपरिक pronuclear / cytoplasmic इंजेक्शन का उपयोग कर के रूप में कृंतक प्रजातियों चुनौतीपूर्ण और अक्सर गलत में इस्तेमाल microinjection बनाते हैं।

क्योंकि यह प्रदर्शन करने के लिए आसान है और यह भी, इंजेक्शन भ्रूण को कम नुकसान का कारण बनता है उच्च व्यवहार्यता 2 में जिसके परिणामस्वरूप cytoplasmic microinjection pronuclear microinjection से अधिक लाभ है। इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य के खेत पशु युग्मनजों की कोशिका द्रव्य में समाधान देने के लिए एक सफल विधि का प्रदर्शन करने के लिए है। प्रदर्शन करने में सक्षम होना करने के लिएपशुधन भ्रूण पर उच्च दक्षता के साथ cytoplasmic microinjection, एक लेजर zona pellucida (जिला परिषद) और फिर एक कुंद अंत गिलास सुई microinjection के लिए प्रयोग किया जाता है में एक छेद उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस रणनीति के यांत्रिक इंजेक्शन के दौरान भ्रूण पर अंकित नुकसान को कम करना है। फिर, इंजेक्शन सुई अंदर cytoplasmic सामग्री की आकांक्षा सुनिश्चित करना है कि समाधान भ्रूण की कोशिका द्रव्य में कर दिया है प्रधानमंत्री के कुशल और विश्वास टूटना अनुमति देता है।

इस तकनीक को पहले से ही सफलतापूर्वक युग्मज कोशिका द्रव्य 3,4 में siRNA देने के लिए और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / CRISPR जुड़े प्रणाली 9 (Cas9) प्रणाली का उपयोग करते हुए 5 म्यूटेशन उत्पन्न करने के लिए गोजातीय भ्रूण में इस्तेमाल किया गया है। यह भी उपयुक्त (मामूली संशोधनों के साथ) गोजातीय मेघपुंज संलग्न oocytes 6 इंजेक्षन है। यहाँ, हम हमारे इंजेक्शन एक डाई पहुंचाने प्रोटोकॉल का वर्णन है, कि किसी भी des इंजेक्शन लगाने के लिए लागू हो सकता हैयुग्मनज में iRed समाधान, और पता चलता है कि इस तकनीक का उपयोग कम से कम सेल का कारण बनता है और जल्दी भ्रूण के विकास को प्रभावित नहीं करता।

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Protocol

1. Micropipette उत्पादन

  1. इंजेक्शन micropipette
    1. एक borosilicate ग्लास केशिका (1.0 मिमी, भीतरी व्यास (आईडी): बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट) 0.75 मिमी) की जगह एक micropipette खींचने में (दाएं और बाएं केशिका धारकों के केंद्र में है) और यह ताला।
    2. एक उपयुक्त प्रोग्राम का उपयोग गिलास केशिका खींचने के लिए तो यह एक लंबे टेपार के साथ एक पतली टिप में यह परिणाम है। (उदाहरण: गर्मी: 825; खींचो: 30; वेग: 120, समय: 200; दबाव: 500)।
    3. ध्यान से डिवाइस से निकाला pipettes हटाने और एक क्षैतिज स्थिति में एक microforge पर जगह है।
    4. खींच लिया पिपेट और ध्यान में अपने गिलास मनका के साथ microforge हीटर रेशा लाओ। इच्छित मोटाई मापने के लिए और पिपेट क्षैतिज कदम जब तक हीटर रेशा लक्ष्य भीतरी व्यास (5 माइक्रोन) तक पहुँच ऐपिस लजीला व्यक्ति का प्रयोग करें।
    5. के बारे में 45% करने के लिए गर्मी को समायोजित करें और धीरे पिपेट नीचे लाने के लिए तो यह रेशा छू लेती है। हीटर संक्षेप सक्रिय करें। यह wबीमार थोड़ा पिपेट पिघल तो यह रेशा का पालन करता है और ठंडा होने पर, पिपेट संपर्क बिंदु एक सीधे कटौती पैदा करने में टूट जाएगा।
      नोट: उचित तापमान की स्थापना इस चरण में महत्वपूर्ण है के बाद से बहुत अधिक तापमान पिपेट मोड़ कर देगा और इस तरह एक सीधे कटौती संभव नहीं होगा और बहुत कम तापमान पिपेट (चित्रा 1 ए) पिघल करने के लिए पर्याप्त नहीं होगा।
    6. यह स्थिति हीटर रेशा से लगभग 10 माइक्रोन दूर से पिपेट टिप के पास लगभग एक 30 डिग्री के कोण बनाते हैं। 60% तक तापमान सेट और हीटर को सक्रिय करें।
      नोट: यह रेशा खत्म पिपेट झुकना होगा। इस कोण वांछित है तो सुई की नोक इंजेक्शन प्लेट की सतह के समानांतर जब इंजेक्टर (चित्रा 1 बी) में मुहिम शुरू की है।
    7. सावधानी के साथ microinjection pipettes संभाल के रूप में वे बहुत तेज और कमजोर कर रहे हैं।
  2. होल्डिंग micropipette
    1. एक borosilic रखें(1.0 मिमी, आईडी: आयुध डिपो 0.75 मिमी) गिलास केशिका खाया एक micropipette खींचने में (दाएं और बाएं केशिका धारकों के केंद्र में है) और यह ताला।
    2. कांच केशिका खींचने के लिए तो उसके साथ एक लंबे समय से भी घटना और समानांतर दीवारों एक पतली टिप में यह परिणाम एक उपयुक्त कार्यक्रम का उपयोग करें (: गर्मी: उदाहरण 815; खींचो: 20; वेग: 140, समय: 175; दबाव: 200)।
    3. ध्यान खींचने डिवाइस से निकाला पिपेट को हटाने और एक क्षैतिज स्थिति में microforge धारक पर जगह है। हीटर रेशा और पिपेट पर ध्यान केंद्रित करने को समायोजित करें।
    4. पिपेट व्यास मापने के लिए और पिपेट कदम जब तक रेशा के ऊपर इसका व्यास 180 माइक्रोन तक पहुँच ऐपिस लजीला व्यक्ति का प्रयोग करें।
    5. संकेत आकार में, एक हीरे की नोक कलम के साथ कांच केशिका निशान, और फिर धीरे से खींच लिया टिप कांच तोड़ने पर दबाएँ। यह एक सीधे कटौती (चित्रा 1 सी) में परिणाम चाहिए।
    6. रेशा के करीब अपनी टिप के साथ एक ऊर्ध्वाधर स्थिति के लिए पिपेट ले जाएँ। तापमान सेट 60% तक microforge की।
    7. आग पॉलिश पिपेट मानक तकनीक 7 का उपयोग कर जब तक यह 40 माइक्रोन से एक आईडी पहुँचता है की नोक। आईडी (चित्रा -1) की जाँच करने के आईपीस लजीला व्यक्ति का प्रयोग करें।
    8. पिपेट पर एक कोण बनाते हैं।
      1. पिपेट वापस एक क्षैतिज स्थिति के बारे में 10 माइक्रोन रेशा और अपनी टिप से दूर 5 मिमी से दूर ले आओ। लगभग 60% करने के लिए तापमान सेट और फिलामेंट के ऊपर पिपेट मोड़ करने के लिए हीटर को सक्रिय करें। हीटिंग जारी रखें जब तक एक वांछित कोण (लगभग 30 के) पर पहुंच गया है। कोण नेत्रहीन (चित्रा 1E) की जाँच करें।
        नोट: पिपेट आम तौर पर इंजेक्शन डिश के नीचे करने के लिए सम्मान के साथ 60 की एक अनुमानित कोण पर microinjector करने के लिए मुहिम शुरू की है। पिपेट की नोक मुड़े तो यह डिश है, जो अपने बीच विमान में भ्रूण का सही इंजेक्शन के लिए आवश्यक है की तह तक समानांतर है।
Le "> 2। micromanipulator सेटअप

  1. जाँच करें कि microinjectors पूरी तरह से तेल से भरी हुई हैं और इस प्रणाली में कोई हवाई बुलबुले देखते हैं कि (microinjector में बुलबुले इंजेक्शन के ठीक नियंत्रण को रोकने)।
  2. जाँच करें कि micromanipulators केंद्र की स्थिति में हैं। इस pipettes के आंदोलन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देगा।
  3. बाएं micromanipulator धारक में पकड़े पिपेट और सही micromanipulation धारक में इंजेक्शन पिपेट डालें।
  4. तेल केशिकत्व द्वारा pipettes में प्रवेश और जाँच करें कि सिस्टम microinjector नियंत्रण का उपयोग कर पिपेट अंदर ऊपर और नीचे तेल ले जाकर ठीक से काम कर रहा है की अनुमति दें।
    नोट: यदि सुइयों के अंदर तेल का कोई आंदोलन है, वहाँ एक रोकना हो सकता है। इस मामले में, एक नई सुई का उपयोग करें।
  5. देखने की माइक्रोस्कोप के मैदान के मध्य में pipettes लाने के लिए micromanipulator नियंत्रण का प्रयोग करें। 4X बढ़ाई का उपयोग, जाँच करें कि micropipette सुझावों सही कोण में हैं (Pडिश के नीचे) को arallel।
    नोट: सुइयों का एक सही सेटअप एक सफल इंजेक्शन के लिए और परिणाम स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है।
  6. निर्माता के अंशांकन मैनुअल निम्नलिखित लेजर प्रणाली जांचना।

3. इंजेक्शन पकवान की तैयारी (चित्रा 2)

  1. गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) SOF-HEPES एक 100 मिमी पेट्री डिश के ढक्कन के केंद्र पर (सामग्री अनुभाग में विस्तृत संरचना) 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक के एक 50 μl बूंद रखें। जगह एक 1 - समाधान के 2 μl बूंद बूंद इंजेक्शन के करीब इंजेक्शन जा। सुनिश्चित करें कि भ्रूण आरटी नीचे नीचे शांत नहीं है।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में हम इंजेक्शन के स्थल कल्पना और इसे बाद में ट्रैक करने में सक्षम होना करने के लिए इंजेक्शन समाधान के लिए Dextran लाल डाई जोड़ देगा।
  2. खनिज तेल का लगभग 10 मिलीलीटर का उपयोग कर इंजेक्शन थाली में बूंदों को कवर किया।
  3. उल्टे खुर्दबीन के मंच पर इंजेक्शन पकवान प्लेस और रंज लानाइंजेक्शन बूंद में ettes। जाँच करें कि सुई बूंद के अंदर ध्यान में हैं। के रूप में micromanipulator नियंत्रण का उपयोग कर की जरूरत है अपनी ऊंचाई को समायोजित करें।
  4. इंजेक्शन बूंद के ऊपरी हिस्से में - (20 घंटा के बाद निषेचन (HPF) 17) 30 युग्मनजों - एक microdispenser का प्रयोग, के बारे में 20 लोड। इसलिए इंजेक्शन बूंद में भ्रूण की संख्या जिस गति से व्यक्ति उन्हें इंजेक्षन कर सकते हैं द्वारा निर्धारित किया जाता कमरे के तापमान पर इंजेक्शन प्रदर्शन करना। लोगों को लगता है कि 30 मिनट में इंजेक्ट किया जा सकता है और अधिक से अधिक भ्रूण लोड नहीं है।
    1. microdispenser में भ्रूण लोड करने के लिए पूरी तरह से सवार दबाना और समाधान भ्रूण युक्त में टिप विसर्जित कर दिया। भ्रूण को स्पर्श गिलास केशिका की नोक (समय में एक) के साथ उठाया जाएगा और धीरे धीरे सवार इसलिए प्रत्येक भ्रूण केशिका में प्रवेश करती जारी। इस दोहराएँ जब तक सभी भ्रूण उठाया जाता है या microdispenser क्षमता भरा हुआ है।
    2. लोड भ्रूण को रिहा करने के लिए, जब तक पूरी मात्रा सह धीरे सवार दबानाभ्रूण ntaining केशिका से जारी है।

4. Microinjection

  1. 4X उद्देश्य का प्रयोग, समाधान लोड नकारात्मक दबाव (श्वास) को लागू करने से इंजेक्शन पिपेट में इंजेक्ट किया। 3 युग्मनजों - 2 इंजेक्षन करने के लिए पर्याप्त समाधान लोड। फिर इंजेक्शन बूंद के लिए कदम।
  2. इंजेक्शन बूंद के भीतर पकड़े पिपेट कदम इतना टिप एक युग्मनज के करीब हो जाता है। पकड़े microinjector के साथ नकारात्मक दबाव (महाप्राण) लागू करें, ताकि युग्मनज पकड़े विंदुक और एक 20x उद्देश्य को बदलने के लिए तय हो जाता है।
  3. एक बार जब युग्मनज पकड़े विंदुक से जुड़ा हुआ है, इंजेक्शन लगाने पिपेट का उपयोग धीरे इसे हटाए बगैर आसपास भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए इसकी गुणवत्ता की जाँच करें। एक अच्छी गुणवत्ता युग्मनज दो ध्रुवीय शरीर है (हालांकि कभी कभी एक ही देखा जाता है) और एक सजातीय कोशिका द्रव्य चाहिए। असामान्य युग्मनजों (चित्रा 3 ए) इंजेक्षन मत करो।
  4. यदि आवश्यक हो, एक उचित इंजेक्शन के लिए भ्रूण की स्थिति बदलनेस्थान। एक अच्छी स्थिति होगी, जिसमें जिला परिषद और प्रधानमंत्री के बीच कुछ जगह नहीं है, इसलिए प्रधानमंत्री लेजर द्वारा क्षतिग्रस्त हो नहीं करता है।
  5. जाँच करें कि इंजेक्शन पिपेट धीरे इंजेक्शन के स्थल पर युग्मनज छू द्वारा भ्रूण के मध्य विमान पर तैनात है। अगर यह अपने मध्य विमान पर नहीं है, सुई भ्रूण पंचर की बजाय बारी बारी से करने के लिए करते हैं जाएगा। जरूरत के रूप में इंजेक्शन पिपेट की ऊंचाई को समायोजित करें।
  6. एक लेजर (चित्रा 3 बी) का उपयोग करते हुए जिला परिषद में एक छेद बनाओ।
    1. लेजर के सॉफ्टवेयर जगह जिला परिषद जहां छेद (जहां भ्रूण पकड़े विंदुक से जुड़ा हुआ है को विपरीत दिशा में) बनाया जाएगा में लेजर लजीला व्यक्ति का उपयोग करना। आग बटन पर लेजर नियंत्रण विंडो क्लिक का उपयोग करना। सुनिश्चित करें कि छेद का आकार काफी बड़ा PM को नुकसान पहुँचाए बिना सुई के माध्यम से पारित करने के लिए जिला परिषद में एक खोलने बनाने के लिए है (उदाहरण: 0.662 मिसे पल्स चौड़ाई / 6.9 माइक्रोन होल आकार)।
  7. इंजेक्शन सुई दर्राजिला परिषद में छेद के माध्यम से और प्रधानमंत्री के साथ संपर्क बनाने। पिपेट आगे बढ़ा जब तक सुई भ्रूण (चित्रा -3 सी) में जिस तरह की ¾ है जारी रखें।
  8. समाधान तेल interphase पर meniscus की स्थिति का निरीक्षण करें, के रूप में यह लगातार इंजेक्शन की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  9. इंजेक्शन पिपेट, जिसमें प्रधानमंत्री और कोशिका द्रव्य इंजेक्शन सुई में aspirated किया जा रहा परिणाम होगा पर नकारात्मक दबाव (महाप्राण) को लागू करें। जारी रखें जब तक सुई में कोशिका द्रव्य के आंदोलन को तेज करता या इंजेक्शन के समाधान के साथ मिश्रण कोशिका द्रव्य सामग्री देखा जा सकता है। इन PM (चित्रा 3 डी) का टूटना का संकेत होगा।
  10. , Cytoplasmic सामग्री सकारात्मक दबाव (इंजेक्शन लगाने) को लागू करने से युग्मनज की कोशिका द्रव्य में समाधान द्वारा पीछा वापस इंजेक्षन जब तक समाधान तेल interphase पर meniscus एक युग्मनज के बराबर व्यास प्रारंभिक बिंदु अतीत उन्नत है।
    नोट: हमारी शर्तों के तहत, इस प्रतिनिधिsents इंजेक्शन समाधान (चित्रा 3E) की लगभग 7 PL।
  11. एक 4X उद्देश्य के लिए परिवर्तित करें और इंजेक्शन बूंद के निचले तरफ करने के लिए इंजेक्शन भ्रूण / एस ले जाते हैं। पकड़े microinjector पर सकारात्मक दबाव लागू करने से भ्रूण रिलीज। ऊपरी तरफ गैर इंजेक्शन भ्रूण और ड्रॉप के निचले तरफ इंजेक्शन लोगों को रखने में मदद करने के लिए इंजेक्शन / गैर-इंजेक्शन भ्रूण का ट्रैक रखने के लिए और कुशलता से काम करते हैं।

5. भ्रूण रिकवरी और इंजेक्शन परिणाम

  1. पूर्व गर्म SOF-HEPES के साथ एक नई डिश में लगभग 200 μl के 3 बूँदें बनाओ। एक microdispenser (ऊपर वर्णित के रूप में) का उपयोग इंजेक्शन भ्रूण लीजिए। 3 SOF-HEPES के माध्यम से उन्हें चलती बूंदों से इंजेक्शन भ्रूण धो लें।
  2. भ्रूण microinjection दौरान lysed गणना और उन्हें त्यागें।
    नोट: पहले एक पारदर्शी दिखाई देता है के बाद से, पूरे जिला परिषद बाहर भरने के लिए एक lysed युग्मनज एक अक्षुण्ण एक से आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, और यह आमतौर पर cytoplasmic हैसामग्री भ्रूण के बाहर करने के लिए लीक।
  3. वैकल्पिक रूप से, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग microinjection दक्षता की जाँच करें। पता है कि यूवी प्रकाश जोखिम भ्रूण क्षति है कि बाद के विकास को प्रभावित कर सकते हैं पैदा कर सकते हो।
  4. 38.5 डिग्री सेल्सियस पर 50 μl पोटेशियम सिंप्लेक्स अनुकूलन माध्यम की (KSOM) 4 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ पूरक खनिज तेल के तहत बूंदों में 25 इंजेक्शन भ्रूण की संस्कृति समूहों, हवा में 5% सीओ 2, और संतृप्ति के लिए आर्द्रता।
  5. 5% FBS के साथ संस्कृति मीडिया अनुपूरक दो दिनों के इंजेक्शन के बाद।
  6. इंजेक्शन के बाद ब्लास्टोसिस्ट (बीएल) की दरों में 7 दिन की जाँच करें। ब्लास्टोसिस्ट भ्रूण / कि बूंद में सुसंस्कृत भ्रूण की कुल संख्या की कुल संख्या के रूप में बीएल दरों की गणना।

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Representative Results

लेजर की मदद से cytoplasmic microinjection पशुधन युग्मनजों की कोशिका द्रव्य में समाधान देने के लिए एक शक्तिशाली और विश्वसनीय प्रोटोकॉल है। चित्रा 3 से पहले और इंजेक्शन के साथ ही तकनीक के समग्र रूपरेखा के बाद युग्मनजों की एक सामान्य रूपरेखा पता चलता है। Dextran लाल समाधान इंजेक्शन इंजेक्शन और इंजेक्शन क्षमता और सटीकता की ट्रैकिंग साइट की अनुमति देने के रूप में प्रयोग किया जाता है। समाधान के सफल प्रसव के 4 चित्र में सचित्र है एक हाल ही में इंजेक्शन भ्रूण जिसमें डाई ही ढंग कोशिका द्रव्य में वितरित किया जाता दिखा। इस तकनीक भ्रूण की 100% अपने कोशिका द्रव्य में इंजेक्ट किया जाता है का उपयोग करना।

इस प्रोटोकॉल गोजातीय और ovine युग्मनज में कम से कम सेल दर है प्रदर्शन किया है। केवल 15.6 ± 5 और इंजेक्शन भ्रूण के 5.8 ± 3.9%, पशु और भेड़, क्रमशः में lysed थे microinjection का एक परिणाम के रूप में 6 चित्र में दिखाया है, वहाँ कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण इंजेक्शन समूहों बनाम दोनों गोजातीय के लिए नियंत्रण में ब्लास्टोसिस्ट विकास दरों में अंतर (32.8 ± 6.6% नियंत्रण, 31.4 ± 5.9% इंजेक्शन) और ovine भ्रूण (40.3 ± 7.8 नियंत्रण कर रहे हैं, 30.3 ± 6.0% इंजेक्शन)।

इन परिणामों से संकेत मिलता है कि लेजर की सहायता intracytoplasmic इंजेक्शन इंजेक्शन और सामान्य ब्लास्टोसिस्ट विकास दरों में परिणाम के दौरान कम से कम नुकसान का कारण बनता है।

आकृति 1
चित्रा 1: एक जनरल आरेख दिखा कैसे होल्डिंग और इंजेक्शन pipettes बनाने के लिए। एबी) इंजेक्शन पिपेट, सीई) होल्डिंग पिपेट। ए) धीरे वांछित व्यास (5 माइक्रोन) में खींच लिया विंदुक के साथ रेशा स्पर्श करें। हीटर संक्षेप सक्रिय करें (ओ में दिखाया रेंज)। यह थोड़ा पिपेट पिघल जाएगा तो यह रेशा करने के लिए और ठंडा, पिपेट पिपेट स्थिति से। बी) बनाओ और कोण पिपेट में अपनी टिप से लगभग 0.5 सेमी की दूरी पर एक सीधे कटौती पैदा संपर्क बिंदु पर टूट जाएगा पर पालन करता है के बारे में 10 माइक्रोन हीटर रेशा से दूर। हीटिंग जारी रखें जब तक वांछित कोण हासिल की है। सी) चिह्नित करने के लिए एक हीरे की टिप पेन का प्रयोग करें और, आग पॉलिश पकड़े पिपेट की नोक वांछित व्यास (180 माइक्रोन)। डी) पर पकड़े विंदुक कटौती एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में यह तक पहुंचता है वांछित आंतरिक व्यास (40 माइक्रोन)। ई) पिपेट पिपेट वापस एक क्षैतिज स्थिति के लिए फिलामेंट से एक जोड़ी माइक्रोन दूर है और इसकी टिप से लगभग 0.5 सेमी की दूरी पर लाने पर एक कोण बनाते हैं। रेशा खत्म पिपेट मोड़ करने के लिए हीटर को सक्रिय करें। हीटिंग जारी रखें जब तक वांछित कोण हासिल की है। कैसे सुई बनाने के लिए पर अधिक जानकारी के लिए 8,9,10 देखें।= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:।। इंजेक्शन डिश के जनरल सेटअप pipettes, की व्यवस्था चला जाता है, और भ्रूण इस बैठक में प्रदर्शित कर रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। लेजर की मदद से intracytoplasmic इंजेक्शन प्रोटोकॉल एक) एक युग्मनज इंजेक्शन से पहले पकड़े विंदुक के साथ संलग्न की एक सामान्य आरेख। पंजाब: ध्रुवीय निकायों, जिला परिषद: zona pellucida, CYT: कोशिका द्रव्य, पी.एन.: pronuclei, PM: प्लाज्मा membranई, हिमाचल प्रदेश: पकड़े पिपेट, आईपी:। इंजेक्शन पिपेट इ) Microinjection कदम: बी) एक युग्मनज एक लेजर का उपयोग करते हुए पकड़े विंदुक के साथ संलग्न की जिला परिषद में एक छेद बनाओ सी) भ्रूण के विपरीत दिशा की ओर इंजेक्शन पिपेट का परिचय। । Meniscus (क)। डी की स्थिति को सत्यापित करें) इंजेक्शन पिपेट अंदर cytoplasmic सामग्री aspirating द्वारा प्लाज्मा झिल्ली तोड़। ई) युग्मज कोशिका द्रव्य में cytoplasmic सामग्री और समाधान वापस इंजेक्षन, जब तक meniscus एक युग्मनज व्यास (ख) पिछले प्रारंभिक बिंदु तक पहुँच जाता है । दूरी एबी इंजेक्शन समाधान। एफ) इंजेक्शन के बाद एक युग्मनज का एक सामान्य चित्र के ~ 7 पी एल का प्रतिनिधित्व करता है। ध्यान दें कि इंजेक्शन समाधान ही ढंग कोशिका द्रव्य में फैलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 4:।। साथ Dextran लाल एक इंजेक्शन युग्मनज ए) इंजेक्शन युग्मनज बी के उज्ज्वल क्षेत्र छवि) इंजेक्शन युग्मनज का फ्लोरोसेंट छवि के प्रतिनिधि चित्रा यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। दो अलग अलग प्रजातियों डेटा 4 गोजातीय भ्रूण के लिए प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है में युग्मनज Microinjection के बाद lysed भ्रूण के अनुपात और 3 (103 इंजेक्शन युग्मनजों की कुल) ovine भ्रूण (173 इंजेक्शन युग्मनजों की कुल) के लिए दोहराता है। त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व SEM कृपया देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

चित्रा 6
चित्रा 6:। गोजातीय और Ovine भ्रूण डेटा में ब्लास्टोसिस्ट दरें 4 102 इंजेक्शन और 156 नियंत्रण भ्रूण की कुल के साथ गोजातीय प्रजातियों के लिए प्रतिकृति और 3 163 इंजेक्शन और 239 नियंत्रण भ्रूण की कुल के साथ ovine प्रजातियों के लिए प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व SEM कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

युग्मनजों के microinjection स्तनधारी भ्रूण में समाधान शुरू करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। कुछ बदलाव प्रजातियों और प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर है के साथ, इस तकनीक को मोटे तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता है। हम कैसे एक कुंद अंत micropipette के प्रवेश द्वार की सहायता के लिए एक लेजर का उपयोग कर intracytoplasmic microinjection प्रदर्शन करने के लिए दिखा। कुछ पशुधन प्रजातियों (जैसे पशु, भेड़, सुअर और के रूप में) की युग्मनजों एक बार भ्रूण के अंदर इंजेक्शन पिपेट के दृश्य निरोधक एक अंधेरे कोशिका द्रव्य है। इसके अलावा, उनके प्लाज्मा झिल्ली, बहुत लोचदार हैं एक beveled नुकीला सुई को प्राप्त करने के लिए कठिन है (आमतौर पर कृंतक प्रजातियों में से युग्मनजों इंजेक्षन करने के लिए प्रयोग किया जाता है) के साथ उनकी पैठ बना रही है। इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम प्लाज्मा झिल्ली और भ्रूण की कोशिका द्रव्य के अंदर समाधान की रिहाई का टूटना सुनिश्चित करने के लिए zona pellucida और cytoplasmic सामग्री के बाद आकांक्षा के माध्यम से एक कुंद अंत सुई के पारित होने सक्षम करने के लिए एक लेजर का इस्तेमाल किया। इसके अलावा, injecti द्वारासुई प्रवेश द्वार के विपरीत साइट में एनजी (लगभग 3/4 भ्रूण के अंदर) हम पी.एन. विस्थापित करने के लिए और इस तरह उनकी आकांक्षा / इंजेक्शन से बचने के लिए लक्ष्य। इसके अलावा, इस प्रकार कम सेल दरों में जिसके परिणामस्वरूप, टूटी झिल्ली चंगा करने के लिए संपर्क का अधिक बिंदु प्रदान करता है।

अच्छा micropipettes (विशेष रूप से इंजेक्शन पिपेट) के उत्पादन और उचित रूप से उन्हें micromanipulator में स्थापित करने के लिए इस तकनीक के साथ अच्छे परिणाम प्राप्त करने की कुंजी है। इंजेक्शन सुई के रूप में लंबे समय के इंजेक्शन समाधान सुई अंदर सुचारू रूप से चलता रहता है के रूप में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कभी कभी, cytoplasmic सामग्री या यहां तक ​​कि pronuclei सामग्री सुई की नोक के अंदर अटक जाता है, प्रवाह असमान रूप से चलाने के लिए कारण और इंजेक्शन उलझी है (यह भी सेल दर बढ़ जाती है और इस प्रक्रिया में देरी)। इंजेक्शन की सुई जब ऐसा होता है की जगह इस प्रोटोकॉल के साथ इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। समय की राशि है कि भ्रूण इनक्यूबेटर के बाहर हैं महत्वपूर्ण हैलगातार बचने की दर पाने के लिए और 30 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए। प्रशिक्षण और अभ्यास के बाद, ऑपरेटरों आमतौर पर प्रति मिनट 1-2 इंजेक्शन भ्रूण का एक इंजेक्शन की गति को प्राप्त करने। इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु लगातार भ्रूण प्रति समाधान की मात्रा का एक ही राशि इंजेक्षन है। यह आसानी से और सही समाधान तेल इंटरफेस meniscus के विस्थापन को देख कर नियंत्रित किया जाता है। यह महत्वपूर्ण है कि पिपेट व्यास जोड़तोड़ के बीच और टिप एक नियमित और निरंतर व्यास है कि संगत है। नोक पर 5 सुक्ष्ममापी आईडी pipettes के साथ, एक 7 - 10 इंजेक्शन की मात्रा के पीएल एक युग्मनज की लंबाई के बराबर इंजेक्शन द्वारा हासिल की है। ओवर-इंजेक्शन अक्सर भ्रूण सेल में परिणाम है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, भ्रूण की 100% कोशिका द्रव्य में ठीक से इंजेक्ट कर रहे हैं, पूरी तरह से झूठी perivitelline अंतरिक्ष इंजेक्शन (चित्रा 4) से परहेज। यह विश्वसनीयता अधिकतम और परख के reproducibility किया जा रहा है (इंजेक्शन समाधान) के परिणाम के बाद की परवाह किए बिना ही इंजेक्शन समाधान के प्रभाव को और इंजेक्शन विसंगतियों के लिए नहीं होने वाले हैं। इंजेक्शन युग्मनजों से कुछ आम तौर पर इंजेक्शन के दौरान यांत्रिक क्षति के कारण lyse जाएगा। इंजेक्शन के बाद अस्तित्व का एक सामान्य दर 75% 11 है। इस विधि का प्रयोग, हम lysed भ्रूण (चित्रा 5) के न्यूनतम दर प्राप्त करने में सक्षम हैं। इसके अलावा, ब्लास्टोसिस्ट विकास दर के गैर इंजेक्शन (नियंत्रण) भ्रूण (चित्रा 6) के बराबर थे, इंगित करता है कि इंजेक्शन तकनीक जल्दी भ्रूण के विकास पर कोई हानिकारक प्रभाव पड़ता है। इस प्रोटोकॉल की दक्षता में हाल ही में पारंपरिक cytoplasmic microinjection प्रोटोकॉल (प्रत्यक्ष cytoplasmic लेजर के उपयोग के बिना एक beveled नुकीला गिलास सुई का उपयोग microinjection डी जिला परिषद घुसना करने के लिए) गोजातीय युग्मनजों 5 इंजेक्शन लगाने के लिए की तुलना में था। परिणाम प्रत्यक्ष cytopl के लिए ब्लास्टोसिस्ट्स गठन की दर कम lysed भ्रूण की काफी ऊंची दरों और पता चलाasmic microinjection। हमारा मानना ​​है कि जब, लेजर की सहायता cytoplasmic microinjection का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला में पशुधन प्रजातियों इंजेक्शन लगाने के लिए पसंदीदा एक बना इन मतभेदों को सुई प्रवेश के दौरान कम यांत्रिक क्षति के कारण हैं।

यहाँ, हम इन विट्रो निषेचन के द्वारा प्राप्त गोजातीय और ovine भ्रूण के लिए डेटा मौजूद है, लेकिन यह भी का उपयोग कर प्रोटोकॉल का परीक्षण किया है में vivo और इन विट्रो इसी तरह के परिणाम प्राप्त करने के स्वाइन भ्रूण (नहीं दिखाया डेटा)। इंजेक्शन समाधान पर निर्भर करता है, इस प्रोटोकॉल कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हाल ही में, हम इसे इस्तेमाल किया है इन विट्रो निषेचित भ्रूण गोजातीय पर नाक आउट करने के लिए विशिष्ट जीन एक CRISPR / Cas9 प्रणाली लागू करने और परिवर्तन के साथ अनुक्रम ब्लास्टोसिस्ट की एक उच्च अनुपात पाया: भ्रूण का 50% (एन = 6) biallelic म्यूटेशन था 33% (एन = 4) monoallelic म्यूटेशन था, और 17% (एन = 2) थे जंगली प्रकार 5। इस प्रोटोकॉल बहुत विश्वसनीय दिया गया है और में इस्तेमाल किया जा सकताकई प्रजातियों और असंख्य अनुप्रयोगों।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish Falcon 351029 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2 Sigma C7902 Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

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References

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