높은 처리량, 광물 조직의 멀티 이미지 Cryohistology

Biology

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Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L., Hong, S. H., Adams, D. J., Ackert-Bicknell, C., Shin, D. G., Rowe, D. W. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (115), e54468, doi:10.3791/54468 (2016).

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Abstract

Introduction

생물학적 연구는 종종 자주 조직 학적 분석 1-3 일종의와 관련된 효율적인 표현형가 필요합니다. 이 필요 마우스 게놈 4 각 유전자를 방해 더욱 분명 야심 찬 프로젝트가있다. 이러한 조직 학적 분석은 개별 세포에 특정 유전자 또는 단백질의 매핑 표현 세포 형태 및 / 또는 해부학 적 특징을 평가에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 사실, 유전체 분야에 조직학의 기본적인 기여 중 하나가 특정 영역 또는 세포 유형으로 특정 분자 신호를 연결하는 기능이다.

특히 근골격계 조직에 대한 조직 검사의 전통적인 방법은 종종 시간이 많이 걸리고 힘들고, 때로는 해결하기 위해 주를 필요로하고, 석회, 섹션, 얼룩 및 이미지 시편은 인간의 해석을 통해 이미지를 분석 할 수 있습니다. 시츄 hybridizat의 여부 면역 통해 여러 분자 신호를 분석이온, 또는 특수 얼룩, 적절하게 수행하기 위해 여러 섹션, 심지어 여러 표본을 필요로한다. 또한, 이러한 복수 응​​답은 주어진 시료 내 특정 지역에 공동 지역화 할 수 없습니다 때로는 동일한 셀에 공동 지역화 할 수 없습니다. 게놈과 후성 유전체 매핑 센터, 후성 유전체학 분야는 디지털 시대로 이동함에 따라, 조직 학적 필드는 효율적이고 높은 처리량, 단일 조직 학적 섹션 내 분자 신호의 다양한 자동화 된 분석을 제공하기 위해 소송을 수행해야합니다.

실제로, 소정의 시험편의 특정 셀에 다수의 분자 신호들을 연결할 수 향상 조직학 기술에 대한 필요성이 대두되고있다. 최근에, 우리는 광물 조직 5-14에서 주어진 섹션 내에서 여러 가지 대응 방안을 평가하기위한 새로운 높은 처리량 cryohistological 방법을 발표했다. 방법은 현미경 슬라이드에 견고하게 접착 테이프 부 냉동 cryotape로 동결 절단 (Cryosections) 안정화 포함하며각 섹션에 염색 및 이미징의 여러 라운드를 실시. 이미지의 이러한 라운드는 수동 또는 이미지 분석하기 전에 컴퓨터 자동화 (그림 1)을 통해 정렬됩니다. 여기, 우리는이 과정에 대한 자세한 프로토콜을 제시하고 이러한 기술은 서로 다른 생물학적 과정에 대한 우리의 이해를 향상 예를 제공합니다.

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Protocol

코네티컷 보건 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학은 모든 동물 절차를 승인했다.

1. 고정 및 포함

  1. CO 2 질식 또는 기타 승인 된 방법을 통해 동물을 안락사.
  2. 제대로 고정 될 때까지 4 ° C에서 10 % 중성 완충 포르말린에 대한 관심의 조직 (예를 들어, 사지, 척추 등)과 장소를 수확. 이전의 고정 일관성 해부학 적 위치를 유지하기 위해 특별한주의하십시오. 예를 들어, 일관성 굴곡, 내부 회전에서 관절과 사지를 해결하고 외부 회전은 11 각도. 삼일 - 일반적으로 1 전체 마우스 사지를 고정합니다.
    주의 : 포르말린은 독성 및 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 동안 흄 후드에서 처리되어야한다.
    참고 : 고정의 기간은 표본의 크기에 따라 달라집니다. 실험이 허용하는 경우, 뼈를 오픈 절단하면 골수 실의 고정이 향상됩니다.일부 표본 (골수 내에서 예를 들어, 희미한 형광 신호) 형광 배경을 최소화하기 위해 관류 고정 (15)가 필요할 수 있습니다.
  3. 4 ° C에서 24 시간 - 전송 1X PBS에서 만든 12 부화 30 % 자당에 포르말린에서 표본.
    참고 : 12 회 동안 항온 - 24 시간, 시험편 후 장기간 보관을 위해 -80 ° C에 배치 될 수있다. 저장이 방법은 연구자들은 동일한 블록에서 여러 샘플을 포함하고자하지만, 동시에 이러한 모든 샘플을 채취하지 않을 수있는 실험 추천 (예를 들어, 여러 시점 실험).
  4. 자당에서 표본을 제거하고 초과 조직을 멀리 해부하다.
  5. cryomold 채우기 냉동 매체를 포함와 방법의 일부 (금형의 크기는 표본의 크기에 따라 달라집니다). 관심있는 지역의 비행기를 절단하는 금형의 바닥과 평행이되도​​록 금형 샘플을 놓습니다.
    주 : 특정 조직 위치 및 방향의 예도 2a에서 찾을 수있다 - B있다.
  6. 냉동 내장 매체 정지의 얇은 층까지 드라이 아이스의 조각 상 cryomold를 놓고 이후 장소에서 시료를 해결합니다. 드라이 아이스 펠릿의 cryomold을 유지하면서 냉동 매체를 포함와 cryomold의 남은 용량을 입력합니다.
  7. 2- 메틸 부탄은 드라이 아이스로 미리 냉각이 들어있는 용기에 cryomold를 놓습니다. 시료가 완전히 고정되면, cryomolds를 제거하고 여분의 2- 메틸 부탄을 흔들. -20 °의 C에 셀로판과 장소에 cryomolds을 감싸 또는 -80 저장을위한 C 냉동고 °.
    주 : 특히 -20 ℃에서 냉동 매립 매체에 저장 될 때 샘플 시간 동안 건조 할 수있다. (단계 1.3 참조) -80 ° C 또는 -80 ° C에서 30 % 자당 매체를 포함 크라이 2 개월 - 우리는 이상 1 샘플의 저장을 권장합니다.

2. 테이프 안정화 조직 단면

  1. 냉장고에서 표본 블록을 제거하고 cryosta에 배치-20 ° C ~ -25 사이에 설정 한 온도 t.
  2. cryomold에서 블록을 제거하고 면도날 매체를 포함 초과 냉동 멀리 트림.
  3. 시험편 디스크에 일부 크라이 매립 매체를 배치하고 시편 디스크 표면함으로써 관심 영역에 대한 적절한 절단면 확립 블럭의 바닥면과 평행이되도​​록, 블록을 정렬.
  4. 그라 이오 스탯의 표본 디스크를 놓고 동결 매체를 포함 크라이 허용합니다.
  5. 시험편 헤드 상 시험편 디스크를 삽입하고, 블레이드 절단 시험편 블록의 표면에 평행하도록 상기 헤드를 조정한다.
  6. 관심 영역 내에서 수준으로 블록을 아래로 트림과 블록의 표면에서 모든 부스러기를 브러시.
  7. 그라 이오 스탯에 대한 관심 및 사전 냉기의 영역을 커버 할 수있을만큼 cryotape의 조각을 잘라.
    참고 : 여러 조각이 cryost 내에서 일관된 크기로 잘라 저장할 수 있습니다절편시에.
  8. 다음 아래 블록 끈적 측 상에 테이프를 배치 집게를 사용하여 비 접착 실버 / 골드 탭으로 테이프를 잡고 cryotape에서 비 부착지지를 제거합니다.
  9. 롤러 (그림 2C)를 사용하여 cryotape에 압력을 적용합니다.
  10. 자동 모터 또는 저온 유지 장치를 수동으로 커팅 휠을 사용하여 - (8 μm의 5) 섹션을 확인합니다.
    참고 :이 부분 (그림 2D)를 절편 동안 무대 떨어지지하지 않도록 무대에 오는대로 cryotape의 가장자리를 유지하는 것이 좋습니다.
  11. 그라 이오 스탯 내에서 플라스틱 현미경 슬라이드에 섹션 조직 측면을 놓습니다.
  12. 그라 이오 스탯에서 플라스틱 슬라이드를 제거하고 냉동 포함 매체는 부분은 슬라이드의 표면에 부착되도록 용융 할 수 있습니다.
  13. 시리얼 섹션 또는 관심의 다른 지역에 대한 절편 반복합니다.
  14. 완성되면, 슬라이드 박스 A의 부분을 저장할t (4) -20 또는 -80 ° C는 필요한 스토리지의 길이와 하류 대응책에 따라. 4 ° C에서 보관하면 한 달 내에 - 예를 들어, 효소 활성을 물들 일 예정 슬라이드를 사용 (5.3 5.2 참조).

현미경 슬라이드에 섹션 3. 접착

  1. UV 경화형 접착제 제조 방법.
    1. 현미경 슬라이드 레이블.
      참고 :이 증가 자동화, 샘플 및 슬라이드가 바코드로 표시 할 수하십시오.
    2. 두 개의 유리 슬라이드에 UV 활성화 광학 접착제 방울을 적용하여 유리 슬라이드의 표면에 걸쳐 접착제의 얇은 층을 전파 플라스틱 슬라이드의 에지를 사용한다.
    3. 실버 / 골드 탭을 차단하고 첫 번째 슬라이드의 접착에 녹화 섹션 조직 측면을 배치합니다. 테이프 아래에 포획 된 기포의 형성을 최소화하기 위해 다른 하나의 에지에서 롤링 모션 구간을 적용한다.
      참고 : 첫 번째 슬라이드는 t의 사전 젖은 밑면에 사용된다이전에 두 번째 (영구) 슬라이드 (단계 3.1.4)에 배치에 그는 테이프.
    4. 첫 번째 슬라이드에서 테이프 부분을 제거하고 제 2 슬라이드 (그림 3A)의 접착제 층에 놓습니다. 다시 말하지만, 거품의 함정을 피하기 위해주의하십시오.
      참고 :이 단계는 마스터에 연습이 필요합니다.
    5. 주어진 실험 섹션의 해당 번호가 각 슬라이드에 배치되면, 주변 지역에서 초과 접착제를 닦아.
    6. 테이프 아래에 거품 또는 섬유에 대한 밀접하게 각 부분을 검사합니다. 현미경이나 돋보기에서이 검사를 수행합니다. 장애물이 존재하는 경우, 각각의 부분을 제거하는 장애물을 제거하고 유리 슬라이드에 다시 적용.
    7. 접착제를 가교하는 10 분 - 녹화 섹션 아래에 장애물이 없는지 결정되면, (5)의 UV 검은 빛 아래 현미경 슬라이드를 놓습니다.
  2. 키토산 접착 방법.
    1. 일을 준비전자 1 % 키토산 접착제. 100㎖의 탈 이온수에서 농축 아세트산 0.25 ㎖에 용해시켜 초산 용액을 제조 하였다 (0.25 % v / v)로. 아세트산 용액 100ml에 키토산 분말 1g을 용해시키고, 용액을 교반 O / N 또는 모든 키토산 분말이 용해 될 때까지.
      참고 :이 솔루션은 실온에서 안정하다.
    2. 슬라이드에 배치 될 각 섹션에 대한 키토산 용액 한 방울을 입금.
    3. 테이프의 실버 / 골드 탭을 잘라 접착제 (그림 3A)에까지 각 테이프 섹션 조직면을 배치합니다. 거품의 함정을 피하기 위해 신중을 사용합니다.
    4. 일단 모든 섹션이 슬라이드에 배치, 긴 모서리 중 하나에 슬라이드를 위로 기울 집게를 사용하여 하단 가장자리에 과도한 키토산을 끕니다.
    5. 슬라이드 상자에 종이 타월 위에이 방향으로 슬라이드를 놓습니다. 중력은 키토산의 평평하고 균일 한 층을 산출 초과 키토산은 수건에 아래로 떨어질 것입니다.
    6. 놀이터냉장고 O 오픈 내놓고의 뚜껑 슬라이드 상자를 CE / N은 ​​키토산 건조 할 수 있도록합니다.
      주 :이 접착 방법의 비교 표 1을 참조하십시오.

슬라이드에 참조 마커 4. 응용 프로그램

  1. 녹색의 50 μL 및 물 100 ㎕에 빨간 미소의 50 μl를 용해하여 기준 마커 솔루션을 준비합니다. 4 ° C에서 어둠 속에서 솔루션을 저장합니다.
  2. 마이크로 스피어 용액에 10 μL, 20 μL 피펫 팁을 놓습니다. 관심 영역 (그림 3C)에 인접한 각 섹션에 마이크로 스피어 솔루션의 작은 방울을 추가합니다. 관심 영역 내에서 미소를하지 않도록주의해야합니다.
  3. 그 날에 슬라이드를 처리하는 경우 30 분 (빛으로부터 보호) RT에서 슬라이드를 건조시킵니다. 그렇지 않은 경우, 4 ° C에서 슬라이드 상자에 슬라이드를 배치합니다.
    주 : 미세 용액 슬라이드 수화 전에 건조만큼 상기 MI중 공구는 염색 / 영상의 여러 라운드 동안 슬라이드에 부착 된 상태로 유지됩니다.

염색 5. 여러 라운드

주 : 촬상 염색 및 재 이미징 단계 호환 시퀀스를 선택하여, 그것을 검출하여 동일한 조직 절편 많은 생체 신호를 공동 지역화 할 수있다. 영상 / 염색 / 재 이미징의 각 라운드는 특정 조직 학적 질문을 위해 개발되어야한다. 촬상 / 염색 / 재 이미징 시퀀스는 일반적으로 형광 다중화 면역 염색 및 효소 활성 얼룩 여러 발사 다음 영상의 첫 번째 라운드에서 내인성 형광 신호 (예를 들어, 셀룰러 GFP, 광물 염료, 생체 내 이미징 프로브)를 획득하는 것을 포함한다. 마지막 섹션은 조직 구조를 강조 발색 염료 (O safranin H & E, 톨루이딘 블루, 등)를 사용하여 염색 될 수있다. 에서 적응이 절에 제시 지정 방법상업적으로 사용 가능한 프로토콜.

  1. 축적 된 광물에 대한 칼 세인 블루 염색
    참고 : 칼 세인 블루 염색이 암시 야 또는 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지와 달리 자동 이미지 분석에 대한 의무가 일관성있는 광물 표면을 얻을 수 있습니다. 칼 세인 블루 염색의 문제점은 샘플이 미네랄 라벨 이미지 칼 세인 블루로 염색하기 전에 화상의 첫 번째 라운드에서 라벨을 포함하는 경우 형광 스펙트럼 그러므로. 테트라 사이클린 및 demeclocycline 라벨과 겹치는 점이다.
    1. 조직 내에서 내생 신호가이 염색 단계 이전에 몇 군데 경우 커버 슬립 멀리 슬라이드에서 떨어질 때까지, 1 x PBS를 가득 코 플린 항아리에 이전 이미징 라운드에서 슬라이드를 잠수함. 제거하고 커버 슬립을 건조.
    2. NaHCO3을 2 %에 칼 세인 블루 용액 30 ㎎ / ㎖를 준비 (100 ㎖의 H 2 g을 NaHCO3을 용해시켜 만든 2 O 및 조정) 염산 7.4의 pH로 보내고. 나누어지는 및 -20 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
    3. 이미 이전 라운드에서 수화하지 않을 경우, 섹션을 수화 15 분 동안 1X PBS를 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 담가.
    4. 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 뒷면과 가장자리를 건조.
    5. 슬라이드 당 칼 세인 블루 용액 500 ㎕를하고 실온에서 습도 챔버에서 10 분 동안 품어 - (100)를 적용합니다.
    6. 3 변경 10 분 동안 1X PBS에서 슬라이드를 씻어.
    7. 각 슬라이드에 1X PBS에 50 % 글리세롤 ~ 200 μl를 적용하고 커버 슬립을 탑재합니다.
    8. 초과 글리세롤을 제거하고 슬라이드의 바닥을 건조.
  2. 타르트 레이트 저항성 산 포스파타제 (TRAP) 효소 활성 염색
    주 : TRAP는 파골 세포를 포함하는 조혈 리니지 여러 세포 유형에서 발현된다. 여기에 제시된 TRAP 염색 노란색 형광 산 포스 파타 아제 기판을 사용합니다. 특정 형광 신호가 OV합니다테트라 사이클린 / demeclocycline 광물 라벨, 블루 얼룩 칼 세인 및 DAPI의 Counterstain과를 포함하여 사용자 지정 노란색 필터 세트 erlap.
    1. 커버 슬립 멀리 슬라이드에서 떨어질 때까지 1X PBS로 가득 찬 코 플린 항아리에 이전 이미징 라운드에서 슬라이드를 잠수함. 제거하고 커버 슬립을 건조.
    2. 아세트산 나트륨 무수물 9.2 g 및 물 중의 나트륨 타르트 레이트 이염 기성 이수화 물 11.4 g을 용해시키고, 1000 ml의 최종 부피를 가져 와서 버퍼 (1)를 준비한다. 농축 빙초산 (- 2 ml의 ~ 1.5)와 4.2 pH를 조정합니다. 4에서 솔루션을 저장 최대 12 개월 동안 C를 °.
    3. 아질산 나트륨 40 mg을 용해하고 1 ml의 최종 부피를 가져 와서 버퍼 (2)를 준비한다. 최대 일주 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
    4. 염색 날, 버퍼 (1)의 7.5 ml의 버퍼 (2) 150 μL를 혼합하여 반응 완충액을 제조.
    5. 슬라이드에 기재하지 않고 반응 버퍼를 적용10의 - 15 분은 낮은 pH에서 조직을 평형 수 있습니다.
      참고 : 일반적으로 볼륨 ~ 200 μL하지만 모든 부분을 커버 할만큼 충분히 커야합니다.
    6. 100 반응 버퍼 : 1:50 1 사이의 노란색 형광 산 포스 파타 아제 기판을 희석.
      참고 : 희석 시료 내 TRAP의 활동에 의해 결정됩니다.
    7. 슬라이드 떨어져 반응 버퍼를 붓고 슬라이드에 노란색 형광 기판과 반응 버퍼를 적용합니다.
    8. 기판을 활성화하기 위해 UV 검은 빛 아래 5 ~에 대한 분 슬라이드를 놓습니다.
      참고 : 배양 시간은 샘플 내에서 TRAP의 활동에 따라 달라질 수 있습니다.
    9. 3 변경 10 분 동안 1X PBS에서 슬라이드를 씻어.
    10. 각 슬라이드에 1X PBS에 50 % 글리세롤 ~ 200 μl를 적용하고 커버 슬립을 탑재합니다.
    11. 초과 글리세롤을 제거하고 슬라이드의 바닥을 건조.
      주 : 산성 TRAP 버퍼 섹션을 석회됩니다. decalcifica의 추가 혜택기 특정 색상이 다운 스트림 염색 (예를 들어, 광물 라벨) 다시 사용할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 칼 세인 블루 염색은 TRAP 염색시 제거됩니다. 따라서, DAPI의 Counterstain과 후속 라운드 동안이 채널에서 이미지화 할 수있다.
  3. 알카라인 포스파타제 (AP) 효소 활성 염색
    참고 : 광물이 조골 세포를 포함하고 광 화제 연골 세포가 AP를 표현과 관련된 여러 세포 유형. 이 프로토콜에 사용되는 고속 레드 기판은 모두 형광 빨간색과 발색 빨간 신호를 유도한다. 이 때문에, 발색 기질 기판 침전물 영역의 형광 신호를 해소한다. 따라서, AP 기판 급냉 될 수있는 형광 신호를 촬상 한 후이 얼룩을 수행하는 것이 최상이다.
    1. 커버 슬립 멀리 슬라이드에서 떨어질 때까지 1X PBS로 가득 찬 코 플린 항아리에 이전 이미징 라운드에서 슬라이드를 잠수함. 레모적이 커버 전표를 건조.
    2. 물 100ml에 트리스 12.1 g에 용해시켜 1 M 트리스 준비. 1 M NaOH로 9.5 산도를 조정합니다.
    3. 탈 이온수 100 ㎖에서의 MgCl 2 20.33 g을 용해시켜 1 M의 MgCl 2 수화물을 준비한다.
    4. 탈 이온수 100 ㎖에 11.68 g의 NaCl을 용해시켜 2 M 염화나트륨을 준비한다.
    5. 증류수 50ml에 1g 분체를 용해 패스트 레드 TR 소금 100X 준비 (20 ㎎ / ㎖) 원액. -20 ° C에서 100 ㎕를 분취하고 저장합니다.
    6. N, N 디메틸 포름 아미드 50 mL에 500 mg의 분말을 용해하여 100 배 (10 ㎎ / ㎖) 나프톨 AS-MX 인산 스톡 용액을 제조 하였다. -20 ° C에서 100 ㎕를 분취하고 저장합니다.
    7. 밀리미터 100 : 염색 일째에 2 M 염화나트륨의 MgCl 2, 0.5 mL의 1 M 트리스 1 ㎖, 1 M, 0.5 mL를 첨가하여 AP 버퍼를 준비하고 (증류수를 사용하여 10 ml의 최종 농도를 최종 부피를 가지고 트리스, 50 밀리미터의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨).
    8. AP B를 배치각 슬라이드 uffer 및 RT에서 10 분 동안, 습도 챔버 내에서 배양한다.
    9. AP에 버퍼에 1 배 빠른 레드 TR 소금과 나프톨 AS-MX의 100 배 주식을 희석하여 AP 기판 버퍼를 준비합니다.
    10. 슬라이드 오프 AP 버퍼를 붓고 AP 기판 버퍼로 교체합니다. 실온에서 습도 챔버에서 10 분 - 5 슬라이드를 품어.
      주 : 배양 시간은 샘플의 AP 활성에 의해 결정한다.
    11. 워시는 5 분마다 1X PBS에서 배를 슬라이드.
    12. (: 1X PBS 중의 50 % 글리세롤 DAPI 1000 희석 1) 마운트 커버 DAPI의 대조 염색 용액으로 미끄러.
  4. 톨루이딘 블루 O (TB) 발색 염색
    주 : 이전 단계 50 % 글리세롤 / PBS 용액에 임시 장착 수성 하에서 묘화되기 때문에, 발색 단계는 수성 조건 하에서 묘화된다. 그러나, 염색 액은 시간이 지남에 따라 침출하는 경향이있다. 따라서, 가능한 한 빨리 염색 후의 이미지에 톨루이딘 블루를 제안한다.
    1. 커버 슬립 멀리 슬라이드에서 떨어질 때까지 탈 이온수로 가득 코 플린 항아리에 이전 영상 라운드에서 슬라이드를 잠수함. 제거하고 커버 슬립을 건조.
    2. 커버 전표를 제거한 후, 깨끗한 물로 교체하고 PBS에서 염은 충분히 조직에서 제거되도록 적어도 10 분 동안 슬라이드를 품어.
    3. 탈 이온수에 0.025 %의 TB 솔루션을 준비합니다.
    4. 5 분 - 1의 TB 용액에 슬라이드를 놓습니다.
      참고 : 배양 시간은 사용자 기본 설정에 의존하지만, 모든 샘플에 걸쳐 일관성을 유지해야합니다.
    5. 탈 이온수 세척 슬라이드와 코 플린 항아리에 장소 슬라이드는 5 분마다 배.
    6. 탈 이온수에 용해 된 30 % 글리세롤 마운트 커버 슬립 (이 얼룩이 조직으로부터 침출 발생할으로 PBS를 1 배 NOT). 주 : 글리세롤 장착 매체 조직으로부터 오염의 확산을 방지 과당 시럽, 치환 될 수있다. 에상기 과당 시럽을 제조 용해 될 때까지 60 ° C로 가열 탈 이온수 10ml에 과당 30g을 용해.

이미징 6. 여러 라운드

  1. 현미경 트레이 (그림 3D)에 슬라이드를 넣습니다.
    참고 : 트레이 봄로드됩니다.
  2. 슬라이드 스캐닝 현미경 (그림 3E)의 트레이 스택에 트레이를 넣습니다.
  3. 각 형광에 적합한 노출 시간 각 슬라이드에 대한 프로파일을로드 할 프로필 목록을 클릭합니다. 수동으로 각 슬라이드의 이름 또는 소프트웨어가 슬라이드 라벨에 제공되는 바코드를 읽게하는 슬라이드 이름을 클릭합니다. 슬라이드의 미리보기 이미지를 촬영하기 시작 미리보기 스캔 버튼을 클릭합니다.
  4. 조직 검출 마법사에 대한 관심의 영역을 설정하고 영상의 다음 라운드에 저장합니다. 각 슬라이드가 설치가되면, 시작 스캔 버튼을 클릭하여 스캔 프로세스를 시작합니다.
    참고 :이 시스템은 100 SLI까지 보유 할 수 있습니다한 번에 데.
  5. 이미징이 완료되면, 이미지 어셈블리 및 분석을위한 각이 .tif 개별 채널 및 이미징 라운드 또는 .jpg 파일에서 이미지를 내보낼 수 있습니다.

7. 이미지 어셈블리

  1. 포토샵을 사용하여 수동 방식 (또는 계층화 된 이미지를 생성 할 수있는 유사한 이미지 편집 소프트웨어).
    1. 각 영상 라운드에서 각각의 채널 이미지를 엽니 다.
    2. 하나의 합성 이미지 내에서 레이어로 개별 이미지를 조립합니다. 이렇게하려면, 하나의 이미지에서 레이어 팔레트에서 레이어를 클릭합니다. 그런 다음 다른 이미지에 레이어를 드래그합니다. 이 드래그 앤 드롭 작업은 이미지에 새 레이어를 생성합니다. 다른 모든 이미지에 대해이 작업을 수행합니다. 또한, 이미지 스택의 레이어로 여러 이미지 파일을로드하여이 프로세스를 자동화하기 위해 (스택 ...에 파일> 스크립트>로드 파일) 스크립트를 사용합니다.
    3. 각각의 이미지는 합성 이미지에서 각각의 층으로 나열되면, 레이어 이름을 더블 클릭은 ​​라 이름을 바꾸려면yers로 다른 채널을 식별 할 필요가 있었다.
    4. 각 층을 통해보고 진정으로 합성 이미지를 생성, 레이어 팔레트에서 "화면"에서 "일반"에서 각 레이어의 혼합 모드를 변경하려면.
      참고 :이 단계 속도를 높이기 위해 화면에 하나의 층을 변경 한 다음 레이어를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 다른 모든 레이어를 강조, "복사 레이어 스타일"을 선택하고 다른 화면 스타일을 적용하려면 "붙여 넣기 레이어 스타일"을 선택 층.
    5. 더 발색 층을 형광 신호를 시각화하는 발색 층 (즉, 톨루이딘 블루)의 - 경우에 따라, 불투명도 (40 % 내지 10 변화 값)을 감소시킨다.
      주 :이 프로토콜에서 사용되는 기와 주사 현미경으로 촬상하여 각 라운드 동안 슬라이드에 발생할 수있는 회전의 양을 최소화 3 에지에 슬라이드를 보유하고있다. 따라서, 유도 된 이미지를 회전 할 필요없이 사용자가 직접 이미지를 정렬하기가 훨씬 쉽다이미지의 다른 라운드에서.

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Representative Results

높은 처리량, 멀티 이미지 Cryohistology을위한 일반 워크 플로

그림 1은이 기술에 사용되는 일반적인 작업을 나타냅니다. 이 영상 마지막 이미지 정렬 / 분석의 여러 라운드를 통해 고정에서 여러 단계를 포함한다. 일주일이 샘플의이 유형을 석회하는 데 걸리는 시간보다 적은 시간 영상 4 라운드를 통해 샘플 고정에서 이동으로이 과정은 조금 걸릴 수 있습니다. 촬상의 순서는 통상적으로 시편 이미 (등 GFPs, 광물 라벨) 후 형광 효소 활성 분석 하였다 다중화 형광 면역 (예., TRAP, AP 등) 인 내인성 신호로 시작 최종적으로 세포주기 분석 시험 법 (예를 들면, EDU) 및 발색 얼룩 완료 (예를 들어, 톨루이딘 블루 O, 끝단), O safranin atoxylin.

청소년 발목 공동 6에서 대표적인 예

이 특정 연구의 목적은 아킬레스 건 - 투 - 뼈 삽입 사이트 (즉, enthesis)의 섬유 연골의 광물과 콜라겐의 다른 유형 (즉, Col1a1, Col2a1,Col10a1)의 발현 사이의 상관 관계를 입증하는 것이 었습니다. 따라서 Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFPCol10a1-mcherry 포함한 트리플 형광 리포터 유전자 변형 마우스는 각 유전자를 발현하는 세포를 식별하기 위해 사용되었다. 영상의 첫 번째 라운드에 해당하는 2 주 된 마우스에서 내인성 유전자 발현의 때 아킬레스 건 (그림 4B)에서 enthesis의 mineralizes. 영상의 두 번째 라운드는 다음에 실시되었다광자 현미경은 두 개의 광자 두 번째 고조파 세대 (SHG, 그림 4C)를 통해 콜라겐 구조의 이미지를 수집합니다. 이 단계는 enthesis 내의 콜라겐 섬유의베이스 셀을 식별하기 위해 사용되었다. 이미지의 세 번째 라운드는 enthesis (그림 4D)의 광물을 촉진 메인 신호 리간드 중 하나 인 인도 고슴도치 (IHH)에 대한 면역 염색 단계이었다. 영상의 네 번째 라운드는 활성 미네랄 증착 (그림 4E)의 영역을 시각화, Cy5에 형광 파란색 발색 신호를 모두 이끌어 파란색 알칼리 포스 파타 아제 기판 키트를 사용하여 AP 염색했다. 마지막으로, 영상의 다섯 번째 라운드는 섬유 연골 (그림 4 층) 내에서 프로테오글리칸 내용을 포함하는 해부학 적 특징을 시각화 TB 염색했다. 모든 이미지는 수동으로 이미지 편집 소프트웨어 내에서 정렬했다. 촬상의 5 라운드 3을 따라 4 일 기간 동안 수행 된샘플 처리 및 절편 (7 일 전체) 일.

공동 성인 무릎 (11) 대표 예

이 실험의 목적은 전방 십자 인대 (ACL)의 절개를 통해 관절 불안정 다음 무릎 내측 측부 인대 (MCL)의 enthesis에서 발생하는 광물의 변화를 알아보고자 하였다. 광물 변경이 3 개월 된 생쥐에서 MCL enthesis 이르면이 같은 주 후 수술에서 볼 수 있습니다. enthesis 내 섬유 연골의 미네랄 동격를 모니터링하려면 미네랄 레이블은 이주 후 수술에서 수술 (demeclocycline)의 날에 마우스와 희생 (칼 세인) 전날에 주어졌다. 쥐도 unmineralized 및 광물 fibrochondrocyt의 콜라겐 발현을 모니터링하는 Col1a1-CFPCol10a1-mcherry 형광 기자를 포함에스 각각. 화상의 첫 번째 라운드이 경우, 형광 단백질 및 광물 형광 라벨 (도 5a)에 대응 내인성 신호이었다. 두 번째 라운드는 기본 골수 (그림 5B)에 enthesis의 무기질 fibrochondrocytes에서이 효소의 발현뿐만 아니라 파골 세포를 증명하기 TRAP 염색을 포함했다. 세 번째 라운드는 AP가 활성화 fibrochondrocytes의 광물뿐만 아니라 기본 뼈 (그림 5C)의 조골 세포의 영역을 보여주기 위해 염색했다. 마지막으로, TB 염색은 네 번째 라운드 (그림 5D)을 실시 하였다. 모든 이미지는 수동으로 이미지 편집 소프트웨어 내에서 정렬했다. 다시 한 번 이미지 정렬에 조직 수확에서의 총 시간을 7 일이었다.

원위 대퇴골에서 소주 성 뼈의 대표적인 예

(그림 3B)에 적용 하였다. 이 프로세스 (12)의 슬라이드의 총 수를 산출 8 여성 및 골수 내에서 3 가지 레벨의 8 수컷 마우스에서 수행 하였다. 기준 마커 (미소)는 골단 및 건조 섹션 (그림 3C)에 중반 골간 내에서 적용되었다. 모든 12 슬라이드 fo를 염색 하였다R 파란색과 영상 (도 6A)의 첫 번째 라운드 동안 축적 된 미네랄 (칼 세인 블루)과 광물 라벨 (칼 세인과 알리자린 complexone)에 대한 군데 칼 세인. 슬라이드는 다음 이미지의 세 번째 라운드의 두 번째 라운드와 AP 활동 (그림 6C)의 TRAP 활동 (그림 6B)에 대한 몇 군데 있었다. 마지막으로, 슬라이드는 네 번째 라운드 (그림 6D)에 톨루이딘 블루 염색 하였다. 기준 마커 발색 라운드를 포함한 모든 영상 라운드 동안 묘화하고, 커스텀 소프트웨어를 사용하여 정렬 하였다. 3 섹션은 각 블록에서 촬영 된 8 블록에 포함 된 절차 32 뼈 (16 대퇴골 16 척추)에 대한 처리량에 대한 아이디어를 제공하기 위해, 섹션 (12)의 슬라이드에 분산시키고, 12 슬라이드는 4 번 군데 있었다 합성 화상 (96) 스택을 생성한다. 이 실험을 수행 할 수있는 총 시간 8 일이었다.


의정서 그림 1. 일반적인 워크 플로우. 일반 단계는 1) 조직 고정, 2) 테이프 안정화 냉동 절편, 유리 슬라이드에 녹화 섹션 3) 준수, 기준 마커 4) 응용 프로그램, 6 5) 여러 염색 라운드 등) 포함 이미징 및 7) 이미지 조립, 정렬 및 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 높은 처리량 임베딩 테이프 안정화 동시에 cryotape 제공 안정성 여러 뼈 (AB) 서로 인접 삽입 될 수 있기 때문이다. 냉동 절편과 단면 (CD). 드라이 아이스 조각은시 사용과정을 포함하는 것은 엄격하게 이전에 전체 냉동 블록 (B)를 동결하는 장소에서 뼈를 고정합니다. cryotape이 블록 (C)에 출시되며, 섹션 (D)를 절편 동안 테이프에 붙어 남아있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
유리 슬라이드, 슬라이드 주사 현미경의 트레이에 참조 마커의 적용 및 프레젠테이션의로드를 녹화 섹션의 그림 3. 준수는.로 녹화 부분은 UV 경화 또는 키토산 계 접착제 중 하나와 유리 슬라이드의 표면 (A에 붙어있다 ). 경화 또는 건조 후, 접착제의 얇은 층은 평면 cryotape 유리 표면 (B) 사이에 유지된다. 기준 월KERS는 건조 슬라이드 (C가, 화살표 지점이 미세 용액 드롭하는)에 적용됩니다. 슬라이드가 다음 현미경 트레이 (D)에 장착 및 현미경 (E)에로드됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 2 주 된 마우스에서 아킬레스 힘줄의 이미징의 5 라운드가. 복합 이미지 스택 (A)는 영상의 5 라운드에서 만들어졌습니다. 1 라운드 (B) : 내생 Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFPCol10a1-mcherry의 유전자 식입니다. 두 광자 현미경에 콜라겐 두 번째 고조파 세대 (SHG) 2 라운드 (C). 3 라운드 (D) : IHH에 대한 면역 염색. 라운드 4(E) : AP 효소 활성. 라운드 5 : 톨루이딘 블루 O (F). 이 그림은 Dyment 등의 알에서 수정되었습니다. 2015 년 6. 스케일 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 공동 불안정화에 따라 MCL Enthesis의 영상의 네 라운드. 무릎이 MCL의 enthesis의 증가 광물로 이어지는 3 개월 된 쥐에서 불안정했다. 희생 전날 부여 된 demeclocycline 미네랄 레이블은 수술과 칼 세인 미네랄 라벨의 날을 받았습니다. 1 라운드 (A) : 내생 Col1a1-CFP, demeclocycline와 칼 세인 미네랄 레이블 Col10a1-mcherry의 유전자 식입니다. 2 라운드 (B) </ strong>을 : TRAP의 효소 활성. 라운드 3 (C) : AP 효소 활동. 4 라운드 (D) : 톨루이딘 블루 O. 트랩과 AP 신호가 패널 BC에서 TB 신호의 위에 겹쳐졌다. 트랩 버퍼가 demeclocycline 라벨을 제거하는 조직을 decalcifies 때문에 황색 TRAP 채널에 대해 다시 사용될 수있다. 이 수치는 Dyment 등의 알에서 수정되었습니다. 2015 년 11. 스케일 바 = 200 μm의. 민주 : demeclocycline, TRAP : 주석산 내성 산성 포스 파타 아제, AP : 알칼리 포스 파타 아제, MCL : 내측 측부 인대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6. 마이크로 스피어 참조 마커를 포함하는 원위 대퇴골 내에서 이미지의 네 라운드. 3 개월 된 마이크전자는 칼 세인과 알리자린의 complexone 미네랄 레이블을 받았다 라운드 1 (AA ').뿐만 아니라 내생 칼 세인과 alizarain의 complexone 레이블 축적 된 미네랄의 블루 염색을 칼 세인하는 2 라운드 (BB.') : TRAP의 효소 활성 3 라운드 (CC '). :. AP의 효소 활성 라운드 4 (DD ')가 (화살표는 모든 이미지에 동일한 미세이고, 톨루이딘 블루 O. 녹색 미소는 A'-D) 각 라운드 동안 몇 군데 있었다'. 스케일 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

키토산 접착제 UV 경화형 접착제
접착기구 증발 UV중합
경화 시간 > 24 시간 <20 분
섹션은 접착제 경화 후에 제거 할 수 있습니까? 아니
접착제를 용해을 치료합니까? 예, 낮은 pH와 산성 용액에 아니
접착제는 열 항원 검색을 견딜 수 있는가? 아니
접착제 자동 형광인가? 아니 UV 범위에서 최소

키토산 접착제 UV 경화 접착제 사이의 비교를 표 1

Cryotape 테이프 반송 시스템
이 시스템을 사용하여 섹션 광물 뼈에 가능? 광물 뼈의 예,하지만 조각슬라이드에 완전히 양도 할 수 없습니다
이 시스템을 사용하여 섹션 광물 관절에 가능?
이 시스템을 사용하여 섹션 뇌 가능? 네,하지만 조직은 이미지의 여러 라운드 후 테이프 떨어져 떨어질 수 있습니다
가능한 같은 블록에 포함 된 여러 샘플을 잘라?
가능한 같은 섹션에 영상의 여러 라운드를 수행하는 방법?

Cryotape 시스템 및 테이프 전송 시스템 간 표 2. 비교

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Discussion

여기에서 우리는 공동 현지화 및 단일 섹션에 염색 / 영상의 여러 라운드에서 이미지를 정렬하여 여러 가지 생물학적 조치를 정량화하기위한 세부 cryohistology 프로토콜을 제시 하였다. 이 섹션 조직에 어려운 형태 (예를 들어, 광물 뼈와 연골을) 유지로 cryotape을 사용하여 설명하는 방법은 특히 유용합니다. 또한, 단면 조직은 동일한 부의 염색 / 영상 여러 발사를 허용 유리 슬라이드에 단단히 부착되고; 시리얼 섹션은 각각의 다른 프로토콜로 염색하는 전통적인 방법과는 달리. , 섹션 사이의 공동 현지화 신호에 스테인드 여러 라운드로 이미지화 된 하나의 섹션이 문제가되지 않습니다 뭔가를 시도 할 때 문제를 제기 할 수 있습니다 시리얼 섹션을 사용.

시장 최초의 테이프 - 안정화 된 조직 절편 생성물 테이프 이송 시스템 (16), (17)이다.이 코팅 된 플라스틱 테이프를 사용티슈 cryoblock의 표면 상에 배치 된 저온 접착제. 테이프 밑의 저온 유지 장치 블레이드 상처는 부분은 테이프에 손상 및 부착 제거됩니다. 이어서 테이프 티슈 견고 슬라이드에 부착이되도록 UV 경화형 접착제로 코팅 슬라이드로 다운 샘플 측에 배치된다. 테이프가 떨어진 부분에서 울렸다되면, 슬라이드 또는 형광 발색 중 조직학을 위해 처리 될 수있다. 접착제의 배경 형광이 낮고, 염색의 여러 라운드 및 이미지는 대부분의 부드러운 조직과 잘 작동합니다. 유리 슬라이드에 접착 테이프로부터 조직을 전송할 때 광물 부와, 미네랄 단편의 손실이있을 수있다. 또한, 상기 저온 유지 장치 (> $ 8,000) 및 소모품 비용을 설치하는 비교적 고가 시스템 (> $ 2 / 슬라이드) 고되어있다.

닥터 Tadafumi 모토가 개발 다른 테이프 안정화 전략은 사용접착제 코팅 된 폴리 비닐 리덴 클로라이드 필름 조직 절편을 캡처한다. 자신의 프로토콜에서, 냉동 조직은 테이프에 구분되며, 즉시 PFA 또는 에탄올 (18)에 고정. 이어서, 테이프를 염색 한 후 현미경 검사를위한 다운 샘플면을 유리 슬라이드 상에 장착. 따라서 각 염색 프로토콜은 다른 녹화 부에서 수행된다.

우리는 수정 매립 전에 포르말린의 샘플을 고정 포함한 다양한 방식으로 모토 프로토콜에 부가 하였다. 이 단계는 세포의 범위 내에서 트랜스 제닉 동물의 가용성 세포질 GFP를 해결하는 것이 매우 중요하다. 우리는 조직 유형 5-13에서 다양한 cryotape를 이용했다. 제한된 조직 학적 경험과 실험실 요원은이 방법으로 고품질의 섹션을 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 상대적으로 저렴한 비용 (특수 장비, <슬라이드 당 $ 1.00)이며, 광물 조각의 손실,와 기능은 동일 섹션에 염색 및 이미징의 여러 라운드를 수행 할 수 있습니다.

반복에서 슬라이드 여러번 동일한 영역을 촬상하는 경우에도 모터 스테이지를 사용하여 슬라이드 다수 부당 것이기 때문에,이 프로토콜의 다른 중요한 단계는 일관성 및 스루풋을 증가시키는 슬라이드 주사 현미경의 이용이다. 현미경은 표면 형광 및 투과광 모두에서 작동하는 디지털 슬라이드 스캐너입니다. 그것은 10 위치 동력 포탑 모두 B & W 및 컬러 카메라가 장착되어 있습니다. 시스템의 새로운 사실​​, 우리의 손에서 특정 관심 영역을 신속하고 용이하게 사용자가 정의하거나 이미징 소프트웨어에 의해 자동적으로 검출 될 수 있다는 것이다. 관심이 지역은 영상의 첫 번째 라운드에서 저장 한 다음 이후의 라운드 중에 신속하게 다시로드 할 수 있습니다. 따라서 관심의 동일한 영역은 영상의 각 라운드 동안 몇 군데 있습니다. 사용자 -에 근거소프트웨어에 정의 된 매개 변수는 현미경 자동 초점과 관심의 영역 내에서 취득하는 동안 스티치되는 타일 이미지를 검색합니다.

사용자가 염색 여러 차례 수행되는 순서는 중요하다. 일반적인 순서는도 1에서 설명된다. 충분히 형광 현미경을 통해 분리 될 수있는 형광 물질의 수는 주어진 섹션에 취득 할 수 대응책들의 수 주요 제한 요인이다. 그러나, 형광은 특정 채널의 경우 재사용 할 수있다. 예를 들어, 청색 및 칼 세인 demeclocycline 모두 옐로우 채널에 강한 신호 TRAP 활성을 측정하는 데 방출한다. 이 블리드 스루는 TRAP 버퍼하여 TRAP 활성을 묘화하기 전에 광물 제거 섹션을 decalcifies 때문에 비록 회피된다. 또한, DAPI를 Counterstain과 마찬가지로 옐로우 채널 방출된다. 그러나, 사용자가 다른 일 Counterstain과 함께 DAPI를 대체 할전자 빨간색 또는 원적외선 범위. 또한, 항체는 제거 될 수 있고, 동일한 형광 채널을 이용하여 다른 항체를 재 염색. 따라서,이 방법은 주어진 섹션에 기록 할 수 대응책의 수를 증가시키는 매우 융통성이다.

제시된 프로토콜에 특정 제한 사항이 있습니다. 1) cryotape 특정 조직에 충분히 준수하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 포르말린 고정 뇌 섹션 염색의 여러 라운드 후 테이프를 떨어지는 경향이있다. 조직은 UV 활성화 접착제 (두 방법 사이의 비교는 표 2 참조)을 통해 유리 표면에 부착 될 때 이와 같은 조직의 경우, 테이프 반송 시스템이 더 적합 할 수있다. 투명 광학 특성을 제공하면서 2) 키토산 접착제, 고온 또는 강산을 포함하는 가혹한 처리 단계를 생존 할 것이다. 따라서, UV 활성화 접착제는 이러한 애플리케이션에 더 적합하다 (표 1 참조 F이 두 접착제 사이 또는 비교).

여기에 제시된 cryohistological 프로토콜은 또한 더 높은 처리량 및 자동화에 자신을 빌려. 비교적 초보자 처리량이 크게 증가하고, 동일한 블록에서 한번에 여러 뼈 또는 관절을 절단하는 예를 들어, cryotape 의해 제공된 테이프 안정화 허용한다. 자동화 된 스캐너를 사용하여 상당히 통상적으로 경험에서 속도 제한 단계왔다 촬상에 관련된 기술자 시간 및 비용을 감소시킨다. 조직의 자동화 객관적인 분석을위한 플랫폼을 제공 단시간에 지속적이고 안정적​​으로 화상 관심 여러번 동일한 영역에있게된다. 사실, 우리 그룹은 컴퓨터로 자동 정렬 및 뼈의 조직 형태 측정을위한 플랫폼을 개발했다. 첫째, 소프트웨어는 형광 기준 마커에 따라 이미지의 복수의 원을 정렬. 그리고, 정렬 된 이미지는 조직 형태 파이프 여기서 자동 생산에 공급어 소프트웨어는 관심 영역을 정의하고 객관적으로 여러 정적 및 동적 측정 (에서 더 볼 수 측정 www.bonebase.org) 13. 이 플랫폼은 때문에 cryotape의 절편, 디지털 슬라이드 스캐닝 현미경, 맞춤 분석 소프트웨어가 제공하는 증가 된 처리량과 일관성으로 가능하게되었다. 이 프로토콜은 높은 처리량 cryohistology에서 중요한 발전을 나타내며, 조직 절편과 경험들뿐만 아니라 뼈 같은 부분의 조직에 어려운 그 영상에 사용이어야한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Multiple suppliers available.
PBS Sigma Aldrich P5368 Multiple suppliers available.
Cryomolds Fisher Scientific Fisherbrand #22-363-554 Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix Thermo Scientific 6769006 Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane Sigma Aldrich M32631 Multiple suppliers available.
Cryostat Leica Biosystems 3050s Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc Leica Biosystems 14037008587 Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades Thermo Scientific 3051835 Can be substituted with other brands/models.
Cryotape Section Lab Cryofilm 2C
Roller Electron Microscopy Sciences 62800-46 Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides Electron Microscopy Sciences 71890-01 Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides Thermo Scientific 3051 Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61 Norland Optical Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light General Electric F15T8-BLB
Glacial acetic acid Sigma Aldrich ARK2183 Multiple suppliers available.
Chitosan Sigma Aldrich C3646 Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres ThermoFisher Scientific I-14787
InSpeck green microspheres ThermoFisher Scientific I-14785
Calcein Blue Sigma Aldrich M1255 Multiple suppliers available.
Calcein Sigma Aldrich C0875  Multiple suppliers available.
Alizarin complexone Sigma Aldrich A3882  Multiple suppliers available.
Demeclocycline Sigma Aldrich D6140  Multiple suppliers available.
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761 Multiple suppliers available.
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate ThermoFisher Scientific E-6588
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific R37108 Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous Sigma Aldrich S2889 Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate  Sigma Aldrich T6521 Multiple suppliers available.
Sodium nitrite Sigma Aldrich S2252 Multiple suppliers available.
Tris Sigma Aldrich 15504 Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate Sigma Aldrich M9272 Multiple suppliers available.
NaCl Sigma Aldrich S7653 Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt Sigma Aldrich F8764 Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX  Sigma Aldrich N4875 Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide Sigma Aldrich D158550 Multiple suppliers available.
Toluidine blue O Sigma Aldrich T3260 Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1 Carl Zeiss AG Axio Scan.Z1 Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set Chroma Technology Corp. 49000
CFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49001
GFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49020
YFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set Chroma Technology Corp. custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set Chroma Technology Corp. 49004
Cy5 Filter Set Chroma Technology Corp. 49009
CryoJane Tape Transfer System Electron Microscopy Sciences 62800-10 Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows Electron Microscopy Sciences 62800-72 Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides Electron Microscopy Sciences 62800-4X Multiple suppliers available.

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References

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