À haut débit, multi-images Cryohistology de minéralisés Tissues

Biology

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Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L., Hong, S. H., Adams, D. J., Ackert-Bicknell, C., Shin, D. G., Rowe, D. W. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (115), e54468, doi:10.3791/54468 (2016).

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Abstract

Introduction

La recherche biologique nécessite souvent phénotypage efficace, qui est souvent associée à une sorte d'analyse histologique 1-3. Ce besoin est encore plus évident avec les projets ambitieux de perturber chaque gène dans le génome de la souris 4. Ces analyses histologiques peuvent varier d'évaluer la morphologie des cellules et / ou des caractéristiques anatomiques de l'expression de la cartographie de gènes ou de protéines spécifiques aux cellules individuelles. En fait, l'un des apports fondamentaux de l'histologie au domaine de la génomique est la possibilité d'associer un signal moléculaire spécifique à une région ou d'une cellule de type spécifique.

Les méthodes traditionnelles de l'histologie, en particulier pour les tissus musculo-squelettiques, sont souvent longue et laborieuse, nécessitant parfois des semaines pour fixer, détartrer, section, tache, et l'image de l'échantillon, puis d'analyser les images via l'interprétation humaine. L' analyse des signaux moléculaires multiples, que ce soit par immunohistochimie, hybridizat in situion, ou des colorations spéciales, nécessite de multiples sections et même des échantillons multiples pour effectuer de manière appropriée. En outre, ces réponses multiples ne peuvent pas être co-localisés à la même cellule et parfois ne peuvent pas être co-localisée à une région spécifique dans un échantillon donné. Comme le domaine de la génomique et épigénomique se déplace dans l'ère numérique, le champ histologique doit également suivre pour fournir efficace, à haut débit, et l'analyse automatisée d'une variété de signaux moléculaires dans une coupe histologique unique.

En effet, il existe une demande pour une amélioration des techniques histologiques qui peuvent associer des signaux moléculaires multiples à des cellules spécifiques dans un échantillon donné. Récemment, nous avons publié un nouveau haut-débit méthode cryohistological pour évaluer plusieurs mesures d'intervention au sein d' une section donnée de tissu minéralisé 5-14. Le procédé consiste à stabiliser la cryosection avec cryotape congelé, faire adhérer l'article collé de façon rigide sur une lame de microscope, etla réalisation de plusieurs cycles de coloration et de l'imagerie sur chaque section. Ces séries d'images sont ensuite alignées manuellement ou grâce à l' automatisation de l' ordinateur avant l'analyse de l' image (figure 1). Ici, nous présentons des protocoles détaillés de ce processus et de fournir des exemples où ces techniques ont amélioré notre compréhension des différents processus biologiques.

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Protocol

L'Université du Connecticut Health Center protection des animaux et l'utilisation comité a approuvé toutes les procédures animales.

1. Fixation and Embedding

  1. Euthanasier l'animal via CO 2 asphyxie ou d' autres méthodes approuvées.
  2. Récolter le tissu d'intérêt (par exemple, des membres, des vertèbres, etc.) et dans 10% du formol tamponné neutre à 4 ° C jusqu'à ce que fixé correctement. Faites attention à maintenir le placement anatomique cohérente avant la fixation. Par exemple, fixer des membres avec des joints à la flexion constante, la rotation interne et rotation externe des angles 11. En règle générale, fixer des membres entiers de souris pour 1 - 3 jours.
    Attention: Formol est toxique et doit être manipulé dans une hotte, tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
    Remarque: Le délai de la fixation dépend de la taille de l'échantillon. Si l'expérience permet, coupe ouverte l'os permettra d'améliorer la fixation du compartiment de la moelle.Certains échantillons peuvent nécessiter une perfusion de fixation 15 afin de minimiser fond fluorescent (par exemple, des signaux de fluorescence faibles à l'intérieur de la moelle osseuse).
  3. Transfert des spécimens de formaline à 30% de saccharose made in 1x PBS et incuber pendant 12-24 heures à 4 ° C.
    Note: Une fois mis à incuber pendant 12-24 heures, les échantillons peuvent alors être placés à -80 ° C pour le stockage à long terme. Cette méthode de stockage est recommandé pour des expériences dans lesquelles les chercheurs ont l' intention d'intégrer plusieurs échantillons dans le même bloc , mais ne peuvent pas récolter tous ces échantillons en même temps (par exemple, des expériences avec de multiples points de temps).
  4. Retirer les échantillons du saccharose et disséquer les tissus en excès.
  5. Remplir un cryomoule (taille du moule dépend de la taille de l'échantillon) une partie du chemin avec cryo milieu d'inclusion. Placer l'échantillon dans le moule de telle sorte que plan de coupe de la région d'intérêt est parallèle au fond du moule.
    Note: Un exemple de placement de tissu spécifique et de l'orientationpeut être trouvé dans la figure 2A - B.
  6. Placez le cryomoule sur un morceau de glace sèche jusqu'à ce qu'une mince couche de cryo enrobage gèle moyennes et fixe ensuite l'échantillon en place. Remplissez le reste du volume du cryomoule avec cryo milieu d'inclusion tout en maintenant la cryomoule sur le culot de glace carbonique.
  7. Placez le cryomoule dans un récipient contenant du 2-méthyl-butane pré-refroidi par de la glace sèche. Une fois que les échantillons sont complètement gelés, enlever cryomoules et secouer l'excédent de 2-méthyl-butane. Enveloppez cryomoules en cellophane et placer dans un -20 ° C ou -80 ° C congélateur pour le stockage.
    Note: Les échantillons peuvent sécher au fil du temps lorsqu'ils sont stockés dans cryo milieu d'inclusion, en particulier à -20 ° C. Nous vous recommandons le stockage des échantillons pendant plus de 1 - 2 mois en cryo milieu d'inclusion à -80 ° C ou à 30% de saccharose à -80 ° C (voir l'étape 1.3).

2. Sectionnement Tissue Tape-stabilisé

  1. Retirer les blocs d'échantillons du congélateur et placer dans cryostat avec la température réglée entre -20 et -25 ° C.
  2. Retirez le bloc de la cryomoule et couper l'excès de cryo intégration moyenne avec une lame de rasoir.
  3. Placer un certain milieu cryogène enrobage sur le disque de spécimen, puis aligner le bloc de telle sorte que la surface du disque d'échantillon est parallèle à la surface inférieure du bloc établissant ainsi le plan de coupe approprié pour la région d'intérêt.
  4. Placez le disque de l'échantillon dans le cryostat et permettre la cryo enrobage moyen de geler.
  5. Placez le disque de l'échantillon sur la tête de l'objet et d'ajuster la tête de telle sorte que la lame coupe parallèles à la surface du bloc de l'échantillon.
  6. Coupez le bloc vers le bas à un niveau dans la région d'intérêt et de brosser les copeaux de la surface du bloc.
  7. Coupez un morceau de l'cryotape assez grand pour couvrir la région d'intérêt et de pré-refroidissement dans le cryostat.
    Remarque: Plusieurs pièces peuvent être coupées de tailles cohérentes et stockées dans le cryostau cours de la coupe.
  8. Retirer support non-adhérente du cryotape en saisissant la bande par les onglets non-collante argent / or en utilisant une pince, puis placer le ruban sur le bloc collant vers le bas.
  9. Appliquer une pression sur la cryotape l' aide du rouleau (figure 2C).
  10. Faire une section (5-8 pm) en utilisant soit le moteur automatique ou roue de coupe manuelle du cryostat.
    Note: Il est recommandé de maintenir le bord de la cryotape comme il vient sur ​​la scène de telle sorte que la section ne tombe pas hors de la scène pendant la coupe (figure 2D).
  11. Placer le côté section de tissu sur une lame de microscope en plastique à l'intérieur du cryostat.
  12. Retirer la lame plastique du cryostat et laisser le milieu cryogène enrobage à l'état fondu de telle sorte que la partie adhère à la surface de la lame.
  13. Répétez la coupe pour les sections de série ou d'autres régions d'intérêt.
  14. Une fois terminé, stocker les sections dans une boîte de diapositives at 4, -20 ou -80 ° C en fonction de la durée de stockage nécessaire et que les mesures d'intervention en aval. Par exemple, utiliser des diapositives qui vont être colorées pour l'activité enzymatique (voir 05/02 à 05/03) dans un mois si elle est conservée à 4 ° C.

3. Adhérence des articles à Microscope Slides

  1. méthode adhésif à séchage UV.
    1. Étiquette de la lame de microscope.
      Remarque: Pour une automatisation accrue, des échantillons et des diapositives peuvent être étiquetés avec des codes-barres.
    2. Appliquer une goutte de colle optique activé par UV à deux lames de verre et en utilisant le bord d'une lame en matière plastique pour étaler une mince couche d'adhésif sur la surface des lames de verre.
    3. Couper l'onglet argent / or et de jeter le côté enregistré section de tissu sur l'adhésif de la première diapositive. Appliquer la section dans un mouvement de roulis d'un bord à l'autre afin de minimiser la formation de bulles piégées en dessous de la bande.
      NOTE: La première diapositive est utilisé pour pré-mouiller la face inférieure de til tape avant de le placer sur la deuxième diapositive (permanent) (étape 3.1.4).
    4. Retirer la section enregistrée depuis la première diapositive et placez - le sur la couche d'adhésif de la deuxième glissière (figure 3A). Encore une fois, prenez soin d'éviter d'emprisonner des bulles.
      REMARQUE: Cette étape prend la pratique à maîtriser.
    5. Une fois que le nombre approprié de sections pour l'expérience donnée est placée sur chaque diapositive, essuyez l'excédent de colle des zones environnantes.
    6. Inspectez chaque section près de bulles ou de fibres en dessous de la bande. Effectuez cette inspection sous un verre de microscope ou loupe. S'il y a des obstructions, retirez la section individuelle, enlever les obstacles, puis réappliquer à la lame de verre.
    7. Une fois qu'il est déterminé qu'il n'y a aucun obstacle dans les sections soudées, placer les lames de microscope sous la lumière noire UV pendant 5 - 10 min pour réticuler l'adhésif.
  2. Procédé adhésif chitosan.
    1. Préparer ee 1% adhésive chitosane. Préparer une solution d'acide acétique en dissolvant 0,25 ml d'acide acétique concentré dans 100 ml d'eau déminéralisée (0,25% v / v). Dissoudre 1 g de poudre de chitosane dans 100 ml d'une solution d'acide acétique et on agite la solution O / N ou jusqu'à ce que toute la poudre de chitosan est dissous.
      NOTE: La solution est stable à la température ambiante.
    2. Déposer une goutte de solution de chitosane pour chaque section qui sera placé sur la diapositive.
    3. Couper l'onglet argent / or de la bande et placer chaque côté du tissu de la section enregistrée vers le haut sur ​​l'adhésif (figure 3A). Utilisez grand soin pour éviter d'emprisonner des bulles.
    4. Une fois que toutes les sections sont placées sur la diapositive, inclinez le glisser vers le haut sur un de ses bords longs et faites glisser chitosane excessive sur le bord inférieur en utilisant une pince.
    5. Placer les lames dans cette orientation, sur une serviette en papier dans une boîte coulissante. Gravity va alors provoquer l'excès de chitosane à tomber sur la serviette, ce qui donne une couche plate et uniforme de chitosane.
    6. PlaÇe la boîte de diapositives avec son couvercle maintenue ouverte dans le réfrigérateur O / N pour permettre le chitosane sécher.
      NOTE: Voir le tableau 1 pour une comparaison entre les deux méthodes adhésives.

4. Application des marqueurs de référence aux diapositives

  1. Préparer une solution de marqueur de référence en dissolvant 50 ul de vert et de 50 ul de microsphères rouges dans 100 pl d'eau. Conserver la solution dans l'obscurité à 4 ° C.
  2. Placez une pointe de pipette 10 pi ou 20 pi dans la solution de microsphère. Ajouter une petite goutte de la solution de la microsphère à chaque section adjacente à la région d'intérêt (figure 3C). Faites attention à ne pas obtenir les microsphères dans la région d'intérêt.
  3. Sécher les lames à RT (abri de la lumière) pendant 30 min, si le traitement des diapositives sur ce jour-là. Sinon, placez les lames dans une boîte de glissement à 4 ° C.
    Nota: Tant que la solution de microsphère sèche avant l'hydratation des diapositives, le microspheres resteront adhéré aux diapositives pendant plusieurs cycles de coloration / imagerie.

5. Rounds multiples de Coloration

NOTE: En choisissant une séquence compatible avec l'imagerie, la coloration, et les étapes de réimagerie, il est possible de détecter et de co-localiser de nombreux signaux biologiques sur la même coupe de tissu. Chaque tour de l'imagerie / coloration / réimagerie doit être mis au point pour la question histologique particulier. La séquence d' imagerie / coloration / réimagerie implique généralement l' acquisition des signaux fluorescents endogènes (par exemple, la GFP cellulaire, des colorants de minéralisation, in vivo des sondes d'imagerie) sur le premier tour de l' imagerie suivie par immunocoloration multiplexé fluorescent et plusieurs cycles de taches d'activité enzymatique. Enfin, la section peut être teinté en utilisant des colorants chromogènes (par exemple, H & E, toluidine bleu, safranine O, etc.) pour mettre en évidence l'architecture tissulaire. Présenté dans cette section sont des méthodes personnalisées adaptées deles protocoles disponibles dans le commerce.

  1. Calcéine coloration bleu pour minéraux accumulés
    NOTE: calcéine coloration au bleu donne une surface minérale cohérente qui se prête à l'analyse automatisée de l'image à la différence de contraste darkfield ou interférence différentiel (DIC) imagerie. Le problème avec coloration au bleu calcéine est que le spectre fluorescent chevauche la tétracycline et l' étiquetage demeclocycline. Par conséquent, si l'échantillon contient ces étiquettes minérales, image les étiquettes dans le premier tour de l' imagerie avant la coloration avec le bleu de calcéine.
    1. Si les signaux endogènes dans le tissu sont imagées avant cette étape de coloration, submerger les diapositives de la ronde d'imagerie précédente dans un bocal de Coplin remplie de 1xPBS jusqu'à ce que les lamelles tombent loin des diapositives. Retirer et sécher les lamelles.
    2. Préparer 30 mg / ml de solution de bleu de calcéine à 2% de NaHCO 3 (préparée en dissolvant 2 g de NaHCO3 dans 100 ml d' H 2 O et s'adaptertion à un pH de 7,4 avec HCl). Aliquoter et stocker la solution à -20 ° C.
    3. Immerger les lames dans un bocal de Coplin contenant 1x PBS pendant 15 minutes pour hydrater les sections, sinon déjà hydraté du tour précédent.
    4. Retirez les diapositives et sécher le dos et les bords avec une serviette en papier.
    5. Appliquer 100 - 500 pi de solution de bleu de calcéine par lame et incuber pendant 10 min dans une chambre humide à température ambiante.
    6. Rincer les lames dans 1x PBS pendant 10 min avec 3 changements.
    7. Appliquer ~ 200 pi de 50% de glycérol dans du PBS 1X à chaque diapositive et monter la lamelle.
    8. Enlever l'excès de glycérol et sécher le fond des diapositives.
  2. Phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP) enzymatique de coloration de l' activité
    NOTE: TRAP est exprimée par plusieurs types de cellules dans la lignée hématopoïétique, y compris les ostéoclastes. La coloration TRAP présentée ici utilise un substrat de la phosphatase acide jaune fluorescent. Certains signaux fluorescents seront ovERLAP avec le jeu de filtre jaune personnalisé y compris les étiquettes de tétracycline / demeclocycline de minéralisation, calcéine bleuissement et DAPI de contraste.
    1. Immerger les lames de la ronde d'imagerie précédente dans un bocal de Coplin remplie 1x PBS jusqu'à ce que les lamelles tombent loin des diapositives. Retirer et sécher les lamelles.
    2. Préparer le tampon 1, en dissolvant 9,2 g d'acétate de sodium anhydre et 11,4 g de tartrate de sodium dibasique dihydraté dans de l'eau et en portant le volume final à 1000 ml. Ajuster le pH à 4,2 avec de l'acide concentré acétique glacial (environ 1,5 - 2 ml). Conserver la solution à 4 ° C pendant jusqu'à 12 mois.
    3. Préparer le tampon 2 en dissolvant 40 mg de nitrite de sodium dans l'eau et en portant le volume final à 1 ml. Conserver la solution à 4 ° C pendant 1 semaine.
    4. Le jour de la coloration, préparer le tampon de réaction en mélangeant 7,5 ml de tampon 1 et 150 ul de tampon 2.
    5. Appliquer le tampon de réaction sans le substrat à la glissières pendant 10 - 15 minutes pour équilibrer le tissu au pH inférieur.
      NOTE: Le volume typique est ~ 200 pi, mais doit être suffisamment large pour couvrir toutes les sections.
    6. On dilue le substrat fluorescent de la phosphatase acide jaune entre 1:50 et 1: 100 dans le tampon de réaction.
      REMARQUE: La dilution sera dictée par l'activité de TRAP dans l'échantillon.
    7. Verser le tampon de réaction hors des glissières et d'appliquer le tampon de réaction avec le substrat fluorescent jaune sur les lames.
    8. Placer les lames sous la lumière noire UV pour ~ 5 min pour activer le substrat.
      NOTE: Le temps d'incubation peut varier en fonction de l'activité de TRAP dans l'échantillon.
    9. Rincer les lames dans 1x PBS pendant 10 min avec 3 changements.
    10. Appliquer ~ 200 pi de 50% de glycérol dans du PBS 1X à chaque diapositive et monter la lamelle.
    11. Enlever l'excès de glycérol et sécher le fond des diapositives.
      REMARQUE: Le tampon de TRAP acide sera détartrer les sections. L'avantage supplémentaire de l'decalcification est que certaines couleurs seront à nouveau disponibles pour la coloration aval (par exemple, des étiquettes de minéralisation). Par exemple, la coloration au bleu de calcéine sera supprimé lors de la coloration TRAP. Par conséquent, DAPI de contraste peut être imagée dans ce canal pendant un tour ultérieur.
  3. La phosphatase alcaline (AP) activité enzymatique coloration
    REMARQUE: plusieurs types de cellules impliquées dans la minéralisation, y compris les ostéoblastes et chondrocytes minéralisateurs exprimer AP. Le substrat Fast Red utilisé dans ce protocole suscite à la fois un signal fluorescent rouge et chromogène rouge. De ce fait, le substrat chromogène sera étancher des signaux fluorescents dans les régions où le substrat précipite. Par conséquent, il est préférable de faire cette tache après l'imagerie des signaux fluorescents qui peuvent être trempés par le substrat AP.
    1. Immerger les lames de la ronde d'imagerie précédente dans un bocal de Coplin remplie 1x PBS jusqu'à ce que les lamelles tombent loin des diapositives. Remove et sécher les lamelles.
    2. Préparer Tris 1 M en dissolvant 12,1 g de Tris dans 100 ml d'eau. Ajuster le pH à 9,5 avec 1 M de NaOH.
    3. Préparer 1 M MgCl 2 hexahydraté en dissolvant 20,33 g de MgCl 2 dans 100 ml d'eau déminéralisée.
    4. Préparer NaCl 2 M en dissolvant 11,68 g de NaCl dans 100 ml d'eau déminéralisée.
    5. Préparer 100x (20 mg / ml) solution mère de Fast Red TR sel en dissolvant 1 g de poudre dans 50 ml d'eau déminéralisée. Faire 100 aliquotes ul et conserver à -20 ° C.
    6. Préparer 100x (10 mg / ml) de solution de naphtol AS-MX phosphate en dissolvant 500 mg de poudre dans 50 ml de N, N diméthylformamide. Faire 100 aliquotes ul et conserver à -20 ° C.
    7. Le jour de la coloration, la préparation du tampon AP en ajoutant 1 ml de Tris 1 M, 0,5 ml de 1 M de MgCl2, 0,5 ml de NaCl 2 M et amener le volume final à 10 ml avec de l' eau déminéralisée (concentration finale: 100 mM tris, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl).
    8. Placez AP buffer sur chaque lame et incuber dans une chambre humide pendant 10 min à température ambiante.
    9. Préparer un tampon de substrat AP en diluant 100x stocks de Fast Red TR Sel et naphtol AS-MX à 1x dans le tampon AP.
    10. Verser le tampon AP off de diapositives et remplacer avec un tampon de substrat de AP. Incuber les lames pendant 5 - 10 minutes dans une chambre humide à la température ambiante.
      NOTE: Le temps d'incubation sera dictée par l'activité AP de l'échantillon.
    11. Laver les lames 3x 1x PBS pendant 5 minutes chacun.
    12. Monter le couvercle glisse avec une solution DAPI de contre-coloration (1: 1000 dilution de DAPI dans 50% de glycérol dans 1x PBS).
  4. O bleu Toluidine (TB) coloration chromogène
    NOTE: Parce que toutes les étapes précédentes sont imagés dans le montage aqueux temporaire dans 50% de glycérol / solution PBS, l'étape chromogène est également reproduite dans des conditions aqueuses. Cependant, la solution de coloration peut avoir tendance à lixivier au fil du temps. Par conséquent, il est suggéré à l'image du bleu de toluidine le plus tôt possible après coloration.
    1. Immerger diapositives de tour précédent d'imagerie dans un bocal de Coplin remplie d'eau déminéralisée jusqu'à ce que les lamelles tombent loin des diapositives. Retirer et sécher les lamelles.
    2. Après avoir enlevé les lamelles, remplacer l'eau douce et incuber les lames pendant au moins 10 minutes afin que les sels de PBS sont suffisamment éliminés du tissu.
    3. Préparer la solution de TB 0,025% dans l'eau déminéralisée.
    4. Placer les lames dans la solution de TB pendant 1 - 5 min.
      NOTE: Le temps d'incubation dépend de la préférence de l'utilisateur, mais doit rester cohérente dans tous les échantillons.
    5. Placer les lames dans le récipient du Coplin avec toboggans et de lavage désionisée 3x pendant 5 minutes chacun.
    6. Mont lamelle avec 30% de glycérol dissous dans de l' eau déminéralisée (PAS 1x PBS car cela provoquerait la tache de lessivage à partir du tissu). REMARQUE: Glycérine moyen de montage peut être substitué par un sirop de fructose, ce qui contribue à empêcher la diffusion du colorant à partir du tissu. Àpréparer le sirop de fructose, on dissout 30 g de fructose dans 10 ml d'eau déminéralisée et on chauffe à 60 ° C jusqu'à dissolution.

6. Rounds multiples d'imagerie

  1. Charger les lames dans les plateaux de microscope (Figure 3D).
    Remarque: Les plateaux sont à ressort.
  2. Insérer les plateaux dans la pile de plateaux du microscope à balayage à glissière (figure 3E).
  3. Cliquez sur la liste des profils pour charger un profil pour chaque diapositive avec des temps d'exposition appropriés pour chaque fluorophore. Cliquez sur le nom de la diapositive pour nommer chaque diapositive manuellement ou le logiciel lire le code-barres sur l'étiquette de la diapositive. Cliquez sur le bouton de démarrage aperçu de balayage pour prendre une image d'aperçu de la diapositive.
  4. Définissez les régions d'intérêt dans l'assistant de détection des tissus et les enregistrer pour les cycles suivants de l'imagerie. Une fois que chaque diapositive est configuré, démarrer le processus d'analyse en cliquant sur le bouton de balayage de départ.
    Remarque: Le système peut contenir jusqu'à 100 slides à la fois.
  5. Une fois que l'imagerie est terminée, exporter les images de chaque canal et de l'imagerie ronde individuelle comme .tif ou .jpg pour l'assemblage et l'analyse d'images.

7. Photo Assemblée

  1. Méthode manuelle en utilisant Photoshop (ou un logiciel de retouche d'image similaire capable de produire des images en couches).
    1. Ouvrez chaque image individuelle de canal de chaque tour d'imagerie.
    2. Assembler les images individuelles en tant que couches au sein d'une image composite. Pour ce faire, cliquez sur le calque dans la palette de couches d'une image. Ensuite, faites glisser la couche sur une autre image. Cette opération de glisser-déposer va créer une nouvelle couche dans l'image. Pour ce faire, pour toutes les autres images. Vous pouvez également utiliser un script (Fichier> Scripts> Fichiers de charge dans la pile ...) pour automatiser ce processus en chargeant plusieurs fichiers image sous forme de couches dans une pile d'images.
    3. Une fois que chaque image est répertorié comme une couche individuelle dans l'image composite, double-cliquez sur le nom du calque pour renommer le layers que nécessaire pour discerner les différents canaux.
    4. Afin de voir à travers chaque couche et créer une image vraiment composite, changer le mode de fusion pour chaque couche de "Normal" à "Screen" dans la palette des calques.
      Remarque: Pour accélérer cette étape, changer une seule couche à l'écran, puis cliquez-droit sur la couche, sélectionnez "style de calque de copie", puis mettez en surbrillance toutes les autres couches et sélectionnez "pâte style de calque" pour appliquer le style de l'écran à l'autre couches.
    5. Si vous le souhaitez, diminuer l'opacité (changement de la valeur à 10-40%) de la couche chromogène (c. -à- bleu de toluidine) pour mieux visualiser les signaux fluorescents à travers la couche chromogène.
      Remarque: le microscope à balayage en mosaïque utilisé dans ce protocole contient les diapositives sur 3 bords, ce qui réduit la quantité de rotation qui peut se produire à la lame au cours de chaque cycle de formation d'image. Par conséquent, il est beaucoup plus facile pour l'utilisateur d'aligner manuellement les images sans avoir à faire pivoter les images dérivéesà partir de différents cycles de formation d'image.

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Representative Results

Un flux de travail général pour le haut-débit, multi-images Cryohistology

La figure 1 représente le processus général utilisé pour cette technique. Il comprend plusieurs étapes de fixation à travers plusieurs cycles de l'imagerie et enfin l'image d'alignement / analyse. Le processus peut prendre aussi peu que d'une semaine pour aller de l'échantillon fixation à travers 4 séries d'imagerie, ce qui est moins de temps qu'il ne faut pour détartrer ces types d'échantillons. L'ordre de l'imagerie commence généralement avec les signaux endogènes qui sont déjà dans l'échantillon (par exemple, GFP, étiquettes de minéralisation, etc.), puis immunomarquage fluorescent multiplexé suivi par fluorescence des essais d'activité enzymatique (par exemple., TRAP, AP, etc.) et cycle cellulaire des essais d'analyse (par exemple, EdU) et enfin se termine par une tache chromogène (par exemple, le bleu de toluidine O, hematoxylin, safranine O, etc.).

Exemple représentatif d'un juvénile cheville 6

Le but de cette étude était de démontrer la corrélation entre l' expression de différents types de collagène ( par exemple, COL1A1, COL2A1 et Col10a1) avec minéralisation du fibrocartilage du site du tendon d' Achille à l' os insertion (ie, enthèse). Par conséquent, une souris transgénique fluorescent triple rapporteur y compris COL1A1-GFPTpz, Col2a1-CFP et Col10a1-mcherry a été utilisé pour identifier les cellules exprimant chaque transgène. Le premier tour de l' imagerie est de l'expression du transgène endogène à partir d' une souris à deux semaines d'âge, ce qui correspond au moment où les minéralise enthèse du tendon d' Achille (figure 4B). Le second tour de l'imagerie a ensuite été menée sur lamultiphotonique microscope pour acquérir des images de l'architecture du collagène par l' intermédiaire de deux photons génération de second harmonique (SHG, la figure 4C). Cette étape a été utilisée pour identifier les cellules à la base des fibres de collagène dans la enthésique. Le troisième tour de l' imagerie a été une étape immunocoloration pour Indian hedgehog (IHH), qui est l' un des principaux ligands de signalisation qui favorise la minéralisation de l'enthèse (Figure 4D). La quatrième manche de l' imagerie a été coloration AP utilisant un kit de substrat de la phosphatase alcaline bleue, ce qui provoque à la fois la fluorescence Cy5 et signaux chromogènes bleus, de visualiser des zones de dépôt minéral actif (Figure 4E). Enfin, la cinquième ronde de l' imagerie a été TB coloration pour visualiser les caractéristiques anatomiques , y compris le contenu des protéoglycanes dans le fibrocartilage (Figure 4F). Toutes les images ont été alignées manuellement dans le logiciel de retouche d'image. Les cinq tours de l'imagerie ont été réalisées sur une période de 4 jours, qui a suivi 3jours de traitement des échantillons et la coupe (7 jours au total).

Exemple représentatif d'un genou adulte mixte 11

Le but de cette expérience était de déterminer les changements de minéralisation qui se produisent dans l'enthèse du ligament collatéral médial (MCL) du genou suivant déstabilisation commune via transection du ligament croisé antérieur (LCA). changements de minéralisation peut être vu aussi tôt que deux semaines après la chirurgie de la MCL dans ces 3 mois des souris âgées. Pour surveiller l'apposition minérale de fibrocartilage au sein de l'enthèse, une étiquette minérale a été donné aux souris le jour de la chirurgie (demeclocycline) et le jour avant le sacrifice (calcéine) à 2 semaines après la chirurgie. Les souris comprenaient également COL1A1-PCP et Col10a1-mcherry reporters fluorescents pour surveiller l' expression du collagène de fibrochondrocyt non minéralisé et minéralisées, respectivement. Le premier tour de l' imagerie était des signaux endogènes, qui dans ce cas correspondaient aux protéines fluorescentes et les étiquettes de minéralisation fluorescentes (Figure 5A). Le second tour inclus TRAP coloration pour démontrer l' expression de cette enzyme dans fibrochondrocytes minéralisateurs dans le enthèse ainsi que ostéoclastes dans l'os sous - jacent osseuse (figure 5B). Le troisième tour était AP coloration pour démontrer les régions de minéralisation active de fibrochondrocytes ainsi que les ostéoblastes de l'os sous - jacent (Figure 5C). Enfin, la tuberculose coloration a été réalisée pour le quatrième tour (figure 5D). Toutes les images ont été alignées manuellement dans le logiciel de retouche d'image. Encore une fois, le temps total pris de la récolte des tissus à l'alignement de l'image était de 7 jours.

Exemple représentatif de l' os trabéculaire de Distal Fémur

(figure 3B). Ce processus a été menée sur 8 femmes et 8 souris mâles à 3 niveaux différents au sein de la moelle osseuse, ce qui donne un nombre total de 12 diapositives. Les marqueurs de référence (microsphères) ont été appliquées dans l'épiphyse et le milieu diaphyse sur les parties sèches (figure 3C). Les 12 lames ont été colorées for calcéine bleu et imagé pour minéral accumulé (bleu de calcéine) et les étiquettes de minéralisation (calcéine et alizarin complexone) lors du premier tour de l' imagerie (figure 6A). Les lames ont ensuite été imagées pour l' activité de TRAP (figure 6B) dans le deuxième tour et l' activité AP (Figure 6C) au troisième tour de l' imagerie. Enfin, les lames ont été colorées avec du bleu de toluidine dans la quatrième ronde (Figure 6D). Les marqueurs de référence ont été imagées au cours de chaque cycle d'imagerie, y compris la ronde chromogène, et ont été alignées à l'aide du logiciel personnalisé. Pour donner une idée du débit pour cette procédure, 32 os (16 fémurs et 16 vertèbres) ont été intégrés dans 8 blocs, 3 sections ont été prises à partir de chaque bloc, les sections ont été distribuées dans 12 diapositives, et les 12 diapositives ont été imagées 4 fois produisant 96 piles d'images composites. Le temps total pour effectuer cette expérience a été de 8 jours.


Figure 1. Flux de travail typique pour le protocole. Étapes générales comprennent 1) la fixation des tissus, 2) bande stabilisée cryosectioning, 3) l' adhésion des sections soudées à des lames de verre, 4) application de marqueurs de référence, 5) des cycles multiples de coloration et 6) imagerie, et 7) l' assemblage de l' image, l' alignement et l' analyse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Enrobage à haut débit et de bande stabilisée Cryosectioning. En raison de la stabilité de la cryotape fournit plusieurs os peuvent être intégrés adjacents les uns aux autres (AB) et sectionnée en même temps (CD). Un morceau de glace sèche est utilisée au cours de laprocessus enrobage pour fixer rigidement les os en place avant la congélation de la totalité de cryo-bloc (B). Le cryotape est enroulé sur le bloc (C) et la section reste collée à la bande pendant la coupe (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Respect des sections étanchées à lames de verre, Application de référence Marqueurs, et chargement des diapositives dans le magasin de Microscope Slide-balayage. Sections étanchées sont collées à la surface des lames de verre soit avec durcissement UV ou un adhésif à base de chitosane (A ). Après le durcissement ou le séchage, seule une mince couche, plat de colle reste entre la surface de cryotape et le verre (B). Référence markers sont appliqués sur des lames sèches (C, flèche à goutte de solution de microsphère). Les lames sont ensuite montés dans des plateaux de microscope (D) et chargés dans le microscope (E). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Cinq rounds suivants de l' imagerie du tendon d' Achille d'une souris à deux semaines d'âge. La pile d'image composite (A) a été créé à partir de cinq tours de l' imagerie. Round 1 (B): endogène COL1A1-GFPTpz, Col2a1-CFP et Col10a1-mcherry expression du transgène. Tour 2 (C): génération de seconde harmonique du collagène (SHG) sur le microscope à deux photons. Round 3 (D): immunocoloration pour IHH. Round 4(E): activité enzymatique AP. Round 5: O bleu toluidine (F). Ce chiffre a été modifié depuis Dyment et al., 2015 6. Barre d'échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Quatre rounds de Imaging de MCL Enthesis Après Déstabilisation mixte. Knees ont été déstabilisées chez les souris à trois mois, conduisant à une minéralisation accrue de l'enthèse MCL. Une étiquette minérale demeclocycline a reçu le jour de la chirurgie et une étiquette minérale calcéine a été donné le jour avant le sacrifice. Round 1 (A): endogène COL1A1-CFP, Col10a1-mcherry expression du transgène avec demeclocycline et calcéine étiquettes minérales. Round 2 (B) </ Strong>: activité enzymatique de TRAP. Round 3 (C): activité enzymatique AP. Round 4 (D): le bleu de toluidine O. Le TRAP et le signal AP a été superposées au - dessus du signal de la tuberculose dans les panneaux BC. Le canal jaune peut être utilisé à nouveau pour TRAP parce que le tampon de TRAP décalcifier le tissu, retirer l'étiquette de demeclocycline. Ce chiffre a été modifié depuis Dyment et al., 2015 11. Barre d'échelle = 200 um. Dem: demeclocycline, TRAP: tartrate résistant à la phosphatase acide, PA: phosphatase alcaline, MCL: ligament collatéral médial. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Quatre rounds de Imaging au sein de Distal Fémur contenant microsphères marqueurs de référence. Trois-month-old mice ont reçu calcéine et alizarin complexone étiquettes minérales Round 1 (AA '):. calcéine et alizarain complexone étiquettes endogènes en plus de calcéine coloration au bleu de minéraux accumulés Round 2 (BB.): activité enzymatique de TRAP Round 3 (CC'). :. activité enzymatique AP Round 4 (DD '): le bleu de toluidine O. les microsphères vertes ont été imagées au cours de chaque cycle (A'-D', flèche indique la même microsphère dans toutes les images). Barre d' échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

adhésif chitosane adhésif durcissant aux UV
mécanisme adhésif Évaporation UVPolymérisation
Le temps de durcissement > 24 h <20 min
Les sections peuvent être enlevés après adhésif durcit? Oui Non
Est guéri dissoluble adhésif? Oui, dans des solutions acides à faible pH Non
Est-ce que l'adhésif résiste récupération d'antigène de la chaleur? Non Oui
Est-adhésif auto-fluorescent? Non Minimal dans la gamme UV

Tableau 1. Comparaison entre Chitosan adhésif et adhésif durcissant aux UV

Cryotape Système de bande-transfert
Possibilité de section osseuse minéralisée en utilisant ce système? Oui Oui, mais des morceaux d'os minéraliséne peut pas transférer complètement à la diapositive
Possibilité de section joints minéralisées en utilisant ce système? Oui Oui
Possibilité de section du cerveau en utilisant ce système? Oui, mais le tissu peut tomber de la bande après plusieurs tours de l'imagerie Oui
Possibilité de couper plusieurs échantillons embarqués dans le même bloc? Oui Oui
Possibilité d'effectuer plusieurs tours de l'imagerie sur la même section? Oui Oui

Tableau 2. Comparaison entre le système et le système Cryotape Tape-transfert

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Discussion

Ici, nous avons présenté un protocole de cryohistology détaillé pour co-localiser et quantifier plusieurs mesures biologiques en alignant les images provenant de plusieurs cycles de coloration / imagerie sur une seule section. La méthode décrite à l' aide de la cryotape est particulièrement utile car il conserve la morphologie des tissus difficiles à la section (par exemple, os minéralisé et le cartilage). En outre, le tissu sectionné adhère fermement à la lame de verre, ce qui permet plusieurs cycles de coloration / formation d'image de la même section; contrairement aux méthodes traditionnelles où des coupes en série sont chacun colorés avec un protocole différent. Utilisation des sections en série peut poser un problème lors de la tentative de co-localiser les signaux entre les sections, ce qui est pas un problème avec les sections individuelles qui ont été colorées et imagées avec plusieurs tours.

Le premier tissu produit sectionnant de bande stabilisée sur le marché était un système de transfert de bande 16, 17. Il utilise la bande de matière plastique revêtuavec un adhésif à froid qui est placé sur la surface de la cryoblock tissulaire. Lorsque la lame coupe de cryostat sous la bande, la section est retirée intacte et adhérente à la bande. Ensuite, la bande est placée côté échantillon vers le bas sur les lames qui sont enduites avec de la colle durcissant aux UV de sorte que le tissu devient solidaire du coulisseau. Une fois que la bande est tintait loin de la section, la lame peut être traitée soit pour la fluorescence ou l'histologie chromogène. La fluorescence des adhésifs de fond est faible et que des cycles multiples de coloration et d'imagerie fonctionne bien avec la plupart des tissus mous. Cependant, avec des sections minéralisées, il peut y avoir perte de fragments minéraux lors du transfert du tissu du ruban adhésif sur les lames de verre. En outre, il est un système relativement coûteux à installer dans le cryostat (> 8.000 $) et les coûts de consommables sont élevés (2> $ / slide).

Une autre stratégie de stabilisation de bande développée par le Dr Tadafumi Kawamoto utilise unFilm adhésif revêtu de chlorure de polyvinylidène pour saisir la section de tissu. Dans leur protocole, un tissu frais congelé est sectionnée sur la bande et immédiatement fixé PFA ou de l' éthanol 18. Par la suite, la bande est colorée et monté sur une lame de verre avec la face vers le bas de l'échantillon pour l'examen microscopique. Ainsi, chaque protocole de coloration est réalisée sur une section enregistrée différente.

Nous avons modifié et ajouté au protocole Kawamoto dans un certain nombre de façons, y compris la fixation de l'échantillon dans du formol avant l'enrobage. Cette étape est essentielle pour fixer la GFP cytoplasmique soluble d'animaux transgéniques dans les limites de la cellule. Nous avons utilisé le cryotape pour un large éventail de types de tissus 5-13. Le personnel de laboratoire ayant une expérience histologique limitée peuvent produire des sections de haute qualité avec cette méthode. Les principaux avantages de ce protocole sont le faible coût relatif (pas d'instrumentation spéciale, <1,00 $ par diapositive), aucune perte de fragments minéraux,et la possibilité d'effectuer plusieurs cycles de coloration et d'imagerie sur la même section.

Parce que l'imagerie des mêmes régions d'une diapositive à plusieurs reprises dans la répétition serait déraisonnable pour un grand nombre de diapositives, même en utilisant une platine motorisée, une autre étape cruciale de ce protocole est l'utilisation d'une lame de microscope à balayage pour augmenter la cohérence et le débit. Le microscope est un scanner de diapositives numérique qui fonctionne sous deux épifluorescence et la lumière transmise. Il est équipé d'une tourelle 10 positions motorisée et les deux B & W et des caméras couleur. La véritable nouveauté du système, en nos mains, est que certaines régions d'intérêt peuvent être rapidement et facilement définis par l'utilisateur ou automatiquement détectés par le logiciel d'imagerie. Ces régions d'intérêt peuvent être enregistrés à partir du premier tour de l'imagerie, puis rechargées rapidement au cours des tours suivants. Par conséquent, les mêmes régions d'intérêt sont imagés au cours de chaque cycle de l'imagerie. Sur la base par l'utilisateurparamètres définis dans le logiciel, le microscope sera mise au point automatique et numériser des images en mosaïque qui sont cousues lors de l'acquisition dans les régions d'intérêt.

L'ordre par lequel l'utilisateur effectue les cycles multiples de coloration est importante. L'ordre général est décrit dans la figure 1. Le nombre de fluorophores qui peuvent être séparés suffisamment par microscopie à fluorescence est le principal facteur limitant le nombre de mesures d'intervention qui peuvent être acquis sur une section donnée. Cependant, les canaux fluorescents peuvent être réutilisés dans certains cas. Par exemple, la calcéine bleu et demeclocycline deux émettent un signal fort dans le canal jaune utilisé pour mesurer l'activité de TRAP. Cette purge est évitée grâce à bien parce que le tampon de TRAP décalcifier la section, ce qui élimine le minéral avant l'imagerie de l'activité de TRAP. En outre, DAPI de contraste émet dans le canal jaune aussi. Toutefois, l'utilisateur peut remplacer DAPI avec une autre contre-coloration au ièmee rouge ou rouge lointain gamme. En outre, les anticorps peuvent être retirés et re-colorées avec des anticorps différents en utilisant les mêmes canaux fluorescents. Par conséquent, cette méthode est tout à fait adaptable à augmenter le nombre de mesures d'intervention qui peuvent être enregistrées sur une section donnée.

Il y a certaines limitations avec le protocole présenté. 1) Le cryotape peut ne pas adhérer suffisamment à certains tissus. Par exemple, des coupes de cerveau fixées au formol ont tendance à tomber de la bande après plusieurs cycles de coloration. Pour les tissus tels que, le système de transfert de bande peut être plus approprié que le tissu est collé à la surface du verre par l' intermédiaire d' adhésif activé-UV (voir le tableau 2 pour la comparaison entre ces deux méthodes). 2) L'adhésif chitosane, tout en offrant des propriétés optiques transparentes, ne survivra pas à des étapes de traitement sévères qui incluent des températures élevées ou des acides forts. Par conséquent, l'adhésif activé par les UV est plus approprié pour ces applications (voir le Tableau 1 fou la comparaison entre ces deux adhésifs).

Les protocoles cryohistological présentés ici se prêtent également à un débit plus élevé et de l'automatisation. Par exemple, la stabilisation de la bande fournie par le cryotape permet aux utilisateurs relativement novices à couper plusieurs os ou des articulations à la fois dans le même bloc, ce qui augmente considérablement le débit. L'utilisation d'un scanner automatisé réduit considérablement le temps de technicien et les coûts liés à l'imagerie, qui a généralement été l'étape de limitation de vitesse dans notre expérience. Être en mesure de manière cohérente et fiable l'image de la même région d'intérêt à plusieurs reprises dans un court laps de temps fournit une plate-forme automatisée, analyse objective des tissus. En fait, notre groupe a développé une plate-forme pour l'alignement automatisé par ordinateur et histomorphométrie de l'os. Tout d'abord, le logiciel permet d'aligner les multiples séries d'images sur la base des marqueurs de référence fluorescents. Ensuite, les images alignées sont introduits dans un pipeline histomorphométrie où le computer logiciel définit la région d'intérêt et objectivement mesure plusieurs mesures statiques et dynamiques (voir plus à www.bonebase.org) 13. Cette plate-forme a été rendue possible en raison du débit accru et de la cohérence fournie par le tronçonnage de cryotape, numérique lame de microscope à balayage, et un logiciel d'analyse personnalisée. Ce protocole représente une avancée significative dans la haute cryohistology de débit et devrait être utile à ceux imagerie difficile aux tissus de section tels que les os, ainsi que ceux inexpérimentés avec sectionnement des tissus.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Multiple suppliers available.
PBS Sigma Aldrich P5368 Multiple suppliers available.
Cryomolds Fisher Scientific Fisherbrand #22-363-554 Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix Thermo Scientific 6769006 Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane Sigma Aldrich M32631 Multiple suppliers available.
Cryostat Leica Biosystems 3050s Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc Leica Biosystems 14037008587 Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades Thermo Scientific 3051835 Can be substituted with other brands/models.
Cryotape Section Lab Cryofilm 2C
Roller Electron Microscopy Sciences 62800-46 Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides Electron Microscopy Sciences 71890-01 Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides Thermo Scientific 3051 Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61 Norland Optical Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light General Electric F15T8-BLB
Glacial acetic acid Sigma Aldrich ARK2183 Multiple suppliers available.
Chitosan Sigma Aldrich C3646 Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres ThermoFisher Scientific I-14787
InSpeck green microspheres ThermoFisher Scientific I-14785
Calcein Blue Sigma Aldrich M1255 Multiple suppliers available.
Calcein Sigma Aldrich C0875  Multiple suppliers available.
Alizarin complexone Sigma Aldrich A3882  Multiple suppliers available.
Demeclocycline Sigma Aldrich D6140  Multiple suppliers available.
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761 Multiple suppliers available.
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate ThermoFisher Scientific E-6588
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific R37108 Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous Sigma Aldrich S2889 Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate  Sigma Aldrich T6521 Multiple suppliers available.
Sodium nitrite Sigma Aldrich S2252 Multiple suppliers available.
Tris Sigma Aldrich 15504 Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate Sigma Aldrich M9272 Multiple suppliers available.
NaCl Sigma Aldrich S7653 Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt Sigma Aldrich F8764 Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX  Sigma Aldrich N4875 Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide Sigma Aldrich D158550 Multiple suppliers available.
Toluidine blue O Sigma Aldrich T3260 Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1 Carl Zeiss AG Axio Scan.Z1 Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set Chroma Technology Corp. 49000
CFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49001
GFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49020
YFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set Chroma Technology Corp. custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set Chroma Technology Corp. 49004
Cy5 Filter Set Chroma Technology Corp. 49009
CryoJane Tape Transfer System Electron Microscopy Sciences 62800-10 Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows Electron Microscopy Sciences 62800-72 Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides Electron Microscopy Sciences 62800-4X Multiple suppliers available.

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References

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