उच्च throughput, mineralized ऊतकों की बहु छवि Cryohistology

Biology

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Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L., Hong, S. H., Adams, D. J., Ackert-Bicknell, C., Shin, D. G., Rowe, D. W. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (115), e54468, doi:10.3791/54468 (2016).

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Abstract

Introduction

जैविक अनुसंधान अक्सर कुशल phenotyping, जो अक्सर ऊतकीय विश्लेषण 1-3 के कुछ प्रकार के साथ जुड़ा हुआ है की आवश्यकता है। इस जरूरत को माउस जीनोम 4 में प्रत्येक जीन को बाधित करने के लिए और भी अधिक महत्वाकांक्षी परियोजनाओं के साथ स्पष्ट है। ये ऊतकीय विश्लेषण विशिष्ट जीन या व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए प्रोटीन का मानचित्रण अभिव्यक्ति के लिए सेल आकृति विज्ञान और / या शारीरिक विशेषताओं का आकलन करने से लेकर कर सकते हैं। वास्तव में, ऊतक विज्ञान के मौलिक योगदान जीनोमिक्स के क्षेत्र में से एक एक विशिष्ट क्षेत्र या सेल प्रकार के लिए एक विशिष्ट आणविक संकेत संबद्ध करने की क्षमता है।

विशेष रूप से मांसपेशियों के ऊतकों के लिए ऊतक विज्ञान के पारंपरिक तरीकों, अक्सर समय लेने वाली और श्रमसाध्य है, कभी कभी ठीक करने के लिए सप्ताह की आवश्यकता होती है, अम्लो व्दारा कैल्सियम, अनुभाग, दाग, और छवि नमूना तो मानव व्याख्या के माध्यम से छवियों का विश्लेषण। कई आणविक संकेतों का विश्लेषण, immunohistochemistry के माध्यम से चाहे, सीटू hybridizat मेंआयन, या विशेष दाग, उचित रूप से प्रदर्शन करने के लिए कई वर्गों और यहां तक ​​कि कई नमूनों की आवश्यकता है। इसके अलावा, इन कई प्रतिक्रियाएं एक ही सेल सह-स्थानीय नहीं किया जा सकता है और कभी कभी दिए गए नमूने के भीतर एक विशिष्ट क्षेत्र के लिए सह-स्थानीय नहीं किया जा सकता। जीनोमिक्स और epigenomics क्षेत्र डिजिटल युग में ले जाता है के रूप में, ऊतकीय क्षेत्र में भी कुशल, उच्च throughput, और एक एकल ऊतकीय अनुभाग के भीतर आणविक संकेतों की एक किस्म की स्वचालित विश्लेषण प्रदान करने के लिए सूट का पालन करना चाहिए।

वास्तव में, वहाँ सुधार ऊतकीय तकनीक है कि दिए गए नमूने के भीतर विशिष्ट कोशिकाओं को कई आणविक संकेतों संबद्ध कर सकते हैं के लिए एक मांग है। हाल ही में, हम mineralized ऊतक 5-14 से किसी दिए गए खंड के भीतर कई उपायों की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक नई उच्च throughput cryohistological विधि प्रकाशित किया है। प्रक्रिया जमे हुए cryotape साथ cryosection स्थिर, एक खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए सख्ती से पालन करने टेप खंड शामिल है, औरधुंधला और प्रत्येक खंड पर इमेजिंग के कई दौर का आयोजन। छवियों के इन दौर तो स्वयं या कंप्यूटर स्वचालन छवि विश्लेषण करने से पहले (चित्रा 1) के माध्यम से जुड़ रहे हैं। यहाँ, हम इस प्रक्रिया का विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद है और जहां इन तकनीकों विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है उदाहरण देते हैं।

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Protocol

कनेक्टिकट स्वास्थ्य केंद्र संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी।

1. फिक्सेशन और एम्बेडिंग

  1. सीओ 2 asphyxiation या अन्य अनुमोदित विधियों के माध्यम से पशु euthanize।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10% तटस्थ बफर formalin में ब्याज के ऊतकों (जैसे, अंग, कशेरुकाओं, आदि) और जगह फसल जब तक ठीक से तय की। प्रायर निर्धारण करने के लिए लगातार शारीरिक नियुक्ति को बनाए रखने के लिए विशेष ध्यान रखना। उदाहरण के लिए, लगातार बल, आंतरिक रोटेशन पर जोड़ों के साथ अंग ठीक है, और बाहरी रोटेशन कोण 11। 3 दिन - आमतौर पर, 1 के लिए पूरे माउस अंग ठीक।
    सावधानी: Formalin विषैला होता है और जब तक उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने एक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए।
    नोट: निर्धारण की समय सीमा नमूना के आकार पर निर्भर करता है। प्रयोग की अनुमति देता है, तो हड्डी खुला काटने मज्जा डिब्बे के निर्धारण में सुधार होगा।कुछ नमूनों फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि (अस्थि मज्जा के भीतर जैसे, बेहोश फ्लोरोसेंट संकेतों) को कम करने के छिड़काव निर्धारण 15 आवश्यकता हो सकती है।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा - स्थानांतरण 30% सूक्रोज 1x पीबीएस में बनाया गया है और 12 के लिए सेते formalin से नमूनों।
    नोट: एक बार 12 के लिए incubated - 24 घंटा, नमूनों तो लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। भंडारण की यह विधि प्रयोगों में जो शोधकर्ताओं ने एक ही ब्लॉक में कई नमूने एम्बेड करने का इरादा रखते हैं, लेकिन एक ही समय में इन नमूनों के सभी फसल नहीं कर सकते हैं के लिए सिफारिश की है (जैसे, कई बार अंक के साथ प्रयोग)।
  4. सुक्रोज से नमूनों निकालें और किसी भी अतिरिक्त ऊतक दूर काटना।
  5. एक cryomold भरें (मोल्ड के आकार नमूना आकार पर निर्भर है) क्रायो embedding मध्यम के साथ जिस तरह का हिस्सा है। मोल्ड में नमूना जगह ऐसी है कि ब्याज के क्षेत्र के लिए विमान काटने मोल्ड के नीचे के साथ समानांतर है।
    नोट: विशिष्ट ऊतक नियुक्ति और उन्मुखीकरण का एक उदाहरणचित्रा 2A में पाया जा सकता है - बी।
  6. सूखी बर्फ के एक टुकड़े पर cryomold क्रायो embedding मध्यम जमा देता है की एक पतली परत तक जगह जगह और बाद में नमूना ठीक करता है। क्रायो embedding मध्यम जबकि सूखी बर्फ गोली पर cryomold बनाए रखने के साथ cryomold की शेष मात्रा भरें।
  7. एक कंटेनर से युक्त 2-मिथाइल-ब्यूटेन सूखी बर्फ से पूर्व ठंडा में cryomold रखें। एक बार जब नमूनों पूरी तरह से जमे हुए हैं, cryomolds निकालें और अतिरिक्त 2-मिथाइल-ब्यूटेन हिला दिया था। लपेटें सिलोफ़न और जगह में cryomolds एक -20 डिग्री सेल्सियस या -80 भंडारण के लिए सेल्सियस फ्रीजर।
    नोट: नमूने समय के साथ बाहर शुष्क कर सकते हैं जब क्रायो embedding माध्यम में संग्रहीत है, विशेष रूप से -20 डिग्री सेल्सियस पर। क्रायो -80 डिग्री सेल्सियस पर या -80 डिग्री सेल्सियस पर 30% sucrose में मध्यम embedding में 2 महीने (1.3 चरण देखें) - हम अब से 1 के लिए नमूने के भंडारण सलाह देते हैं।

2. टेप स्थिर ऊतक सेक्शनिंग

  1. फ्रीजर से नमूना ब्लॉक को हटाने और cryosta में जगहतापमान -20 और -25 डिग्री सेल्सियस के बीच सेट के साथ टी।
  2. cryomold से ब्लॉक निकालें और एक रेजर ब्लेड के साथ मध्यम embedding अतिरिक्त क्रायो दूर ट्रिम।
  3. नमूना डिस्क पर कुछ क्रायो embedding मध्यम प्लेस और फिर ब्लॉक ऐसी है कि नमूना डिस्क की सतह जिससे ब्याज के क्षेत्र के लिए उचित काटने विमान की स्थापना ब्लॉक के नीचे की सतह के समानांतर है संरेखित।
  4. cryostat में नमूना डिस्क की जगह और क्रायो embedding फ्रीज करने के लिए माध्यम के लिए अनुमति देते हैं।
  5. नमूना सिर पर नमूना डिस्क की जगह और सिर ऐसी है कि ब्लेड कटौती नमूना ब्लॉक की सतह के समानांतर समायोजित करें।
  6. ब्याज के क्षेत्र के भीतर एक स्तर पर ब्लॉक नीचे ट्रिम और ब्लॉक की सतह से किसी भी छीलन को ब्रश।
  7. cryotape काफी बड़े हित और cryostat में पूर्व ठंड के क्षेत्र को कवर करने का एक टुकड़ा काट।
    नोट: एकाधिक टुकड़े अनुरूप आकार की कटौती की जा सकती है और संग्रहीत cryost भीतरसेक्शनिंग के दौरान कम से।
  8. संदंश का उपयोग तो नीचे ब्लॉक चिपचिपा पक्ष पर टेप जगह गैर चिपचिपा चांदी / सोने टैब द्वारा टेप लोभी द्वारा cryotape से गैर पक्षपाती समर्थन निकालें।
  9. Cryotape रोलर (चित्रा -2) का उपयोग करने के लिए दबाव लागू करें।
  10. (- 8 माइक्रोन 5) या तो स्वत: मोटर या cryostat के मैनुअल काटने पहिया का उपयोग कर एक खंड बनाओ।
    नोट: यह cryotape के किनारे पकड़ के रूप में यह मंच पर आता है कि इस तरह के खंड सेक्शनिंग (चित्रा 2 डी) के दौरान मंच से गिर नहीं करता है अच्छा अभ्यास है।
  11. खंड ऊतक ऊपर की ओर cryostat के भीतर एक प्लास्टिक खुर्दबीन स्लाइड पर रखें।
  12. cryostat से प्लास्टिक स्लाइड निकालें और क्रायो embedding मध्यम ऐसी है कि खंड स्लाइड की सतह का पालन करता है पिघला करने के लिए अनुमति देते हैं।
  13. धारावाहिक वर्गों या हित के अन्य क्षेत्रों के लिए सेक्शनिंग दोहराएँ।
  14. समाप्त होने पर, एक स्लाइड बॉक्स में एक वर्गों स्टोरT 4, -20 या -80 डिग्री सेल्सियस के लिए आवश्यक भंडारण की लंबाई और नीचे की ओर प्रतिक्रिया के उपायों पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, स्लाइड कि enzymatic गतिविधि के लिए दाग होने जा रहे हैं का उपयोग करें (5.2 देख - 5.3) एक महीने के भीतर अगर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।

3. खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए धारा के आसंजन

  1. यूवी का इलाज चिपकने वाला तरीका।
    1. खुर्दबीन स्लाइड लेबल।
      नोट: के लिए बढ़ा स्वचालन, नमूने और स्लाइड बारकोड के साथ लेबल किया जा सकता है।
    2. दो गिलास स्लाइड के लिए यूवी सक्रिय ऑप्टिकल चिपकने की एक बूंद लागू करें और गिलास स्लाइड की सतह भर में चिपकने की एक पतली परत प्रसार करने के लिए एक प्लास्टिक स्लाइड के किनारे का उपयोग करें।
    3. चांदी / सोने टैब काट दिया और पहली स्लाइड के चिपकने वाला टेप पर खंड ऊतक पक्ष रख। आदेश टेप के नीचे फँस बुलबुले के गठन को कम करने के लिए एक किनारे करने के लिए अन्य से एक रोलिंग गति में धारा लागू करें।
      नोट: पहली स्लाइड टी के नीचे पूर्व गीला करने के लिए प्रयोग किया जाता हैवह दूसरे (स्थायी) स्लाइड (कदम 3.1.4) पर रखने से पहले टेप।
    4. पहली स्लाइड से टेप खंड निकालें और दूसरी स्लाइड (चित्रा 3 ए) के चिपकने वाली परत पर जगह है। फिर, बुलबुले की फंसाने से बचने के लिए ध्यान रखना।
      नोट: यह कदम मास्टर करने के लिए अभ्यास लेता है।
    5. एक बार भी प्रयोग के लिए वर्गों की उपयुक्त संख्या प्रत्येक स्लाइड पर रखा गया है, आसपास के क्षेत्रों से अतिरिक्त चिपकने पोंछ।
    6. बुलबुले या फाइबर टेप के नीचे के लिए बारीकी से प्रत्येक अनुभाग का निरीक्षण किया। एक माइक्रोस्कोप या आवर्धक कांच के तहत इस निरीक्षण प्रदर्शन। अवरोधों देखते हैं, तो, व्यक्ति अनुभाग को हटाने के अवरोधों को दूर, और फिर गिलास स्लाइड करने के लिए इसे पुन: लागू।
    7. चिपकने वाला crosslink करने के लिए 10 मिनट - एक बार जब यह निर्धारित किया जाता है टेप धाराओं के तहत कोई अवरोधों देखते हैं कि, 5 के लिए यूवी काला प्रकाश के तहत खुर्दबीन स्लाइड जगह है।
  2. Chitosan चिपकने वाला तरीका।
    1. वें तैयारई 1% chitosan चिपकने वाला। 100 मिलीलीटर डि पानी में केंद्रित एसिटिक एसिड के 0.25 मिलीलीटर भंग द्वारा एसिटिक एसिड समाधान (0.25% वी / वी)। एसिटिक एसिड समाधान की 100 मिलीलीटर में chitosan पाउडर का 1 ग्राम भंग और हलचल समाधान हे / एन या जब तक सभी chitosan पाउडर भंग कर रहा है।
      नोट: समाधान आरटी पर स्थिर है।
    2. प्रत्येक अनुभाग कि स्लाइड पर रखा जाएगा के लिए chitosan समाधान की एक बूंद जमा।
    3. टेप की चांदी / सोने टैब कट और चिपकने वाला (चित्रा 3 ए) पर प्रत्येक अनुभाग टेप ऊतक ऊपर की ओर रखें। बुलबुले की फंसाने से बचने के लिए बड़ी सावधानी का प्रयोग करें।
    4. एक बार सभी वर्गों स्लाइड पर रखा जाता है, अपने लंबे किनारों में से एक पर स्लाइड ऊपर झुकाव और नीचे बढ़त संदंश का उपयोग करने के लिए अत्यधिक chitosan खींचें।
    5. एक स्लाइड बॉक्स में एक कागज तौलिया के शीर्ष पर इस उन्मुखीकरण में स्लाइड रखें। गुरुत्वाकर्षण तो chitosan के एक फ्लैट और वर्दी परत उपज, अतिरिक्त chitosan तौलिया पर नीचे गिर करने के लिए कारण होगा।
    6. पीएलएइसकी ढक्कन रेफ्रिजरेटर हे में खुला खड़ा के साथ स्लाइड बॉक्स सीई / एन chitosan सूखे के लिए अनुमति देते हैं।
      नोट: दो चिपकने वाला तरीकों के बीच एक तुलना के लिए 1 टेबल देखें।

स्लाइड्स के संदर्भ मार्करों के 4. आवेदन

  1. हरे रंग के 50 μl और पानी के 100 μl में लाल microspheres की 50 μl भंग द्वारा संदर्भ मार्कर समाधान तैयार है। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में समाधान स्टोर।
  2. microsphere समाधान में एक 10 μl या 20 μl pipet टिप रखें। प्रत्येक अनुभाग के हित के क्षेत्र (चित्रा 3 सी) के लिए आसन्न करने के लिए microsphere समाधान की एक छोटी बूंद जोड़ें। ब्याज के क्षेत्र के भीतर microspheres नहीं पाने के लिए सावधान रहें।
  3. 30 मिनट के लिए आरटी पर स्लाइड (प्रकाश से सुरक्षित) सूखी उस दिन स्लाइड प्रसंस्करण है। यदि नहीं, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड बॉक्स में स्लाइड्स जगह है।
    नोट: microsphere समाधान से पहले सूख जाता है जब तक स्लाइड hydrating के लिए, एमआईcrospheres धुंधला / इमेजिंग के कई दौर के दौरान स्लाइड का पालन रहेगा।

5. धुंधला की कई दौर

ध्यान दें: इमेजिंग, धुंधला, और reimaging कदम की एक संगत अनुक्रम का चयन करके, यह पता लगाने के लिए और एक ही ऊतक खंड पर कई जैविक संकेतों सह स्थानीय बनाना संभव है। इमेजिंग / धुंधला / reimaging के प्रत्येक दौर के विशेष ऊतकीय प्रश्न के लिए विकसित किया जाना है। इमेजिंग / धुंधला / reimaging अनुक्रम आम तौर पर इमेजिंग के पहले दौर फ्लोरोसेंट मल्टिप्लेक्स immunostaining और enzymatic गतिविधि दाग के कई दौर के द्वारा पीछा किया पर अंतर्जात फ्लोरोसेंट संकेतों (जैसे, सेलुलर GFP, खनिज रंजक, vivo इमेजिंग जांच) का अधिग्रहण शामिल है। अन्त में, खंड ऊतक वास्तुकला को उजागर करने chromogenic रंजक (जैसे, एच एंड ई, toluidine नीले, हे सैफरैनीन, आदि) का उपयोग दाग जा सकता है। इस खंड में प्रस्तुत कर रहे हैं कस्टम तरीकों से अनुकूलितव्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल।

  1. संचित खनिज के लिए Calcein नीले धुंधला
    नोट: Calcein नीले धुंधला एक सुसंगत खनिज सतह है कि विपरीत darkfield या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) इमेजिंग स्वचालित छवि विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी है अर्जित करता है। Calcein नीले रंग धुंधला के साथ समस्या यह है कि फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम टेट्रासाइक्लिन और demeclocycline लेबलिंग के साथ overlaps। इसलिए, नमूना इन खनिज लेबल्स, छवि इमेजिंग calcein नीले रंग के साथ पूर्व धुंधला करने के पहले दौर में लेबल होता है, तो है।
    1. ऊतक के भीतर अंतर्जात संकेतों इस धुंधला कदम से पहले imaged रहे हैं, तो एक Coplin 1xPBS के साथ भरा जार में पिछले इमेजिंग दौर से स्लाइड डूब तक कवर फिसल जाता स्लाइड से दूर गिर जाते हैं। निकालें और कवर फिसल जाता है सूखी।
    2. 2% में calcein नीले समाधान के 30 मिलीग्राम / मिलीलीटर की तैयारी NaHCO 3 (100 मिलीलीटर एच में 2 जी 3 NaHCO भंग द्वारा किए गए 2 हे और समायोजितएचसीएल के साथ 7.4 के पीएच को आईएनजी)। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान।
    3. 15 मिनट के लिए 1x पीबीएस युक्त एक Coplin जार में विसर्जित स्लाइड, वर्गों को हाइड्रेट करने के लिए यदि पहले से ही पिछले दौर से हाइड्रेटेड नहीं।
    4. स्लाइड्स निकालें और एक कागज तौलिया के साथ वापस आ गया और किनारों से सूखे।
    5. स्लाइड प्रति calcein नीले समाधान के 500 μl और आरटी पर एक नमी कक्ष में 10 मिनट के लिए सेते हैं - 100 लागू करें।
    6. 3 में परिवर्तन के साथ 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में स्लाइड्स कुल्ला।
    7. प्रत्येक स्लाइड के लिए 1x पीबीएस में 50% ग्लिसरॉल के ~ 200 μl लागू करें और कवर पर्ची माउंट।
    8. अतिरिक्त ग्लिसरॉल निकालें और स्लाइड के नीचे सूखी।
  2. Tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (जाल) enzymatic गतिविधि धुंधला
    नोट: जाल अस्थिशोषकों सहित hematopoietic वंश में कई प्रकार की कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की है। जाल यहाँ प्रस्तुत धुंधला एक पीले रंग की फ्लोरोसेंट एसिड फॉस्फेट सब्सट्रेट उपयोग करता है। कुछ फ्लोरोसेंट संकेतों ov होगाटेट्रासाइक्लिन / demeclocycline खनिज लेबल, नीले दाग calcein, और DAPI counterstain सहित कस्टम पीला फिल्टर सेट के साथ erlap।
    1. एक Coplin 1x पीबीएस के साथ भरा जार में पिछले इमेजिंग दौर से स्लाइड डूब तक कवर फिसल जाता स्लाइड से दूर गिर जाते हैं। निकालें और कवर फिसल जाता है सूखी।
    2. सोडियम एसीटेट निर्जल की 9.2 ग्राम और पानी में सोडियम टार्ट्रेट द्विक्षारकीय dihydrate की 11.4 ग्राम भंग और 1000 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाकर बफर 1 तैयार करें। केंद्रित हिमनदों एसिटिक एसिड (- 2 मिलीलीटर ~ 1.5) के साथ 4.2 पीएच को समायोजित करें। 4 पर समाधान स्टोर अप करने के लिए 12 महीने के लिए सें।
    3. पानी में सोडियम नाइट्राइट के 40 मिलीग्राम भंग और 1 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाकर बफर 2 तैयार करें। अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर।
    4. धुंधला के दिन, बफर 1 से 7.5 एमएल और बफर 2 के 150 μl मिश्रण से प्रतिक्रिया बफर तैयार करते हैं।
    5. स्लाइड के लिए सब्सट्रेट के बिना प्रतिक्रिया बफर लागू करें10 के लिए एस - 15 मिनट कम पीएच पर ऊतक संतुलित करने के लिए।
      नोट: विशिष्ट मात्रा ~ 200 μl है, लेकिन काफी बड़े सभी वर्गों को कवर करने की जरूरत है।
    6. 100 प्रतिक्रिया बफर में: 1:50 और 1 के बीच पीले फ्लोरोसेंट एसिड फॉस्फेट सब्सट्रेट पतला।
      नोट: कमजोर पड़ने नमूना भीतर जाल गतिविधि से तय किया जाएगा।
    7. स्लाइड्स के बंद प्रतिक्रिया बफर डालो और स्लाइड के लिए पीले रंग फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया बफर लागू होते हैं।
    8. सब्सट्रेट सक्रिय करने के लिए ~ 5 मिनट के लिए यूवी काला प्रकाश के तहत स्लाइड रखें।
      नोट: ऊष्मायन समय नमूना भीतर जाल गतिविधि के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
    9. 3 में परिवर्तन के साथ 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में स्लाइड्स कुल्ला।
    10. प्रत्येक स्लाइड के लिए 1x पीबीएस में 50% ग्लिसरॉल के ~ 200 μl लागू करें और कवर पर्ची माउंट।
    11. अतिरिक्त ग्लिसरॉल निकालें और स्लाइड के नीचे सूखी।
      ध्यान दें: अम्लीय जाल बफर वर्गों decalcify होगा। decalcifica के अतिरिक्त लाभtion कि कुछ रंग नीचे की ओर धुंधला (जैसे, खनिज लेबल) के लिए फिर से उपलब्ध हो जाएगा। उदाहरण के लिए, calcein नीले धुंधला जाल धुंधला दौरान हटा दिया जाएगा। इसलिए, DAPI counterstain बाद में एक दौर के दौरान इस चैनल में imaged किया जा सकता है।
  3. Alkaline फॉस्फेट (एपी) enzymatic गतिविधि धुंधला
    नोट: अनेक प्रकार की कोशिकाओं अस्थिकोरक सहित खनिज और mineralizing chondrocytes एपी एक्सप्रेस के साथ शामिल किया गया। फास्ट लाल इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सब्सट्रेट दोनों एक फ्लोरोसेंट लाल और chromogenic लाल सिग्नल elicits। इस वजह से, chromogenic सब्सट्रेट क्षेत्रों में जहां सब्सट्रेट precipitates में फ्लोरोसेंट संकेतों बुझाना होगा। इसलिए, यह इमेजिंग फ्लोरोसेंट संकेत है कि एपी सब्सट्रेट से बुझती जा सकता है के बाद इस दाग को ऐसा करने के लिए सबसे अच्छा है।
    1. एक Coplin 1x पीबीएस के साथ भरा जार में पिछले इमेजिंग दौर से स्लाइड डूब तक कवर फिसल जाता स्लाइड से दूर गिर जाते हैं। रेमोve और कवर फिसल जाता है सूखी।
    2. पानी की 100 मिलीलीटर में Tris के 12.1 ग्राम भंग करके 1 एम Tris तैयार करें। 1 एम NaOH के साथ 9.5 पीएच को समायोजित करें।
    3. विआयनीकृत पानी की 100 मिलीलीटर में 2 MgCl के 20.33 ग्राम भंग करके 1 एम 2 MgCl hexahydrate तैयार करें।
    4. विआयनीकृत पानी की 100 मिलीलीटर में 11.68 छ NaCl भंग द्वारा 2 एम NaCl तैयार करें।
    5. (20 मिलीग्राम / एमएल) के शेयर विआयनीकृत पानी की 50 मिलीलीटर में 1 ग्राम पाउडर भंग द्वारा फास्ट लाल टीआर नमक के समाधान 100x तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μl aliquots और दुकान बनाओ।
    6. एन, एन dimethylformamide की 50 मिलीलीटर में 500 मिलीग्राम पाउडर भंग द्वारा 100x (10 मिलीग्राम / एमएल) naphthol AS-एमएक्स फॉस्फेट शेयर समाधान तैयार है। -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μl aliquots और दुकान बनाओ।
    7. धुंधला के दिन, 2 एम NaCl के 2 MgCl, 0.5 मिलीग्राम 1 एम Tris के 1 मिलीलीटर, 1 एम के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर एपी बफर तैयार करने और (विआयनीकृत पानी का उपयोग 10 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने के अंतिम सांद्रता: 100 मिमी Tris, 50 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी NaCl)।
    8. जगह एपी खuffer प्रत्येक स्लाइड पर और आरटी पर 10 मिनट के लिए एक आर्द्रता चैम्बर में सेते हैं।
    9. फास्ट लाल टीआर नमक और naphthol AS-एमएक्स के 100x शेयरों गिराए एपी बफर में 1x करने से एपी सब्सट्रेट बफर तैयार करें।
    10. स्लाइड्स के बंद एपी बफर डालो और एपी सब्सट्रेट बफर के साथ बदलें। आरटी पर एक नमी कक्ष में 10 मिनट - 5 के लिए स्लाइड सेते हैं।
      नोट: ऊष्मायन समय नमूना के एपी गतिविधि से तय किया जाएगा।
    11. धो 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस में 3x स्लाइड।
    12. (: 1,000 1x पीबीएस में 50% ग्लिसरॉल में DAPI के कमजोर पड़ने 1) माउंट कवर DAPI counterstaining समाधान के साथ निकल जाता है।
  4. Toluidine नीले हे (टीबी) chromogenic धुंधला
    नोट: क्योंकि सभी पिछले चरणों में 50% ग्लिसरॉल / पीबीएस समाधान में अस्थायी जलीय बढ़ते तहत imaged हैं, chromogenic कदम भी जलीय की शर्तों के तहत imaged है। हालांकि, धुंधला समाधान समय के साथ बाहर नमकीन पानी के लिए करते हैं सकता है। इसलिए, यह छवि के लिए toluidine नीले रंग के रूप में जल्द ही संभव के रूप में धुंधला के बाद सुझाव दिया है।
    1. एक Coplin विआयनीकृत पानी से भरे जार में पिछले इमेजिंग दौर से स्लाइड डूब तक कवर फिसल जाता स्लाइड से दूर गिर जाते हैं। निकालें और कवर फिसल जाता है सूखी।
    2. कवर फिसल जाता है हटाने के बाद, ताजा पानी के साथ की जगह है और कम से कम 10 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं इतना है कि पीबीएस से लवण पर्याप्त ऊतकों से हटा रहे हैं।
    3. विआयनीकृत पानी में 0.025% टीबी समाधान तैयार है।
    4. 5 मिनट - 1 के लिए टीबी समाधान में स्लाइड रखें।
      नोट: ऊष्मायन समय उपयोगकर्ता पसंद पर निर्भर है, लेकिन सभी नमूनों भर में लगातार रखा जाना चाहिए।
    5. विआयनीकृत पानी और धोने स्लाइड के साथ Coplin जार में जगह स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3x।
    6. 30% ग्लिसरॉल विआयनीकृत पानी में भंग के साथ माउंट कवर पर्ची (नहीं पीबीएस 1x के रूप में इस दाग ऊतक से बाहर नमकीन पानी के लिए कारण होगा)। नोट: ग्लिसरॉल बढ़ते मध्यम फ्रुक्टोज सिरप, जो ऊतकों से दाग के प्रसार को रोकने में मदद करता है के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। सेवा मेरेफ्रुक्टोज सिरप तैयार, 60 डिग्री सेल्सियस के लिए विआयनीकृत पानी और गर्मी के 10 मिलीलीटर में फ्रुक्टोज की 30 ग्राम भंग जब तक भंग कर दिया।

6. इमेजिंग के कई दौर

  1. माइक्रोस्कोप ट्रे (चित्रा 3 डी) में स्लाइड लोड।
    नोट: ट्रे वसंत लोड कर रहे हैं।
  2. स्लाइड खुर्दबीन स्कैनिंग (चित्रा 3E) की ट्रे ढेर में ट्रे डालें।
  3. प्रत्येक fluorophore के लिए उचित जोखिम समय के साथ प्रत्येक स्लाइड के लिए एक प्रोफ़ाइल लोड करने के लिए प्रोफ़ाइल सूची पर क्लिक करें। स्लाइड नाम पर क्लिक करें मैन्युअल रूप से प्रत्येक स्लाइड नाम या सॉफ्टवेयर पढ़ स्लाइड लेबल पर उपलब्ध कराई बारकोड है। स्लाइड के एक पूर्वावलोकन छवि लेने के लिए शुरू बटन पूर्वावलोकन स्कैन क्लिक करें।
  4. ऊतक का पता लगाने के लिए विज़ार्ड के हित के क्षेत्रों निर्धारित करें और उन्हें इमेजिंग के बाद के दौर के लिए बचा। एक बार प्रत्येक स्लाइड सेटअप है, बटन शुरू स्कैन क्लिक करके स्कैन प्रक्रिया शुरू करते हैं।
    नोट: सिस्टम 100 SLI को पकड़ कर सकतेएक समय में des।
  5. एक बार इमेजिंग समाप्त हो गया है, छवि विधानसभा और विश्लेषण के लिए .tif के रूप में प्रत्येक व्यक्ति के चैनल और इमेजिंग गोल या .jpg फाइलों से छवियों को निर्यात।

7. छवि विधानसभा

  1. मैनुअल विधि का उपयोग फ़ोटोशॉप (या इसी तरह की छवि संपादन सॉफ्टवेयर बहुस्तरीय छवियों का निर्माण करने में सक्षम)।
    1. प्रत्येक इमेजिंग दौर से प्रत्येक व्यक्ति के चैनल छवि खोलें।
    2. एक समग्र छवि के भीतर परतों के रूप में अलग-अलग छवियों को इकट्ठा करो। ऐसा करने के लिए, एक छवि से परत पैलेट के भीतर परत पर क्लिक करें। फिर एक और छवि पर परत खींचें। यह खींचें और ड्रॉप कार्रवाई की छवि में एक नई परत का निर्माण करेगा। अन्य सभी छवियों के लिए यह मत करो। वैकल्पिक रूप से, एक छवि ढेर में परतों के रूप में कई छवि फ़ाइलों को लोड करके इस प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए एक स्क्रिप्ट (फ़ाइल> लिपियों> ढेर ... में लोड फ़ाइलें) का उपयोग करें।
    3. एक बार प्रत्येक छवि के समग्र छवि में एक व्यक्ति परत के रूप में सूचीबद्ध है, परत नाम पर डबल क्लिक करें ला नाम बदलने के लिएyers के रूप में विभिन्न चैनलों विचार करने की जरूरत है।
    4. क्रम में प्रत्येक परत के माध्यम से देख सकते हैं और वास्तव में एक समग्र छवि बनाने के लिए, परत पैलेट के भीतर "स्क्रीन" "सामान्य" से प्रत्येक परत के लिए मिश्रण मोड बदलने के लिए।
      नोट: इस चरण में तेजी लाने के लिए, स्क्रीन के लिए एक एकल परत बदलने के लिए, तो परत पर राइट क्लिक करें, "नकल परत शैली" का चयन करें, तो अन्य सभी परतों पर प्रकाश डाला और "पेस्ट परत शैली" का चयन करने के लिए स्क्रीन अन्य शैली लागू करने के लिए परतें।
    5. बेहतर chromogenic परत के माध्यम से फ्लोरोसेंट संकेत कल्पना करने के लिए chromogenic परत (यानी, toluidine नीला) की - अगर वांछित, अस्पष्टता (40% से 10 परिवर्तन मूल्य) में कमी।
      नोट: टाइलों स्कैनिंग इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल माइक्रोस्कोप, 3 किनारों पर स्लाइड रखती है जिससे रोटेशन की राशि है कि इमेजिंग के प्रत्येक दौर के दौरान स्लाइड करने के लिए हो सकता है कम से कम। इसलिए, यह बहुत आसान ली गई छवियों को बारी बारी करने के लिए बिना के लिए उपयोगकर्ता मैन्युअल छवियों को संरेखित करने के लिए हैइमेजिंग के विभिन्न दौर से।

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Representative Results

उच्च throughput, बहु छवि Cryohistology के लिए एक सामान्य कार्यप्रवाह

चित्रा 1 जनरल इस तकनीक के लिए इस्तेमाल किया कार्यप्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है। यह इमेजिंग और अंत में छवि संरेखण / विश्लेषण के कई दौर के माध्यम से निर्धारण से कई कदम भी शामिल है। प्रक्रिया के रूप में छोटे रूप में एक सप्ताह इमेजिंग के 4 दौर है, जो कम समय की तुलना में यह नमूने के इन प्रकार decalcify के लिए ले जाता है के माध्यम से नमूना निर्धारण से जाने के लिए ले जा सकते हैं। इमेजिंग के आदेश आमतौर पर अंतर्जात संकेत है कि पहले से ही नमूना में (जैसे, GFPs, खनिज लेबल, आदि), तो मल्टिप्लेक्स फ्लोरोसेंट फ्लोरोसेंट enzymatic गतिविधि assays के द्वारा पीछा immunostaining (जैसे।, जाल, एपी, आदि) के साथ शुरू होता है और सेल चक्र विश्लेषण assays (जैसे, edu) और अंत में एक chromogenic दाग के साथ रहता है (जैसे, toluidine नीला हे, हेमatoxylin हे सैफरैनीन, आदि)।

एक किशोर टखने संयुक्त 6 से प्रतिनिधि उदाहरण

इस विशेष अध्ययन का उद्देश्य अलग है (यानी, Col1a1, Col2a1, और Col10a1) स्नायुजाल करने वाली हड्डी प्रविष्टि साइट (यानी, enthesis) की fibrocartilage की खनिज के साथ कोलेजन के प्रकार की अभिव्यक्ति के बीच संबंध प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। इसलिए, Col1a1-GFPTpz, Col2a1-सीएफपी और Col10a1-mCherry सहित एक ट्रिपल ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस प्रत्येक transgene व्यक्त कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इमेजिंग के पहले दौर में एक दो सप्ताह पुरानी माउस, जो करने के लिए संगत से अंतर्जात transgene अभिव्यक्ति का था, जब स्नायुजाल (चित्रा 4 बी) में enthesis mineralizes। इमेजिंग के दूसरे दौर तो पर आयोजित किया गयाmultiphoton माइक्रोस्कोप दो फोटोन दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी, चित्रा 4C) के माध्यम से कोलेजन वास्तुकला की छवियों को प्राप्त करने के लिए। यह कदम enthesis भीतर कोलेजन फाइबर के आधार पर कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इमेजिंग के तीसरे दौर में भारतीय हाथी (IHH) है, जो मुख्य संकेत ligands कि enthesis (चित्रा 4D) के खनिज को बढ़ावा देता है में से एक है के लिए एक immunostaining कदम था। इमेजिंग के चौथे दौर में एक नीले alkaline फॉस्फेट सब्सट्रेट किट है, जो दोनों Cy5 प्रतिदीप्ति और नीले chromogenic संकेतों elicits का उपयोग करते हुए, सक्रिय खनिज बयान (चित्रा 4E) के क्षेत्रों कल्पना करने के लिए एपी धुंधला था। अंत में, इमेजिंग के पांचवें दौर fibrocartilage (चित्रा 4F) के भीतर proteoglycan सामग्री सहित शारीरिक विशेषताओं कल्पना करने के लिए टीबी धुंधला था। सभी छवियों मैन्युअल छवि संपादन सॉफ्टवेयर के भीतर गठबंधन किया गया। इमेजिंग के पांच दौर एक 4 दिन की अवधि, जो पीछा किया पर 3 आयोजित की गईनमूना प्रसंस्करण और सेक्शनिंग (7 दिन कुल) के दिन।

एक वयस्क घुटने संयुक्त 11 से प्रतिनिधि उदाहरण

इस प्रयोग का उद्देश्य खनिज परिवर्तन है कि पूर्वकाल cruciate बंधन (एसीएल) की transection के माध्यम से संयुक्त अस्थिरता के बाद घुटने की औसत दर्जे का जमानत बंध (एमसीएल) के enthesis में होते हैं निर्धारित करने के लिए किया गया था। खनिज परिवर्तन इन 3 महीने की उम्र में चूहों में एमसीएल enthesis के रूप में जल्दी के रूप में दो सप्ताह के बाद सर्जरी में देखा जा सकता है। enthesis भीतर fibrocartilage के खनिज समानाधिकरण पर नजर रखने के लिए, एक खनिज लेबल 2 सप्ताह के बाद सर्जरी पर सर्जरी (demeclocycline) के दिन पर चूहों और इससे पहले कि बलिदान (calcein) के दिन के लिए दिया गया था। चूहे भी unmineralized और mineralized fibrochondrocyt के कोलेजन अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए Col1a1-सीएफपी और Col10a1-mCherry फ्लोरोसेंट संवाददाताओं शामिलes, क्रमशः। इमेजिंग के पहले दौर अंतर्जात का संकेत है, जो इस मामले में फ्लोरोसेंट प्रोटीन और खनिज फ्लोरोसेंट लेबल (चित्रा 5 ए) के लिए corresponded की थी। दूसरे दौर में अंतर्निहित अस्थि मज्जा (चित्रा 5 ब) में enthesis में mineralizing fibrochondrocytes में इस एंजाइम की अभिव्यक्ति के रूप में अच्छी तरह से अस्थिशोषकों प्रदर्शित करने के लिए जाल धुंधला शामिल थे। तीसरे दौर एपी fibrochondrocytes के सक्रिय खनिज के साथ ही अंतर्निहित हड्डी (चित्रा 5C) के अस्थिकोरक के क्षेत्रों का प्रदर्शन करने के धुंधला हो जाना था। अंत में, टीबी धुंधला चौथे दौर (चित्रा 5 डी) के लिए आयोजित किया गया। सभी छवियों मैन्युअल छवि संपादन सॉफ्टवेयर के भीतर गठबंधन किया गया। एक बार फिर से कुल समय ऊतक फसल से छवि संरेखण के लिए ले जाया 7 दिन था।

बाहर का फीमर से ट्रैबेकुलर हड्डियों के प्रतिनिधि उदाहरण

(चित्रा 3 बी) के लिए लागू किया गया था। इस प्रक्रिया 8 महिला और अस्थि मज्जा के भीतर 3 विभिन्न स्तरों पर 8 नर चूहों पर आयोजित किया गया, 12 स्लाइड्स की कुल संख्या उपज। संदर्भ मार्कर (microspheres) एपिफ़ीसिस और सूखी वर्गों (चित्रा 3 सी) पर मध्य diaphysis के भीतर लागू किया गया। सभी 12 स्लाइड के लिए दाग थेआर नीले और इमेजिंग (चित्रा 6A) के पहले दौर के दौरान एकत्रित खनिज (calcein नीला) और खनिज लेबल (calcein और Alizarin complexone) के लिए imaged calcein। स्लाइड तो इमेजिंग के तीसरे दौर में दूसरे दौर में और एपी गतिविधि (चित्रा 6C) में जाल गतिविधि (चित्रा 6B) के लिए imaged थे। अंत में, स्लाइड चौथे दौर (चित्रा 6D) में toluidine नीले रंग के साथ दाग रहे थे। संदर्भ मार्कर chromogenic दौर सहित हर इमेजिंग दौर के दौरान imaged थे, और कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गठबंधन किया गया। इस प्रक्रिया 32 हड्डियों (16 femurs और 16 कशेरुकाओं) 8 ब्लॉक, 3 वर्गों प्रत्येक ब्लॉक से लिया गया में एम्बेडेड थे throughput के एक विचार प्रदान करने के लिए, वर्गों 12 स्लाइड भर में वितरित किए गए, और 12 स्लाइड्स 4 बार imaged थे 96 समग्र छवि के ढेर का निर्माण किया। कुल समय इस प्रयोग को करने के लिए 8 दिन था।


चित्रा 1. प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट कार्यप्रवाह। सामान्य चरण 1) ऊतक निर्धारण, 2) टेप स्थिर cryosectioning, 3) गिलास स्लाइड के लिए टेप वर्गों का पालन, 4) संदर्भ मार्कर के आवेदन, 5) धुंधला के कई दौर और 6) शामिल इमेजिंग, और 7) छवि विधानसभा, संरेखण, और विश्लेषण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. उच्च throughput एम्बेडिंग और टेप स्थिर Cryosectioning। क्योंकि स्थिरता cryotape प्रदान करता है, कई हड्डियां एक दूसरे को (अटल बिहारी) से सटे एम्बेडेड जा सकता है और sectioned एक साथ (सीडी)। सूखी बर्फ का एक टुकड़ा के दौरान प्रयोग किया जाता हैembedding प्रक्रिया सख्ती से पूरे क्रायो ब्लॉक (बी) ठंड से पहले जगह में हड्डियों को ठीक करने के लिए। Cryotape ब्लॉक (सी) पर लुढ़का हुआ है और इस खंड (डी) सेक्शनिंग दौरान टेप करने के लिए अटक रहता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. गिलास स्लाइड, संदर्भ मार्करों के आवेदन, और स्लाइड-खुर्दबीन स्कैनिंग की ट्रे में स्लाइड्स की लोडिंग के लिए टेप धारा का पालन। टेप वर्गों या तो यूवी इलाज या chitosan आधारित चिपकने के साथ गिलास स्लाइड की सतह (ए से चिपके रहे )। इलाज या सूखने के बाद, केवल एक पतली, चिपकने के फ्लैट परत cryotape और कांच की सतह (बी) के बीच बनी हुई है। संदर्भ मार्चKERS सूखी स्लाइड्स (सी, तीर अंक microsphere समाधान के ड्रॉप करने के लिए) को लागू कर रहे हैं। स्लाइड्स तो माइक्रोस्कोप ट्रे (डी) में रखा और माइक्रोस्कोप (ई) में लोड कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एक दो सप्ताह पुरानी माउस से स्नायुजाल की इमेजिंग के पांच दौर। समग्र छवि ढेर (ए) इमेजिंग के पांच दौर से बनाया गया था। 1 दौर (ख): अंतर्जात Col1a1-GFPTpz, Col2a1-सीएफपी और Col10a1-mCherry transgene अभिव्यक्ति। दौर 2 (सी): कोलेजन दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) के दो फोटोन खुर्दबीन पर। दौर 3 (डी): IHH के लिए immunostaining। दौर 4(ई): एपी enzymatic गतिविधि। दौर 5: toluidine नीला हे (एफ)। यह आंकड़ा Dyment एट अल से संशोधित किया गया है। 2015 6। स्केल बार = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. एमसीएल Enthesis की इमेजिंग के चार दौर संयुक्त अस्थिरता के बाद। घुटनों तीन महीने की उम्र में चूहों में अस्थिर कर रहे थे, एमसीएल enthesis की वृद्धि की खनिज के लिए अग्रणी। एक demeclocycline खनिज लेबल सर्जरी और एक calcein खनिज लेबल के दिन दिया गया था बलिदान एक दिन पहले दिया गया था। 1 दौर (ए): अंतर्जात Col1a1-CFP, demeclocycline और calcein खनिज लेबल के साथ Col10a1-mCherry transgene अभिव्यक्ति। दौर 2 (बी) </ Strong>: जाल enzymatic गतिविधि। दौर 3 (सी): एपी enzymatic गतिविधि। दौर 4 (डी): toluidine नीले ओ जाल और एपी संकेत पैनलों ईसा पूर्व में टीबी संकेत के शीर्ष पर मढ़ा गया था। पीला चैनल जाल के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि जाल बफर ऊतक decalcifies, demeclocycline लेबल हटाने। यह आंकड़ा Dyment एट अल से संशोधित किया गया है। 2015 11। स्केल बार = 200 माइक्रोन। डेम: demeclocycline, जाल: टारट्रेट प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट, एपी: alkaline फॉस्फेट, एमसीएल: औसत दर्जे का जमानत बंध। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 डिस्टल फीमर के भीतर इमेजिंग के चार दौर युक्त Microsphere संदर्भ मार्करों। तीन महीने की उम्र में micई calcein और Alizarin complexone खनिज लेबलों दिया गया 1 दौर (एए '):। अलावा अंतर्जात calcein और alizarain complexone लेबलों संचित खनिज के नीले धुंधला calcein के लिए 2 दौर (बी बी।'): जाल enzymatic गतिविधि दौर 3 (सीसी)। :। एपी enzymatic गतिविधि दौर 4 (डीडी): toluidine नीले हरे ओ microspheres प्रत्येक दौर के दौरान imaged थे (A'- डी ', तीर सभी छवियों में एक ही microsphere को दर्शाता है)। स्केल बार = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

chitosan चिपकने वाला यूवी इलाज चिपकने वाला
चिपकने वाला तंत्र भाप यूवीpolymerization
इलाज का समय > 24 घंटा <20 मिनट
वर्गों चिपकने वाला इलाज के बाद हटाया जा सकता है? हाँ नहीं
चिपकने वाला गलने ठीक हो जाता है? हाँ, कम पीएच के साथ अम्लीय समाधान में नहीं
चिपकने का सामना गर्मी प्रतिजन पुनर्प्राप्ति करता है? नहीं हाँ
चिपकने वाला ऑटो फ्लोरोसेंट है? नहीं यूवी श्रेणी में मिनिमल

तालिका 1 Chitosan चिपकने वाला और यूवी इलाज चिपकने वाला के बीच तुलना

Cryotape टेप-अंतरण प्रणाली
करने के लिए खंड mineralized हड्डी इस प्रणाली का उपयोग संभव है? हाँ हाँ, लेकिन mineralized हड्डी के टुकड़ेस्लाइड करने के लिए पूरी तरह से स्थानांतरण नहीं हो सकता
करने के लिए खंड mineralized इस प्रणाली का उपयोग जोड़ों संभव है? हाँ हाँ
इस प्रणाली का उपयोग खंड मस्तिष्क के लिए संभव है? हाँ, लेकिन ऊतक इमेजिंग के कई दौर के बाद टेप का गिर सकता है हाँ
संभव ही ब्लॉक में एम्बेडेड कई नमूने में कटौती करने के लिए? हाँ हाँ
संभव ही खंड पर इमेजिंग के कई दौर का संचालन करने के लिए? हाँ हाँ

तालिका 2 Cryotape प्रणाली और टेप-हस्तांतरण प्रणाली के बीच तुलना

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Discussion

यहाँ हम सह-स्थानीय बनाना और एक एकल खंड पर धुंधला / इमेजिंग के कई दौर से छवियों को संरेखित द्वारा कई जैविक उपायों यों एक विस्तृत cryohistology प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। के रूप में यह खंड ऊतक के लिए मुश्किल की आकृति विज्ञान (जैसे, mineralized हड्डी और उपास्थि) का कहना है विधि का उपयोग कर cryotape उल्लिखित विशेष रूप से उपयोगी है। इसके अलावा, sectioned ऊतक गिलास स्लाइड के लिए मजबूती से पालन किया जाता है, एक ही अनुभाग का धुंधला / इमेजिंग के कई दौर के लिए अनुमति देता है; पारंपरिक तरीकों जहां धारावाहिक वर्गों प्रत्येक एक अलग प्रोटोकॉल के साथ दाग रहे हैं के विपरीत है। धारावाहिक वर्गों का प्रयोग एक मुद्दा बन सकता है जब सह स्थानीय बनाना वर्गों के बीच संकेतों के लिए कुछ है कि एकल वर्गों है कि दाग दिया गया है और कई दौर के साथ imaged के साथ एक समस्या नहीं है का प्रयास।

बाजार पर पहले टेप स्थिर ऊतक सेक्शनिंग उत्पाद एक टेप हस्तांतरण प्रणाली 16, 17 वर्ष की थी। यह प्लास्टिक टेप लेपित का उपयोग करता हैएक ठंडे तापमान चिपकने वाला है कि ऊतक cryoblock की सतह पर रखा गया है साथ। जब cryostat ब्लेड टेप के नीचे कटौती, खंड बरकरार है और टेप के अनुयायी निकाल दिया जाता है। इसके बाद टेप स्लाइड है कि यूवी इलाज गोंद है कि इस तरह के ऊतकों सख्ती से स्लाइड से जुड़ी हो जाता के साथ लेपित हैं पर नीचे नमूना पक्ष रखा गया है। एक बार जब टेप अनुभाग से दूर pealed है, स्लाइड या तो प्रतिदीप्ति या chromogenic ऊतक विज्ञान के लिए कार्रवाई की जा सकती है। चिपकने की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम है, और धुंधला के कई दौर और इमेजिंग सबसे कोमल ऊतकों के साथ अच्छी तरह से काम करता है। mineralized वर्गों के साथ हालांकि, वहाँ खनिज टुकड़े के नुकसान जब गिलास स्लाइड के लिए चिपकने वाला टेप से ऊतक स्थानांतरित हो सकता है। इसके अलावा, यह cryostat (> $ 8,000 से) और उपभोज्य लागत में स्थापित करने के लिए एक अपेक्षाकृत महंगी व्यवस्था कर रहे हैं उच्च (> $ 2 / स्लाइड) है।

एक और टेप स्थिरीकरण डॉ Tadafumi कावामोटो द्वारा विकसित की रणनीति एक का उपयोग करता हैचिपकने वाला लेपित polyvinylidene क्लोराइड फिल्म ऊतक खंड पर कब्जा करने के लिए। उनकी प्रोटोकॉल में, एक ताजा जमे हुए ऊतक टेप पर sectioned है और तुरंत पीएफए ​​या इथेनॉल 18 में तय की। बाद में, टेप सना हुआ है और उसके बाद सूक्ष्म परीक्षण के लिए नमूना नीचे पक्ष के साथ एक गिलास स्लाइड पर मुहिम शुरू की। इस प्रकार प्रत्येक धुंधला प्रोटोकॉल एक अलग टेप खंड पर किया जाता है।

हम संशोधित और embedding से पहले formalin में नमूना फिक्सिंग सहित तरीकों की एक संख्या में कावामोटो प्रोटोकॉल को जोड़ लिया है। यह कदम सेल की सीमा के भीतर ट्रांसजेनिक जानवरों के घुलनशील cytoplasmic GFP ठीक करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम प्रकार के ऊतकों 5-13 की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए cryotape उपयोग किया है। सीमित ऊतकीय अनुभव के साथ प्रयोगशाला कर्मियों इस विधि के साथ उच्च गुणवत्ता वाले वर्गों का उत्पादन कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल का प्राथमिक लाभ सापेक्ष कम लागत (कोई खास इंस्ट्रूमेंटेशन, <$ 1.00 प्रति स्लाइड) कर रहे हैं, खनिज टुकड़े का कोई नुकसान नहीं,और क्षमता एक ही खंड पर धुंधला हो जाना और इमेजिंग के कई दौर प्रदर्शन करने के लिए।

क्योंकि पुनरावृत्ति में इमेजिंग एक स्लाइड कई बार एक ही क्षेत्रों स्लाइड भी एक मोटर चालित मंच के उपयोग की एक बड़ी संख्या के लिए अनुचित होगा, इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम एक स्लाइड खुर्दबीन स्कैनिंग स्थिरता और throughput बढ़ाने के लिए का उपयोग होता है। माइक्रोस्कोप एक डिजिटल स्लाइड स्कैनर है कि दोनों epifluorescence और प्रेषित प्रकाश के तहत चल रही है। यह एक 10-स्थिति मोटर चालित बुर्ज और दोनों बी और डब्ल्यू और रंग कैमरों से लैस है। प्रणाली का असली नवीनता, हमारे हाथ में है, उस हित के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए जल्दी और आसानी से उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किया जा सकता है या इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से पाया है। ब्याज की इन क्षेत्रों में तो इमेजिंग के पहले दौर से बचाया जा सकता है और फिर बाद के दौर के दौरान तेजी से पुनः लोड। इसलिए, ब्याज की एक ही क्षेत्रों इमेजिंग के प्रत्येक दौर के दौरान imaged हैं। उपयोगकर्ता के आधार परसॉफ्टवेयर में निर्धारित मापदंडों, माइक्रोस्कोप ऑटोफोकस और टाइलों छवियों है कि ब्याज के क्षेत्रों के भीतर अधिग्रहण के दौरान सिले हैं स्कैन करेगा।

जिस क्रम से उपयोगकर्ता धुंधला की कई दौर करता है महत्वपूर्ण है। सामान्य आदेश चित्रा 1 में उल्लिखित है। Fluorophores पर्याप्त फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से अलग किया जा सकता है कि की संख्या प्रतिक्रिया उपायों किसी दिए गए खंड पर प्राप्त किया जा सकता है कि की संख्या के प्राथमिक सीमित कारक है। हालांकि, फ्लोरोसेंट चैनलों कुछ मामलों में पुन: उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, नीले calcein और दोनों demeclocycline फेंकना पीला चैनल में एक मजबूत संकेत जाल गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया। यह खून के माध्यम से हालांकि, क्योंकि जाल बफर खंड decalcifies, जिससे खनिज जाल गतिविधि इमेजिंग के लिए पहले हटाने से बचा है। इसके अलावा, DAPI counterstain के रूप में अच्छी तरह से पीले चैनल में उत्सर्जन होगा। हालांकि, उपयोगकर्ता वीं में एक और counterstain साथ DAPI की जगह ले सकताई लाल या दूर लाल सीमा होती है। इसके अलावा, एंटीबॉडी छीन लिया जा सकता है और एक ही फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग कर विभिन्न एंटीबॉडी के साथ फिर से सना हुआ। इसलिए, इस विधि प्रतिक्रिया उपायों किसी दिए गए खंड पर दर्ज किया जा सकता है कि की संख्या में वृद्धि करने के लिए काफी अनुकूल है।

वहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ कुछ सीमाएं हैं। 1) cryotape कुछ ऊतकों को पर्याप्त रूप से पालन नहीं हो सकती है। उदाहरण के लिए, formalin तय मस्तिष्क वर्गों धुंधला के कई दौर के बाद टेप से गिर जाते हैं। इस तरह के रूप ऊतकों के लिए, टेप हस्तांतरण प्रणाली को और अधिक उचित रूप में ऊतक यूवी सक्रिय चिपकने वाला (इन दो तरीकों के बीच तुलना के लिए 2 टेबल देखें) के माध्यम से कांच की सतह का पालन किया है हो सकता है। 2) chitosan चिपकने वाला, पारदर्शी ऑप्टिकल गुण प्रदान करते हुए, कठोर प्रसंस्करण कदम है कि उच्च तापमान या मजबूत एसिड शामिल जीवित नहीं होगी। इसलिए, यूवी सक्रिय चिपकने वाला इन अनुप्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त है (देखें तालिका 1 चया इन दोनों के बीच तुलना चिपकने)।

cryohistological यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल भी उच्च throughput और स्वचालन के लिए खुद को उधार दे। उदाहरण के लिए, अपेक्षाकृत नौसिखिया उपयोगकर्ताओं को एक ही ब्लॉक में एक बार में कई हड्डियों या जोड़ों में कटौती करने के लिए, काफी बढ़ रही throughput टेप cryotape द्वारा प्रदान की स्थिरीकरण की अनुमति देता है। एक स्वचालित स्कैनर का उपयोग करना महत्वपूर्ण तकनीशियन समय और लागत इमेजिंग, जो आम तौर पर हमारे अनुभव में दर-कदम सीमित कर दिया गया है से संबंधित कम कर देता है। लगातार और मज़बूती से एक छोटी अवधि के समय के स्वचालित, ऊतकों का उद्देश्य विश्लेषण के लिए एक मंच प्रदान करता है में छवि के हित में कई बार के एक ही क्षेत्र के लिए सक्षम होने के नाते। वास्तव में, हमारे समूह कंप्यूटर स्वचालित संरेखण और हड्डी के histomorphometry के लिए एक मंच विकसित की है। पहला, सॉफ्टवेयर फ्लोरोसेंट संदर्भ मार्करों के आधार पर छवियों के कई दौर संरेखित करता है। फिर, गठबंधन छवियों को एक histomorphometry पाइपलाइन जहां कंप्यूटर में खिलाया जाता हैएर सॉफ्टवेयर ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करता है और निष्पक्ष उपायों कई स्थिर और गतिशील माप (में और अधिक देखने www.bonebase.org) 13। इस मंच बढ़ा throughput और स्थिरता cryotape सेक्शनिंग, डिजिटल स्लाइड खुर्दबीन स्कैनिंग, और कस्टम विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की वजह से संभव बनाया गया था। इस प्रोटोकॉल उच्च throughput cryohistology में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है और ऊतक सेक्शनिंग करते उन के रूप में के रूप में अच्छी तरह के हड्डी के रूप में उन इमेजिंग के लिए खंड के ऊतकों मुश्किल करने के लिए उपयोग की होनी चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Multiple suppliers available.
PBS Sigma Aldrich P5368 Multiple suppliers available.
Cryomolds Fisher Scientific Fisherbrand #22-363-554 Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix Thermo Scientific 6769006 Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane Sigma Aldrich M32631 Multiple suppliers available.
Cryostat Leica Biosystems 3050s Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc Leica Biosystems 14037008587 Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades Thermo Scientific 3051835 Can be substituted with other brands/models.
Cryotape Section Lab Cryofilm 2C
Roller Electron Microscopy Sciences 62800-46 Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides Electron Microscopy Sciences 71890-01 Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides Thermo Scientific 3051 Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61 Norland Optical Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light General Electric F15T8-BLB
Glacial acetic acid Sigma Aldrich ARK2183 Multiple suppliers available.
Chitosan Sigma Aldrich C3646 Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres ThermoFisher Scientific I-14787
InSpeck green microspheres ThermoFisher Scientific I-14785
Calcein Blue Sigma Aldrich M1255 Multiple suppliers available.
Calcein Sigma Aldrich C0875  Multiple suppliers available.
Alizarin complexone Sigma Aldrich A3882  Multiple suppliers available.
Demeclocycline Sigma Aldrich D6140  Multiple suppliers available.
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761 Multiple suppliers available.
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate ThermoFisher Scientific E-6588
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific R37108 Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous Sigma Aldrich S2889 Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate  Sigma Aldrich T6521 Multiple suppliers available.
Sodium nitrite Sigma Aldrich S2252 Multiple suppliers available.
Tris Sigma Aldrich 15504 Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate Sigma Aldrich M9272 Multiple suppliers available.
NaCl Sigma Aldrich S7653 Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt Sigma Aldrich F8764 Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX  Sigma Aldrich N4875 Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide Sigma Aldrich D158550 Multiple suppliers available.
Toluidine blue O Sigma Aldrich T3260 Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1 Carl Zeiss AG Axio Scan.Z1 Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set Chroma Technology Corp. 49000
CFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49001
GFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49020
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References

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