Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

Biology

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Summary

Wir präsentieren ein Protokoll für die Anwendung von interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm), einer 3-dimensionalen Einzelmoleküllokalisierung Super Resolution Mikroskopie-Methode, um die Abbildung des Aktin-Zytoskelett in adhärenten Säugerzellen. Dieser Ansatz ermöglicht es Licht-basierte Visualisierung von Nanostrukturmerkmale, die sonst mit herkömmlichen beugungsbegrenzten optischen Mikroskopie ungelöst bleiben würde.

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Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).

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Abstract

Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung von spezifischen Biomoleküle in Zellen. Jedoch für konventionelle Fluoreszenzmikroskopie, die räumliche Auflösung wird durch Beugung auf ~ 200 nm innerhalb der Bildebene und> 500 nm entlang der optischen Achse beschränkt. Als Ergebnis wurde bei der Beobachtung der ultrastrukturellen Merkmale innerhalb der Zellen Fluoreszenzmikroskopie lang stark eingeschränkt. Die jüngste Entwicklung der Super Resolution Mikroskopie-Methoden hat diese Einschränkung zu überwinden. Insbesondere ermöglicht das Aufkommen von photoschaltbarer Fluorophore Lokalisation-basierten Super Resolution Mikroskopie, die die molekulare Länge Annäherung Skala Auflösungsvermögen zur Verfügung stellt. Hier beschreiben wir die Anwendung eines dreidimensionalen Super Resolution Mikroskopie-Methode basiert auf Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie und mehrphasigen Interferometrie genannt interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm). Dieses Verfahren liefert nahezu isotrop Auflösung auf demGrößenordnung von 20 nm in allen drei Dimensionen. Protokolle für die filamentöse Aktin-Zytoskelett Visualisierung, einschließlich Probenvorbereitung und den Betrieb des Instruments iPalm, werden hier beschrieben. Diese Protokolle sind auch leicht anpaßbar und lehrreich für die Untersuchung anderer ultrastrukturelle Merkmale in Zellen.

Introduction

Die Visualisierung von komplexen zellulären Strukturen ist seit langem ein integraler Bestandteil biologische Einsichten und Entdeckungen. Obwohl die Fluoreszenzmikroskopie können Bildzellen mit hohem Molekular Spezifität, dessen Auflösungsvermögen durch Beugung auf ~ 200 nm in der Bildebene begrenzt ist (x, y, oder laterale Dimension) und> 500 nm entlang der optischen Achse (z, oder axiale Abmessung) 1,2. Daher hat die Beobachtung der ultrastrukturellen Merkmale historisch worden Elektronenmikroskopie (EM) begrenzt. Glücklicherweise hat die jüngste Entwicklung der Super Resolution Mikroskopie , diese Grenze zu umgehen, räumliche Auflösung im 10 ermöglicht - Bereich 100 nm 1-6. Insbesondere Ansätze Superauflösung auf Einzelmoleküllokalisierung anhand von Akronymen wie PALM (photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie) 4 bekannt, FPALM (Fluorescence photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie) 5 (d) STORM (direkte Stochastische Optische Rekonstruktionsmikroskopie) 6,7, PAINT ( Point Accumulation for Imaging Nanoskalige Topographie) 8, GSDIM (Grundzustand Depletion - Mikroskopie , gefolgt von einzelnen Molekülrück) 9 oder SMACM (Einzelmolekül - Aktiv-Control - Mikroskopie) 10, sowie deren 3-dimensionale (3D) Implementierungen, wie interferometrischen PALM (iPalm) 11 oder 3D-STORM 12, haben neuronale Axone in enthüllt neue Einblicke in die nanoskaligen Organisation zahlreicher biologischer Strukturen, einschließlich wertvoll und Synapsen 13, Fokaladhäsionen 14,15, Zell-Zell - Verbindungen 16, Kernporen 17 und Zentrosomen 18-20, um nur einige zu nennen.

Ein weiteres Merkmal ultra in Zellen, für die Super Resolution Mikroskopie potentiell nützlich ist, ist das Aktin-Zytoskelett. Der Komplex meshwork filamentöser (f) -Actin in der Zelle cortex spielt eine wesentliche Rolle bei der Kontrolle der Zellform und der mechanischen Eigenschaften 21. Die Organisation of F-Aktin ist aktiv und dynamisch wenn zahlreiche regulatorische Proteine reguliert , die stark beeinflussen Polymerisation, Vernetzung, Umsatz, Stabilität und Netzwerktopologie 22. Doch obwohl die Charakterisierung der f-Actin meshwork Architektur ist wichtig für die mechanistische Einblicke in ein breites Spektrum von zellulären Prozessen, die geringe Größe (~ 8 nm) der f-Aktin-Filamente ihre Beobachtung behindert durch konventionelle beugungsbegrenzte Lichtmikroskopie; Somit hat die Visualisierung von Aktin Feinstruktur bisher durch EM ausschließlich durchgeführt. Hier beschreiben wir Protokolle zur Visualisierung des f-Aktin - Zytoskelett in adhärenten Säugetierzellen unter Verwendung der iPalm Super Resolution Mikroskopie - Technik den Vorteil der sehr hohen Präzision Fähigkeit zu nehmen in 3D 11,23. Obwohl die iPalm Instrument hoch spezialisiert ist, Instruktion über die Einrichtung eines solchen Instruments wurde vor kurzem 23 beschrieben, während der Zugang zu dem iPalm Mikroskop vom Ho gehostetStation Hughes Medical Institute hat sich auch für die Forschungsgemeinschaft mit minimalen Kosten zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus sind die Probenvorbereitung hier beschriebenen Verfahren unmittelbar auf alternative 3D Super Resolution Ansätze, wie solche auf Basis von astigmatischen Defokussierung des Punktverteilungsfunktion (PSF) 12 oder bi-Ebenenerkennung 24, die im weiteren Sinne zur Verfügung stehen.

Wir stellen fest , dass ein notwendiger Bestandteil für Einzelmoleküllokalisierung-basierten Super Resolution Mikroskopie im Allgemeinen ist die photoschaltbare Fluorophore 25, die die drei kritischen Anforderungen für Einzelmoleküllokalisierung-basierten Super Resolution Mikroskopie erfüllt werden können: i) hohe Einzelmolekül Helligkeit und Kontrast in Bezug auf Hintergrundsignale; ii) spärliche Verteilung einzelner Moleküle in einem gegebenen Bildrahmen; und iii) eine hohe räumliche Dichte der Markierung ausreichend, um das Profil der darunterliegenden Struktur zu erfassen (auch bekannt als Nyquist-Shannon Sampling - Kriterium) 26. So für zufriedenstellende Ergebnisse sollte der Schwerpunkt gleichermaßen sowohl auf der richtigen Vorbereitung von Proben Fluorophor Photoschaltbarkeit platziert werden, um zu optimieren und die zugrunde liegende Ultrastruktur sowie auf die Instrumentierung und Akquisitions Aspekte der Experimente zu erhalten.

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Protocol

1. Imaging Probenvorbereitung

  1. Da die Signale Hintergrund - Fluoreszenz mit der Fluoreszenz von Fluorophor Etiketten stören, reinigen Sie die Deckgläser indem sie zunächst in de-ionisiertem Wasser (ddH 2 O) Spülen und dann an der Luft trocknen sie mit Druckluft. Anschließend Plasmaätzen in einem Plasma-Reiniger für 15 sec oder länger, falls erforderlich, durchzuführen.
  2. Um Driftkorrektur und iPalm Kalibrierung zu aktivieren, verwenden # 1.5 Runde (22 mm Durchmesser) vorgereinigte Deckgläser mit fluoreszierenden Nanopartikel als Markierungszeichen eingebettet, die als hoch licht fiducials für zuverlässige Kalibrierung und Driftkorrektur dienen. Aufgrund der Zeit langen Erfassung erforderlich, um ausreichende Fluorophor Dichte zu akkumulieren (> 15 - 30 min), ist Probe Drift unvermeidlich.
  3. Platzieren Sie jede fiducialed Abdeckglas in einer 6-Well-Gewebekulturplatte. Sterilisieren sie durch ultraviolette (UV) Strahlung in einer laminaren Strömungshaube für 15 min.
  4. In einem sterilen Laminar-Flow-Haube, bereiten FibroNectin Lösung für Abdeckglas Beschichtung durch Verdünnen von 1 mg / ml Fibronektin-Stammlösung in sterilem Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) in einer Endkonzentration von 2 bis 10 & mgr; g / ml. Spülen jedes Abdeckglas dreimal mit DPBS und Inkubation mit 2 ml der Fibronektin-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Anschließend absaugen Fibronektinlösung aus und spülen Sie einmal mit DPBS.
  5. Spülen Sie die Zellen kurz mit DPBS. Inkubieren mit 1 bis 2 ml Trypsin für einige min bei 37 ° C, bis die Zellen abzulösen und schrecke mit ~ 10 ml frischem serumhaltigen Zellkulturmedium. Beispielsweise für den menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), verwenden große Kulturmedium Gefäß endothelial mit großen Gefäß Endothelfaktoren und Penicillin oder Streptomycin ergänzt.
    1. Ausstrich der Zellen auf die Fibronektin-beschichtete Deckglas (für spärliche Dichte, Platte <50.000 Zellen pro Deckglas) und zur Erhaltung der Kultur in einem Inkubator eingestellt bei 95% Feuchtigkeit, 5% CO 2 und 37 & #176; C.
  6. Für eine ordnungsgemäße Erhaltung der feinen Strukturen des f-Aktin - Zytoskelett, verwenden Pufferlösungen auf Basis von Good-Puffer - Reagenzien 27.
    1. Beispielsweise PHEM - Puffer als 2x - Stammlösung (120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, pH 7,0 mit KOH) durch Auflösen von 6,5 g HEPES, 3,8 g EGTA und 190 mg Vorbereitung von MgCl 2 in ~ 300 ml ddH 2 O, wobei der pH auf 7,0 eingestellt durch tropfenweise Zugabe von konzentrierter KOH - Lösung; Dann fügen Sie ddH 2 O , um das Volumen auf 500 ml zu bringen. Sterilisieren Sie den Puffer mit einem 0,22-um - Filter verwenden, lagern Sie es bei 4 ° C, und verdünnen Sie es 1: 1 mit ddH 2 O vor dem Gebrauch.
  7. Für die besten Ergebnisse mit hoher Dichte Kennzeichnung von F-Actin, Verwendung phalloidin mit organischen Fluorophore konjugiert, wie Alexa Fluor 647. Bei der gewünschten Zeitpunkt nach Zelle replating, um die Zellen zu beheben, wie folgt:
    1. Absaugen Medien aus jeder Kultur, die auch die cell Probe. Sanft, aber schnell mit 2 ml warmem (37 ° C) Extraktions Fixiermitteln mit 0,25% Triton X-100, das 0,25% Glutaraldehyd in PHEM-Puffer verzichtet werden. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 bis 2 min. Für nachfolgende Schritte Verwenden 2 ml Fixativ oder Abschrecken Puffer pro Deckglas, sofern nicht anders angegeben.
    2. Ersetzen Sie die Extraktion Fixiermittel mit einer 2,5% Glutaraldehyd Fixiermittel in PHEM Puffer und lassen Sie die Proben 10 brüten - 12 min. Diese und alle folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
    3. Saugen Sie die Fixierungen und sanft sie mit PHEM Puffer ersetzen. Tilt und wirbeln sanft, und dann waschen wieder mit PHEM. Zweimal wiederholen.
    4. Abzuschrecken Autofluoreszenz von Glutaraldehyd, die Signale von den gewünschten Fluorophore überwältigen können, Inkubation der Proben mit einem frisch zubereiteten Abschrecken Puffer, der NaBH 4 bei einer Massenkonzentration von 0,1% in PHEM. Reichlicher Blasen werden beobachtet. Gelegentlich tippen Sie auf die Probenschale sanft Dislodge die Blasen. Lassen Sie es für 5 ausbrüten - 10 min.
    5. Saugen Sie die Löschpuffer und ersetzen Sie sie vorsichtig mit PHEM Puffer. Spülen Sie ein paar Mal um die Blasen zu beseitigen. Pipette in 2 ml PHEM Puffer und lassen Sie es für 5 min im Dunkeln inkubiert. Wiederholen Sie zweimal und lassen Sie die Probe Rest in PHEM Puffer, wenn Sie fertig.
    6. Bereiten Sie eine Feuchtigkeitskammer für Phalloidin Inkubation mit einem großen Kunststoff - Petrischale mit einem Stück Papiertuch mit 5 großzügig befeuchtet gepolstert - 10 ml ddH 2 O. Legen Sie ein großes Blatt sauber Parafilm auf der Oberseite des nassen Papiertuch.
    7. Aufgrund der relativ hohen Kosten von markiertem Phalloidin, verwenden für jede Markierung ein kleines Volumen. Für hochdichte Markierung, mit einer Konzentration von 0,3 uM starten. Bereiten Sie ~ 60 & mgr; l pro Deckglas mit Phalloidin-Alexa Fluor 647 in PHEM Puffer.
    8. Pipette 55-60 ul der phalloidin Lösung auf das Blatt Parafilm in der Feuchtigkeitskammer. Mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Probe covergMädel. Achten Sie darauf, die richtige Zellen enthaltende Gesicht zu beachten.
    9. Schnell und leicht abklopfen entfernt überschüssige Puffer durch den Rand des Deckglases mit einem gefalteten Stück zart saugfähigem Papier zu berühren, und dann das Deckglas Zellenseite legen auf die Tropfen phalloidin Lösung auf dem Parafilm nach unten zeigt. Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen durch das Deckglas gefangen sind.
    10. Legen Sie die Abdeckung auf der Feuchtigkeitskammer. Wickeln Sie die Kammer in Aluminiumfolie zum Schutz vor Umgebungslicht, und lassen Sie die Probe Inkubation über Nacht bei 4 ° C. Die Probe kann in diesem Zustand für mehrere Tage aufbewahrt werden. Stellen Sie sicher, dass die feuchte Kammer feucht bleibt, wenn lange Lagerung geplant.
  8. Vor der Bildgebung, legen Sie vorsichtig die Abdeckglas Zellseite nach oben auf ein neues 6-Well-Platte 2 ml PHEM-Puffer, der pro Vertiefung.
  9. Bereiten Sie Sauerstoff-gespülten Thiolbasis Bildgebung Puffer die folgenden Stammlösungen: 1-M Glucose, 1 M Cysteamin und 100x Glucose-Oxidase / Katalase Enzym mixture (4 mg Katalase und 10 mg Glukoseoxidase in 100 ul PHEM - Puffer, gut gemischt , durch Vortexen) 28. Kurz vor Bildgebung, mischen 75 ul 1 M Glucoselösung, 30 ul 1 M Cysteamin-Lösung und 3 ul 100x Stockenzymmischung. Stellen Sie die Lautstärke auf 300 & mgr; l mit PHEM Puffer und verwenden unmittelbar nach dem Mischen der Probe zu montieren.
  10. Für iPalm, bereiten Sie die Imaging-Probe unter Verwendung eines vorgereinigte # 1.5 Deckglas (22 mm Durchmesser).
    1. Alternativ können Sie einen Glasobjektträger (3 "x 1") mit einem doppelseitig klebenden Abstandshalter in der Anordnung zu unterstützen , wenn Astigmatismus basierten 3D-STORM 12 stattdessen verwendet werden.
    2. Um die Abbildungs ​​Beispiel verwenden feinen Pinzette montieren vorsichtig auf die Probe Abdeckglas aus dem Puffer gut entfernen. Dann schnell und leicht abklopfen entfernt überschüssige Puffer durch den Rand des Deckglases mit gefalteten saugfähigem Papier zu berühren.
    3. Legen Sie die Deckglaszellenseite auf einem sauberen Objektivpapier nach oben zeigt. Spülen Sie die Probedurch Platzieren von 30 bis 50 & mgr; l von Abbildungspuffer auf die Probe, und die überschüssige Puffer entfernen durch Kippen und mit gefalteten absorbierenden Papier tippen.
    4. Wiederholen Sie den Spülvorgang ein paar Mal, und legen Sie dann 30 - 50 & mgr; l von Abbildungspuffer auf die Probe. Blot den Rand des Deckglas trocknen und mehrere sehr kleine Punkte von schnell aushärtenden Epoxid auf die getrocknete Fläche platzieren.
    5. Langsam senken andere vorgereinigte # 1.5 Deckglas (plain, rund Abdeckglas, 18 mm Durchmesser) auf die Mitte der Zelle enthaltenden 22-mm-Deckglas. Lassen Sie den Imaging-Puffer beide Deckgläser durch Kapillarwirkung benetzen. Die kleinen Punkte von schnell härtenden Epoxid sollte an beiden Deckgläsern haften.
    6. Drücken Sie vorsichtig auf die zusammengesetzten Probe gefaltet saugfähigem Papier mit gleichmäßig um den Druck zu verbreiten. Verwenden Sie einen ausreichenden Druck der Probenzelle dünn und sogar (<15 & mgr; m) zu machen, aber nicht so viel wie die Zellen zu vernichten. Spur die richtige Dicke durch die Ringe Muster Newton beobachten. Also, stellen Sie sicher, dass diese st ausführenep sanft Luftblasen zu minimieren. Bei Bedarf üben mit leeren vorher mehrmals Deckgläsern.
  11. Verschließen Sie die Probe mit geschmolzenem Vaseline-Lanolin-Paraffin (VALAP, Lager , hergestellt aus je 100 g Vaseline, Lanolin und Paraffin, zusammengeschmolzen) 29, spülen Sie die versiegelte Probe mit ddH 2 O und Föhnen mit Druckluft. Die Probe ist nun bereit für die für die Bildgebung auf das Mikroskop Montage.

2. Proben Platzierung und Ausrichtung iPalm

  1. Bewegen Sie den gefederten oberen Objektivlinse nach oben für die Entfernung des Probenhalters zu ermöglichen. Legen Sie die versiegelte Probe vorbereitet in Schritt 1.10 auf den Probenhalter und sichern mit mehreren kleinen Seltenerd-Magneten. Anwenden Sionsöl auf beiden Seiten der Abbildungsprobe. Setzen Sie den Probenhalter zurück in den optischen Pfad und sanft die obere Objektivlinse zu senken.
  2. Schalten Sie den Anregungslaser. Schalten Sie den Elektronenvervielfachungs Charge-Coupled Device (EMVCD) Kamera im Rahmen-Übertragungsmodus.
    1. Drehen Sie in den richtigen Emissionsfilter. Aktivieren Sie einen mechanischen Verschluss der oberen Strahlengang (Abbildung 1A) und öffnen Sie den unteren Strahlengang zu blockieren. Bringen Sie die untere Objektivlinse in den Fokus durch Übersetzung in kleinen Schritten den Piezo-Aktor verwendet wird.
    2. Sobald der Fiducial im Fokus ist, öffnen Sie den Pfad oberen Balken, während die untere Strahlengang blockiert und die obere Objektivlinse in den Fokus auf eine ähnliche Art und Weise bringen. Überwachen der Breite der Justiermarke auf der Computeranzeige für eine optimale Fokussierung.
  3. Für eine korrekte Zentrierung offen sowohl für die oberen und unteren Strahlengänge. Manuelle Einstellung der oberen Objektivlinse, während die untere Ziel konstant gehalten wird, ein Paar von mikrofeinen Satz Schrauben, bis die Fiducial Bilder so nah wie möglich überlappen, idealerweise innerhalb eines Pixels.
    1. Anschließend führen Sie die Feineinstellung, so dass die Fiducial Bilder in Schritt 2.3 Überlappung innerhalb eines Zehntel eines EMCCD Pixel. Stellen Sie die obere2-Achsen-Piezo montierte Spiegel über die Steuerungssoftware und halten die beiden Objektivlinsen und die untere Reflexionsspiegel konstant. Vergleichen der Zentren der Justiermarken der oberen und der unteren Objektiv Ansichten über den Computerbildschirm, den Prozess zu führen.

3. Kalibrierung des iPalm-Setup

HINWEIS: Da die Fluoreszenzemission inkohärent ist, für eine Interferenz in iPalm beobachtet werden, die Weglängen durch die oberen und unteren Ziele müssen innerhalb von wenigen Mikrometern zueinander, in der Nähe sein. Dies kann wie folgt erreicht werden:

  1. Mit den Laser auf die Kameras kontinuierlich Streaming und sowohl die oberen und unteren Strahlengänge offen, schwingen die Probenhalter z-piezo unter Verwendung einer sinusförmigen Spannungswellenform von der Steuersoftware für eine kontinuierliche z-Achse Schwingung über eine Amplitude von 400 nm erzeugt, .
  2. Unter Ausnutzung der Tatsache, dass, wenn aus der optimalen Ausrichtung variiert die Intensität fiducial wenig mit ter Schwingung, zu übersetzen manuell den motorisierten Strahlteilerbaugruppe nach oben oder nach unten, bis die Intensität der Fiducial oszilliert aufgrund der Ein-Photonen-Interferenzeffekt erwünscht ist. Dies bedeutet, die enge Anpassung der optischen Weglängen. Ein Spitze-Tal - Verhältnis von> 10 können in optimalen Fällen (Figur 1D) erreicht werden.
  3. Um sicherzustellen, dass sowohl die Amplitude und die Phase an jeder Oberfläche sind so gleichförmig wie möglich über das Feld, stellen Sie den unteren Spiegel des Strahlteileranordnung in kleinen Schritten, um eine Feinabstimmung des Spaltes und die Neigungswinkel. Führen Strahlteiler Feinausrichtung durch die Probe in 8 nm z-Schritten über 800 nm zu übersetzen.
    1. Überwachung der Fiducial Intensität unter Kameras # 1 - 3. Die Höhe, Position und Neigung des unteren Spiegels innerhalb des Strahlteilerbaugruppe in kleinen Schritten, so dass die Schwingungsphase der Kamera # 1 relativ zur Kamera 2 # maximiert ist, im Idealfall bei 120 ° (1B-D).
    2. Sobald die ersteAusrichtung abgeschlossen ist, übersetzen die Probe für ein geeignetes Sichtfeld zu scannen, die beide Zellen zu Bild enthält und mehrere Justiermarken in der Nähe. Legen Sie ein Gehäuse um das System Streulicht und Umgebungsstörungen zu blockieren. Mit dem Befehl "Acquire Kalibrierung Scans vs Beispiel Piezo-Position" in der Hauptoberfläche Nachdem der Imaging-Bereich gefunden wird, durchführen 3.4 das Verfahren in einem Schritt wieder, und die Kalibrierungskurve für die Verwendung in nachfolgenden z-Koordinaten Extraktionen aufzuzeichnen.

4. Datenerfassung

  1. Sobald eine gewünschte Bereich gefunden wird und die Kalibrierungskurve erhalten wird, geben Sie die entsprechenden Dateinamen in die Software. Öffnen Sie sowohl die obere und untere Strahlengänge. Erhöhen Sie die Anregungsleistung des 642-nm-Laser auf Maximum. Für Alexa Fluor 647 kann eine anfängliche Dauer von Fluorophor Abschalten benötigt werden (2A).
    1. Belichten mit einer konstanten 642-nm-Anregung für 5 min oder länger, falls erforderlich, bis single Molekül blinkt beobachtet (2B). Die Software ermöglicht eine automatische Erhöhung der 405-nm-Photoaktivierung im Verlauf der Übernahme. Eine große Anzahl von Akquisitionsrahmen sind in der Regel erforderlich für filamentöse Merkmale deutlich sichtbar sind (> 50.000 Frames). Wenn Sie bereit sind, beginnen die Akquisition von rohen Bild setzt den Befehl "Start iPalm Acquisition" in der Hauptoberfläche.
  2. Während der Akquisition, stimmen die Photoaktivierungsniveau , indem die Intensität des Lasers 405-nm Einstellen der richtigen Blink Dichte zu halten , wie (siehe Beispiele in 2B) benötigt.
    HINWEIS: Sobald die Übernahme abgeschlossen ist, wird die Software automatisch die Bilddateien in die richtige binäre Format konvertieren. Die Daten-Repository in der Berechnung Server als Netzwerk-Laufwerk, sind die Daten damit direkt dort zur weiteren Verarbeitung kopiert werden.

5. Datenverarbeitungand Analysis

  1. Führen Lokalisierung Analyse einer speziell entwickelten Software Best-Fit - Parameter für alle einzelnen Molekülen sowie für die fiducials 11,15,23 zu extrahieren. Dies ergibt nicht nur die x, y-Koordinate, sondern auch die Intensität, die für die Kalibrierungskurvenanalyse verwendet wird.
    1. Importieren Sie die rohen Kalibrierungsdaten in Schritt erworben 3.5 mit dem Befehl "Extrahieren Peaks Mehrere Labels" unter dem Menü "Datei" die Einzelmoleküllokalisierung durchzuführen. Nach der anfänglichen Lokalisierungsanalyse, Koordinaten von Kameras # erhalten 1-3 vorhanden sind, in Rot, Grün und Blau-Kanäle sind, und können zur weiteren Analyse mit dem Befehl gespeichert werden "Speichern verarbeitet, wie IDL (.sav)" unter dem " Datei "-Menü.
  2. Zu bringen , Daten von Kameras # 1 - 3 in den Registrierung der Fluoreszenz fiducials mit auf den Deckgläsern eingebettet, wählen Sie mehrere helle fiducials Abdeckung des zentralen Bild zu liefern (zBAbbildung 1B) den Befehl "Anchor Fiducial - Punkte" im "Bild - Transformation" Menü. Verwenden Sie die dreifache Sätze von Lokalisierung von Kameras # Koordinaten 1 - 3 den hellen fiducials in Schritt 5.1 die Rotations- und Skalierungsmatrix zu berechnen, die Kameras # 1 und # 3 in das Register mit der Kamera # 2 bringen wird. Mit einer ausreichend großen Anzahl von fiducials höherer Ordnung kann Polynom Warping für bessere Anpassungen durchgeführt werden.
  3. Sobald die Transformationsmatrix berechnet wird, transformieren die Rohdaten der Kameras # 1 - 3 zusammen die summierten Rohdaten zu erhalten. Führen Sie eine weitere Runde der Lokalisierung Analyse eine genauere x zu erhalten, Y-Koordinate und den relativen Beitrag der einzelnen Kamerakanäle zu dem summierten Rohdaten zu bestimmen; verwenden Sie den Befehl "Trans Raw, Speichern und Speichern Sum (.dat)" unter "Bild-Transformation" Menü. Das Intensitätsverhältnis enthält die z-Koordinateninformationen.
  4. Wählen Sie eine helle Fiducial und führen z-Kalibrierung Einpassen der Funktion "Test Wind-Punkt-3D" im Pop-up-Dialog von "Z-Koordinate Operationen" unter dem "Sonderfunktionen" Menü klicken. Dies passt 3-Sinusfunktionen zu den Intensitäten der drei Kamerakanäle der Eichkurve zu bestimmen. Die Kalibrierungsdatei wird dann zur weiteren Verwendung auf den wichtigsten Datensätze gespeichert.
  5. Um die Qualität der Eichkurve zu testen, führen z-Koordinaten Extraktion, wie zuvor beschrieben 23. Für wohlerzogene fiducials in einem gut kalibriertes System, die z-Koordinate sollte linear skalieren, da die Kalibrierungsdatensätzen mit einem linearen Sweep in z-Position genommen werden. Darüber hinaus sollte die z-Positionen aller Justiermarken mit einer ähnlichen Steigung erklimmen.
  6. Sobald eine zufriedenstellende Kalibrierung erhalten wird, führen Sie die Lokalisierung und Transformation-Analyse für die RAW-Bilddatensätzen in Schritt erworben 4 folgende gleiche Verfahren in Schritten beschrieben 5,1-5,3. Wenn Sie fertig sind, laden Sie die Kalibrierungsdatei aus Schritt 5.4 und führen z-Koordinate Extraktion der Funktionen "WND Datei-Pick" und "Extrahieren Z-Koordinate" im Pop-up-Dialog von "Z-Koordinate Operationen" unter dem "Sonderfunktionen" Menü klicken.
    HINWEIS: Da die Erfassungszeit> 15 min, mechanische Drift ist zu erwarten.
  7. Um Driftkorrektur in x ausführen, y, wählen Sie eine helle Fiducial aus den Lokalisierungskoordinaten. Diese Fiducial sollte in allen Frames vorhanden sein. Verwenden Sie dann die x, y-Koordinaten - Drift des Fiducial alle anderen Koordinaten innerhalb des gleichen Rahmens auszurichten zurück in Registrierung (3A-B) mit der Funktion "Test / Write Guide Star" unter "Bild - Transformation" Menü. durch Zugriff auf den "Test Guide Star" und "Write Guide Star" Funktionen in der Pop-up-Dialog ähnlich ausgeführt werden, indem Sie auf "Z-Koordinate Operationen" unter dem "Sonderfunktionen" Menü Z-Koordinaten-Registrierung kann.
  8. Da die Probe leichte Neigung aufweisen kann, Neigungskorrektur durch die Bereitstellung der x, y, z-Koordinaten von drei Referenzpunkte definieren die Ebene auszuführen, die Ebene mit der Funktion "entfernen XYZ Tilt" im Pop-up-Dialog, indem Sie auf "eingestellt werden sollte Z-Koordinaten-Operationen "unter dem" Sonderfunktionen "Menü.
  9. Im Anschluss an die Drift und Neigungskorrekturen, speichern Sie die Lokalisierungskoordinaten. Rekonstruieren einer Super - Resolution - Bild für die weitere Analyse (4A-D) mit dem Befehl "Render" auf dem Hauptbildschirm. Farbe kann die z-Koordinate, um anzuzeigen, verwendet werden. Alternativ kann auch eine Seitenansicht des ausgewählten Bereichs wiedergegeben werden. Die Lokalisierungskoordinaten können als Textdateien zur weiteren Quantifizierung exportiert werden, oder das rekonstruierte Bild kann als TIF-Datei gespeichert werden.

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Representative Results

Kritische Anforderungen für iPalm sind die Ausrichtung, Registrierung und Kalibrierung der optischen Systeme. Diese sind notwendig, geeignete Störungen innerhalb der 3-Wege-Strahlteiler erforderlichen, um sicherzustellen, für die Extraktion z-Koordinate. Damit eine kontinuierliche Überwachung, konstante Punktquellen der Fluoreszenz erforderlich. Dies kann unter Verwendung von fluoreszierenden Au erreicht oder Bi-Metall - Nanopartikel 23 , deren Photolumineszenz entstehen aus lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR). Sie wirken als eine stabile einzelne Dipol bei Beleuchtung und kann in der Regel mit 5 lokalisiert werden - 10 nm Genauigkeit. Diese kommerziell erhältlichen Nanopartikel emittieren einen Helligkeitspegel innerhalb des Bereiches der meisten Einzelmolekül Fluorophoren, so dass sowohl die Fluorophore und die Justiermarken können mit ähnlichen Anregungsintensitäten und Verstärkungseinstellungen auf den EMCCD Kameras abgebildet werden, ohne Sättigung (1B). Darüber hinaus unterstützen die fiducials stark facilitate konzentriert, wobei die scheinbare Breite der fiducials kann während der Fokuseinstellung überwacht werden. Auch stringent Reinigung der Abdeckglas Oberfläche, wie durch Piranha Ätzen oder Plasma-Reinigung ist auch erforderlich, da störende Hintergrundfluoreszenz ungereinigter oder schlecht gereinigt Deckgläsern leicht Einzelmolekülsignale überwältigen kann, wie zuvor beschrieben.

iPalm beruht auf mehrphasige Interferometrie hochpräzise z-Koordinatenmessung gleichzeitig mit PALM (für x, y) zu ermöglichen. Im iPalm Instrument jedes Fluoreszenzphoton emittiert kann berücksichtigt werden durch beide optische Wege zu propagieren, die dann in einem speziell hergestellten 3-Wege-Strahlteiler Selbst stören. Die z-Koordinate ist somit in der Phase des interferierenden Photons kodiert. Die gegenseitigen Phasendifferenzen von ~ 120 ° der Ausgangsstrahlen aus dem 3-Wege-Strahlteiler Ergebnis der Intensitätsvariation der Einzelmolekülbilder zwischen dem 3 cameras, so dass z - Extraktion aus einer Eichkurve , zu koordinieren. Auf dieser Grundlage ist die iPalm Probenhalteranordnung ein wesentlicher Bestandteil, da es mit einem Paar von piezoelektrischen Aktuatoren ausgestattet ist, die nm-precision Translation in z ermöglichen, die für die Ausrichtung und Kalibrierung verwendet werden können.

In der richtigen Ausrichtung und Ausrichtung, die Translation der Probe entlang der z-Achse wird einen Interferenzeffekt erzeugen. Dies wird als die Oszillation der Fiducial Intensität zwischen den drei Kamerakanäle (1C-D) manifestiert. Diese Schwingungen auch an, dass sowohl die obere und untere optische Strahlengänge sind nahezu abgestimmt, so dass Einzelphotonen Störungen. Üblicherweise wird bei Einschalten des Gerätes werden die Anfangsphasen jeder Kamera wird nicht optimal sein, und die Abtastung des z-Position wird als ein diagnostisches Werkzeug für die Kalibrierung und Ausrichtung erforderlich. bei den optimalen Phasen der untere Spiegel des Strahlteilers ankommen(1A) kann mit Hilfe des piezoelektrischen Bühne Tip-Tilt eingestellt werden. 20 nm Einstellung - Die Kalibrierungsabtastung von z-Position wird nach jedem kleinen 10 genommen. Die Intensität des Fiducial in jedem Kanal wird dann durch Lokalisierungsanalyse bestimmt (dh mit einer 2D-Gauß - Funktion passend). Die Intensität von Gesamtintensität normalisiert durch eine Sinuswellenform angenähert werden, so dass der Phasenterm berechnet werden; Somit kann die Phase jeder Kamera entspricht , bestimmt werden, wie in Figur 1C zu sehen. Wir nehmen zur Kenntnis, dass die Single-Photon-Interferenzprinzip in iPalm verwendet wird, kann auch eine viel einfachere 2-Wege-Strahlteiler demonstriert werden. Jedoch ist ein 2-Wege-Strahlteiler für 3D Superauflösungsmikroskopie da an oder nahe der Grenze von destruktiver Interferenz, wobei das Signal in einem Kanal unpraktisch ist minimal, in verrauschten Schätzungen der Intensität und Lokalisierung Koordinaten führt, die effektiv die Filterung der z-Koordinate Bestimmung zur range, wo beide Kameras erhebliche Intensität (<100 nm) haben. Die minimale Anzahl von Kanälen um diesen Effekt zu überwinden , benötigt drei ist , und 3- und 4-Wege - Projektionssysteme sind in der Literatur beschrieben worden 11,30.

Unter optimalen Bedingungen für ein 3-Wege-Strahlteiler, sollten die Phasendifferenzen zwischen den Kameras 3 etwa 120 ° betragen. Das 3-Wege - Strahlteiler für iPalm enthält 3 reflektierenden Schnittstellen, wie in Figur 1A schematisch dargestellt. Der Strahlteiler ist über einer flachen dielektrischen Spiegel positioniert ist, mit einem dünnen Spalt mit Brechungsindexanpassungsöl gefüllt ist, eine Feineinstellung der Pfad innerhalb des Strahlteilerlängen zu ermöglichen und eine optimale Phasenunterschiede zu erzielen. In der richtigen Ausrichtung für iPalm, die Kameras sind in der Nähe einer 120 ° gegenseitigen Phasendifferenz wie in 1C-D, gezeigt. In der Praxis wird eine Phasendifferenz größer als 105 ° im Allgemeinen akzeptabel. Eine solche Kalibrierung sowohl indicates, dass das System gut ausgerichtet ist, und dass es für die nachfolgende z-Koordinaten Extraktion verwendet werden. Es ist auch hilfreich, um die Kalibrierungskurve zu bewerten verschiedene fiducials erzeugt. Die meisten fiducials mit mäßiger Helligkeit emittieren im Allgemeinen als ein einziges Dipol, gut erzogene Kalibrierungskurven ergibt. (Die oft mit extremer Helligkeit) jedoch gelegentlich Aggregate von fiducials kann in einer anomalen Weise verhalten, wodurch man unzuverlässig Kalibrierungskurven. Es ist auch ratsam , fiducials nahe dem Zentrum des Abbildungsfeldes zu wählen und in der Nähe der Gegend von biologischem Interesse (1B), zumal die hohe NA Ziele Linse im iPalm Setup verwendet wird , ist nicht flach-Feld korrigiert. Das effektive Feld-of-view ist mit dem zentralen Bereich, ergibt sich aus den größeren fiducial Breiten zum Rand des Feldes begrenzt.

Im Anschluss an die anfängliche Ausrichtung der Felder-of-view-Zellen mit wünschenswerten mo enthaltendrphology und mehrere fiducials gute Kalibrierung zu gewährleisten, sind für die Bildgebung gewählt. Dies kann durch langsames Verschieben des Probenhalters mit 2-Achsen-Servomotor Antriebe erreicht werden. Die Übersetzung der Probe wird in einem gewissen Unschärfe führen, da die Probe nicht immer perfekt flach ist. Daher werden Fokus muss kontinuierlich während der Übersetzung eingestellt. Sobald das Bildfeld ausgewählt wurde, um eine weitere Runde der Kalibrierung die Kalibrierungskurve optimieren wird dann die Systemausrichtung auf die Feinabstimmung durchgeführt wird und die tatsächliche Kalibrierungskurve zu erhalten. Wichtig ist, dass Flächen unter den Kern oder in der Nähe von Gebieten mit heterogenen Brechungsindex (zB Luftblasen) in der Regel vermieden werden, da diese erhebliche Veränderung des relativen Pfad verursacht Längen, verzerren die z-Koordinate.

Mit hoher Dichte Kennzeichnung, Fluoreszenzsignale aus organischen Fluorophore wie Alexa Fluor 647 kann sehr hell sein. Wie ich gezeigtn 2A, mit der richtigen Vorbereitung Puffer enthält , sollte eine hohe Konzentration an Thiol (-SH) -Gruppen 31, der Fluorophor schnell geschaltet werden unter hohen Anregungsbeleuchtung ausgeschaltet. Dies resultiert in der Unterdrückung der Fluoreszenz-Signale von der Mehrzahl der Moleküle. Bei einem gegebenen Fall eine sehr kleine Minderheit von Fluorophore Rückkehr stochastisch in den "Ein" -Zustand. Diese sind zu erwarten, dünn verteilt und kann somit als einzelne Moleküle für eine oder ein paar Frames sichtbar gemacht werden vor dem Einschalten "off". Die Photoschaltung Dynamik sind stark abhängig von der Anregungsintensität und der Konzentration von -SH und somit für ein gegebenes System, muss darauf geachtet werden, die richtige Markierungsdichte, besonders, da eine relativ hohe Anregungsintensität zu optimieren (640-647 nm) benötigt, um eine Mehrheit von Alexa Fluor 647 Moleküle auszuschalten. Wenn die Erregung nicht ausreichend stark, ein signifikanter Anteil von Alex Fluor 647 Willenin der "on" Zustand bleiben, in hohen Hintergrund führt, Schwierigkeiten bei der Einzelmolekül-Fluoreszenz beobachtet, und schließlich, schlechte Qualität Ortungsergebnisse Einzelmolekül. Unter einem richtig ausgeglichenen Zustand, Einzelmolekül - Rohdaten sollte eine ausreichend große Anzahl von Molekülen (hunderte) pro Bild (2B) enthalten, während jedes Molekül spärlich genug ist , eindeutige Erkennung und Lokalisierung Analyse zu ermöglichen. Es ist auch erwähnenswert, dass für iPalm, die Grundsätze der Photoschaltbarkeit denen von PALM oder STORM identisch sind, und damit die Proben richtig vorbereitet für iPalm kann direkt auf die einfachere 3D-PALM oder 3D-STORM-Systemen verwendet werden. Um eine ausreichend hohe Dichte von Molekülen erwerben , um Nyquist erfüllen, in der Regel 50.000 oder mehr Frames von Rohdaten erforderlich sind (dh 150.000 Gesamtrahmen für die drei Kameras). Da der Erwerb voranschreitet, könnte eine zunehmende Anteil an Fluorophore durch destruktive Photobleichens erschöpft sein, in Holm resultierendeser Einzelmoleküldichte. Um dies zu, kurze Pulse von 405 nm blaues Licht (405 nm) kompensieren kann auf die Probe in Intervallen beleuchtet werden, um Fluorophore Aktivierung fördern.

Aufgrund der Zeit lange Akquisition erforderlich ist, um optimale Ergebnisse für iPalm (oder allgemein Lokalisierungsmikroskopie Einzelmolekül) erfordern geringen Probendrift und / oder gute Driftkorrektur. Zum Beispiel ist die Belichtungszeit von 50 ms in Frame-Transfer-Modus (20 Hz Bildrate), die Gesamtaufnahmezeit für 50.000 Frames unter Verwendung von 42 min. Während dieser Zeit wird die mechanische Drift über zehn nm erwartet. Tatsächlich, zusätzlich zu der hohen Lokalisierungsgenauigkeit und hohe Markierungsdichte, die Auflösung hängt auch von Driftkorrektur Qualität. Es gibt mehrere Ursachen für diese Drifts mit Temperaturschwankungen eine Hauptursache zu sein. Aufgrund dieser Überlegung, wo möglich, werden Teile iPalm Verwendung Invar, einen niedrigen Wärmeausdehnungslegierung oder Edelstahl individuell bearbeitet,beide haben viel niedrigere Wärmeausdehnungseigenschaften als Messing oder Aluminium. Leider ist dies erlegt auch zusätzliche Kosten im Vergleich zu Aluminium, die eine häufig verwendete Metall für optomechanische Komponenten ist, viel billiger und leichter zu bearbeiten ist. Andere Quellen von Drift können mechanische Schwingungen von Peripheriegeräten, Umgebungs Umgebungen oder Luftströmungen sein. Diese sollten, indem das System in einem geeigneten Gehäuse und durch Umlenken der Luftströmungsrichtung in dem Mikroskopbereich minimiert werden. Das Setup sollte auf einer Forschungsqualität optischen Tisch und, wenn möglich, Fan haltige Komponenten platziert ausgeschaltet werden sollte, die optischen Tisch aufgebaut werden. Doch trotz aller Vorsichtsmaßnahmen, wird eine gewisse Menge an Drift bleiben. Entscheidend ist, müssen diese Driften solche minimiert werden, dass das Bild im Fokus in der gesamten Erfassungszeit bleibt. In unseren Systemen, genügen diese passiven Methoden Drift auf ein akzeptables Maß zu minimieren. Es sollte jedoch möglich sein, aktive drift com zu implementierenEntschädigungsverfahren 32 langfristige und hohe Präzision Bildgebung zu ermöglichen.

10 Millionen Einzelmolekül Spitzen pro-Datensatz - in der Regel 5 Nach der Verarbeitung der Rohdaten, Lokalisierung 3D-Koordinaten können mit erhalten werden. Wie in Figur 3 gezeigt ist , kann die Drift als eine Funktion der Zeit von den Lokalisierungs Koordinaten der Justiermarken visualisiert werden. Mehrere Justiermarken kann die mittlere Driftkorrektur Trajektorie (3A-B) zu berechnen. Auch ist es üblich, Spitzen, um herauszufiltern, die schlecht in den 2D-Gauß-Funktion bei der Lokalisierung Analyse passen. Dies könnte durch unbeabsichtigtes Geräusche oder teilweise überlappende Einzelmolekülspitzen sein und kann während des Anpassungsprozesses, berechnet durch die große Restquadratfehler unterschieden werden. Peaks mit niedriger Helligkeit (wie durch die Photonenzählung angegeben) und somit höhere Unsicherheit (dh größer als ~ 25 nm) sind ebenfalls abfiltriert, as diese wahrscheinlich aus nicht-spezifische Hintergrundfluoreszenz auftreten. In ähnlicher Weise Spitzen, für die die Intensitäten der drei Kamerakanäle schlecht auf die Kalibrierungskurve passen, werden ebenfalls abgelehnt, da die erhaltenen z-Koordinaten unzuverlässig sind. Es sollte beachtet werden , dass der volle Informationsgehalt der iPalm (und Lokalisierungsmikroskopie im allgemeinen) massiv ist, da die Analyseergebnisse nicht nur in den Fluorophor - Koordinaten, sondern auch in mehrere zusätzliche Parameter wie Intensität, Breite, Helligkeit usw. Jedoch in der Praxis für die Analyse im Raum zu koordinieren, da relativ wenige Rechentools zur Zeit verfügbar sind, werden Lokalisierungskoordinaten typischerweise gemacht oder rekonstruiert in pixelbasierte Bilder für die weitere Analyse.

Die am häufigsten verwendete Ansatz für iPalm Bildrekonstruktion ist jede Lokalisierungs Koordinate mit einer normierten 2D-Gauß-Funktion darstellen, mit der Lokalisierung Unsicherheit als Gau gesetztssian Breite 33. Somit erscheinen die hochgenaue Koordinaten (in der Regel Einzelmolekülspitzen mit hoher Helligkeit gegenüber niedrigen Hintergrund) so scharf und schmalen Peaks, während die niedriger Genauigkeit Koordinaten (in der Regel geringer Helligkeit oder hohen Hintergrund Einzelmolekülspitzen) als Dimmer erscheinen und breiter Spitzen. Auf diese Weise trägt jedes Molekül die gleiche Menge an Intensität zu dem Bild. Für einen 3D - Datensatz, die z-Koordinate unter Verwendung von Farbe dargestellt werden, in der Regel auf der Grundlage eines Farbtonskala (4C-D). Alternativ können die Bilder als eine Seitenansicht (x, z und y, z) Vorsprung oder als Volumina gezeigt. Eine Reihe von öffentlich zugänglichen Software kann verwendet werden , solche Daten 34 zu visualisieren.

Wie in den Figuren 4-6, Ausbeute iPalm Bilder , die eine signifikante Verbesserung gegenüber beugungsbegrenzten Fluoreszenzmikroskopie. Die F-Actin-Architektur in HUVEC-Zellen mit wesentlich verbesserten räumlichen Reso sichtbar gemacht werdenlution. In Bereichen der Hirnrinde, Netzwerke von unterschiedlichen Filamente können während in Stressfasern, Bündel ersichtlich, und Lamellipodien, die dicht gepackte F-Aktin-Netzwerken beobachtet ein filamentöser Textur zu haben, auch wenn einzelne Filamente nicht unterscheidbar sind. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der Beschränkungen sowohl in der Helligkeit der Fluorophore und der Lokalisierungspräzision. Die Anwesenheit von verschiedenen kortikalen Fäden legt nahe, dass die Ultra des f-Actin-Netzwerk ist ausreichend gut erhaltene; Somit ist ein nützliches Werkzeug für die Charakterisierung der kortikalen Architektur sein iPalm könnte. In 5 ist ein Teilbereich einer HUVEC Zelle ist mit den Profilen einer Aktin - Filament quantifiziert angezeigt. Man erkennt, dass die z-Histogramm eines Filaments gesehen werden etwa 15 nm in der Breite ist, relativ klein im Vergleich zu ~ 45 nm für die Querrichtung (x, y) Ansicht, die zeigen, dass iPalm eine signifikante Verbesserung der Auflösung in z-Auflösung relativ nachgibt die x, y-Ebene, wie erwartet. Da jedoch der actual Durchmesser von F-Aktin ist ~ 8 nm, ist es unklar, ob die beobachteten Filament ein einzelnes Filament oder ein Bündel von wenigen Filamenten. Korrelativen Bildgebung iPalm und EM könnte eine nützliche Strategie für die weitere Charakterisierung von F-Actin - Architektur sein, obwohl dieser Ansatz wurde nicht angewendet F-Aktin noch 23 zu studieren.

Abbildung 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der iPalm 3-D Super Resolution Mikroskopie. A) Schema von iPalm Optik. Die Dual-Objektive (Nikon, NA 1,49 60X) ermöglichen jedem emittierten Fluoreszenzphotons sowohl durch die oberen und unteren optischen Strahlengänge zu propagieren, und sie sind in den Strahlteiler durch ein Paar von Spiegeln bei 22,5 ° ausgerichtet zu stören umgeleitet. Die Phase der Selbst gestört Photons ist direkt proportional zu & dgr; Z und so codiert, die z-Koordinate des Fluorophors und kann us gemessen werdening ein 3-Wege-Strahlteiler mit gegenseitigen Phasendifferenzen von ca. 120 ° zwischen den drei Ausgangsstrahlen. (- F3 F1) sie werden durch die Rohr Linsen (L1-L3, f = 400 nm) gefiltert und durch Emissionsfilter konzentriert. Jedes einzelne Molekül scheint daher mit unterschiedlichen Intensitäten zwischen den Kameras (EMCCD1-3) , aber auf ähnliche x, y-Koordinaten. (A) wiedergegeben wird und modifiziert von Ref. 11. (B) beugungsbegrenzte Abbildung von HUVEC markierten Zellen für f-Aktin mit Alexa Fluor 647. Helle Flecken bezeichnen Au Nanopartikel fiducials. Die Phasenwinkel für Kameras # 1 - 3 sind mit roten, grünen und blauen Linien dargestellt, die jeweils auf jeder Fiducial zentriert, mit der Phasendifferenz zwischen den Kameras # 1-3 angegeben. Maßstabsbalken:. 5 um (C) Fiducial Bilder die interferometrische Effekte zeigt. Bilder eines Au-Nanopartikel Fiducial für jede Kamera (CCD1-3) oder total (Summe), als z-Position genommen (in nm, auf untere Reihe) wird für die Kalibrierung gescannt. Die Intensität innerhalb each Kamera kann mit einer Phasenbeziehung gesehen zu oszillieren, wie gezeigt in (B). (D) iPalm Kalibrierungskurve. Die Probe wird entlang der z-Achse verschoben. Die Intensitäten eines Au-Nanopartikel Fiducial für die EMCCD1-3 sind zeigen, wie rot, grün und blau Linien bzw. (oben). Diese werden dann normalisiert und passen die Phasendifferenzen (unten) zu bestimmen. Während der Ausrichtung wird das System die maximale Phasenunterschiede zwischen allen drei Kameras zu erreichen, eingestellt. Die Kalibrierungskurve bei jeder Bildstelle genommen wird bei der Extraktion von der z-Koordinate jedes einzelnen Moleküls zu verwenden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Single Molecule Imaging von Photoschalten AlEXA Fluor 647-Phalloidin als Actin Labels. (A) Anfangs Photoschaltbarkeit Schritt. F-Actin in fixierten Zellen mit einer hohen Dichte gekennzeichnet durch Phalloidin konjugiert Alexa Fluor 647. Hohe Intensität Beleuchtung in einem thiolhaltigen Bildpuffer führt zu einer schnellen Abschaltung der meisten Fluorophore. (B) Repräsentative Rahmen von rohem Einzelmolekül Frames. Im Steady-State-Blinken sollte die aktivierte Alexa Fluor 647 ausreichend spärlich sein, dass einzelne einzelne Moleküle als PSF-Größe vor Ort erscheinen. Bilder von den gleichen Zellen in (A) gezeigt, mit inverser Kontrast gezeigt. Maßstabsbalken in A und B:. 5 & mgr; m Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Driftkorrektur mit Multip. le Fiducials Lokalisierung Koordinaten für vier Justiermarken (A, x-Koordinate; B, Y-Koordinate) wurden verwendet , um Drift mit Polynom Armaturen (5. Ordnung, Fitparameter oben rechts) zu berechnen. Die durchschnittliche Driftbahn ermöglicht die Korrektur der Drift mit Unter 5 nm Genauigkeit (x: 3,085 nm, y: 3,606 nm). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Visualisierung von 3-D - F-Actin - Architektur von iPalm. (A) beugungsbegrenzte Abbildung von HUVEC - Zellen mit markiertem F-Aktin von Alexa Fluor 647-Phalloidin (entsprechend subareas der Zelle in Figur 2). Der helle Fleck ist aufgrund der Au-Nanopartikel fiducials. (C) Reconstructed iPalm Bild Koordinate durch eine 2D-Gaussian mit der Breite entsprechend Lokalisierungsunsicherheit mit jeder Lokalisierungs gerendert. Die z-Koordinate entsprechend dem Farbbalken gefärbt. Bereiche dicht und spärlich fädigen Merkmale zu erkennen. Maßstabsbalken (AC): 1 um (D) Zoom-im Hinblick auf eingerahmten Bereich in C fädigen kortikalen Aktin - Topologie zeigt.. Maßstabsbalken:. 250 nm Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Nanoskalige Dimension von F-Actin durch iPalm Visualisierte. (A) Rekonstruierte iPalm Bild HUVEC - Zellen mit F-Actin markiert b y Alexa Fluor 647-Phalloidin. Die Farbe zeigt die z-Koordinate entsprechend der Farbleiste. Maßstabsbalken:. 1 um (B) Querschnitt Histogramm von x, y-Koordinaten die Lokalisierung entlang der langen Achse des eingerahmten Bereich in (A). Um das Histogramm zu erhalten, werden die Koordinaten auf die Längsachse des Kastens projiziert und binned mit einem 5-nm bin-Größe. Die graue Kurve zeigt eine Gaußsche beste Anpassung an das Histogramm, mit einer vollen Breite bei halbem Maximum (FWHM) von 43,88 nm. (C) Histogramm der z-Position der Lokalisation im eingerahmten Bereich Koordinaten in (A). Die z-Positionen sind mit einem bin Größe von 1 nm binned. Die graue Kurve zeigt eine Gaussian beste Anpassung an das Histogramm mit einer FWHM von 17,50 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6:. Vergleich von iPalm Imaging von f-Actin Verschiedene Markierungsreagenzien Mit Rekonstruierte iPalm Bilder von F-Aktin mit Hilfe markierter Alexa Fluor 647-Phalloidin (A), Alexa Fluor 568-Phalloidin (B), oder durch Transfektion mit Actin -mEos2 Fusionsprotein - Expressionsvektor (C). Maßstabsbalken (AC):. 1 & mgr; m Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das optische System iPalm basiert auf einem 4-π dual-Gegensatz Ziel - Design, wie in 1A gezeigt. Die Einrichtung ist mit konstruiert sowohl individuell bearbeitet und kommerzielle opto-mechanische Teile, wie bereits 23 beschrieben und in Tabelle 1 aufgelistet. Zusätzlich zu unserer Einrichtung beherbergt das Howard Hughes Medical Institute (HHMI) ein System, das für die wissenschaftliche Gemeinschaft an der Advanced Imaging Center an der Janelia Research Campus zugänglich ist. Für die volle mechanische Zeichnungen, Steuerpläne und Software werden die Leser aufgefordert, mit Harald Hess bei HHMI für weitere Informationen zu erkundigen. Ein Hauptvorteil für iPalm sowie andere Einzelmoleküllokalisierung Mikroskopieverfahren unter Verwendung von F-Aktin zur Visualisierung ist die relative Leichtigkeit der Probenvorbereitung im Vergleich zu EM - Techniken, die harte Probenverarbeitung, aufwendige Vorbereitung erfordern im allgemeinen, und hoch qualifizierten Praktiker 3,23 . Additionally, Fluoreszenz ist natürlich offen für Mehrkanalaufnahmen, die für die EM schwierig bleibt. Dennoch, wie weiter unten beschrieben, gibt es mehrere Strombegrenzungen für den Ansatz, sowohl in Bezug auf die Probenvorbereitung und Abbildungsverfahren. Erstens, wie es der Fall für die EM Probenvorbereitung ist, muss darauf geachtet werden , um gute Erhaltung ultra der Proben , da ein Protokoll ausreichend für eine beugungsbegrenzte Auflösungsstufe 35, um sicherzustellen , können schwere Störungen auf der Nanoebene führen. Für Aktin-Bildgebung ist die richtige Fixierung der Zellen ein wichtiger Faktor Probenqualität zu beeinträchtigen. Glutaraldehyd ist ein bevorzugtes Fixiermittel, da sie die Zellskeletts und der Membran sehr gut konserviert, obwohl im Falle von Co-Färbung mit Antikörpern, Epitopstellen betroffen sein könnten. In solchen Fällen einen akzeptablen Kompromiss Paraformaldehyd bieten kann, wie es besser neigt Antikörperepitop Seiten erhalten. Wichtig ist für Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie, diese Fixierungen neigenHintergrund-Autofluoreszenz zu erzeugen; Somit Postfixierung Quenching durch Borhydrid ist notwendig, insbesondere im Fall von Glutaraldehyd.

Darüber hinaus sind die richtige Auswahl der Fluorophore und Markierungsstrategien gehören zu den wichtigsten Faktoren für eine erfolgreiche Experimente. Aufgrund der nanoskaligen Dimension von F-Actin, werden hohe Dichten von Etiketten erforderlich , um die zugrunde liegenden Faden Netzwerke zu erfassen, als 36 von der Nyquist - Abtasttheorem vorgegeben. Für Aktin ermöglicht phalloidin sehr hohe Dichte Etikettierung, mit einer breiten Palette von organischen Fluorophore von vielen Herstellern erhältlich. Da jedoch Phalloidin toxisch ist, Zell Fixierung und Permeabilisierung erforderlich. Alternative Strategien für die lebenden Zellen kompatibel Aktin Kennzeichnung gehören die Verwendung der Fusion von fluoreszierenden Proteinen (FP), entweder mit monomeren Aktin oder mit kleinen Aktin-bindenden Polypeptide. Jedoch fanden wir, dass diese dazu neigen, eine geringere Markierungsdichte verglichen mit Phalloidin zu ergeben ( 37, eingeführt markiert werden , aber dieser Ansatz wird erwartet , dass kosten- und arbeitsintensiv. In Bezug auf die Fluorophore, hat Alexa Fluor 647 allgemein gefunden worden, für die Lokalisierungsmikroskopie konstant gute Leistung zu bieten. Dies kann in Bezug auf das Kontrastverhältnis-Helligkeitsquotienten zwischen dem Einzelmolekülpeak und der Hintergrundfluoreszenz 38 beschrieben. Eine höhere Markierungsdichte erfordert ein höheres Kontrastverhältnis, da der Hintergrund kumulativ die Lokalisierungsgenauigkeit verschlechtern könnte. In unserer Erfahrung können mehrere andere Fluorophore, wie ATTO488, ATTO520 und Alexa Fluor 568 (6B), verwendet werden , um die F-Aktin zu visualisieren, wenn auch mit weniger konsistente Ergebnisse im Vergleich zu Alexa Fluor 647, die sich über robuste Photoschaltung Leistung bietet eine breite Palette von Imaging-Pufferbedingungen.

39. Dies gilt gleichermaßen für die Vorteile und Grenzen der iPalm. Im Vergleich zu anderen 3-dimensionalen Superauflösungsmikroskopie - Techniken hat die höchste iPalm auflösenden optischen Ansatz blieb bisher, insbesondere entlang der z-Achse mit der z-Auflösung nahezu 2 mal besser als die x, y-Auflösung 11. Jedoch erlegt die Abhängigkeit von iPalm auf Interferometrie für eine hohe z-Auflösung auch eine Beschränkung der Abbildungstiefe, da die Kalibrierungskurve periodisch ist. Mit anderen Worten, z-Koordinaten wiederholen jede 250 nm oder so (für ~ 700 nm Emissionswellenlängen von Alexa Fluor 647). In der Praxis kann dies durch die Verwendung TIRF Beleuchtung adressiert werden, die die Anregungszone begrenzt, um innerhalb des abklingenden Feldes Tiefe <200 nm aus dem Deckglas. So Fluorophore tiefer in die Probe nicht aufgeregt sind und unsichtbar bleiben. Dies begrenzt jedoch auch die biologischen Strukturen, die denen in der Nähe des Deckglas, wie fokalen Adhäsionen, kortikale Zellskeletts und ventral Plasmamembran abgebildet werden kann, während weitere Innenstrukturen außerhalb der Reichweite sind. Für die feste Probe ist ein Mittel Kryoschneiden 40 auszuführen. Jedoch ist eine solche Vorgehensweise ist sehr umständlich und erfordert spezielles Know-how, die nicht allgemein zugänglich ist.

Alternativ kann iPalm für einen längeren z-Bereich angepasst werden , indem der Interferometrie mit dem astigmatischen-Defokussierung Schema 12 in 3D-STORM verwendet kombinieren. Dieser Ansatz bietet dual z-Koordinate Auslesungen, die erste durch Interferometrie, die hochpräzise aber periodisch ist, und die zweite von astigmatischen Defokussierung, was weniger genau ist, aber nicht periodisch. Letzteres kann dann verwendet werden, um "auszupacken" oder brechen die degeneriertendie interferometrische z-Koordinaten, so dass damit die Verdreifachung der iPalm Bildtiefe bis ~ 750 nm, effektiv die intrinsische Schärfentiefe von hoher NA Objektivlinsen nähern. Mit Phasenentkompaktierungstechniken hat iPalm zu Bildstrukturen tief in den Proben, wie Mitochondrien, wenn auch mit leicht reduzierten Präzision in allen drei Dimensionen verwendet worden , aufgrund der zusätzlichen 40 Defokussierung.

Eine weitere innere Begrenzung der iPalm ist die Bildgebungsgeschwindigkeit. Da eine große Anzahl von Rahmen erforderlich sind, eine hohe Dichte der Lokalisierungskoordinaten zu erhalten, ist die Kamerageschwindigkeit Regel die Begrenzung der Erfassungsrate. Mit aktuellen EMCCD Kameras 10 läuft - 20 MHz Ausleseraten, zehn Minuten für eine ausreichende Anzahl von Rahmen erforderlich. Solche langen Zeitskalen erfordern, daß die Probe befestigt werden. Hier die jüngsten Fortschritte in der Kameratechnik, wie zum Beispiel die viel schneller wissenschaftliche Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) Kamera kann eine schnelle Zunahme der im aktivieren41 Alterungsgeschwindigkeit, obwohl dies nicht für iPalm noch nicht umgesetzt worden. Für einige Lokalisierungsmikroskopie Ansätze Einzelmolekül, ein dichtes Feld Einzelmolekül kann Sensing 43 unter Verwendung eines modifizierten Algorithmus 42 oder komprimiert analysiert werden. Die Anpassung solcher Strategien kann auch iPalm beschleunigen, indem dichtere Einzelmolekül Bilder und damit weniger Frames.

Mit Einschränkungen in der Geschwindigkeit und Abbildungsbereich und Stärken in der räumlichen Auflösung, eine wichtige Anwendung für iPalm ist als ultra Methode, die die Vorteile der Fluoreszenzmarkierung nutzt 14,15,44 nanoskaligen Organisation von spezifischen Proteinen zu enthüllen. Eine weitere Verbesserung, sowohl in Bezug auf Optik und Fluorophore Technologien sollte eine weitere Verbesserung in iPalm räumliche Auflösung ermöglichen. Zum Beispiel beschäftigt iPalm Bildverarbeitung zur Zeit eine relativ einfache Annäherung Annäherung erster Ordnung, wobei jeder durch eine 2D-Gauß-Funktion modelliert einzelnes Molekül und alsausgegangen, ein gemittelt werden isotopisch Dipol. Dies könnte mit den jüngsten Methoden ergänzt werden, die ein genaueres Modell der Point-Spread-Funktion und Dipolorientierung oder explizite Behandlung von optischen Aberrationen über das Sichtfeld verwenden, um deutlich räumliche Auflösung zu verbessern. Ebenso hat photocaging berichtet worden, die Fluorophore Helligkeit um Größenordnungen 45 verbessert. Tatsächlich, da wesentliche Elemente ihrer ultrastrukturellen Organisation wurden gut charakterisiert, die f-Aktin-Zytoskelett könnte ein sehr wertvolles Modellsystem sein für die Prüfung weiterer methodischer Entwicklungen in iPalm. Die Fähigkeit, Proteinorganisation durch Lichtmikroskopie mit echten EM-Ebene Auflösungsvermögen zu analysieren wird erwartet, dass unser Verständnis von unzähligen Aspekte der zellulären Struktur und Funktion zu verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

YW und PK dankbar finanzielle Unterstützung von der Singapore National Research Foundation, vergeben PK (NRF-NRFF-2011-04 und NRF2012NRF-CRP001-084) bestätigen. Wir danken auch den MBI offenen Labor und Mikroskopie Kerneinrichtungen für Infrastrukturunterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
optical table Newport, CA RS4000 iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical table Newport, CA S-2000
laser-642 Newport, CA 1185055 output power=100 mw
laser-561 Newport, CA 1168931 output power=200 mw
laser-488 Newport, CA 1137970 output power=200 mw
laser-405 Newport, CA 1142279 output power=100 mw
broadband dielectric mirrors Thorlabs, NJ BB1-E02 laser combiner
dichroic beamsplitter Semrock, NY LM01-427-25
acousto-optic tunable filter AA Opto-Electronic, France AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer Newport, CA 05LP-VIS-B
baseplate local workshop customized
turning mirror (22.5°) Reynard Corpporation, CA customized 22.5° mirror
motorized optic mounts New Focus, CA 8816
motorized XYZ translation stage Thorlabs, NJ MT3/M-Z6 sample holder
T-Cube DC servo motor controller Thorlabs, NJ TDC001
Piezo Phase Shifter Physik Instrumente, Germany S-303.CD
objective lens Nikon, Japan MRD01691 objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stage New Focus, CA 9062-COM-M
Pico Motor Actuator New Focus, CA 8301
rotary Solenoid/Shutter DACO Instruments, CT 5423-458
3-way beam splitter Rocky Mountain Instruments, CO customized beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner Physik Instrumente, Germany S-316.10
motorized five-axis tilt aligner New Focus, CA 8081
Picmotor ethernet controller New Focus, CA 8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module Physik Instrumente, Germany E-509/E-503/E-517
band-pass filter Semrock, NY FF01-523/20 filters
band-pass filter Semrock, NY FF01-588/21
band-pass filter Semrock, NY FF01-607/30
band-pass filter Semrock, NY FF01-676/37
notch filter Semrock, NY NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter Thorlabs, NJ FW103H
EMCCD Andor, UK DU-897U-CSO-#BV 3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization Dell Precision T3500 PC, 4 sets
coverslips with fiducial Hestzig, VA 600-100AuF sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectin Millipore, MT FC010
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 15710 fixation. 16%
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 16220 25%
triton X-100 Sigma aldrich, MO T8787
HUVEC cells Life Technologies, CA C-015-10C
Medium 200 Life Technologies, CA M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors Life Technologies, CA A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 14190367
Pennicillin/Streptomycin 15140122
Trypsin/EDTA Life Technologies, CA 25200056
PIPES Sigma aldrich, MO P1851 PHEM
HEPES 1st base, Malaysia BIO-1825
EGTA Sigma aldrich, MO E3889
MgCl2 Millipore, MT 5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen, CA A22287 staining
sodium borohydride (NaBH4) Sigma aldrich, MO 480886 quenching
glucose 1st base, Malaysia BIO-1101 imaging buffer
glucose oxidase Sigma aldrich, MO G2133
catalase Sigma aldrich, MO C9322
cysteamine Sigma aldrich, MO 30070
Epoxy Thorlabs, NJ G14250
vaseline Sigma aldrich, MO 16415 sample sealing
lanolin Sigma aldrich, MO L7387
parafin wax Sigma aldrich, MO 327204
Immersion oil Electron Microscopy Sciences, PA 16915-04 imaging. Cargille Type HF

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