Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tubbs, E., Rieusset, J. Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells. J. Vis. Exp. (118), e54899, doi:10.3791/54899 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (ER) hücrede bağımsız organelleri olmayan, ancak mitokondri ilişkili endoplazmik retikulum zarlarının (MAM) olarak tanımlanan temas bölgelerinde yapısal ve fonksiyonel etkileşim. Aslında, MAM her iki taraftan da proteinler arasındaki etkileşimi sağlayan ER membranlar ve mitokondri yakın kapatılan bölgelere karşılık gelir. Bununla birlikte, bu organellerin membranlar bu bölgeler içinde kaynaştırmak yok, bu yüzden onların ayrı varlıklar korumak. MAM Enerji metabolizması ve hücre yaşamını 1-3 etkileyen, mitokondri ER bir kalsiyum açısından önemli bir rol (Ca 2+) ve fosfolipid transferi oynarlar.

ER ve mitokondri arasındaki ilişki ilk elektron mikroskobu ile 1970'lerde görüntülendi. O zamandan beri, transmisyon elektron mikroskobu 4,5, elektron tomografi 6,7 veya ER ve mitokondri özgü fluorofor immün lokalizasyonus / floresan proteinleri 8 klasik ER-mitokondri etkileşimleri çalışmak için kullanılmıştır. MAM analizi için yararlı bir araç içi fraksiyonasyon kullanımına dayanır. Bir Percoll degrade 9 bağlanmış diferansiyel Ultrasantrifügasyon tarafından MAM fraksiyonların izolasyonu sağlar. Bununla birlikte, nihai ürün zenginleştirilmiş MAM fraksiyonlar yerine, saf kesimlerin içerir. Toplamda, bu stratejiler özellikle hassas ve / veya kantitatif değildir ve onlar büyük tarama kolayca uygun değildir. Alternatif olarak ilaç indüklenebilir floresan arası organel bağlayıcılar kullanılarak genetik yaklaşımlar ortaya çıkmıştır, ancak protein 10 'nın endojen ekspresyonunun seviyelerinde organel etkileşimlerin analizine izin vermez.

MAM 11'de IP3R / GRP75 / SSVD kompleksinin Szabadkai keşfinden dayanarak, ER-mitokondri etkileşimleri analiz etmek için kantitatif bir yöntem geliştirdi. In situ yakınlığı ligati kullanılantahlil üzerinde algılamak ve VDAC1 ve IP3R1 arasındaki etkileşimleri ölçmek için, sabit hücrelerde 12 MAM arayüzünde Ca 2 + -channeling kompleksi yer alan iki organel-yüzey proteinleri. Kısaca, bizler, ER membran dış mitokondriyal zarın (fare anti-VDAC1 birincil antikor) ve IP3R1 (tavşan anti-IP3R1 birincil antikor) (Şekil 1, bir panel) de VDAC1 incelenir. Daha sonra, deney göre, anti-fare ve tamamlayıcı oligonükleotid uzantıları konjuge edilmiş anti-tavşan IgG (fare ve tavşan proksimite ligasyonu deney Probes), her iki ilave edildi. İki hedef proteinler 40 nm'nin altında bir mesafede ise, oligonükleotidler dairesel DNA şablonu (Şekil 1 Panel B) oluşmasına izin vermek için daha sonra ilave bağlayıcı oligo ile hibridize olabilir. Bu dairesel bir DNA molekülü kovalent yakınlığı probları birine bağlanmış bir tek-şeritli DNA ürününü oluşturmak, lige edilmiş ve amplifiye edilir (Şekil 1, Panel C) 6, proksimite ligasyonu ve amplifikasyon bağlı Texas kırmızısı etiketli oligonükleotid sondalar (Şekil 1, Panel D hibridizasyonu sonraki tespiti yol yapılabilir 25-10 nm arasında değerler ). Her floresan nokta böylece tek tek hücrelerin in situ ER-mitokondri etkileşimleri sayılmasına olanak tanıyan, VDAC1 / IP3R1 arasındaki etkileşimleri temsil eder.

Şekil 1
Şekil 1: Yerinde Proximity ligasyon Tahlili tarafından Endoplazmik Retikulum-mitokondri Etkileşimleri Algılama şematik İllüstrasyon. a) VDAC1 ve MAM arayüzü yakın kendi epitopuna bağlanabilir IP3R1 karşı bir tavşan primer antikora karşı yönlendirilmiş bir fare primer antikor, B) proksimite ligasyonu probları bir çift ilavesifare ve tavşan IgG karşı. Bu sondalar bağlayıcı oligo ligasyonu için şablonlar oluşturabilirler DNA ipliklerini eklenmiş. c) bağlanmasından sonra oluşturulan dairesel DNA zinciri Texas kırmızısı etiketli oligonükleotidler kullanılarak bir flüoresan nokta olarak mikroskopi ile görünür) yükseltilir ve D edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

In situ proksimite ligasyonu deneylerinde benzer antikorların GRP75 / IP3R1 çifti, hem de siklofilin D (CypD) ile yapılabilir / IP3R1 antikorlar CypD MAM arayüzü IP3R / GRP75 / SSVD kompleksi ile etkileştiği gösterilmiştir olduğu dikkate 12-14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Çözümler 1. hazırlanması

  1. PBS 14.5 ml% 37 formaldehit 5.5 mi seyreltilmesiyle PBS (tuz) içinde% 10 formaldehit hazırlayın. PBS, 50 ml glisin 3.8 g çözülmesiyle, 1 M glisin, pH 8.0, hazırlanması; 1x PBS içinde 100 mM glisin elde etmek için bu seyreltilir.
  2. 1x PBS içinde% 0.1 Triton-X100 hazırlayın. 3.0 M sodyum klorid ve 25 ° C de pH 7.0 ile, iyonu giderilmiş su içinde hazırlanan 0.30 M trisodyum sitrat ile 20x Tuzlu sodyum sitrat (SSC) hazırlayın. 1x bu tampon sulandırmak ve deiyonize su kullanılarak 0.01x.

Hücreler 2. Sabitleme

NOT: Bu çalışmada HuH7 hepatokarsinoma hücre çizgisi kullanılır, ancak bu yöntem diğer yapışık hücre kültürleri için de geçerlidir.

  1. kaplanmamış 35 mm'lik cam alt tabak başına 150.000 hücre (% 10 fetal dana serumu ve% 0.01 penisilin-streptomisin stok ile desteklenmiş DMEM, 1 g / L glikoz kültürlenmiştir) Levha Huh7 hücreleri,. Birincil hücrenin üzerinde çalışırkenKültürler, kolajen kaplı yemekler kullanımı.
  2. Sonraki gün, kültür ortamı çıkarın. PBS aspire 1 ml hücreleri yıkayın. Formaldehit% 10 1 ml ekleyerek hücreleri saptamak ve ajitasyon altında oda sıcaklığında (RT) 10 dakika süreyle inkübe edilir.
  3. 1 M glisin, 1 ml reaksiyonu durdurun ve rotasyon karıştırılır. Dur reaksiyon çözüm çıkarın ve 1x PBS 1 ml ekleyerek hücreleri yıkayın; rotasyon ve aspirat ile çalkalayın. hücrelere 100 mM glisin 1 ml ilave edilir ve 15 çalkalanarak oda sıcaklığında dakika ve daha sonra aspire için inkübe.
    NOT: protokol burada durdurulabilir ve aşağıdaki adımlar başka bir güne ertelenebilir. Bu durumda, 100 mM glisin, 1 ml ilave edilir ve gerektiğinde, 4 ° C'de tutun.

3. Hücrelerin Permeabilization

  1. 15 çalkalanarak oda sıcaklığında dakika ve daha sonra aspire inkübe edin, 1 x PBS içinde% 0.1 Triton-X100 içinde 1 ml ilave edilir. Primer hücre kültür üzerinde çalışırken 20 dakika - Bu inkübasyon süresi 15 kadar arttırılabilires (örneğin, birincil fare hepatositler). 1x PBS 1 ml ekleyerek hücreleri yıkayın; aspire.

4. Engelleme

  1. (Kit ile birlikte verilen) her bir örnek için bloke etme çözeltisi 40 ul ekle; Bu hacimli bir numunesi kapsayacak şekilde arttırılabilir. bir nemlilik bölmesi içerisinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca yemekler inkübe edin.
  2. yemekler kapalı engelleme çözümü dokunun. Bu tekrarlanabilirlik etkileyecek gibi, her slayt için eşit kalan miktarlar elde etmek için çalışın. Numuneler kurumasına izin vermeyin!

5. Birincil antikorlar,

  1. 1x PBS birincil antikorlar seyreltin ve yemekler (VDAC1 fare antikoru: 1/100, IP3R1 tavşan antikoru: 1/500) için çözüm ekleyin. Seçenek olarak ise, GRP75 ve CypD antikorlar (1/500 kullanılan her iki fare antikorları) kullanılarak VDAC1 arasında kullanılabilir.
  2. 4 ° C'de bir nem odasında gece boyunca inkübe edin. % 0.01 Tween (TBS-T) ile slaytlar Tris Tamponlu Salin kullanarak iki kez yıkayın.
  1. Yakınlık ligasyon tahlil sondaları kit tarafından sağlanmaktadır. Primer antikor türlere göre problar seçin.
  2. Antikor seyreltici 5: İki yakınlık ligasyon tahlil Sensörler 1 hazırlayın. Karışım, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bekletin. seyreltilmiş yakınlık ligasyonu tahlil prob çözüm ekleyin. 37 ° C'de 1 saat boyunca önceden ısıtılmış bir nem odasında yemekler inkübe edin. TBS-T ile yemeklere iki kez yıkayın.

7. ligasyonu

  1. In situ saptama reaktif maddesi Texas kırmızısı kiti kullanım.
  2. Yüksek saflıkta su içinde 5 ve iyice karıştırın (kit ile birlikte verilen) 5x bağlama suyu 1 seyreltin. 1:40 ve vorteks (kit tarafından sağlanan) 1x ligasyon çözeltisi içinde ligaz sulandırmak. hemen örneklerin yanı sıra öncesine kadar ligaz eklemek için bekleyin.
  3. önceden ısıtılmış bir nem Cham slaytlar her bir örnek için, bu solüsyonu (35 mm cam alt yemekler için 40 ul) ilave edilir ve kuluçkayaBER, 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı. TBS-T ile slaytlar iki kez yıkayın.

8. Büyütme

NOT: Dikkatli, ışığa duyarlı reaktifler olunuz.

  1. Yüksek saflıkta su içinde 5: (kit ile birlikte verilen) 5x büyütme stok 1 seyreltin. donma blok kullanarak dondurucu polimeraz çıkarın (-20 ° C). (Kit tarafından sağlanan) polimeraz 1x büyütme çözüm ve vorteks içinde 1:80 seyreltilir. karışımı kullanılarak hemen önce polimeraz ekleyin.
  2. Her bir örnek için, bu solüsyonu (35 mm cam alt yemekler için 40 ul) eklenir. 37 ° C'de 100 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir nem odasında slaytlar inkübe edin. slaytlar kapalı Amplifikasyon-Polimeraz çözümü dokunun.

9. Final Yıkama

  1. 2 dakika için 1 x SSC yıkama tamponunda slaytlar yıkayın. 2 dakika boyunca 0.01x SSC yıkama tamponunda slaytlar yıkayın. Yemekler karanlıkta oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Görüntüleme için 10. Hazırlık

hava kabarcıkları kapak kayma altında yakalanmak sağlanması, (sulu ve katılaşmaya değildir) DAPI içeren montaj orta minimal hacmi kullanılarak slaytlar monte edin. Tırnak cilası kenarları mühür için kullanılabilir. (: 594 nm, emisyon: 624 nm, Büyütme: 63X uyarım) bir floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak analiz etmeden önce yaklaşık olarak 15 dakika boyunca bekleyin.
  • görüntüleme sonra karanlıkta -20 ° C'de slaytlar saklayın.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Bu protokolü kullanarak bizim deneyime dayalı, biz güvenle sabit hücrelerde ER-mitokondri etkileşimleri görselleştirme ve miktar tayini için bu yöntemi tavsiye ederim. Antikorların çeşitli çiftleri kullanılarak HuH7 hepatokarsinoma hücre çizgisinde in situ proksimite ligasyonu deneyi-görüntülenmiştir ER-mitokondri etkileşimlerine temsili görüntüleri gösterilmektedir. Flüoresans mikroskopisi ile, Şekil 2'de gösterildiği gibi, her bir kırmızı nokta, iki hedef protein arasındaki etkileşimi temsil etmektedir, ve çekirdekler mavi renkli. Bir negatif kontrol olarak, sadece bir primer antikorun in situ proksimite ligasyonu deney sinyal üretiminde için çift tanıma ihtiyacını doğrulayarak, sinyal (Şekil 2, bir panel) yol açtı. Klasik, biz antikorların VDAC1 / IP3R1 çifti (Şekil 2, panel b) kullanarak ER-mitokondri etkileşimleri analiz. Yerinde yakınlık ligasyonu tahlil experimen benzerGRP75 MAM arabirimi 11 de VDAC ve IP3R bağlayan bir şaperon olduğu TS da antikorlar (Şekil 2'de, panel c ve sırasıyla d,) arasında GRP75 / IP3R1 veya CypD / IP3R1 çifti ile yapılabilecek ve CypD etkileşim olduğu gösterilmiştir karmaşık 12-14 -channeling SSVD / GRP75 / IP3R Ca 2+. Floresan noktalar Niceleme Kabarcık-Finder 15 veya ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. hücrelerin çekirdekleri mavi etiketli gibi, hücre başına ER-mitokondri etkileşimleri sayımsal gerçekleştirmek için uygundur. Biz iyice Bu testte 12 doğrulanmış ve bu hedef proteinler ER-mitokondri etkileşimleri çalışmak için iyi bir aday olduğu sonucuna varabiliriz.

    şekil 2
    Şekil 2: Yerinde Proximity Ligatio In tarafından VDAC1 / IP3R1, GRP75 / IP3R1 ve CypD / IP3R1 Etkileşimler GörselleştirmeHuh7 hücreleri, n Deneyi. Hücre çekirdekleri mavi görünür ve iki hedef proteinler arasındaki etkileşimleri kırmızı olarak tasvir edilmektedir (; ölçek çubuğu = 20 um 63X büyütme). Biz VDAC1, GRP75 ve CypD IP3R1 etkileşim göstermektedir. Bir negatif kontrol olarak, sadece bir birincil antikor-kırmızı flüoresans yol açmadığını göstermektedir. analizi doğrulamak için, çeşitli diğer kontroller VDAC1, GRP75 ve CypD diğer ER proteinler ile etkileşmeyen göstermek için yapılmıştır ve IP3R1 mitokondrial proteinler ile etkileşmediğini (veriler gösterilmemiştir, ref. 9 ve 13). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Biz optimize etmek ve protokol doğrulamak katkıda laboratuarımızda tüm insanlara teşekkür ederim. Bu çalışma INSERM ve ulusal araştırma kurumu (ANR-09-JCJC-0116 VE ANR-11-BSV1-033-02) tarafından desteklenmiştir. ET yüksek öğrenim ve araştırma Fransız bakanlığından bir araştırma bursu ile onu doktora sırasında desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Formaldehyde Sigma F-8775
    Glycine Sigma G-8898
    Triton Sigma T8532
    35 mm Glass bottom culture dishes MatTeK corporation P35G-0-14-C
    Blocking solution Sigma DUO-92004 or DUO-92002 provided in the Duolink PLA probes, Sigma
    VDAC1 antibody Abcam ab14734
    IP3R1-H80 antibody Santa Cruz sc28614
    CypD antibody Abcam ab110324
    Grp75 antibody Santa Cruz sc13967
    TBS 10x euromedex ET220 Dilute to obtain 1x
    Tween 100x euromedex 2001-B dilute in TBS to obtain 0,01%
    PLA Probes Mouse MINUS Sigma DUO-92004 Duolink, Sigma
    PLA Probes Rabbit PLUS Sigma DUO-92002 Duolink, Sigma
    Duolink detection reagents red Sigma DUO-92008 Duolink, Sigma
    Ligation solution Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Ligase Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Amplification solution Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Polymerase Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Duolink Mounting Medium Sigma DUO80102 Duolink, Sigma
    Softwares
    Blob-finder software BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
    ImageJ software Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
    2. Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
    3. Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
    4. Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169 (2012).
    5. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
    6. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
    7. Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
    8. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
    9. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
    10. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
    11. Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
    12. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
    13. Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
    14. Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
    15. Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
    16. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. (2016).
    17. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
    18. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
    19. De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
    20. Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

      Usage Statistics