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Developmental Biology

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Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

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Abstract

A angiogénese, definido como o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes, envolve células endoteliais, pericitos, células musculares lisas, células do sistema imunológico, bem como a coordenação com vasos linfáticos e nervos. A multi-celular, as interacções multi-sistema exige a investigação de angiogénese num ambiente fisiologicamente relevante. Assim, enquanto o uso de modelos de cultura celular in vitro proporcionaram conhecimentos mecanicistas, uma crítica comum é que eles não recapitular a complexidade associada com uma rede microvascular. O objetivo deste protocolo é o de demonstrar a capacidade de fazer comparações de lapso de tempo de redes microvasculares intactas antes e após a estimulação da angiogénese em tecidos mesentério de rato cultivadas. tecidos cultivados contêm redes microvasculares que mantêm a sua hierarquia. imunohistoquímica confirma a presença de células endoteliais, células musculares lisas, pericitos, vasos sanguíneos e vasos linfáticos. Em umddition, rotulando tecidos com BSI-lectina permite a comparação de lapso de tempo de regiões de rede local antes e após a estimulação fator de soro ou crescimento caracterizada pelo aumento da germinação capilar e densidade de vasos. Em comparação com os modelos de cultura de células comuns, este método proporciona uma ferramenta para estudos de linhagens de células endoteliais e avaliação de medicamentos angiogénica do tecido específico em redes microvasculares fisiologicamente relevantes.

Introduction

O crescimento da rede microvascular e remodelação são denominadores comuns para a função do tecido, cicatrização de feridas, e patologias múltiplas e um processo chave é a angiogénese, definido como o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos existentes 1, 2. Para Engenharia de Tecidos novos navios ou projetar terapias baseadas angiogénicos, compreendendo a importância da dinâmica celulares envolvidos na angiogênese é crítica. No entanto, este processo é complexo. Ela pode variar em locais específicos dentro de uma rede microvascular e envolve vários tipos de células (isto é, células endoteliais, células musculares lisas, pericitos, macrófagos, as células estaminais) e múltiplos sistemas (redes linfáticas e redes neurais). Embora os modelos in vitro têm contribuído enormemente para examinar a relação entre diferentes células envolvidas na angiogênese 3, a sua relevância fisiológica pode ser prejudicada devido à thei r complexidade limitada eo fato de que eles não refletem de perto um cenário in vivo. Para superar estas limitações, os sistemas de cultura tridimensionais 3, ex vivo modelos de tecido 4, sistemas de microfluidos 5, 6, 7 e modelos computacionais foram desenvolvidos e introduzidos nos últimos anos. No entanto, ainda existe uma necessidade para um modelo com capacidade de lapso de tempo para investigar a angiogénese em redes microvasculares intactas ex vivo. A criação de novos modelos de lapso de tempo para estudos de angiogênese com esse nível de complexidade irá fornecer uma ferramenta inestimável para compreender os mecanismos subjacentes que regulam a angiogênese e para melhorar terapias.

Um modelo de potencial que permite a investigação ex vivo da angiogênese através de uma rede microvascular intacta é o modelo de cultura de mesentério de rato> 8. Em trabalho recente, temos demonstrado que o sangue e redes microvasculares linfáticos permanecer viável após o cultivo. Mais importante, o modelo de cultura de mesentério de rato pode ser usado para investigar as interações funcionais pericyte-endotelial de células, sangue e conexões das células endoteliais linfáticas e de imagem time-lapse. O objetivo deste trabalho é fornecer nosso protocolo para o método de imagem time-lapse. Os resultados representativos documentar os vários tipos de células que permanecem viáveis ​​após a estimulação de angiogénese com soro e oferecem exemplos da utilização deste método para a quantificação de respostas angiogénicas específicas dos tecidos, bem como estudos de acompanhamento de células endoteliais.

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Protocol

Todos os experimentos e os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso da Universidade de Tulane Institucional Animal (IACUC).

1. Configuração Procedimento Cirúrgico

  1. instrumentos de autoclave, materiais cirúrgicos e fontes de cultura antes da cirurgia. material cirúrgico para cada rato incluem: 1 cortina, uma cortina com furo pré-cortados (0,5 pol x 1,5 pol) no centro, compressas de gaze, e um resguardo absorvente. Instrumentos cirúrgicos incluem: um bisturi com uma lâmina de número 10, 2 pares de pinças, e um par de tesouras finas. fontes de cultura incluem: uma cortina, um par de pinças, e preparado inserções placa de 6 poços com filtros de policarbonato.
  2. Esterilizar uma plataforma de Plexiglass, uma fase cirúrgica e um espaço de bancada cirúrgica com 70% de etanol. Mantenha o estágio cirúrgico em um recipiente estéril até o uso.
    1. Criar uma fase cirúrgica através da perfuração de um a cerca de 2 em por em um furo no centro de uma placa de cultura de 100 milímetros. Em seguida, use uma lixa para suavizarquaisquer arestas vivas e adicionar uma camada de cola de silicone para as bordas do furo para criar uma superfície elevada para os tecidos.
    2. Alternativamente, projetar o estágio cirúrgico utilizando software CAD e fazer por 3-D de impressão (Figura 1).
  3. Coloque um resguardo absorvente estéril para baixo e estabelecer uma plataforma de plexiglass em cima dela. Coloque a cortina, sem um orifício pré-cortado, uma almofada aquecida ao longo do lado do resguardo absorvente.
  4. Pré-aquecido estéril soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), meios de comunicação e solução salina a 37 ° C. media de lugar e PBS em placas de cultura separados no topo da almofada de aquecimento e coloque soro fisiológico em um tubo de 50 mL cônico ao lado da configuração cirúrgico.
  5. Certifique-se de todos os pacotes são abertos antes do início da cirurgia para garantir a manipulação estéril de todos os materiais. Uma lista completa das ferramentas comuns usados ​​neste procedimento são listados na Tabela de Materiais cirúrgicos específicos e ferramentas.

2. Mesentery colheita Tissue

  1. Use ratos Wistar machos adultos (350 ± 25 g; 6 - 8 semanas de idade). Outras tensões e as idades de ratos podem ser substituídos.
  2. Anestesiar ratos por meio de uma injecção intramuscular de cetamina (80 mg / kg de peso corporal) e xilazina (8 mg / kg de peso corporal). Confirmar o rato está sob anestesia por beliscar entre os dedos para verificar se há uma resposta reflexa; não deve haver nenhum. analgesia preventiva para este procedimento terminal não é necessário.
  3. Raspar a região abdominal e remover cabelo restante usando creme de depilação. Wipe pele abdominal duas vezes com álcool isopropílico a 70%, seguido de povidona-iodo. Para as toalhitas o cirurgião deve começar no centro do local cirúrgico e mover-se para o exterior da área preparada de uma maneira circular a fim de não se sobrepõem áreas que tenham sido previamente limpo com o mesmo pedaço de gaze estéril ou mecha de algodão estéril. Em seguida, transferir animal para a instalação cirúrgica esterilizada e coloque em cima da plat plexiglassFormato.
  4. Usando uma lâmina de bisturi, fazer uma 0,75 em - 1,25 na incisão no intestino a partir de 1º de abaixo do esterno. Tenha cuidado para não perfurar o intestino ou mesentério (1 camada de pele, uma camada de tecido conjuntivo, e uma camada de músculo).
  5. Coloque uma cortina com um buraco pré-cortada sobre a incisão e coloque um estágio cirúrgico esterilizado em cima da cortina. Assegurar as alinha abertura com a incisão. Use aplicadores com ponta de algodão estéreis para localizar e retirar o íleo através da abertura estágio cirúrgico.
  6. Puxe 6 - 8 janelas mesentérica através do estágio usando aplicadores com ponta de algodão, e tenha cuidado para não tocar as janelas (Figura 1). Os tecidos são tipicamente colhidas a partir da região do ileo do intestino delgado começando perto do ceco. Mantenha tecidos expostos úmido com solução salina estéril aquecida, conforme necessário, utilizando uma seringa estéril para escorrer a solução.
  7. Eutanásia do rato através de injecção intracardíaca de pentobarbital de sódio (0,2 mL por rato). Antes de retirar-mejanelas senteric, garantir o rato é sacrificado pela palpação do coração; não deve haver nenhum impulso.
  8. Remover os tecidos mesentério desejados usando uma pinça para agarrar a almofada de gordura e uma tesoura fina para cortar a janela. Deixar uma fronteira de gordura (2 mm), em torno da janela. Lavar tecidos vez em aquecido PBS estéril e uma vez na mídia.
  9. Voltar íleo exteriorizada para a cavidade abdominal e dispor de animais de acordo com as diretrizes institucionais.

3. Mesentery Cultura de Tecidos de Estudos de lapso de tempo

  1. Transferência de fontes autoclavados cultura (ver secção 1.1) e tecidos para uma capela de fluxo laminar estéril.
  2. Use uma pinça para transferir cada tecido no topo de uma membrana filtro de policarbonato. tecidos garra pelas almofada de gordura para evitar danificar a vasculatura.
  3. Rapidamente se espalhou o tecido usando a almofada de gordura, tomando cuidado para não tocar na janela. Inverta a inserção com o tecido para dentro da parte inferior de uma placa de 6 poços e cobrir com 3 ml de meio (Figura 1
  4. Repita os passos de 3,2-3,3 para cada tecido e cultura em condições de incubadora padrão (5% de CO2, 37 ° C) durante até 5 dias.

4. Imagem Time-Lapse de Mesentery Tissue

  1. No dia da imagiologia, suplementar os meios em cada poço com conjugado BSI-LECTINA e incubar em condições padrão de cultura, durante 30 min. Lavar tecidos duas vezes com meio livre de lectina. BSI-LECTINA mancha permanecerá visível no tecido mesentério durante até 3 dias em cultura.
  2. Transferir a placa para um estágio de microscópio. Identificar os vasos sanguíneos e linfáticos com base na sua morfologia e estrutura de rede.
  3. Localize uma região de rede desejado em cada tecido e tomar imagens. Tome nota do imaginglocal para assegurar a mesma região será capturado para imagens subsequentes. Se estiver usando um palco motorizado, documentar as coordenadas.
  4. Retorno tecidos para a incubadora e continuar a cultura até ponto final desejado. Repita os passos 4,1-4,3 conforme necessário dependendo pontos de tempo experimentais desejados.

5. Tissue imunomarcação

  1. BSI-lectina Labeling
    1. Incubar os tecidos durante 30 min a 37 ° C com 01:40 lectina conjugada com FITC em meios (2,5 ml solução de anticorpo por poço em placas de 6 poços) seguida de duas lavagens com meio. Para lavagens, adicionar mídia e substitua imediatamente.
  2. / Etiquetagem Morto Vivo
    1. Incubar os tecidos durante 10 min a 37 ° C com 1: 500 de etídio 2 mM homodímero-1 e 1: 500 calceína AM 1 mM em meio (2,5 ml solução de anticorpo por poço em placas de 6 poços) seguida de duas lavagens com meio.
  3. BSI-lectina / Etiquetagem NG2
    1. tecidos espalhada sobre um microscópio deslizoue (1 - 2 tecidos / lâmina) e deixar secar. Retire o excesso de gordura com um bisturi, pressionando com firmeza para excisar a gordura.
    2. Fix tecidos em metanol frio durante 30 min a -20 ° C. Lavar tecidos com PBS (3 x 10 min).
    3. Para marcação com anticorpos primários incubar tecidos durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo policlonal de NG2: 100 de coelho e soro de cabra normal a 5% (NGS). Lavar tecidos com PBS (3 x 10 min).
    4. Para a marcação do anticorpo secundário tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 100 de cabra anti-coelho conjugado anticorpo-CY2 (GAR-CY2) e 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS (3 x 10 min).
    5. Incubar os tecidos durante 30 minutos à temperatura ambiente com lectina 01:40 conjugado com FITC em PBS seguido por duas lavagens com PBS. Para lavagens, adicione PBS e depois substituir imediatamente.
    6. Para montar os slides, cobrir tecidos com 50:50 PBS e solução de glicerol e lugar lamela em cima. Selar as bordas de slide usando unha polonês.
  4. LYVE-1 / Etiquetagem PECAM
    1. Espalhe tecidos numa lâmina de microscópio (1 - 2 tecidos / lâmina) e deixa-se secar. Retire o excesso de gordura com um bisturi, pressionando com firmeza para excisar a gordura.
    2. Fix tecidos em metanol frio durante 30 min a -20 ° C. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    3. Para marcação com anticorpos primários incubar tecidos durante 1 h à temperatura ambiente com 1: anticorpo CD31 monoclonal biotinilado 200 rato e 1: policlonal LYVE-1 anticorpo 100 de coelho em PBS + 0,1% de saponina + albumina de soro bovino a 2% (BSA) + 5% de NGS . Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    4. Para a marcação do anticorpo secundário, tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 500 de anticorpo de estreptavidina conjugada com Cy3 e 1: 100 GAR-CY2 em PBS + 0,1% de saponina + 2% de BSA + 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    5. Para montar slides, tecidos de cobertura com 50:50 solução PBS e glicerol e colocar uma lamela em cima. Selar as bordas de slide usando unha polonês.
  5. BrdU / BSI-lectina Labeling
    1. Adicionar 1 mg / mL BrdU aos meios de comunicação e substituir a mídia de tecido com uma solução de BrdU. Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
    2. Espalhe tecidos numa lâmina de microscópio (1 - 2 tecidos / lâmina) e deixa-se secar. Retire o excesso de gordura com um bisturi, pressionando com firmeza para excisar a gordura.
    3. Fix tecidos em metanol frio durante 30 min a -20 ° C. Lavar tecidos com PBS (3 x 10 min).
    4. Desnaturação de DNA de tecidos em HCl 2 M durante 1 h a 37 ° C. Lavar tecidos em PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    5. Para marcação com anticorpos primários, tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 100 monoclonal de ratinho anti-BrdU em PBS + 0,1% de saponina + 2% de BSA + 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    6. Para a marcação do anticorpo secundário, tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 100 de anticorpo de cabra anti-rato Cy3-conjugado (GAM-Cy3) em PBS + 0,1% de saponina + 2% de BSA + 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    7. Para montar slides, tecidos de cobertura com 50:50 PBS e solução de glicerol e lugar lamela em cima. Selar as bordas de slide usando unha polonês.
  6. BSI-lectina / rotulagem CD11b
    1. Espalhe tecidos numa lâmina de microscópio (1 - 2 tecidos / lâmina) e deixa-se secar. Retire o excesso de gordura com um bisturi, pressionando com firmeza para excisar a gordura.
    2. Fix tecidos em metanol frio durante 30 min a -20 ° C. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    3. Para marcação com anticorpos primários tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 100 de murganho anti-rato de CD11b em PBS + 0,1% de saponina + 2% de BSA + 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    4. Para a marcação do anticorpo secundário tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 100 GAM-Cy3 em PBS + 0,1% de saponina + 2% de BSA + 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS+ 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    5. Incubar os tecidos durante 30 minutos à temperatura ambiente com lectina 01:40 conjugado com FITC em PBS seguido por duas lavagens com PBS.
    6. Para montar slides, tecidos de cobertura com 50:50 PBS e solução de glicerol e lugar lamela em cima. Selar as bordas de slide usando unha polonês.

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Representative Results

Após 3 dias em cultura, os tecidos foram marcados com um kit de viabilidade / citotoxicidade Live / morto para demonstrar a viabilidade da microcirculação no mesentério de ratos modelo de cultura (Figura 2A). A maioria das células presentes no mesentério permaneceram viáveis ​​na cultura em que as células endoteliais foram identificados com base na sua localização em segmentos microvasculares. Proliferação de células endoteliais foi também confirmada por marcação lectina / BrdU (Figura 2D). Células de músculo liso e pericitos presença ao longo dos vasos foi confirmado com a rotulagem NG2 (Figura 2B). Rotulagem para LYVE1 e PECAM identificados ramificação redes linfáticas e microvasculares sangue e confirmou a manutenção linfática contra o fenótipo de células endoteliais do sangue (Figura 2C).

O recurso de lapso de tempo deste modelo foi utilizada por rotular o microvaredes scular com BSI-LECTINA em diferentes pontos de tempo e de imagem da mesma região dentro da rede ao longo do tempo; esta capacidade é particularmente valiosa para a investigação de tecidos respostas angiogênicos específicos. A suplementação de meios com 10% de soro provocou uma resposta angiogénica robusta após 3 dias de estimulação. Além disso, os novos segmentos de vasos capilares e rebentos foram identificados por dia 5 da estimulação (Figura 3). O método de imagiologia por intervalo de tempo permitido para a comparação quantitativa das regiões de rede antes e depois da estimulação (Figura 4). Para este estudo representativo, o que corrobora nossos resultados anteriores 9, o número de navios por área vascular eo número de brotos capilares por área vascular foram quantificadas de uma imagem 4X por tecido. segmentos dos vasos sanguíneos foram definidos como segmentos de células endoteliais do sangue lectina positivo presente entre dois pontos de ramificação e brotos capilares foram definidos como cego terminou segmentos originários a partir de uma embarcação de montagem. Comparação de lapso de tempo de regiões de rede também permitiu o acompanhamento de segmentos de células endoteliais (Figura 5) e identificação de sangue / embarcações linfáticas mis-padronização (Figura 6). Etiquetagem de tecidos cultivados para a lectina e CD11b, adicionalmente, confirmaram a presença de macrófagos residentes intersticiais (Figura 7) em redes de remodelação.

figura 1
Figura 1. janelas mesentéricos foram localizados por puxar o intestino delgado através de um estágio cirúrgico. O tempo cirúrgico foi projetado e feito por meio de impressão 3-D. O furo elíptico no centro é de aproximadamente 2 em 1 por em (A). As janelas mesentéricos foram então espalhadas no topo de um inserto de membrana, e o inserto foi invertido e colocado num poço (B). Barra de escala = 2 cm.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Os vasos sanguíneos permanecer viável no modelo de cultura de mesentério de ratos. Ensaio vivo / morto realizada após cultura mostraram uma alta proporção de células vivas (verde) para células mortas (vermelho), especificamente ao longo dos vasos sanguíneos (A). Mesentério tecidos foram marcadas com anti-lectina e NG2, para identificar pericitos (vermelho) ao lado de vasos (verde) e para confirmar que os diferentes tipos de células estão presentes nos tecidos pós-cultura (B). Tecidos também foram marcados contra PECAM / LYVE-1 para identificar vasos (vermelho) de sangue de linfática (verde) vasos (C). Para investigar se as células microvasculares sofrer proliferação em cultura, tecidos mesentério lectina foram marcadas com / anti-BrdU . Em segmentos capilares marcadas com lectina (verde), várias células foram confirmadas como sendo proliferativa (vermelho) (D). Barras de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Lapso de tempo de formação de imagens do mesentério de rato permite observar remodelação microvascular ao longo do curso da cultura. Uma resposta angiogénica robusta foi observada após 3 (B) e 5 dias (C) da cultura com estimulação com soro a 10%. Barras de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. redes microvasculares no modelo de cultura de mesentério de rato foram fotografadas antes e depois da angiogênese. Comparação da mesma rede marcado com lectina no dia 0 e no dia 3 (A, B) após a estimulação com soro a 10% identifica novos vasos. Lectina também rótulos uma população de células intersticiais não identificados. Quantificação da densidade de vasos (C, D) e o número de brotos capilares por área vascular (E, F) confirmou um aumento em ambos os parâmetros para cada tecido. C, E) antes (dia 0) e após comparações (dia 3) por tecido. D, F) Comparação entre o dia 0 e no dia 3 médias usando um teste t emparelhado de Student confirmou que a diferença significativa tanto no número médio de segmentos de vasos (p <0,0001) e o número médio de brotos (p <0,00001) por área vascular . As barras brancas representam dia 0 e barras pretas representam dia 3. Values são médias ± SEM. Para esta análise representativa, 13 tecidos foram colhidas a partir de 2 ratos. Barras de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. O modelo de cultura de mesentério de rato pode ser utilizado para investigar o destino vascular ilha e incorporação em redes próximas. Usando imagens de lapso de tempo, ilhas vasculares, definidos como segmentos endoteliais desconectadas, foram identificados no dia 0 e sua conexão com a rede nas proximidades foi confirmada por dia 3 de estimulação pós-angiogénico. Mesentério tecidos foram estimuladas com bFGF (A, B) e VEGF / PDFG-BB (C, D). setas ocas mostram segmentos desconectados no dia 0 e setas sólidas representam conexão ilha ao network. As setas indicam a localização das ligações entre uma ilha vascular e a rede próxima. Barras de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. imagens de lapso de tempo demonstrar a capacidade de observar linfático e vasos sanguíneos padronização. Linfático (l) navios podem ser distinguidas das arteríolas (A) e vénulas (v) com base na morfologia rotulagem no dia 0 (A). No dia 5 pós-estimulação com soro a 10%, morfologia linfático é perdida e vasos parecem ter integrado com os vasos sanguíneos angiogénicos vizinhas (B). Barras de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma maiorversão desta figura.

Figura 7
Figura 7. Os macrófagos permanecem presentes em tecidos mesentéricos de ratos cultivadas. Lectina / CD11b co-marcação de tecidos cultivados durante 3 dias, com 10% de soro sugerem que as células intersticiais de lectina positivos são um subconjunto de macrófagos. (A) uma imagem representativa de rotulagem BSI-lectina. Rotulagem (B) CD11b no mesmo campo de visão. (C) A imagem mesclada. As setas identificar exemplos de co-rotulagem. Barras de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo documenta um método para usar o modelo de cultura de mesentério de rato como uma ferramenta ex vivo para geração de imagens de lapso de tempo de crescimento da rede microvascular. Trabalhos anteriores em nosso laboratório estabeleceu a utilização do nosso modelo para 1) angiogênese 8, 2) lymphangiogenesis 8, 3) interações celulares pericyte-endotelial 8 e 4) teste de drogas anti-angiogênico 9. A capacidade para imagiologia de tecidos mesentério de rato cultivadas em vários pontos de tempo, oferece um ensaio quantitativo para avaliar as respostas de crescimento específicos de tecido e o seguimento das interacções célula-célula durante a vários estímulos angiogénicos. O aumento da proliferação de células endoteliais durante a angiogénese e a presença de pericitos são consistentes com nosso trabalho anterior 8 e validar as interações dinâmicas entre vários tipos de células durante a angiogénese em tecidos mesentéricos de ratos cultivadas.

em sistemas de cultura de células in vitro, o modelo de cultura de mesentério de rato é único porque o crescimento ocorre dentro de uma rede microvascular intacto, real. Considere em contraste ensaio anel aórtico, que foi criada para estudar a germinação angiogênico a partir de segmentos de aorta em um gel de colágeno 10. Enquanto brotando do anel aórtico envolve vários tipos de células, brotos capilares crescem para fora dos segmentos excisadas da aorta, o que é muito diferente do cenário in vivo. O modelo fatia do cérebro é outro modelo ex vivo, mas é desprovido de vasos linfáticos. Além disso, não foi demonstrado o modelo de fatia de cérebro para ser capaz de imagem lapso de tempo antes e após a estimulação angiogénica 11. Outro modelo ex vivo que foi recentemente introduzida é o modelo de cultura de retina. A vantagem do modelo de retina é a angiogénese que ocorre a partir de microvascu intactaredes Lar dentro do tecido 12, 13. Para estes modelos, estirpes de ratinhos GFP-transgénico pode ser utilizado para ser capaz de observar capilar brotando ao longo do tempo, mas, infelizmente, o mesentério de rato é avascular 14, eliminando a substituição ratinhos mesentério GFP-transgénicos para mesentério de rato, como utilizado no nosso modelo. Além disso, mostra-se que um rótulo simples lectina de tecidos mesentério de rato em cultura é suficiente para determinar o crescimento da rede em diferentes pontos de tempo e, em comparação com o outro ex modelos in vivo, o nosso modelo permite a observação simultânea de sangue e células endoteliais linfáticas.

BSI-lectina foi utilizada neste trabalho para visualizar redes microvasculares e detectar respostas angiogénicos. A lectina é uma estrutura de proteína que se liga a glicoproteínas em células endoteliais e foi seleccionada para este protocolo, devido ao seu curto período de incubação em comparação com ANTIB endotelialmarcadores ody. Lectina é menos dispendioso do que os anticorpos e não requer a fixação; ele também pode ser facilmente misturado no meio de cultura e substituído por meio fresco após o término do período de incubação. Enquanto estudos futuros são necessários para elucidar os efeitos potenciais da técnica de marcação lectina no processo angiogênico, nossos resultados representativos (Figura 4) demonstram que a angiogênese robusto pode ser induzida e trabalho anterior 9 demonstra que a angiogênese em redes lectina rotulada pode ser inibida através de segmentação factor de Crescimento endotelial vascular (VEGF). marcadores de anticorpos podem potencialmente ser utilizados como uma abordagem de marcação alternativa, quando existe uma necessidade de ter marcadores mais específicos, ou quando há uma necessidade de investigar outros tipos de células que estão presentes nas redes microvasculares, tais como células de músculo liso, pericitos, e nervos. Outro método potencial para células visualizando seria transfecção do gene.

A vantagem de usar o modelo de mesentério de rato lapso de tempo tem sido destacada nos resultados representativos para este protocolo. A comparação de imagens antes e após o tratamento reduz problemas de variabilidade que influenciam a análise estatística não pareado. As respostas específicas de explantes variou de aumento de 20% a 233% na densidade de vasos e de aumento de 40% a 3500% em densidade broto. As causas específicas para esta variação permanecem desconhecidos, mas medir o crescimento no mesmo tecido ao longo do tempo apresentar a capacidade de confirmar respostas específicas do tecido.

A análise comparativa de imagens em diferentes pontos de tempo durante o crescimento microvascular também permite para o rastreamento de células endoteliais. Por exemplo, nosso laboratório identificou ilhas vasculares, como segmentos de célula endotelial nos arredores de redes microvasculares que são desconectados das redes próximas 15, 16. Para confirmar que estas ilhas se conectar à networ nas proximidadesk em resposta a estímulos angiogénicos, foi utilizado o modelo de cultura de mesentério de rato. Como mostrado na Figura 5, as ilhas foram rastreados vasculares após a estimulação do tecido com o Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF) ou VEGF mais factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). Nós também têm demonstrado resultados semelhantes estimulação pós de soro (dados não apresentados aqui). Após a estimulação da angiogênese, as ilhas vasculares originalmente desconectados podem ser encontrados conectado a redes próximas.

Outras aplicações potenciais do modelo de cultura de mesentério de rato poderia alavancar a capacidade de investigar as relações entre linfático e vasos sanguíneos e suas respectivas células endoteliais e o rastreamento do destino celular intersticial. Imagens de lapso de tempo de as mesmas redes microvasculares antes e após estimulação com 10% de soro neste modelo fornecidos exemplos de integração embarcação potencial linfática com sangue (Figura 6). Antes de estimulação, linfática e sanguínea Vessels foram distinguidos com base na morfologia do vaso. Após a estimulação, linfático versus a identidade dos vasos sanguíneos tornaram-se menos clara. O potencial para interacções de células endoteliais linfáticas / sangue é suportada pela observação de células PECAM + / 1- LYVE-endoteliais do sangue de ligação com PECAM + / LYVE-1 + células endoteliais linfáticas (dados não apresentados aqui). Estas observações suportam a utilização do modelo de cultura de mesentério de rato para investigar a plasticidade de células endoteliais linfáticas / sangue. Figura 6A também realça a rotulagem lectina de células intersticiais aparentes. Enquanto esta rotulagem é inconsistente e heterogénea de tecido para tecido, que faz realçar a presença de células residentes de tecido endógenos. CD11b rotulagem de tecidos cultivados (Figura 7) sugere que estas células intersticiais de lectina-positivo pode ser um sub-conjunto de macrófagos. Dado o interesse emergente no envolvimento de macrófagos na angiogênese 20, uma força adicional domodelo poderia ser a sua utilização para acompanhar a dinâmica de macrófagos ao longo do tempo.

Muito parecido com outros modelos ex vivo, uma limitação atual de estudar angiogénese no modelo de cultura de mesentério de ratos é a falta de fluxo sanguíneo. Tensão de corte causada pelo fluxo sanguíneo tem sido mostrado desempenhar um papel na morfologia da célula endotelial e a proliferação, bem como angiogénese 17, 18, 19. Para os resultados representativos apresentados na Figura 4, a ausência de tensão de corte por si só pode ter sido suficiente para induzir uma resposta angiogénica nas redes cultivadas. No entanto, sabemos que, com base na nossa publicação inicial caracterizar o modelo de cultura de mesentério de rato 8, que causas de suplementação media aumento da angiogênese relação a outros meios sozinho. Estudos futuros incorporando o fluxo dentro das redes microvasculares cultivadas são, sem dúvida necessário para imitar mais de perto ono cenário vivo. abordagens potenciais para o fluxo de incorporação pode incluir canulação das arteríolas alimentação de rede ou mesmo punção de outras artérias a montante dentro da fronteira de gordura das janelas mesentéricos. No entanto, apesar da falta de fluxo, a viabilidade de vários tipos de células, a manutenção de redes microvasculares linfáticos e no sangue, e a proliferação celular durante a angiogénese suporta nível aumentado em relação ao modelo de cultura de mesentério de rato de complexidade em relação à célula com base em modelos in vitro.

Em conclusão, este protocolo descreve um método simples, reprodutível ex vivo para imagiologia respostas angiogénicos em redes microvasculares intactas. Tal método é uma alternativa para a célula baseada em modelos in vitro para a avaliação dinâmica de células angiogénicos em locais específicos dentro de um ambiente de rede. O método também oferece uma nova ferramenta para investigar a angiogênese, Linfangiogênese e sangue / linfáticos mis-patterNing simultaneamente.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60 mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5 mL Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/mL
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/mL
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

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References

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