蛋白质中 Plasmodesmal 定位序列的识别在底中

Immunology and Infection

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Summary

植物细胞间连接, 胞 (Pd), 在植物生理学和植物-病毒相互作用中扮演中心角色。对 pd 传输的关键是分拣信号, 直接蛋白质的 pd。然而, 我们对这些序列的了解还处于起步阶段。我们描述了一种在 pd 靶蛋白中识别 pd 定位信号的策略。

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Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).

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Abstract

胞 (Pd) 是细胞连接, 它的作用是通过在植物细胞之间传输小分子和大分子的通路。而 Pd 运输的小分子, 如离子和水, 被推定为被动发生, 细胞运输的生物大分子, 这种蛋白质, 最有可能发生通过一个积极的机制, 涉及特定的靶向信号的运输分子。识别的胞 (Pd) 定位信号 (PLSs) 的稀缺性严重限制了对植物细胞大分子运输和通讯所涉及的蛋白质分选途径的理解。从大量的植物内源性和病毒蛋白已知的交通通过 Pd, 迄今只有三 PLSs 报告, 所有这些来自内源植物蛋白。因此, 重要的是要建立一个可靠的, 系统的实验策略, 以确定一个功能 PLS 序列, 这是必要的和足够的 Pd 靶向, 直接在活植物细胞。在这里, 我们描述一个这样的战略使用作为一个范例的细胞运动蛋白 (MP) 的烟草马赛克病毒(TMV)。这些实验, 确定和特点的第一植物病毒 pls, 可以适应发现 pls 序列在多数 Pd 靶向蛋白质。

Introduction

胞 (Pd) 作为植物发育和形态发生的关键调控器的细胞间转运的导管, 从转录因子到 mRNA 和小 RNA 分子不等。此外, 大多数植物病毒利用 Pd 的大分子转运能力在感染过程中进行细胞间传播;通过 pd, 植物病毒进化出专门的蛋白质, 称为运动蛋白 (MPs), 专门针对 pd1,2,3,45,7. Pd 转运的分子通路最有可能是与特定的序列紧密相连的, 靶向转移的蛋白质进入这些通路。因此, 识别这些 pd 定位信号 (PLSs) 可能是对相应的 pd 转运通路的诊断。这是通过类比的 Pd 传输8, 例如, 不同的核进口通路, 可以具体为不同的核定位信号 (不规则) 序列9,10。从概念上讲, NLSs 和 PLSs 都表示 non-cleavable 的亚细胞靶序列是必要和足够的目标。但是, 与 NLSs11不同的是, 有关 PLSs 的序列信息受到严重限制。具体来说, 只有四蛋白序列涉及 Pd 靶向已经报告, 所有这些都来源于内源植物蛋白。第一个是由 KN112的同源域表示的, 这是一个转录因子, 从内部细胞层到植物叶的表皮,13 , 以及它的诺克斯同系物14。第二个也是从转录因子, 自由度, 其中包含一个假定 PLS 描述为细胞间贩运 (IT) 主题15。第三个序列是从 PDLP1 胞的1型膜蛋白, 它由跨膜域16表示。最后, 第四 Pd 靶序列最近报告了 glycosylphosphatidylinositol (GPI) 锚定蛋白, 它由 glycosylphosphatidylinositol (GPI) 修饰信号17表示。

有趣的是, 直到最近, 没有 PLSs 的病毒的 MPs 报告。先前的研究表明, 假设 pls 序列在植物病毒 MPs18,19, 但没有真正 pls,, 一个极小的氨基酸序列必要和充足为 Pd 靶向不相关的货物分子 (e. g, CFP) 已在病毒 MP 中被识别。然而, 其中的一种蛋白质, 即烟草花叶病毒的 MP (TMV), 是 Pd 局部化和传输被证明的第一个20

为了解决这一差距, 我们制定了一个实验策略, 以确定 TMV MP PLS。该策略基于三概念。(i) 我们定义 PLS 作为一个极小的氨基酸序列是必要和充足的蛋白质靶向 Pd21。(ii) 由于 TMV MP 首先瞄准 pd, 然后通过这些通道22translocates, 我们的目的是拆下这两种活动并确定真正的 PLS, 它只对 pd 目标起作用, 而不适用于随后的传输。(iii) 我们分析了在结构上或功能上对其 Pd 靶向活性有重要意义的氨基酸残留物。利用这种方法, 我们在 TMV MP 的氨基末端划定了一个 50-氨基氨基酸残留序列, 作为善意的 PLS。这是通过产生一系列的 TMV MP 片段, 饱和整个蛋白质的长度, 标记他们的羧基总站与 CFP 和瞬时表达他们在植物组织。每个测试片段的 pd 定位是通过 coexpressing 他们与 pd 标记蛋白, PDCB1 (pd 胼胝结合蛋白 1)23。最小的片段, 仍然本地化到 pd, 但没有遍历 pd, 被认为是代表 PLS。最后, PLS 是丙氨酸扫描, 以确定其结构和/或功能所需的关键氨基酸残留物。

在这里, 我们通过描述 TMV MP 的识别来说明这种方法, 它可能被用来发现 PLSs 在任何其他 Pd 靶蛋白, 无论是由植物病原体或植物本身编码;这是因为我们的方法没有利用病毒 MPs 的任何独特的特点, 关于他们的能力目标 Pd。

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Protocol

1. 植物材料

  1. 植物种类的选择
  2. 使用的植物物种的利益蛋白,, 其中一个编码这种蛋白质的内生蛋白或代表自然宿主的病原体的病毒蛋白。此外, 选定的植物种类必须服从选择的瞬态遗传转化方法。
    注意: 这些研究通常使用烟草烟, 它代表了 TMV 的良好宿主, 并通过农杆菌介导的遗传转化技术 (, agroinfiltration (参见步骤 3) 有效地转换。N. 烟植物也很容易生长并且有大叶子, 很容易被农杆菌接种并且通过共聚焦显微镜很容易分析。
  3. 植物生长
    1. 在高密度的潮湿土壤中种植种子。让他们在一个受控环境室在20-25 ˚C 在 16 h 的光下在 ~ 75 µmol 光子 m-2 s-1和 8 h 黑暗。在 euphyll 直径达到0.5 厘米后, 小心地将幼苗转移到较大的盆中, 并在相同的条件下继续生长在同一个室内。
    2. 在4周内, 当最大的叶子直径为4-6 厘米时, 保持植株生长到4-8 叶阶段;此时, 它们可用于 agroinfiltration (参见步骤 3)。
      注意: 重要的是, 永远不要使用植物, 如果他们开始开花, 因为, 在这个发展阶段, 叶子建筑学经常变化24,25, 有时导致不一致的结果。

2. 表达载体结构

  1. 表达系统的选择
    1. 选择表达系统,, 向量和向量传递方法, 最适合在研究的植物物种中表达感兴趣的蛋白质。
      注意: 有时, 这种特定的蛋白质/植物物种组合可能需要特定的载体和载体传递方法, 以获得最理想的蛋白质表达和功能。然而, 对于大多数双子叶植物植物, 选择二元质粒作为表达载体和 agroinfiltration 作为传递系统。
  2. 蛋白质荧光标记
    1. 荧光标记每个表达的蛋白质用于分析其亚细胞分布22, 包括 Pd 定位。
      注: 使用 autofluorescent 蛋白质, 如 CFP 和 DsRed2, 作为标签。标记被测试的蛋白质与 CFP 并且 coexpress 它与一个自由 DsRed2。CFP 功能作为标签和作为一个病毒无关的货物分子。DsRed2 函数来校准瞬态表达式的整体效率, 并因为它是细胞自主的, 来识别最初转化的细胞;这后一种功能是重要的评估细胞运动的潜在 non-cell 自主测试蛋白质。对于共与 Pd 标记 PDCB1, 这也是细胞自主, 标签的测试蛋白与 CFP 和 PDCB1 与 DsRed2。
    2. 作为一个经验法则, 将 autofluorescent 标记融合到表达蛋白质的羧基末端。然而, 如果被标记的全长测试的蛋白质暴露了 Pd 靶向, 转移标记到蛋白质的氨基末端。
    3. 克隆编码序列的蛋白质被测试成一个合适的植物表达载体。
      注意: 有许多不同的植物表达载体, 允许荧光标记。我们使用一系列的 pSAT 质粒26或他们的一些衍生物27,28, 这是适合克隆的利益序列直接在帧与建议的 autofluorescent 标签 (见步骤 2.2.1) 在两个氨基和羧基末端方向。
    4. 将每个表达式卡带转换为农杆菌二元向量。
      注: 虽然 pSAT-based 构造适合直接枪法送到植物组织, agroinfiltration, 这是推荐的转换方法 (参见步骤 3), 要求表达式卡带位于 T-脱氧核糖核酸之间二进制向量29的边框。
      注意: 所有 pSAT 向量都是为了允许这样的传输到 pPZP-RCS2 基因表达式二进制向量26,30由一步克隆使用罕见的切割核酸 AscI, 我-PpoI, i-SceI, 我-CeuI, pi 胶和 pi TliI26. 喜欢利用 recombinatorial 克隆的研究人员,例如, 使用外源液站点31, 可以采用 pSAT 矢量变体26,27
    5. 对于共, 传输两个表达式磁带,例如, 测试蛋白质-CFP 和 DsRed2 或被测试的蛋白质-CFP 和 PDCB1-DsRed2 (参见步骤 2.1), 对相同的 pPZP-RCS2 二进制向量。
      注: 另一种方法是, 将单个二进制结构窝藏的农杆菌培养物混合在一起, 渗透到中 (参见步骤 3.1)。

3. Agroinfiltration

  1. 添加1µg 的 pPZP-RCS2-based 质粒从步2.2.5 到100µL 培养的农杆菌介导细胞菌株 EHA105 或 GV3101 准备的32, 在冰上孵育30分钟, 在液氮中闪光冷冻1分钟, 并孵育在28° c 为15分钟。
    1. 然后, 添加1毫升的 LB 培养基 (10 克/升胰, 5 克/升酵母提取物, 10 克/升 NaCl) 到主管的细胞混合物和孵化在28° c 为2小时. 在3000分钟内将细胞旋转下来 1 x g, re-suspend 他们在0.2 毫升的 LB, 并将它们放在 LB 琼脂上, 辅以适当的抗生素 (例如, 100 毫克/升霉和50毫克/升利福平为 pPZP-RSC2-based 向量26,30)。生长在28° c 为 48 h, 直到各自的殖民地是可看见的。
  2. 挑选和板几个单独的殖民地到一个新鲜的 LB 琼脂板 (见步骤 3.1), 生长在28° c 为48小时, 并采取少量的细菌进行分析的菌落 PCR33 , 以确认特定的二进制结构的存在。
  3. 在28° c 的5毫升培养基中, 用适当的抗生素补充一夜之间的利益结构, 增加每个农杆菌的菌落 (参见步骤 3.1.1)。离心的细胞在 3000 x g, 并 re-suspend 他们的 OD600= 0.5 在 agroinfiltration 缓冲区 (10 mm 氯化镁2, 10 mm MES (pH 5.6), 150 µM 丁香)。室温下孵育2小时。
    1. 如果使用混合的二元质粒, 而不是一个单一的基因表达载体的蛋白质共, 混合相应的细胞培养在 1:1 v/v 比前渗透。然后在28° c 下孵育2小时的细胞。
  4. 将接种装入一个1毫升的塑料注射器中, 然后按下注射器 (无针) 的喷嘴, 对完全成熟的N. 烟叶的下部 (背面) 表皮进行按压。用戴着手套的手指在正面的脸上按住叶子34,35
    1. 采用慢注射法在渗透介质中引入农杆菌。为了统计意义, 每株植物都要渗透几片叶子。
      注意: 请注意, 不使用最旧的叶, 因为它们不产生一致的表达式级别。
    2. 接种所有的叶子原位。保持被渗透的植物直到观察如步骤1.2 所述。

4. 共焦显微镜

  1. 用刀片将每片叶子切割成 24-48 h 之间的静脉浸润, (取决于特定的检测蛋白的瞬态表达效率);每个组织切片的大小应该是这样的, 切片是完全覆盖的盖子玻璃 (22 毫米 x 40 毫米) 用于显微镜。
  2. 将叶片放在对象幻灯片上, 然后朝上, 将一滴水放在叶片上, 用盖玻璃覆盖。将盖玻璃固定在每边的小块胶带上。
  3. 在激光扫描共聚焦显微镜下观察 agroinfiltrated 组织, 记录产生的图像。
    1. 首先, 使用10X 物镜来识别带有信号的细胞, 然后使用63x 物镜进行更详细的观察。
    2. 使用氩离子激光器的 458 nm 波长激发 CFP, 543 nm 激发 DsRed2。保留图像采集的所有设置,, 激光强度和光电倍增管 (PMT) 设置, 在实验之间。平均, 检查每一个实验条件的100-120 细胞。

5. PLS 的识别

  1. 用共焦显微镜诊断检测蛋白的定位 (4 节)。检查测试的蛋白质是否有特征的外围点状图案25363738394041和 colocalizes使用 Pd 标记 PDCB123。这表明, 被测试的蛋白质最有可能包含 PLS 序列。
  2. 经过测试的蛋白质 PLS 活性的确认, 逐步细分其开放阅读框架 (基因库) (BAF93925.1) 到更小的片段, autofluorescently, (例如, CFP,) 标记每一个, 并分析其如步骤4所述的亚细胞定位。最初, 建议每一个细分片段的100氨基酸残基的大小。
  3. 进一步细分有 PLS 活动的被截断的片断和检查他们的亚细胞定位如描述在步4直到最小的片段仍然本地化到 Pd,是足够运输 autofluorescent 标记货物到 Pd, 被确定。这个片断被推测代表 PLS 序列。
  4. 从全长检测的蛋白质中删除假定 pls,将测试蛋白的剩余部分与未假定的 autofluorescent 标记相融合, 并确定所产生的突变蛋白的亚细胞定位, 如步骤所述4. 如果这种突变蛋白缺乏假定的 pls 没有定位到 pd, 这将表明, 识别 pls 不仅是足够的 (见步骤 5.3), 但也有必要的 pd 运输的测试蛋白质。
  5. Agroinfiltrate 的叶子与农杆菌文化的混合物窝藏表达结构的 CFP 标签 PLS 和自由 DsRed2 (见步骤 3.3)。使用与步骤4.3 相同的设置, 使用10x 物镜的共聚焦显微镜观察浸润组织。
  6. 将含有 CFP 和 DsRed2 信号的细胞分入最初渗透的细胞, 并将仅包含 CFP 信号的相邻细胞得分为表现运动的单元。
    注: 此步骤检查已识别的 PLS 的潜在细胞运动能力;这是因为许多靶向 pd (包括大多数植物病毒 MPs) 的蛋白质也通过 pd 转移到相邻的细胞。土壤中的农杆菌浓度分别取决于不同结构的表达效率。对于 agroinfiltration, 确保使用细胞培养稀释, 确保 (i) 单细胞的转化, 使相邻的细胞未, (ii) 达到相似的表达效率。例如, 我们的实验使用 OD600的0.01 和0.005 分别表达 CFP 标记的 PLS 和自由 DsRed2。

6. 使用丙氨酸扫描的关键 PLS 残留物的识别42

  1. 使用标准 PCR 协议放大 PLS 编码序列采用一对引物设计, 以包含所需的突变,, 取代的目标氨基酸残留物与丙氨酸, 周围的中心区域的每一个底漆的描述21. 根据制造商的说明, 进行底漆设计并使用定点诱变试剂盒进行定点诱变。
  2. 使用任何标准的 dna 纯化试剂盒纯化所产生的 PCR 产物, 并在37° c 的 DpnI 中将其消化, 以消除双亲 (、non-mutated) 甲基化和 hemimethylated dna。在室温下冷却5分钟 (不在冰上)。然后将混合物直接转化为大肠杆菌主管细胞43, 并按照步骤3.2 中所述, 识别具有所需突变结构的菌落。
  3. 如步骤2.2.4 所述, 将突变体构造引入二进制向量, 执行步骤3所述的 agroinfiltration, 并按照步骤4和5.1 所述评估 Pd 目标。

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Representative Results

代表数据, 忠实地说明预期的结果从被描述的协议和辨认 TMV MP PLS, 适应从元et al.21.图 1A首先总结了表达全长 TMV mp (1-268) 的主要构造, TMV mp PLS (包括蛋白质的前50氨基酸残滓, 1-50) 和它的丙氨酸扫描 V4A 衍生物熔化了 CFP (生成作为在步骤2.2、5.2 和6中描述), 而图 1B对这些标记蛋白质的亚细胞定位进行了总结和量化。图 1C说明了为 TMV mp-CFP 和 TMV mp PLS CFP 以及 coexpressed pd 标记 PDCB1-DsRed2 (参见步骤 5.1) 观察到的特征性外周点 Pd 定位模式。图 2A说明了 TMV mp-CFP 和 TMV mp CFP 和 nucleocytoplasmic coexpressed 自由 DeRed2 分布的 Pd 目标 (参见步骤 5.1)。最后,图 2B说明了 TMV mp 和 TMV mp pls 与单丙氨酸替代 V4A 的 Pd 靶向损失, 表明该残留物对 pls 结构或功能很重要;在同一个细胞 coexpressed pd 标记 PDCB1 仍然本地化对 pd (参见步骤 6)。

这些数据表明, 这一概念和技术上简单的过程, 系统生产的蛋白质片段, 他们的融合到一个 autofluorescent 标记货物的蛋白质, 并测试的能力, 本地化到 Pd 可以确定一个最低蛋白质序列必要和足够的 Pd 目标,, PLS。为了正确解释这些本地化数据, 必须使用已知的 pd 蛋白进行定位实验,例如、PDLP 或 PDCB 家族成员1623或一种对 pd44 进行排序的植物病毒 MPs。.显然, 定位不必须是完整的, 因为并非所有的 P 定位蛋白可能是针对相同的 pd, 但有统计学意义的定位与至少一个 pd 标记蛋白是必要的定义 PLS 活动。

Figure 1
图 1: TMV MP 的标识请(A) 用于识别 TMV mp 的主要 CFP 融合结构的摘要 TMV mp 序列, 绿色方框;CFP, 蓝色盒子;P, 启动子;T, 终结者左边的数字表示每个 TMV MP 片段中所含的氨基酸残留。(B) 综述了 (A) 中所示的融合蛋白的亚细胞定位。根据相应的亚细胞标记、PDCB1-DsRed2 和自由 DsRed2 的定位, 分别确定局部放电定位或 nucleocytoplasmic 定位。在三独立的实验中, 每一个结构的100个表达单元显示出每个定位模式的细胞百分比。数据是指±标准错误 (SE)。(C) pd 靶向 TMV mp-CFP, TMV mp PLS CFP, 和 pd 标记 PDCB1-DsRed2。CFP 信号是蓝色的;DsRed2 信号呈紫色;质的自发荧光被过滤掉了。图像是单个共焦剖面。缩放条形图 = 10 µm, 差分干涉对比显微图像。这个数字是改编自元et al.21.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: TMV mp、TMV mp 和他们的丙氨酸扫描突变体的 Pd 靶向性.(A) TMV mp-CFP、TMV mp CFP 和 nucleocytoplasmic 标记 DsRed2 的亚细胞定位。(B) TMV mp-CFP 和 TMV mp-CFP V4A 丙氨酸扫描突变体的 Pd 靶向能力损失。pd 标记的共 PDCB1-DsRed2。CFP 信号是蓝色的;DsRed2 信号呈紫色;质的自发荧光被过滤掉了。图像是单个共焦剖面。缩放条形图 = 10 µm, 差分干涉对比显微图像。这个数字是改编自元et al.21.请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

该协议有四核心成分: 确定一个序列的概念是必要的和足够的目标, 以 Pd, 系统划分的利益蛋白的片段, 逐步减少长度, 融合测试片段的 autofluorescent 蛋白, 既作为标签和高分子货物, 和功能测试的 Pd 靶向活植物组织后, 瞬态表达的检测融合蛋白。请注意, 农杆菌介导的瞬态表达式在相对较短的时间内生成数据,, 与在类似研究中经常使用的转基因植物生产所需的月份相比, 是数天,15

共的蛋白质的兴趣与亚细胞定位标记,例如, PDCB1 或自由 DsRed2, 通常是从基因表达载体执行。但是, 如果将多个表达式磁带传输到单个向量中是技术上的问题, 则共也可以通过将每个磁带传输到单独的二进制结构中, 并将等效的液体培养量结果农杆菌菌株为 agroinfiltration。由于该协议利用瞬态表达式, 二进制向量不需要进行稳定变换的选择标记, 尽管它们的存在不利于表达效率。

该协议针对中的蛋白质表达和目标进行了优化;然而, 它可以用于其他植物物种, 包括拟南芥45,46, 适于遗传转化的农杆菌。对于其他植物物种, 或如果其他需要, 此协议可适用于利用枪法传递41直接从 pSAT-based 向量的瞬态表达式, 避免了将表达式磁带传输到二进制向量的需要。

该协议的关键点是植物材料的生理和发育条件的一致性。具体地说, 所有的植物在整个实验中都必须是健康的, 而且, 对于 agroinfiltration, N. 烟植物必须小于4周, 并且在4-8 叶级, 最大的叶子直径为4-6 厘米。如果植株太小, agroinfiltration 的影响会太严重, 干扰标记蛋白的表达和定位。另一方面, 较老的植物通常表现出 pd24,25的可变结构, 也会影响 pd 目标模式的一致性。

尽管如此, 由于整个植物的生理条件的不同, 特别是其转化的细胞, 每个实验中 Pd 靶向的效率可能有所不同。因此, 重要的是要分析一个相对较大数量的细胞 (> 100) 每个实验, 并执行至少三生物复制每一个实验。通常, 我们认为一个测试片段, 以包含 pd 的目标活动, 如果它在至少70% 的转化细胞展示 pd 定位。每个片段的 pd 靶向效率的差异,例如, 显示 pd 特异的点状堆积模式的转化细胞百分比, 应由学生的 t 检验和 p 值 < 0.05-0. 01 对应于统计概率大于95-99%。

另一个重要的问题是荧光标记/货物在聚变分子中的位置。一些 Pd 靶向蛋白质也与内质网 (ER), 这可能需要无障碍的氨基末端序列。在这些情况下, 氨基末端融合, 蛋白质片段的羧基终点被熔化到荧光标记的氨基末端,例如, CFP 或 DsRed2, 应该使用。在以下情况下, 可以更改标记的此默认位置。(i) 如果氨基终端融合不可用--, 它们不表现出有意义的亚细胞定位模式, 表达不充分, 或不产生足够可靠检测的荧光信号--如果感兴趣的蛋白质不包含氨基终端信号序列或羧基终端融合, 其中的氨基终点的测试片段被融合到的羧基终点的标签, 他们应该尝试。(ii) 如果感兴趣的蛋白质在其羧基末端含有信号序列, 则也应使用羧基端融合。(iii) 如果感兴趣的蛋白质具有氨基酸和羧基终端信号, 如在 GPI 锚定蛋白中发现的蛋白, 或者它含有氨基终端信号肽, 但其氨基终端融合不可用, 则应在内部放置标签 (无论是下游的氨基终端信号或上游的羧基终端信号)。我们的早期出版物47,48中描述了一些用于蛋白质内部荧光标记的有用程序。

目前, 还没有已知的协商一致的顺序。正如我们建议的那样 (在步骤5.2 中), 最初将蛋白质细分为连续的~100-200 残滓-长片段。这些可以根据观察到的 Pd 靶向活动或缺乏的情况逐步缩短。人们应该注意到在蛋白质中存在的其他潜在的靶向信号 (例如, 无源性, 信号肽,)。然而, 由于这些序列与 PLS 序列的潜在重叠是未知的, 这些蛋白质区域应该包括在这个突变分析。

到目前为止, 这个协议被用来识别一个单 PLS 在蛋白质分子21。然而, 一个蛋白质可能包含不止一个信号序列;事实上, 许多核蛋白中已经描述了多个 NLSs, 包括 GATA 转录因子49。因此, 在分析被测蛋白质的不同片段用于 Pd 靶点时, 可能会发现不止一个这样的片段, 表明存在多个 PLSs, 它们可以独立或协同作用。

该协议的主要限制是, 在 agroinfiltration 后, 在表皮细胞和相对狭窄的生长阶段, 对瞬时表达的蛋白质的亚单位定位的可视化效果最好。在必要的时候, 可以通过生产转基因植物, 在大多数组织和细胞类型中稳定地表达每个被测试的蛋白质来克服这种限制。此外, 这项协议将不会有用的研究病毒 MPs 或其他 Pd 靶向蛋白质的功能只在植物物种, 不适合瞬态遗传转化。

虽然我们开发了这一技术, 以识别 TMV MP, 它可以用于发现 PLSs 在任何其他植物病毒 MPs 或植物内源性蛋白, 本地化为 Pd, 瞬时或永久性的。此外, 如果结合适当的亚细胞定位标记47, 此协议适用于在植物的感兴趣的蛋白质内的许多其他靶向信号的识别。

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Disclosures

未声明任何利益冲突。

Acknowledgments

由于篇幅不足, 我们主要引用了评论文章, 我们向我们的同事道歉, 他们的原创作品没有被引用。共实验室的工作得到 nih、NSF、美国农业部/NIFA、巴德和 BSF 共的资助, S.G.L. 实验室由国立卫生研究院和植物病理学和植物微生物生物学部门资助, S.G.L。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166

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References

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15, (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42, (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley-Interscience. New York. (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

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