Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) zijn cel-naar-cel verbindingen die functioneren als gateways waarmee kleine en grote moleculen worden vervoerd tussen plantencellen. Overwegende dat Pd vervoer van kleine molecules, zoals ionen en water, wordt verondersteld te passief optreden, cel-naar-cel vervoer van biologische macromoleculen, dergelijke eiwitten bevatten, meest waarschijnlijk gebeurt via een actief mechanisme waarbij specifieke targeting signalen op de vervoerde molecuul. De schaarste van geïdentificeerde plasmodesmata (Pd) lokalisatie signalen (PLSs) heeft strenge beperkingen op het begrijpen van de eiwit-sorteren trajecten die betrokken zijn bij plant cel-naar-cel macromoleculaire vervoer en communicatie. Van een rijkdom aan plant endogene en virale eiwitten bekend om verkeer via Pd, slechts drie PLSs hebben gemeld tot op heden, allemaal van endogene plantaardige eiwitten. Dus, is het belangrijk een betrouwbare en systematische experimentele strategie ter identificatie van een functioneel PLS-reeks, die zowel noodzakelijk als voldoende voor Pd targeting, direct in de woonkamer te ontwikkelen plantaardige cellen. Hier beschrijven we een dergelijke strategie als een paradigma met behulp van de cel-naar-cel verkeer proteïne (MP) van de tabak mosaic virus (TMV). Deze experimenten, die geïdentificeerd en gekenmerkt de eerste plant virale PLS, kunnen worden aangepast voor de ontdekking van PLS sequenties in meest Pd-gerichte eiwitten.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) fungeren als leidingen voor intercellulaire vervoer van belangrijke regelgevende instanties van de ontwikkeling van planten en voedselproductie, variërend van transcriptiefactoren tot mRNA en kleine molecules van RNA. Bovendien, deze macromoleculaire transportcapaciteit van Pd wordt gebruikt door de meeste plantenvirussen voor hun intercellulaire verspreiding tijdens infectie; Als u wilt verplaatsen door middel van Pd, geëvolueerd plantenvirussen gespecialiseerde eiwitten, genoemd verkeer eiwitten (MPs), die specifiek gericht zijn op Pd1,2,3,4,5,6 , 7. moleculaire pathways van Pd vervoer waarschijnlijk zijn nauw met elkaar verbonden met de specifieke opeenvolgingen die gericht zijn op de vervoerde hoeveelheden eiwitten in deze trajecten. Dus, is identificatie van deze Pd lokalisatie signalen (PLSs) diagnose van het overeenkomstige Pd vervoer traject mogelijk. Dit wil analogie van Pd vervoer8, bijvoorbeeld verschillende nucleaire importeren trajecten, die kunnen wel specifiek voor verschillende nucleaire localisatie signaal (NLS) sequenties9,10. Conceptueel, vertegenwoordigen zowel NLSs als PLSs niet-cleavable subcellular targeting sequenties die noodzakelijk voldoende zijn voor targeting en. Echter, in tegenstelling tot de NLSs11, de opeenvolgingsinformatie over PLSs is zeer beperkt. Specifiek, zijn slechts vier proteïne sequenties die betrokken zijn bij de Pd gericht op gemeld, met allemaal afgeleid van endogene plantaardige eiwitten. De eerste die wordt vertegenwoordigd door een domein van de homeobox van KN112 – een transcriptiefactor waarmee wordt verplaatst van de cel van de binnenste lagen naar de opperhuid van de plant blad13 – en haar KNOX homologen14. In het tweede voorbeeld is ook van een transcriptiefactor, Dof, waarin een vermeende PLS beschreven als de intercellulaire handel (IT) motief15. De derde reeks is uit het PDLP1 plasmodesmata-ingezeten type 1 membraan eiwit, en het wordt vertegenwoordigd door een transmembraan domein16. Tot slot, de vierde Pd gericht op volgorde werd onlangs gemeld voor glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerd eiwitten en het wordt vertegenwoordigd door de glycosylphosphatidylinositol (GPI) wijziging signaal17.

Interessant, tot voor kort geen PLSs gemeld voor virale MPs. Eerdere studies aangegeven de aanwezigheid van vermeende PLS sequenties in plant virale MPs18,19, maar geen echte PLS, dat wil zeggen, een minimale aminozuur reeks zowel noodzakelijk als voldoende voor Pd targeting van een ongerelateerde lading molecuul ( bijv., GVB) in een virale MP is geconstateerd. Nog was een van deze proteïnen, MP van het tabak mosaic virus (TMV), de eerste die Pd lokalisatie en vervoer al aangetoond dat20.

Om deze leemte, ontwikkelden we een experimentele strategie ter identificatie van TMV MP PLS. Deze strategie was gebaseerd op drie concepten. (i) we PLS gedefinieerd als een minimale aminozuur-reeks die noodzakelijk en voldoende zijn voor het targeten van eiwit Pd21. (ii) omdat TMV MP eerst Pd richt en vervolgens translocates via deze kanalen22, we gericht op het afkoppelen van deze twee activiteiten en het identificeren van de bonafide PLS, welke functies alleen voor Pd targeting, en niet voor het latere vervoer. (iii) we geanalyseerd de geïdentificeerde PLS voor aminozuurresidu's belangrijk voor haar Pd gerichte activiteit, structureel of functioneel. Met behulp van deze aanpak, we een 50-amino acid residu-reeks op de amino-terminus van TMV MP die als bonafide PLS fungeert afgebakend. Dit werd gedaan door de productie van een reeks van TMV MP fragmenten die verzadigd van de gehele lengte van het eiwit, tagging hun carboxyl-termini met GVB en Transient uiten ze in plantaardige weefsels. PD lokalisatie van elk van de geteste fragmenten werd bepaald door coexpressing hen met een Pd marker eiwit, PDCB1 (Pd callose bindende eiwitten 1)23. Het kleinste fragment dat nog steeds gelokaliseerd op Pd, maar deed niet doorkruisen Pd, werd beschouwd als PLS vertegenwoordigen. Ten slotte was het PLS alanine-gescand om te bepalen van de belangrijkste aminozuurresidu's nodig zijn voor de structuur en/of functie.

Overwegende dat hier we deze benadering illustreren door de identificatie van TMV MP PLS beschrijven, kan het worden gebruikt om te ontdekken PLSs in elke andere Pd-gerichte eiwitten, of gecodeerd door plant ziekteverwekkers of door de planten zelf; Dit is omdat onze werkwijze niet van eventuele unieke kenmerken van virale MPs met betrekking tot hun vermogen om doel te Pd profiteren doet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. de plantmateriaal

  1. Keuze van plantensoorten
  2. Gebruik de plantensoorten afkomstig uit de proteïne van belang, dat wil zeggen, één die codeert dit eiwit voor endogene eiwitten of waarmee de natuurlijke gastheer voor het pathogene agens voor virale eiwitten. Bovendien moet de geselecteerde plantensoorten vatbaar voor de gekozen methode van voorbijgaande genetische transformatie.
    Opmerking: De studies routinematig dienst Nicotiana benthamiana, die vertegenwoordigt een goede gastheer voor TMV en efficiënt wordt omgezet door de genetische transformatie Agrobacterium-gemedieerde techniek, dat wil zeggen, agroinfiltration (zie stap 3). N. benthamiana planten ook gemakkelijk verbouwd en hebben grote bladeren, die gemakkelijk door Agrobacterium geënt en gemakkelijk geanalyseerd door confocale microscopie.
  3. Plantengroei
    1. N. benthamiana zaaien in de natte bodem bij hoge dichtheid. Houd ze in een gecontroleerde omgeving kamer op 20-25 ˚C tot 16 h van licht op ~ 75 µmol fotonen m-2 s-1 en 8 h van duisternis. Nadat de diameter van de euphyll 0.5 cm bereikt, zorgvuldig de zaailingen overbrengen in grotere potten en verder groeien in de dezelfde kamer onder dezelfde voorwaarden.
    2. De planten te handhaven totdat ze groeien tot 4-8-bladstadium binnen 4 weken wanneer de grootste bladeren 4-6 cm diameter zijn; op dit moment, ze kunnen worden gebruikt voor agroinfiltration (zie stap 3).
      Opmerking: Belangrijker nog, gebruik nooit de planten als ze begon te bloeien want vooralsnog ontwikkelingsstoornissen, de architectuur van het blad vaak varieert van24,25, soms leiden tot inconsistente resultaten.

2. weergave Vector bouw

  1. Keuze van expressie systemen
    1. Kies de expressie systeem, dat wil zeggen, vectoren en vector leveringsmethode, geschikt voor de expressie van de proteïne van belang bij de plantensoorten studeerde.
      Opmerking: Soms dergelijke specifieke combinaties van geteste eiwit/plantensoorten kunnen vereisen specifieke vectoren en vector leveringsmethode voor optimale expressie en functie van het eiwit van belang. Voor meest tweezaadlobbige planten, echter binaire plasmiden als expressievectoren en agroinfiltration als levering systeem te selecteren.
  2. Eiwit fluorescerende tagging
    1. Fluorescently label elke uitgedrukt proteïne voor analyse van haar subcellular distributie22, met inbegrip van Pd lokalisatie.
      Opmerking: Dienst autofluorescent eiwitten, zoals GVB en DsRed2, als codes. Tag van de geteste eiwit met GVB en het coexpress met een gratis DsRed2. GVB functies als label én als een virus-onafhankelijke lading molecuul. DsRed2 functies voor het kalibreren van de algehele efficiëntie van voorbijgaande expressie en, omdat het cel-autonome, te identificeren van de aanvankelijk getransformeerde cel; deze laatste functie is belangrijk bij de beoordeling van cel naar cel verkeer van mogelijk niet-cel-zelfstandige geteste eiwitten. Label voor coexpression met de Pd-markering PDCB1, die ook cel-autonome is, de geteste eiwit met GVB en PDCB1 met DsRed2.
    2. Als een vuistregel, zekering de autofluorescent tag aan het carboxyl-terminus van de uitgesproken proteïne. Echter, als de tagged full-length geteste eiwit exposities gecompromitteerd Pd targeting, overbrengen in de tag de amino-terminus van het eiwit.
    3. Kloon de codering sequenties van de eiwitten te beproeven in een geschikte plant expressie vector.
      Opmerking: Er zijn veel verschillende plant-expressievectoren waarmee fluorescerende tagging. Wij gebruiken een aantal pSAT plasmiden26 of sommige van hun derivaten27,28, die geschikt zijn voor het klonen van de opeenvolging van belang rechtstreeks in het frame met de codes van de voorgestelde autofluorescent (zie stap 2.2.1) in beide amino- en carboxyl-terminal oriëntaties.
    4. Breng elke expressie cassette in een Agrobacterium binaire vector.
      Opmerking: Hoewel pSAT gebaseerde constructies zijn geschikt voor directe biolistic levering in plantaardige weefsels, agroinfiltration, die de methode van de transformatie hier aanbevolen (zie stap 3), is vereist dat de expressie cassette moet worden geplaatst tussen het T-DNA grenzen van een binaire vector29.
      Opmerking: Alle pSAT vectoren zijn ontworpen om dergelijke overdracht naar de pPZP-RCS2 multigene expressie binaire vector26,30 door middel van een-voor-stapmodus klonen met zeldzame snijden nucleasen AscI-PpoI, -SceI, ik-CeuI, PI-PspI en PI-TliI 26. onderzoekers die verkiezen te gebruiken recombinatorial klonen, bijvoorbeeldmet behulp van heterologe lox sites31, pSAT vector varianten26,27kunnen inzetten.
    5. Voor coexpression, beide cassettes expressie overbrengen, bijvoorbeeld, geteste eiwit-GVB en DsRed2 of geteste eiwit-GVB en PDCB1-DsRed2 (zie stap 2.1), naar de dezelfde binaire pPZP-RCS2-vector.
      Opmerking: Als alternatief, Agrobacterium culturen herbergen van individuele binaire constructies kunnen met elkaar vermengd worden voor infiltratie in de N. benthamiana (zie stap 3.1).

3. Agroinfiltration

  1. Toevoegen van 1 microgram van een pPZP-RCS2-gebaseerde plasmide van stap 2.2.5 tot 100 µL cultuur van bevoegde cellen van Agrobacterium tumefaciens stam EHA105 of GV3101 bereid als beschreven32, incubeer op ijs voor 30 min, flash-freeze in vloeibare stikstof voor 1 min, en Incubeer bij 28 ° C gedurende 15 minuten.
    1. Dan, voeg 1 mL van LB medium (10 g/L trypton, 5 g/L gistextract en 10 g/L NaCl) toe aan het bevoegde cel mengsel en Incubeer bij 28 ° C voor 2 h. Spin down de cellen bij 3.000 × g gedurende 1 min resuspendeer hen in 0,2 mL LB , en hen op LB agar aangevuld met passende antibiotica (b.v., 100 mg/L spectinomycine en 50 mg/L voor3026,pPZP-RSC2-gebaseerde vectoren rifampicine) plate. Groeien bij 28 ° C gedurende 48 uur totdat afzonderlijke kolonies zichtbaar zijn.
  2. Kies en verschillende afzonderlijke kolonies op een verse LB agarplaat plaat (zie stap 3.1), groeien bij 28 ° C gedurende 48 h, en neem een kleine hoeveelheid bacteriën voor analyse door kolonie PCR33 ter bevestiging van de aanwezigheid van de specifieke binaire constructies.
  3. Groeien elke Agrobacterium kolonie met de constructie van belang 's nachts bij 28 ° C in 5 mL van LB medium aangevuld met passende antibiotica (zie stap 3.1.1). De cellen bij 3.000 × g centrifugeren en resuspendeer hen OD600= 0,5 in agroinfiltration buffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5.6), 150 µM acetosyringone). Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    1. Als het gebruik van een mengsel van binaire plasmiden in plaats van een enkele multigene uitdrukking plasmide voor eiwit coexpression, meng de overeenkomstige celculturen op 1:1 v/v-verhouding voor de infiltratie. Vervolgens Incubeer de cellen bij 28 ° C gedurende 2 uur.
  4. Laad het entmateriaal in een kunststof spuit van 1 mL en druk op die het mondstuk van de spuit (neen naald) tegen de lagere (abaxial) opperhuid van de volwassen N. benthamiana verlaat. Houd het blad met een gehandschoende vinger op de adaxial gezicht34,35.
    1. Het introduceren van het Agrobacterium in infiltratie medium door langzame injectie. Voor statistische significantie, infiltreren in verschillende bladeren op elke plant.
      Opmerking: Merk op dat de oudste bladeren niet worden gebruikt zoals ze doen niet consistent expressie niveaus opleveren.
    2. Inoculeer alle bladeren in situ. Handhaving van de geïnfiltreerde plant tot waarneming zoals beschreven in stap 1,2.

4. confocale microscopie

  1. Gebruik een mes te snijden van elk blad in fragmenten tussen de aderen 24-48 h na de infiltratie, (afhankelijk van de efficiëntie van voorbijgaande expressie van het specifieke geteste eiwit); de grootte van elk segment van het weefsel moet zijn dusdanig dat het segment is volledig wordt bedekt door het cover glas (22 mm x 40 mm) gebruikt voor microscopie.
  2. Plaats de blad-segmenten op het object dia met het oppervlak van de abaxial blad naar boven, breng een druppel water op het blad segment en bedek het met de dekking glas. Immobiliseren de glazen cover met kleine stukjes tape aan elke kant.
  3. Observeren van de agroinfiltrated weefsels onder een laser confocal microscoop scannen en de resulterende beelden registreren.
    1. Eerst, gebruik van een 10 X-objectief cellen worden geïdentificeerd met het signaal, en gebruik vervolgens 63 x objectief voor meer gedetailleerde opmerkingen.
    2. Gebruik de 458 nm golflengte van een laser ion argon te prikkelen GVB en 543 nm te wekken DsRed2. Alle instellingen voor Beeldacquisitie, dat wil zeggen, laser intensiteit en fotomultiplicator buis (PMT) instellingen, tussen experimenten te behouden. Onderzoeken gemiddeld 100-120 cellen voor elke experimentele voorwaarde.

5. identificatie van PLS

  1. Diagnose van de lokalisatie van het geteste eiwit met behulp van de confocal microscoop (punt 4). Controleren of de geteste eiwit de karakteristiek perifere punctate patroon25,36,,37,38,39,40,41 heeft en colocalizes met de markering van de Pd PDCB123. Dit geeft aan dat de geteste proteïne waarschijnlijk PLS sequenties bevat.
  2. Na bevestiging van de PLS-activiteit van geteste eiwit, verdeel geleidelijk haar open leesraam (ORF) (genbank toetreding nummer BAF93925.1) in kleinere fragmenten, autofluorescently, (b.v.GVB) tag van elk van hen, en analyseren hun Subcellular Localisatie zoals beschreven in stap 4. In eerste instantie wordt de grootte van 100 aminozuurresidu's voor elk onderverdeeld fragment aanbevolen.
  3. Verder onderverdelen de afgekapte fragmenten die de PLS-activiteiten hebben plaatsgevonden en controleren van hun subcellular localisatie, zoals beschreven in stap 4 tot en met het kleinste fragment dat nog te Pd lokaliseert, d.w.z. is voldoende voor het vervoer van de lading van de tag autofluorescent Pd, is aangegeven. Dit fragment wordt verondersteld te vertegenwoordigen de PLS-reeks.
  4. De vermeende PLS uit de full-length geteste proteïne, dat wil zeggen de zekering het resterende deel van de test-eiwit zonder putatief PLS aan autofluorescent tag verwijderen en bepalen de subcellular localisatie van de daaruit resulterende mutant eiwitten zoals beschreven in stap 4. Indien deze mutant eiwit dat de vermeende PLS mist niet lokaliseren naar Pd, zal dit erop wijzen dat de vastgestelde PLS niet alleen voldoende (zie stap 5.3), maar ook noodzakelijk voor het vervoer van de Pd van het geteste eiwit is.
  5. Agroinfiltrate de bladeren met een mengsel van Agrobacterium culturen herbergen de expressie samenstellen voor het GVB-gelabeld PLS en gratis DsRed2 (zie stap 3.3). Observeren geïnfiltreerde weefsel confocal microscoop met objectief van 10 x met dezelfde instellingen zoals in stap 4.3.
  6. Score van cellen die zowel GVB en DsRed2 signalen als aanvankelijk geïnfiltreerde cellen bevatten, en score van de aangrenzende cellen die alleen het GVB signaal als degenen die beweging vertonen.
    Opmerking: Deze stap bespreekt de geïdentificeerde PLS voor haar potentiële vermogen van cel naar cel verkeer; Dit komt omdat veel eiwitten die gericht zijn op Pd (met inbegrip van de meeste planten virale MPs) ook door middel van Pd aan de naburige cellen verplaatsen. De concentratie van Agrobacterium gebruikt voor infiltratie hangt af van de efficiëntie van de expressie van verschillende structuren respectievelijk. Voor agroinfiltration, zorg ervoor dat de cel cultuur verdunning die zorgt voor (i) de transformatie van afzonderlijke cellen, waardoor de aangrenzende cellen niet-getransformeerde, (ii) bereikt soortgelijke efficiëntie van expressie gebruiken. Bijvoorbeeld onze experimenten gebruiken OD600 van 0,01 en 0,005 voor expressie van GVB-gelabeld PLS en gratis DsRed2, respectievelijk.

6. identificatie van Key PLS residuen met behulp van Alanine scannen42

  1. Standaard PCR protocollen gebruiken om te versterken de PLS codering volgorde een paar inleidingen ontworpen om de gewenste mutatie, dat wil zeggen, vervanging van het residu doel aminozuur met alanine, rond de centrale regio van elke primer bevatten zoals beschreven in dienst 21. verrichten primer design en gebruik de plaats-geleide mutagenese kit voor plaats-geleide mutagenese volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Zuiveren van de resulterende PCR producten met behulp van zuivering van elke Standaardkit-DNA en verteren ze bij 37 ° C met DpnI te elimineren de ouderlijke gemethyleerd (dat wil zeggen, niet-gemuteerd) en hemimethylated DNA. Afkoelen dit gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (niet op het ijs). Vervolgens het mengsel direct omvormen in E. coli bevoegde cellen43en identificeren van kolonies met de gewenste mutant constructies zoals beschreven in stap 3.2.
  3. Introduceren van de mutant constructies in de binaire vector, zoals beschreven in stap 2.2.4, voert u agroinfiltration zoals beschreven in stap 3 en beoordelen Pd richten zoals beschreven in stap 4 en 5.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representatieve gegevens, die getrouw illustreren de verwachte resultaten van de beschreven protocollen en de TMV MP PLS te identificeren, zijn aangepast van Yuan et al. 21. figuur 1A eerste geeft een overzicht van belangrijke constructies uiten de full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestaande uit de eerste 50 aminozuurresidu's van het eiwit, 1-50), en haar alanine scannen V4A derivaten gesmolten GVB (gegenereerd als beschreven in stappen 2.2, 5.2 en 6) Overwegende dat de figuur 1B worden samengevat en kwantificeert de subcellular localisatie van deze tagged proteïnen. Figuur 1 c illustreert de karakteristieke perifere punctate Pd lokalisatie patronen waargenomen voor TMV MP-GVB en voor TMV MP PLS-GVB alsook wat betreft de coexpressed Pd marker, PDCB1-DsRed2 (zie stap 5.1). Figuur 2A toont Pd targeting van TMV MP-GVB en voor TMV MP PLS-GVB en nucleocytoplasmic distributie van coexpressed gratis DeRed2 (zie stap 5.1). Ten slotte, figuur 2B illustreert het verlies van Pd richten door TMV MP zowel TMV MP PLS met een enkele alanine vervanging V4A, die aangeeft dat dit residu belangrijk voor de PLS structuur of functie is; in dezelfde cellen de coexpressed Pd-markering PDCB1 nog te Pd lokaliseert (zie stap 6).

Deze gegevens tonen aan dat deze conceptueel en technisch eenvoudige procedure voor de systematische productie van een eiwit fragmenten, hun fusie aan een proteïne van de marker-cargo autofluorescent en testen voor de mogelijkheid om te lokaliseren te Pd kan het identificeren van de opeenvolging van een minimale eiwit noodzakelijke en voldoende voor Pd richt, dat wil zeggen, PLS. Voor de juiste interpretatie van deze gegevens lokalisatie, is het van cruciaal belang voor het uitvoeren van colocalization experimenten met een bekende Pd-eiwit, bijvoorbeeld, PDLP of PDCB familieleden16,23 of één van de plant virale MPs die te Pd44 sorteren . De colocalization hoeft uiteraard niet te worden voltooid, als niet alle P-lokaliseren eiwitten kunnen worden gericht op de dezelfde Pd, maar een statistisch significante mate van colocalization met minstens één van Pd marker eiwitten nodig is voor het definiëren van de PLS-activiteit.

Figure 1
Figuur 1: identificatie van TMV MP PLS. (A) samenvatting van de belangrijkste GVB-fusion constructies gebruikt voor het identificeren van TMV MP PLS. TMV MP sequenties, groene vakken; GVB, blauwe dozen; P, promotor; T, terminator. Getallen aan de linkerkant geven de aminozuurresidu's opgenomen in elke TMV MP-fragment. (B) samenvatting van subcellular localisatie van fusie-eiwitten komt te staan in (A). PD lokalisatie of nucleocytoplasmic lokalisatie werd bepaald op basis van de lokalisatie van de overeenkomstige subcellular markers, PDCB1-DsRed2 en gratis DsRed2, respectievelijk. Het percentage cellen exposeren elk lokalisatie patroon wordt weergegeven op basis van scoren 100 waarin cellen per constructie in drie onafhankelijke experimenten. Gegevens zijn gemiddelde ± standaardfouten (SE). (C) Pd doelgerichtheid van TMV MP-GVB, TMV MP PLS-GVB en de Pd-markering PDCB1-DsRed2. GVB signaal is in het blauw; DsRed2-signaal is paars; Plastide autofluorescence was uitgefilterd. Beelden zijn enkele confocal secties. Schaal bars = 10 µm. DIC, differentiële interferentie contrast opname. Dit percentage is aangepast van Yuan et al. 21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Pd doelgerichtheid van TMV MP, PLS TMV-MP en hun alanine-scannen mutants. (A) Subcellular Localisatie van TMV MP-GVB, TMV MP PLS-GVB en de markering van de nucleocytoplasmic DsRed2. (B) verlies van Pd gericht op vermogen van de V4A alanine-scannen mutanten van TMV MP-GVB en TMV MP PLS-GVB. PD waren gevisualiseerd door coexpression van de Pd-markering PDCB1-DsRed2. GVB signaal is in het blauw; DsRed2-signaal is paars; Plastide autofluorescence was uitgefilterd. Beelden zijn enkele confocal secties. Schaal bars = 10 µm. DIC, differentiële interferentie contrast opname. Dit percentage is aangepast van Yuan et al. 21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol heeft vier kern bestanddelen: het concept van de identificatie van een reeks die noodzakelijk en voldoende voor targeting te Pd, systematische indeling van de proteïne van belang in fragmenten worden geleidelijk verlaagd in lengte, smelten de geteste fragmenten aan een autofluorescent eiwit, die fungeert als label én als macromoleculaire lading, en/of functionele assay voor Pd targeting in levende planten weefsels na voorbijgaande expressie van de geteste fusie-eiwitten. Merk op dat Agrobacterium-gemedieerde voorbijgaande expressie gegevens binnen een relatief korte periode van tijd, dat wil zeggen, enkele dagen, in vergelijking met benodigd voor productie van transgene planten vaak gebruikt in soortgelijke studies15maanden genereert.

Coexpression van de proteïne van belang met subcellular localisatie markeringen, bijvoorbeeldPDCB1 of gratis DsRed2, meestal wordt uitgevoerd vanuit een multigene expressie-vector. Echter, als de overdracht van verschillende cassettes van de expressie in een enkele vector is technisch problematisch, coexpression kan ook worden uitgevoerd door elke cassette overbrengen naar een afzonderlijke binaire construct en combineren van gelijkwaardige hoeveelheid vloeibare culturen van de resulterende Agrobacterium stammen voor agroinfiltration. Omdat dit protocol maakt gebruik van voorbijgaande expressie, moet de binaire vector niet voeren selectie markers voor stabiele transformatie, hoewel hun aanwezigheid niet schadelijk is voor de efficiëntie van de expressie is.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor eiwit expressie en doelgerichtheid in de N. benthamiana; het kan echter worden gebruikt in andere plantensoorten, met inbegrip van Arabidopsis45,46, vatbaar voor genetische transformatie door Agrobacterium. Voor andere plantensoorten, of desgewenst anders, dit protocol kan worden aangepast aan het gebruiken van biolistic levering41 voor voorbijgaande expressie rechtstreeks vanuit pSAT gebaseerde vectoren, het vermijden van de noodzaak de cassettes expressie overbrengen naar binaire vectoren.

Een kritisch punt in dit protocol staat het consistente fysiologische en ontwikkelingsstoornissen van het plantmateriaal. In het bijzonder alle planten gezond gedurende het gehele experiment moeten zijn en, voor agroinfiltration, de N. benthamiana planten moet minder dan 4 weken oud en in de 4-8-bladstadium met het grootste blad 4-6 cm diameter. Als de planten te jong zijn, zullen de gevolgen van agroinfiltration te streng, bemoeien met expressie en lokalisatie van de tagged eiwitten. Aan de andere kant, vertonen de oudere planten vaak variabele architectuur van Pd24,25, ook op het gebied van de consistentie van Pd-targeting patronen.

Nog steeds, als gevolg van verschillende fysiologische omstandigheden van de installatie als geheel, en van de getransformeerde cellen in het bijzonder, de efficiëntie van Pd targeting in elk experiment kan enigszins variëren. Het is dus belangrijk om te analyseren van een relatief groot aantal cellen (> 100) per experiment, en het uitvoeren van ten minste drie replicaat-biologische organismen van elk experiment. In het algemeen vinden wij een geteste fragment Pd gericht op activiteiten, bevat als het Pd lokalisatie in ten minste 70% van de getransformeerde cellen vertoont. Verschillen in Pd gericht op efficiëntie van elk fragment, bijvoorbeeld, procent van getransformeerde cellen waaruit de Pd-specifieke punctate accumulatie patroon, moet worden geanalyseerd door de Student t-test, en p-waarden < 0.05-0,01, overeenkomt met de statistische kans van meer dan 95-99%.

Een ander belangrijk punt is de positie van de fluorescerende tag/lading in het fusie-molecuul. Sommige eiwitten Pd-gerichte ook koppelen aan het endoplasmatisch reticulum (ER), en deze vereniging wellicht de onbelemmerde amino-terminal volgorde. In deze gevallen, amino-terminal fusies, waarin het carboxyl-eindpunt van het fragment van de proteïne van belang is gesmolten aan de amino-terminus van de fluorescerende tag, moeten bijvoorbeeldGVB of DsRed2, worden gebruikt. Deze standaardplaatsing van de tag kan worden gewijzigd in de volgende gevallen. (i) indien de amino-terminal fusies niet bruikbaar zijn – dat wil zeggen, ze doen niet zinvolle subcellular localisatie patronen vertonen, zijn slecht uitgedrukt of genereren geen fluorescent signaal voldoende voor betrouwbare detectie- en doet de proteïne van belang geen signaal van de amino-terminal sequenties of carboxyl-terminal samensmeltingen waarin de amino-terminus van de geteste fragment aan het carboxyl-terminus van de tag is gesmolten, ze moeten worden geprobeerd. (ii) het carboxyl-terminal fusies moeten ook worden gebruikt als de proteïne van belang signaal sequenties in haar carboxyl-terminus bevat. (iii) indien de proteïne van belang beide amino - en carboxyl-terminal signalen, zoals die gevonden in GPI-verankerd eiwitten heeft, of als het een amino-terminal signaal peptide bevat nog zijn mengeling van amino-terminal niet bruikbaar is, moet de tag worden geplaatst intern) of stroomafwaarts van de amino-terminal signaal stroomopwaarts van het carboxyl-terminal signaal). Sommige nuttige procedures voor interne fluorescerende tagging van eiwitten worden beschreven in onze eerdere publicaties47,48.

Op dit moment is er geen volgorde van de bekende consensus voor PLS. Als zodanig (in stap 5.2) raadzaam, aanvankelijk controledoeleinden het eiwit in aaneengesloten ~100-200 residu-lange fragmenten. Deze kunnen dan geleidelijk korter worden gemaakt op basis van de waargenomen Pd-targeting activiteit of het gebrek daaraan. Men moet zich bewust zijn van andere potentieel gericht op signalen in het eiwit (b.v., NLS, signaal peptiden, etc.) aanwezig. Echter als de potentiële overlapping van deze sequenties met PLS sequenties niet bekend is, kan deze eiwit-regio's moeten worden opgenomen in deze vogelgriepvirus analyse.

Tot nu toe was dit protocol gebruikt ter identificatie van een enkele PLS in een eiwit molecuul21. Potentieel, kan een eiwit echter bevatten meer dan één signaal volgorde; inderdaad meerdere NLSs zijn beschreven in vele nucleaire eiwitten, met inbegrip van GATA transcriptie factoren49. Bij het analyseren van verschillende fragmenten van het geteste eiwit voor Pd richten, is het dus mogelijk dat meer dan één zo'n fragment worden geïdentificeerd, met vermelding van de aanwezigheid van meerdere PLSs die zelfstandig of synergetisch kan handelen.

De belangrijkste beperking van dit protocol is dat, na agroinfiltration, visualisatie van subcellular localisatie van Transient uitgedrukte proteïnen van belang is het best bereikt in epidermale cellen en relatief smalle groei stadium. Indien nodig, kan deze beperking worden overwonnen door de productie van transgene planten die stabiel uitdrukking geven aan elk van de geteste eiwitten in de meeste van hun weefsels en celtypes. Ook zou dit protocol niet nuttig zijn voor studies van virale MPs of andere Pd-gerichte eiwitten die functioneren alleen in plantensoorten die niet vatbaar voor voorbijgaande genetische transformatie.

Terwijl we deze techniek voor de identificatie van een PLS van TMV MP ontwikkeld, kan het worden gebruikt voor de ontdekking van PLSs in iedere andere plant virale MPs of in endogene eiwithoudende gewassen die te Pd, Transient of permanent lokaliseren. Bovendien, wanneer gecombineerd met passende subcellular localisatie markeringen47, dit protocol is geschikt voor identificatie van de vele andere targeting signalen binnen eiwitten belangstelling voor planten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Voor het gebrek aan ruimte, we meestal review artikelen genoemd, en wij verontschuldigen ons aan onze collega's wier oorspronkelijke werk werd niet genoemd. Het werk in het laboratorium V.C. wordt ondersteund door subsidies van NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD en BSF aan V.C., en het S.G.L. laboratorium wordt ondersteund door de NIH en middelen van de diensten van Plant Pathology en Plant-Microbe biologie naar S.G.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15, (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42, (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley-Interscience. New York. (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics