Name: Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Lernen Sie die Identifizierung von Plasmodesmal-Lokalisierungssignalen in Proteinen in Nicotiana benthamiana. Diese zuverlässige Methode erleichtert die Untersuchung pflanzlicher Zell-zu-Zell-Transportmechanismen.

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Für den Mangel an Raum meist Review-Artikel haben wir angeführt, und wir entschuldigen uns bei unseren Kollegen, deren ursprüngliche Arbeit nicht zitiert wurde. Die Arbeit im Labor V.C. wird unterstützt durch Zuschüsse aus NIH, NSF, USDA/NIFA, BARDEN und BSF, V.C. und das S.G.L. Labor wird unterstützt von NIH und Fonds aus den Abteilungen der Pflanzenpathologie und Pflanze-Mikroben Biologie, S.G.L.

(1) Pflanzenmaterial
<ol><li>Wahl der Pflanzenarten</li>
	<li>Verwenden Sie die Pflanzenarten heimisch in das Protein von Interesse, d. h., die dieses Protein für körpereigene Proteine kodiert oder der natürliche Wirt für den Erreger für virale Proteine darstellt. Darüber hinaus müssen die ausgewählten Pflanzenarten der gewählten Methode der Transienten genetische Transformation zugänglich sein. Hinweis: Die Studien beschäftigen routinemäßig Nicotiana Benthamiana, die einen guten Gastgeber für TMV darstellt und effizient durch die gentechnische Transformation mit Agrobakterien-vermittelten Technik, d. h., Agroinfiltration umgewandelt (siehe Schritt 3). N. Benthamiana Pflanzen auch leicht angebaut und haben große Blätter, die leicht durch Agrobacterium geimpft sind und leicht durch konfokale Mikroskopie analysiert.</li>
	<li>
Pflanzenwachstum
	<ol>
<li>Pflanzensamen Sie N. Benthamiana in feuchter Erde in hoher Dichte. Halten sie in einer kontrollierten Umgebung Kammer bei 20-25 ° c unter 16 h Licht bei ~ 75 µmol Photonen m-2 s-1 und 8 Stunden der Dunkelheit. Nachdem der Durchmesser des Euphyll 0,5 cm erreicht hat, sorgfältig übertragen Sie die Keimlinge in größere Töpfe und fortzusetzen Sie Wachstum in der gleichen Kammer unter den gleichen Bedingungen.</li>
		<li>Pflegen Sie die Pflanzen, bis sie auf 4-8-Blatt-Stadium innerhalb von 4 Wochen wachsen als die größten Blätter 4-6 cm Durchmesser sind; zu diesem Zeitpunkt können sie für Agroinfiltration verwendet werden (siehe Schritt 3). Hinweis: Verwenden Sie wichtig ist, niemals die Pflanzen wenn sie begann zu blühen, da in diesem Entwicklungsstadium die Blatt-Architektur oft24,25, manchmal führt zu inkonsistenten Ergebnissen variiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Ausdruck Vektor Bau
<ol><li>
Wahl des Expressionssystems
	<ol>
<li>Wählen Sie den Ausdruck System, d. h., Vektoren und Vektor Versandweg, bestens geeignet für Expression des Proteins des Interesses an der Pflanzenarten untersucht. Hinweis: Gelegentlich solche spezifischen Kombinationen der getestete Protein/Pflanzenarten können erfordern spezifische Vektoren und Vektor-Übermittlungsmethode für optimale Expression und Funktion des Proteins des Interesses. Wählen Sie für die meisten zweikeimblättrige Pflanzen jedoch binäre Plasmide als Expressionsvektoren und Agroinfiltration als Delivery-System.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tagging-fluoreszierende Protein
	<ol>
<li>Eindringmittel tag jedes exprimierten Protein für die Analyse von seine subzelluläre Verteilung22, einschließlich Pd Lokalisierung. Hinweis: Verwenden Sie Autofluorescent Proteine, wie GFP und DsRed2, als Tags. Tag der getesteten Proteins mit GFP und coexpress es mit einer kostenlosen DsRed2. GFP-Funktionen als Tag sowie ein Virus-unabhängige Ladung-Molekül. DsRed2 Funktionen Gesamteffizienz des Transienten Expression zu kalibrieren und, weil es Handy-autonomen, zu identifizieren, die zunächst transformierte Zelle; Diese letztere Funktion ist wichtig, bei der Beurteilung von Zelle zu Zelle Bewegung möglicherweise nicht-Zelle-autonomen getesteten Proteine. Für Coexpression mit dem Pd-Marker PDCB1, die auch Zelle autonom ist, tag der getesteten Proteins mit GFP und PDCB1 mit DsRed2.</li>
		<li>Als Faustregel gilt Sicherung der Autofluorescent Tag an den Carboxylgruppen-Terminus des Proteins ausgedrückt. Aber wenn die tagged in voller Länge getestete Protein Exponate Pd targeting gefährdet, übertragen Sie das Tag an den amino-Terminus des Proteins.</li>
		<li>Klonen Sie die kodierenden Sequenzen der Proteine in einer geeigneten Anlage Expressionsvektor getestet werden. Hinweis: Es gibt viele verschiedene Pflanzenarten Expressionsvektoren, die fluoreszierende tagging ermöglichen. Wir verwenden eine Reihe von pSAT Plasmide26 oder einige ihrer Derivate27,,28, die eignen sich für das Klonen von der Reihenfolge des Interesses direkt im Rahmen mit den vorgeschlagenen Autofluorescent Tags (siehe Schritt 2.2.1) in beiden amino- und Carboxylgruppen-Terminal Orientierungen.</li>
		<li>Übertragen Sie jedes Expressionskassette in einer binären Vektor Agrobacterium. Hinweis: Obwohl pSAT basierende Konstrukte sind geeignet für direkte biolistischen Lieferung ins Pflanzengewebe, Agroinfiltration, nämlich die Transformationsmethode empfohlen hier (siehe Schritt 3), verlangt, dass die Expressionskassette liegen zwischen der T-DNA soll Grenzen einer Binärdatei Vektor-29. Hinweis: Alle pSAT Vektoren sind entworfen, um solche Versetzung auf die pPZP-RCS2 multigene Ausdruck binären Vektor26,30 durch einen einstufigen Klonen mit seltenen schneiden Nukleasen AscI-PpoI, -SceI, ich-CeuI, PI-PspI und PI-TliI 26. Forscher, die lieber recombinatorial Klonen, nutzen z.B.mit heterologen Lox Seiten31, pSAT Vektor Varianten26,27beschäftigen können.</li>
		<li>Für Coexpression, beiden Expressionskassetten zu übertragen, z.B., getestete Protein GFP und DsRed2 oder getestete Protein GFP und PDCB1-DsRed2 (siehe Schritt 2.1), auf den gleichen pPZP-RCS2 binären Vektor. Hinweis: Alternativ Agrobacterium Kulturen beherbergen einzelne binären Konstrukte können gemischt werden für Infiltration in N. Benthamiana (siehe Schritt 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Agroinfiltration
<ol><li>
Fügen Sie 1 µg der ein pPZP-RCS2-basierte Plasmid aus Schritt 2.2.5 bis 100 µL Kultur zuständigen Zellen des Agrobacterium Tumefaciens Stamm EHA105 oder GV3101 als beschrieben32vorbereitet, Inkubation für 30 min auf Eis, Schockfrosten in flüssigem Stickstoff für 1 min, und bei 28 ° C für 15 min inkubieren.
	<ol>
<li>Dann fügen Sie 1 mL LB-Medium (10 g/L Tryptone, Hefeextrakt 5 g/L und 10 g/L NaCl) auf die zuständigen Zelle Mischung und bei 28 ° C für 2 h Spin die Zellen bei 3.000 × g für 1 min inkubieren, wieder auszusetzen in 0,2 mL LB , und sie auf LB-Agar mit geeigneten Antibiotika (z.B.100 mg/L Spectinomycin und 50 mg/L Rifampicin für pPZP-RSC2-basierte Vektoren26,30) ergänzt. Wachsen Sie bei 28 ° C für 48 h, bis die einzelnen Kolonien sichtbar werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie und mehrere einzelne Kolonien auf eine frische LB-Agar-Platte-Platte (siehe Schritt 3.1), wachsen bei 28 ° C für 48 h, und nehmen Sie eine kleine Menge von Bakterien für die Analyse von Kolonie-PCR-33 um das Vorhandensein der spezifischen binären Konstrukte bestätigen.</li>
	<li>
Wachsen Sie jede Agrobacterium Kolonie mit dem Konstrukt von Interesse über Nacht bei 28 ° C in 5 mL LB-Medium mit geeigneten Antibiotika (siehe Punkt 3.1.1) ergänzt. Die Zellen bei 3.000 × g zentrifugiert, und wieder auszusetzen, OD600= 0,5 im Agroinfiltration-Puffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 150 µM Acetosyringone). 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
	<ol>
<li>Wenn Sie eine Mischung aus binären Plasmide, anstatt einer einzigen multigene Ausdruck Plasmid für Protein Coexpression verwenden, mischen Sie die entsprechenden Zellkulturen im Verhältnis 1:1 V/V vor Eindringen. Inkubieren Sie dann die Zellen bei 28 ° C für 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laden Sie das Inokulum in eine 1 mL Kunststoffspritze und drücken Sie die Düse der Spritze (ohne Nadel) gegen die untere (abaxial) Epidermis der vollreifen N. Benthamiana verlässt. Halten Sie das Blatt mit einem behandschuhten Finger auf die adaxial Gesicht34,35.
	<ol>
<li>Die Agrobacterium Infiltration Medium durch langsame Injektion einzuführen. Statistische Signifikanz sind mehrere Blätter auf jede Pflanze zu infiltrieren. Hinweis: Beachten Sie, dass die ältesten Blätter nicht verwendet werden, da sie konsequent Ausdruck Niveaus nicht nachgeben.</li>
		<li>Alle Blätter in Situzu impfen. Pflegen Sie die infiltrierte Pflanze bis Beobachtung, wie in Schritt 1.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. der konfokalen Mikroskopie
<ol><li>Verwenden Sie eine Klinge, um jedes Blatt in Fragmente zwischen den Adern geschnitten 24-48 h nach der Infiltration (abhängig von der Effizienz der Transienten Expression des getesteten spezifischen Proteins); die Größe der einzelnen Segmente Gewebe sollte so sein, dass die Scheibe durch das Deckglas (22 x 40 mm) für die Mikroskopie verwendet vollständig bedeckt ist.</li>
	<li>Ort, an dem die Blatt-Scheiben auf das Objekt mit der abaxial Blattoberfläche nach oben schieben geben Sie einen Tropfen Wasser auf das Blatt-Scheibe und mit dem Deckglas abdecken. Das Deckglas mit kleinen Klebestreifen auf jeder Seite zu immobilisieren.</li>
	<li>
Beobachten Sie das Agroinfiltrated Gewebe unter einem Laser-scanning-confocal Mikroskop und zeichnen Sie die daraus resultierenden Bilder.
	<ol>
<li>Zuerst verwenden Sie ein 10 X-Objektiv, um Zellen mit dem Signal zu identifizieren, und verwenden Sie dann 63 X Objektiv für genauere Beobachtungen.</li>
		<li>Verwendung der 458 nm Wellenlänge aus eine Argon-Ionen-Laser GFP und 543 begeistern nm DsRed2 begeistern. Behalten Sie alle Einstellungen für die Bildaufnahme, d. h., Laserintensität und Photomultiplier Röhre (PMT) Einstellungen zwischen Experimente. Im Durchschnitt 100-120 Zellen für jede experimentelle Bedingung zu prüfen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Identifizierung der PLS
<ol><li>Die Lokalisierung des getesteten Proteins mit confocal Mikroskop (Abschnitt 4) zu diagnostizieren. Überprüfen Sie, ob das getestete Protein die charakteristische peripheren punktförmige Muster25,36,37,38,39,40,41 hat und colocalizes mit dem Pd-Marker PDCB123. Dies bedeutet, dass das getestete Protein am ehesten PLS Sequenzen enthält.</li>
	<li>Nach Bestätigung der PLS Tätigkeit der getesteten Protein, schrittweise seine offenen Leserahmen (ORF) (Genbank Zbl-Nummer BAF93925.1) in kleinere Fragmente, Autofluorescently, (z. B.GFP) unterteilen beschriften Sie jeden von ihnen und analysieren ihre subzelluläre Lokalisation wie in Schritt 4 beschrieben. Zunächst empfiehlt sich die Größe von 100 Aminosäurereste für jedes Fragment unterteilt.</li>
	<li>Weiter unterteilen die abgeschnittenen Fragmente, die haben die PLS-Aktivität und überprüfen Sie ihre subzelluläre Lokalisation, wie unter Schritt 4 bis zu den kleinsten Fragment, die noch auf Pd lokalisiert, d.h. ist ausreichend, um den Autofluorescent Tag Fracht transportieren für Pd identifiziert. Dieses Fragment ist vermutlich die PLS-Sequenz darstellen.</li>
	<li>Löschen Sie der vermeintlichen PLS vom Full-length getestete Protein, d.h. Sicherung den restlichen Teil des Proteins Test ohne vermeintliche PLS Autofluorescent Tag, und bestimmen Sie die subzelluläre Lokalisation des daraus resultierenden mutierten Proteins zu, wie in Schritt beschrieben (4) Unterlässt diese mutierten Proteins, die vermeintliche PLS fehlt, Pd zu lokalisieren, wird dies bedeuten, dass die identifizierten PLS nicht nur ausreichend (siehe Schritt 5.3), aber auch für den Pd-Transport des getesteten Proteins notwendig ist.</li>
	<li>Agroinfiltrate bauen die Blätter mit einer Mischung aus Agrobacterium Kulturen beherbergen den Ausdruck für die GFP-Tags PLS und kostenlose DsRed2 (siehe Schritt 3.3). Infiltrierten Gewebe mit Objektiv 10 x mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 4.3 confocal Mikroskop zu beobachten.</li>
	<li>Zellen, die GFP und DsRed2 Signale als anfangs infiltrierten Zellen enthalten, und Gäste der benachbarten Zellen, die nur das GFP-Signal als diejenigen enthalten diese Ausstellung Bewegung der Gäste. Hinweis: Dieser Schritt prüft der identifizierten PLS für seine potentielle Bewegungsfähigkeit der Zelle zu Zelle; und zwar deshalb, weil viele Proteine, die auf Pd (darunter die meisten Pflanzen virale MPs) auch durch Pd zu den benachbarten Zellen zu bewegen. Die Konzentration von Agrobacterium verwendet für Infiltration hängt der Ausdruck Effizienz unterschiedlicher Strukturen bzw.. Agroinfiltration stellen Sie sicher, die Zelle-Kultur-Verdünnung, die (i) die Umwandlung der Einzelzellen, verlassen die benachbarten Zellen untransformierten gewährleistet, (Ii) erreicht eine ähnliche Effizienz des Ausdrucks zu verwenden. Zum Beispiel nutzen unsere Experimente bzw. OD600 0,01 und 0,005 für Ausdruck der GFP-Tags PLS und kostenlose DsRed2.</li>
</ol>6. Identifikation der Schlüssel PLS Rückstände mit Alanin Scannen42
<ol><li>Verwenden Sie PCR-Standardprotokolle, um Codierung Sequenz mit ein paar Zündkapseln enthalten wie beschrieben die gewünschte Mutation, d. h., Substitution von Ziel Aminosäurerest mit Alanin in der zentralen Region jeweils Fibel soll PLS verstärken 21. besser gekleideteres Design und Verwendung der Site-verwiesene Mutagenese-Kit für Site-verwiesene Mutagenese nach den Anweisungen des Herstellers durchzuführen.</li>
	<li>Die daraus resultierende PCR-Produkte mit jeder Standardbausatz DNA Reinigung reinigen und verdauen sie bei 37 ° C mit DpnI der Elternzeit zu beseitigen (d. h.nicht mutiert) methyliert und Hemimethylated DNA. Kühlen Sie das für 5 min bei Raumtemperatur (nicht auf dem Eis ab). Dann umwandeln Sie die Mischung direkt in E. Coli kompetente Zellen43, und identifizieren Sie Kolonien mit der gewünschten mutierte Konstrukte zu, wie in Schritt 3.2 beschrieben.</li>
	<li>Führen Sie die mutierten Konstrukte in der binären Vektor ein, wie unter Punkt 2.2.4 beschrieben, führen Sie Agroinfiltration, wie in Schritt 3 beschrieben, und bewerten Sie Pd Ausrichtung wie in den Schritten 4 und 5.1 beschrieben.</li>
</ol>

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</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Dieses Protokoll hat vier Kern-Bestandteile: das Konzept der Identifizierung einer Sequenz, die notwendig und ausreichend für die Zielgruppenadressierung auf Pd, systematische Einteilung des Proteins des Interesses der Fragmente, die in der Länge, degressiv sind Absicherung der getesteten Fragmente, ein Autofluorescent Protein, die dient sowohl als Tag als makromolekulare Fracht- und funktionelle Assay für Pd-targeting in lebenden Pflanzen Gewebe nach transiente Expression von den getesteten Fusionsproteinen. Beachten Si...

Plasmodesmata (Pd) Funktion als Kanäle für den interzellulären Transport der wichtigsten Regulatoren der Pflanzenentwicklung und Morphogenese von Transkriptionsfaktoren bis hin zu mRNA und kleine RNA-Moleküle. Darüber hinaus ist dieser makromolekularen Transport Pd durch die meisten Pflanzenviren für ihre interzellulären Ausbreitung während der Infektion ausgelastet; um Pd zu durchlaufen, entstanden Pflanzenviren spezialisierte Proteinen bezeichnet Bewegung Proteine (MPs), die gezielt auf Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekulare Signalwege Pd Transportmittel sind höchstwahrscheinlich mit spezifischen Sequenzen, die auf die transportierten Proteine in diese Bahnen eng verbunden. So kann Identifikation dieser Pd Lokalisierung Signale (PLSs) Diagnose der entsprechenden Pd Transport Weg sein. Dies ist analog der Pd Transport8, z. B. zu verschiedenen nuklearen Import Pathways, die spezifisch für verschiedene nukleare Lokalisierung Signal (NLS) Sequenzen9,10sein kann. Im Prinzip stehen für NLSs und PLSs nicht spaltbaren subzelluläre targeting-Sequenzen, die notwendig und ausreichend für die Ausrichtung sind. Im Gegensatz zu NLSs11ist jedoch die Reihenfolge Informationen über PLSs stark eingeschränkt. Insbesondere wurden nur vier Proteinsequenzen beteiligt bei der Ausrichtung der Pd mit allen von ihnen abgeleitet von endogenen pflanzlichen Proteinen beschrieben. Ersteres wird durch ein Homeobox-Domäne der KN112 – einen Transkriptionsfaktor, der Epidermis der Pflanze Blatt13 aus inneren Zellschichten bewegt – und seine KNOX homologe14dargestellt. Das zweite ist auch aus einen Transkriptionsfaktor, Dof, enthält eine vermeintliche PLS beschrieben als der interzellulären Handel (IT) Motiv15. Die dritte Sequenz ist aus das Membranprotein PDLP1 Plasmodesmata ansässige Typ 1, und es wird durch eine transmembrane Domäne16dargestellt. Schließlich die vierte Pd targeting Sequenz wurde kürzlich berichtet, für Glycosylphosphatidylinositole (GPI)-verankerte Proteine und es wird durch die Glycosylphosphatidylinositole (GPI) Änderung Signal17dargestellt.
Interessant ist, bis vor kurzem keine PLSs gemeldet wurden für virale MPs. Frühere Studien gezeigt das Vorhandensein von vermeintlichen PLS Sequenzen im Werk virale MPs18,19, aber keine wahre PLS, d. h., eine minimale Aminosäure-Sequenz notwendig und ausreichend für Pd Angriffe auf eine unabhängige Ladung Molekül ( zB., GFP) in eine virale MP identifiziert worden. Noch war eines dieser Proteine, MP das Tabakmosaikvirus (TMV), das erste für die Pd Lokalisierung und Transport demonstrierten20gewesen sein.
Um diese Lücke zu begegnen, entwickelten wir eine experimentelle Strategie um TMV MP PLS zu identifizieren. Diese Strategie basierte auf drei Konzepte. (i) Wir haben PLS als eine minimale Aminosäure-Sequenz, die notwendig und ausreichend für das Protein targeting auf Pd21ist definiert. (Ii) weil TMV MP richtet sich zunächst an Pd und dann durch diese Kanäle22translocates, wollten wir Entkopplung diese beiden Tätigkeiten und der Ausarbeitung der bona-fide PLS, welche Funktionen nur für Pd targeting und nicht für den nachfolgenden Verkehr. (Iii) wir analysiert die identifizierten PLS für Aminosäurereste wichtig für seine Pd targeting Aktivität, ob strukturell oder funktional. Mithilfe dieses Ansatzes abgegrenzt wir eine 50-amino Acid Rückstände Sequenz am amino-Terminus des TMV MP, die als bona fide PLS dient. Dies geschah durch produziert eine Reihe von TMV MP-Fragmente, die die gesamte Länge des Proteins gesättigt, tagging ihre Carboxylgruppen-Termini mit GFP und vorübergehend in Pflanzengewebe auszudrücken. PD-Lokalisierung aller getesteten Fragmente wurde durch coexpressing sie mit einem Pd Marker Protein, PDCB1 (Pd Zellstress bindendes Protein 1)23bestimmt. Die kleinsten Fragment, das nach wie vor auf Pd lokalisiert, aber nicht durchqueren, Pd, galt als PLS darstellen. Schließlich war die PLS Alanin gescannt, die wichtige Aminosäurereste benötigt für seine Struktur und/oder Funktion zu bestimmen.
Während hier wir diesen Ansatz mit der Kennung des TMV MP PLS Beschreibung veranschaulichen, können verwendet werden PLSs in jeder anderen Pd-bezogenen Proteinen zu entdecken ob Pflanzenpathogene oder die Pflanzen selbst kodiert; und zwar deshalb, weil unsere Methode keine Besonderheiten des viralen MPs in Bezug auf ihre Fähigkeit zum Ziel Pd nutzen.

<table><tbody><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM5</td><td>Jedes CLSM mit ähnlichen Fähigkeiten ist geeignet</td></tr><tr><td>Zen-Software für die Bildgebung von konfokalen Mikroskopen</td><td>Zeiss</td><td>Version 2009 Die</td><td>Software sollte mit dem von CLSM verwendeten</td></tr><tr><td>ortsgerichteten Mutagenese-Kit Quickchange II</td> kompatibel sein.<td>Agilent</td><td>200523</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen ohne Nadeln</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>FisherScientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung von plasmodesmal lokalisierung sequenzen in proteine in planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) sind Zell-Zell-Verbindungen, die als Gateways fungieren durch die kleine und große Molekülen zwischen den Pflanzenzellen transportiert werden. Während Pd Transport von kleinen Molekülen, wie Ionen und Wasser, angenommen wird, dass passiv auftreten, Zell-Zell-Transport von biologischen Makromolekülen, solche Proteine am ehesten erfolgt über einen aktiven Mechanismus, spezifische targeting Signale auf der Molekül transportiert. Die Knappheit der identifizierten Plasmodesmata (Pd) Lokalisierung Signale (PLSs) hat stark eingeschränkt, das Verständnis der Protein-Sortierung Bahnen beteiligt zu Pflanzen, makromolekulare Transport von Zelle zu Zelle und Kommunikation. Aus einer Fülle von Pflanzen endogene und virale Proteine bekannt für den Verkehr durch Pd, nur drei PLSs gemeldet wurden bis heute wurden alle von endogenen pflanzlichen Proteinen. So ist es wichtig, eine zuverlässige und systematische experimentelle Strategie um einen Funktionsablauf PLS zu identifizieren, die sowohl notwendig und ausreichend für Pd-targeting, direkt im Wohnzimmer zu entwickeln Pflanzenzellen. Hier beschreiben wir eine solche Strategie verwenden als Paradigma der Zelle zu Zelle Bewegung Protein (MP) das Tabakmosaikvirus (TMV). Diese Experimente, die identifiziert und charakterisiert die erste virale PLS plant, kann für Entdeckung der PLS-Sequenzen in den Pd-bezogenen Proteinen angepasst werden.

Die repräsentativen Daten, die treu illustrieren die beschriebenen Protokolle erwarteten Ergebnisse und der TMV MP PLS zu identifizieren, werden angepasst von Yuan Et al. 21. Abbildung 1A zuerst fasst wichtige Konstrukte, die mit dem Ausdruck der Full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestehend aus den ersten 50 Aminosäurereste des Proteins, 1-50), und seine Alanin Scannen V4A Derivate mit GFP (generiert als verschmolzen beschriebenen Sch...

Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Plasmodesmen-Lokalisationssignal in Zielproteinen zu identifizieren. Die Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Untersuchung der interzellulären Verbindungen von Pflanzen zu beantworten, indem sie entscheidende Signale aufdeckt, die Proteine gezielt zu den Plasmodesmen lenken und dadurch den Transport großer Moleküle von Zelle zu Zelle erleichtern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das Verfahren zuverlässig ist und sich leicht auf die Entdeckung von Plasmodesmen-Lokalisationssignalsequenzen in den meisten auf Plasmodesmen ausgerichteten Proteinen anpassen lässt.Die Video-Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zum Pflanzen, Filtrieren und Vorbereiten für die konfokale Beobachtung schwer anhand herkömmlicher Druckpublikationen zu erlernen sind. Pflanzen Sie Nicotiana benthamiana-Samen in feuchte Erde und mit hoher Dichte. Während des Wachstums halten Sie sie in einer kontrollierten Umweltkammer bei 20 bis 25 Grad Celsius und unter 16 Stunden Licht pro Tag, was etwa 75 µmol Photonen pro m² pro Sekunde entspricht.Nachdem der Durchmesser des U. fil. einen halben Zentimeter erreich

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

Wir haben eine Technik, um Protein-Protein-Interaktionen in Anlage-Test entwickelt. Ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) ist in zwei nicht überlappende Fragmente aufgeteilt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse via Gateway-System geklont, wodurch Expression von Fusionsproteinen. Rekonstitution der YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteinen interagieren.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

Eine grundlegende Aufgabe in der Zellbiologie ist es, die Mechanismen, die die Identität der Organellen, die eukaryotischen Zellen machen zu Grunde liegen zu definieren. Hier schlagen wir eine Methode, um die Gene verantwortlich für die morphologische und funktionelle Integrität der Anlage Organellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Next-Generation-Sequencing-Tools zu identifizieren.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

Diese Arbeit beschreibt ein neues Verfahren zur selektiven Targeting subzellulären Organellen in Pflanzen untersucht, mit dem BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Dieser Artikel beschreibt die Methoden für die Gene Screening plasmodesmal Permeabilität und damit Auxin Gradienten während tropischen Reaktion zu steuern. Dies beinhaltet die Messung des Grades der Tropic Reaktion in Hypokotyl   von Arabidopsis thaliana und plasmodesmal Permeabilität von 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (HPTS) Laden und schließlich Kallose- Ebene Beurteilung zu überprüfen.

Eine Strategie zur Validierung der Rolle der Kallose-vermittelten Plasmodesmal Gating im Tropic Antwort

Wir entwickelten eine neuartige Methode zur Co mehrere Chimären fluoreszierende Fusionsproteine in Anlagen zur Überwindung der Schwierigkeiten von konventionellen Methoden zum Ausdruck zu bringen. Es nutzt die Vorteile der Verwendung einer einzigen Ausdruck Plasmid, das enthält mehrere funktionell unabhängig Protein mit dem Ausdruck Kassetten um Co Proteinexpression zu erreichen.

Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

Fluoreszierende Protein-basierte Ansätze, Effektoren abgesondert von Bakterien in Wirtszellen zu überwachen sind anspruchsvoll. Dies ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen fluoreszierende Proteine und die Typ-III-Sekretion-System. Hier wird eine optimierte Split Superfolder GLP-System zur Visualisierung von Effektoren abgesondert von Bakterien in die Wirtszelle Pflanze verwendet.

Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Beschrieben wird hier eine Näherungskennzeichnungsmethode zur Identifizierung von Interaktionspartnern der TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in Nicotiana benthamiana Blattgewebe. Ebenfalls zur Verfügung gestellt ist ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen von Interesse mit dieser Technik bei Nicotiana und anderen Pflanzenarten.

TurboID-basierte Näherungskennzeichnung für in Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) bietet die Möglichkeit, Entwicklungsprogramme mit minimaler Verarbeitung von Organen und Geweben zu sezieren. Das Protokoll liefert hochwertige RNA aus Zellen, die mit einem grünen fluoreszierenden Protein (GFP)-markierten ribosomalen Untereinheit begezielt sind. Nachgeschaltete Analysewerkzeuge wie qRT-PCR oder RNA-seq zeigen Gewebe- und zelltypspezifische Expressionsprofile auf.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

Dieses Protokoll beschreibt die Auswahl optimaler plasmodesmaler Marker für konfokalmikroskopische Analysen von Proteinen, die während Virus-Plasmodesmata-Interaktionen oder des plasmosmodesmalen Transports auf Plasmodesmen abzielen.

Konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana

Lernen Sie die Identifizierung von Plasmodesmal-Lokalisierungssignalen in Proteinen in Nicotiana benthamiana. Diese zuverlässige Methode erleichtert die Untersuchung pflanzlicher Zell-zu-Zell-Transportmechanismen.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

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