Isolera och analysera celler i bukspottkörteln mesenkym med flödescytometri

Developmental Biology
 

Summary

Här beskriver vi en metod för isolering av celler i bukspottkörteln mikro från embryonala, neonatala och vuxna mus vävnad, med fokus på isolering av mesenkymala celler. Denna metod tillåter profilering av cell genuttryck och proteinutsöndring för att belysa de yttre signaler som reglerar bukspottkörteln utveckling, funktion, och tumörbildning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Epshtein, A., Sakhneny, L., Landsman, L. Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55344, doi:10.3791/55344 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Energi homeostas och matsmältningen hos däggdjur beroende av korrekt bukspottkörtelfunktion. Den vuxna bukspottkörteln består av två huvudsakliga cellulära avdelningar: den exokrina och endokrina. Exokrina celler, även de acinära celler som producerar och utsöndrar matsmältningsenzymer och de gångceller som transporterar dessa enzymer till tarmen, omfattar mer än 80% av den totala pankreasmassan 1. Endokrina celler, som omfattar insulinproducerande betaceller och glukagon producerande alfaceller, är organiserade i Langerhanska öar som är inbäddade i den exokrina vävnaden och utsöndrar hormoner för att reglera blodsockernivåer 2.

Pankreasceller förvärva deras differentierade öde genom en mycket reglerad, flerstegsprocess 3. Uppgifter tyder på att yttre signaler som tillhandahålls av neuronala, endotelceller, och mesenkymala celler vägleda pankreascelldifferentiering och proliferation i than embryo 3, 4, 5. Ett exempel är kravet på stora kroppspulsådern för att specificera början pankreas prekursorer 6. Senare under utveckling, har endotelceller visat sig spela en central roll i utvecklingen av både bukspottkörtelns endokrina och exokrina celler och för att främja betacelldifferentiering 4, 6, 7. Mesenkymala celler visade sig stödja överlevnad och expansion av gemensamma pankreas stamceller, främst genom utsöndring av tillväxtfaktorn Fgf10 8, 9. Vi har vidare visat att dessa celler stöder spridningen av endokrina och exokrina prekursorer, liksom av differentierade celler (inklusive körtel och betaceller) i den embryonala bukspottkörteln 5. Nyligen, mesenkymala celler var ytterligarevisat att reglera endokrina celler differentiering 10.

I den vuxna, var beta-cellfunktion och massa visat sig vara beroende av celler i deras mikromiljö, inklusive neuronal, immun och endotelceller, såväl som pericyter 11, 12, 13. Under skada, har endotelceller visat att rekrytera immunceller till bukspottkörteln att främja beta-cellreplikation 13. Endotelceller vidare visat att producera extracellulära matrix (ECM) komponenter för att stödja insulinuttryck och beta-cellfunktion 14. Vi visade nyligen kravet på ö pericyter för betacellsfunktionen 11. Slutligen har celler i bukspottskörteln stroma visade att reglera utvecklingen av bukspottkörtel duktal adenokarcinom (PDAC) 15, 16. Emellertid idenhet yttre signaler som styr bukspottkörteln utveckling, funktion, och tumörbildning är till stor del okända.

Identifiera ledtrådar som tillhandahålls av celler i bukspottkörteln mikromiljö kräver karakterisera gener och proteiner som uttrycks av dessa celler. Detta beror på att isolera dessa celler från bukspottkörteln för att utföra genuttryck och proteomik analyser och / eller på att etablera cellinjer. Här föreslår vi en metod för att isolera mesenkymala celler i bukspottkörteln mikromiljö genom att utnyttja vävnads enzymatisk digestion och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) av antingen immunofluorescently-märkta celler eller celler som uttrycker fluorescerande proteiner. Detta protokoll genomfördes framgångsrikt för att isolera och analysera gul fluorescerande protein (YFP) uttryckande mesenkymala celler i embryonala, neonatala och vuxna bukspottkörteln 5, 17.

Protocol

Experiment utfördes enligt protokoll som godkänts av kommittén för djurs forskning vid Tel Aviv University.

1. Isolering av bukspottkörtelvävnad från möss

  1. För vuxna möss:
    1. Förbered digereringsbuffert: 0,4 mg / ml kollagenas P och 0,1 ng / ml DNas I löst i Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Färskt förbereda 5 ml buffert per mus i 15-ml koniska rör och hålla dem på is fram till användning.
    2. Euthanize mössen enligt stadgade anvisningen.
    3. Dissekera varje mus för att ta bort bukspottkörteln (för undervisning, vänligen se referens 18); placera den i en odlingsskål innehållande HBSS. Det är möjligt att utföra detta skede under ett stereomikroskop, och för att öka matsmältningen effektivitet, skär vävnaden i 2 - 4 stycken.
    4. Placera den pankreatiska vävnaden i ett rör innehållande matsmältnings buffert (framställd i steg 1.1.1). Hålla rören på is tills alla möss dissekeras och pankreatiska vävnadersamlade in.
    5. Upprepa steg 1.1.2 - 1.1.4 med de återstående mössen.
  2. För embryon och neonatala möss:
    1. Förbered matsmältningen buffert: 0,4 mg / ml kollagenas P och 0,1 ng / ml DNas I upplöstes i HBSS. För embryon och valpar på postnatal dag 7 (P7) eller yngre, nyligen förbereda 1,5 - 2 ml buffert per mus i en 15-ml koniska rör. För p7 eller äldre valpar, förbereda 3 - 4 ml buffert per mus i en 15-ml koniska rör. Håll på is tills användning.
    2. Euthanize mössen enligt stadgade anvisningen. För embryon, ta bort alla embryon från sin mors livmoder och placera dem i en 10 mm odlingsskål innehållande PBS. Dissekera ett embryo åt gången.
    3. Lägga musen på rygg, med dess huvud som pekar bort från undersökaren. Med fin pincett, dra upp buken huden och öppna vid mittlinjen för att exponera bukhålan upp till musen membranet 18.
    4. Med fin pincett, lossa levern frOm den bakre bukväggen. Med en kontinuerlig rörelse mot musens svans, ösa ut de inre organen (inklusive lever, mage, mjälte, tarmar, njure och bukspottkörtel) och placera dem i en odlingsskål innehållande HBSS.
    5. Under ett stereomikroskop, ta bort levern och njurarna för att exponera bukspottkörteln (Figur 1). Med fin pincett, lossa bukspottkörteln från magen, tolvfingertarmen, och slutligen, från mjälten.
    6. Placera den pankreatiska vävnaden i ett rör innehållande matsmältnings buffert (framställd i steg 1.2.1). För P14 eller äldre valpar, skär vävnaden i 2 bitar för att öka matsmältningen effektivitet. Hålla rören på is tills alla möss dissekeras och pankreatiska vävnader uppsamlades.
    7. Upprepa steg 1.2.2 - 1.2.6 med de återstående mössen.

2. Pankreas Digestion

  1. Inkubera rören innehållande pankreatisk vävnad (i digereringsbuffert) i ett värmeblock vid 37 ° C under 30 min med agitatjon vid 700 rpm. Efter 15 minuter, manuellt skaka rören genom att invertera dem 3 - 4 gånger och placera dem tillbaka i värmeblocket.
    OBS: Om du använder en värmeblock utan agitation kapacitet, invertera rören var 5 - 10 min. Se till att vävnaden är ordentligt smält. Om inte, skär vävnaden i mindre bitar före inkubering eller öka omröring.
  2. För att stoppa vävnads matsmältningen, placera rören på is och tillsätt 10 ml kall HBSS till varje rör. Centrifugera rören vid 4 ° C och 300 x g under 5 min och aspirera supernatanten.
  3. Resuspension:
    1. För vuxna möss och P14 eller äldre valpar, återsuspendera pelleten med 6 ml PBS och sila det genom en 70-ìm cell sil placerad på toppen av en ny 15 ml koniska samling polypropylenrör. För att säkerställa maximal cellåtervinning, tvätta ursprungliga röret med ytterligare 6 ml PBS och sila det genom cell sil på provröret.
    2. För embryon och valpar yngre tHan P14, återsuspendera pelleten med 2 ml PBS och sila det genom ett 35 | im cellfilter placerades på toppen av en 5-ml rundbottnad samling polystyrenrör (FACS-rör). För att säkerställa maximal cellåtervinning, tvätta det ursprungliga röret med ytterligare 2 ml av PBS och sila det genom cellfilter på provröret.
  4. Centrifugera rören vid 4 ° C och 300 x g under 5 min och aspirera supernatanten. Avlägsna vätskan noggrant, eftersom cellerna är löst kopplade till polystyrenrör.

3. beredning av märkta enskilda celler

  1. Buffert beredningar: För cellisolering genom FACS, förbereda sorteringsbuffert genom att blanda PBS (utan kalciumklorid och magnesiumklorid), 5% fetalt bovint serum (FBS) och 5 mM EDTA. För flödescytometrianalys, förbereda analys-buffert genom att komplettera sorteringsbuffert med 0,05% natriumazid. Båda buffertarna kan förvaras vid 4-8 ° C i upp till 2 månader.
  2. Återsuspendera celler i sortering eller analyseringsbuffert. Återsuspendera varje pankreas isolerade från embryon och valpar yngre än P7 i en ml, från valpar mellan P8 och en månad gammal i 1,5 ml, och från möss äldre än en månad i 3 ml. Sila cellerna genom en 35-fim cellfilter placerades på toppen av en rundbottnad polystyrenrör (FACS-rör).
  3. För färgning kontroller, ta ut 50 till 100-mikroliter alikvoter från de prover som gjorts i föregående steg (inte mer än 5% av den totala provvolymen) och placera dem i nya FACS rör; innefattar ett rör för varje fluorofor användas, innefattande DAPI och fluorescerande proteiner, såväl som för en ofärgade kontroll.
    OBS: Vid användning av transgena möss med celler som uttrycker ett fluorescerande protein, eller när cellantalet är begränsat, inkludera en icke-transgen vävnad som en färgning kontroll. Om celler som uttrycker ett fluorescerande protein används utan ytterligare färgning, gå vidare till steg 3,8.
  4. Spin-ner cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C och aspirera supernatanten.
  5. för blockung, återsuspendera cellerna med blockeringslösning (100 | il sortering eller analys-buffert som kompletterats med 1 | il av get-IgG) och inkubera i 30 minuter på is.
  6. Att färga cellytmarkörer, framställa en blandning som innefattar alla önskade fluoroforen-konjugerade antikroppar i en volym av 100 mikroliter per prov. Förbereda 2x antikroppsspädningar i sortering eller analys-buffert (dvs., späd antikroppen för att erhålla dubbla den önskade koncentrationen, om en slutlig spädning av 1: 200 är önskvärd, späd antikroppen 1: 100). Utan att tvätta den blockerande lösningen, tillsätt 100 | il av blandningen till provceller för att uppnå en slutlig färgning volym av 200 mikroliter. Inkubera under 30-60 min på is och i mörker.
  7. För att ställa in analys eller sorteringsparametrar (se steg 4.3 och 5.2), förbereder ytterligare rör som innehåller endast en av de antikroppar som används (färgning kontroll). Förbered 2x spädantikropps i sortering eller analys buffert (som beskrivs i steg 3,6). Se till att inkludera en single färgning kontroll utspädning för varje fluorofor används, liksom en ofärgade kontroll. Utan att tvätta den blockerande lösningen, tillsätt 100 | il av mixar antikropps till cellerna (framställd i steg 3,3) för att uppnå en slutlig färgning volym av 200 mikroliter. Inkubera i 30 - 60 min på is och i mörker.
  8. Tvätta genom att fylla varje rör med analys eller sortering buffert till en maximal volym av 4 ml. Eventuellt, re-sila cellerna genom en 35-im cellfilter (såsom beskrivs i steg 3.2).
  9. Centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten noggrant.
  10. Återsuspendera proverna i analys eller sortering buffert. Återsuspendera cellerna isolerade från embryon i 500 mikroliter, från valpar yngre än en månad i en ml, från 1 - 3 månader i 2 ml, och från möss äldre än 3 månader i 3 ml. Färgning kontroller kan återsuspenderas i 300 pl buffert.
  11. Tillsätt 200 ng / ml DAPI på resuspenderade celler för att identifiera de döda cellerna. Se till att inkludera en tub containing ofärgade celler utan DAPI för cytometer inställningar. Fortsätt till cellsortering (steg 4) eller analys (steg 5).

4. cellsortering

  1. förberedelser:
    1. För cellsortering före RNA-extraktion, belägga en 1,5-ml uppsamlingsröret med RNas-hämmare omedelbart före sortering. För detta ändamål tillsätts 1 ml av sorteringsbuffert, innehållande 0,01 U / mL RNase inhibitor, till en steril 1,5-ml provröret. Efter 5 min, Vortexa röret och avlägsna vätskan.
    2. För cellsortering före cellodling, tillsätt 3 ml sterilt odlingsmedium (Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 20% FBS, 1% L-glutamin och 1% penicillin-streptomycin) i en steril 15-ml uppsamlingsrör .
  2. Innan du laddar ett rör i en FACS sorterare, virvel det kort att återsuspendera cellerna. Hålla de återstående rören på is.
  3. Börja med att analysera färgnings kontroller för att avgöra sorteringsparametrar (t.ex. (t.ex. totala cellpopulationen, levande DAPI-negativa celler och cellpopulationer som ska sorteras).
  4. När sorterings parametrar och grindar sätts upp, ladda proverna och initiera cellsortering i uppsamlingsrören.
    OBS: Sortering villkor är i hög grad beroende på instrumentet. Vi använder ett munstycke bredd på 100 | j, m, ett tryck av 23,1 psi och en maximal sorteringshastighet på 5.
  5. Fortsätt till RNA-extraktion eller odling av sorterade celler.
    OBS: För RNA-extraktion, centrifugera cellerna vid 2000 xg under 5 min och avlägsnande av överskottsvätska innan det fortsätter med en vanlig extraktion protokoll. För odling av celler, om cellerna sorterades under icke-sterila betingelser, tvätta dem två gånger genom att fylla röret med odlingsmedium och centrifugering den vid 300 xg under 7 min före odling i syfte att minimera deras kontaminering.

5. Cell Analys med flödescytometri

  1. innan jagoading varje rör i cytometern, virvel det kort att återsuspendera cellerna. Hålla de återstående rören på is.
  2. Börja med att analysera de ofärgade och enkel färgade prover för att fastställa analysparametrarna (t.ex. spänning och ersättning).
  3. När analysparametrarna är inställda, ladda varje prov, inklusive färgnings kontroll, och notera resultaten. Analysera de erhållna resultaten med hjälp av flödescytometri analysprogram.

Representative Results

Pankreas mesenkym krävs under utveckling och vuxen ålder. Den här beskrivna metoden medger isolering av mesenchymala celler från embryonala, neonatala och vuxna pankreas. Mesenkymala celler, men inga andra celltyper, uttrycka gul fluorescerande protein (YFP) i bukspottkörteln hos Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP möss 5, 11, 17, 19. Under utveckling är Nkx3.2 (även känd som BapX1) uttrycks av embryo pankreas, mage, och tarm mesenkym, liksom i en del av skelett somites 19, 20, 21. Denna gen uttrycktes i den pankreatiska mesenkym från E9.5 tills E11.5, vilket tillåter genexpression under kontroll av Nkx3.2 -Cre från E9.5 5, 19, 20. Baserat på denna märkning kan celler renas från bulk pankreatisk vävnad med användning av flödescytometri. Figur 2 visar ett flödes-cytometri-analys av enskilda celler från embryonala, neonatala och vuxna pankreatiska vävnader, isolerade såsom beskrivits här. Medan icke-transgena pankreasvävnader inte innehåller fluorescerande celler, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP bukspottkörtelvävnad från alla analyserade åldrar innehåller en tydlig YFP-märkta cellpopulation (Figur 2, märkt med grindar).

Genom att följa metoden som beskrivs här, kan celler som uttrycker fluorescerande proteiner vara antingen renat eller analyseras med flödescytometri, med eller utan ytterligare immunfärgning. Till exempel, efter sortering baserad på fluorescensmärkning, mesenkymala celler kan odlas för att etablera en cellinje (i minst fem passager), så som visas i figur 3A. note t han fibrocytic morfologin hos de odlade cellerna, typiska till mesenchymala celler. Dessutom var detta system som används för att analysera genexpression genom sorterade celler. För detta ändamål extraherades RNA från sorterade mesenkymceller att syntetisera cDNA och gen-expressionsnivåer analyserades med qPCR. Sådan analys avslöjade att sorterade celler uttrycker pan-mesenkymala markör vimentin (Figur 3B). Slutligen kan ytan markör uttryck av pankreasceller analyseras genom flödescytometri. Till exempel, isolerade vi celler från den pankreatiska vävnaden hos Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP vuxna möss med användning av den metod som beskrivs här och färgade dem med cellytan glykoprotein CD9, som rapporterades uttryckas genom fibroblaster 22. Såsom visas i fig 3C, alla fluorescensmärkt celler i Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP pankreas uttrycka CD9.

tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg "/>
Figur 1: embryonala och neonatal pankreasvävnad. Isolerade hela mag-tarmkanalen, inklusive magsäcken, mjälte, tarm, och pankreas, av en E15.5 embryo (A) och en p4 pup (B). Bukspottkörtelns vävnad avgränsas med en blå linje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: mesenkymala celler fluorescerande i Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP pankreatisk vävnad. Flödescytometri analys av pankreasceller som isolerats från icke-transgena (vänster paneler) och Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP transgen (höger sida) möss vid olika åldrar: embryonala (A), neonatal (B) och annonsult (C). Celler analyserades för sidospridning (y-axel) och den gula fluorescens (x-axel). Grindar (markerat med "D") indikerade närvaron av en YFP + cellpopulation i transgena möss, men inte i icke-transgena kontroller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Analyser av isolerade pankreasceller. (A) Celler sorterade från bukspottkörtelvävnad av Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP neonatala möss (såsom beskrivs i figur 2B) odlades för att etablera en cellinje. Odlade celler avbildades för fluorescens (grön, höger och vänster paneler) och faskontrast (grå, högra panelen). (B) Bar diagram som visar Vimentin1 (Vim1)uttrycksnivåer av YFP + -sorted celler från bukspottskörteln vävnad Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP vuxna möss (som beskrivs i figur 1C, grönt) jämfört med osorterat pankreasvävnad (svart). RNA extraherades och genuttryck analyserades med qPCR; uttryck normaliserades till Cyklofilin. N = 4. *** P <0,001. Data representerar medelvärde ± SD. (C) flödescytometri analys av dispergerade pankreasceller från Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP vuxna möss immuno-färgades med allofykocyanin (APC) -konjugerad anti-CD9-antikropp och analyserades för APC (y-axeln) och den gula fluorescens (x-axel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här beskriver vi en metod för att isolera och analysera celler av den pankreatiska mikromiljö. Denna metod kan användas för att isolera mesenkymala celler från embryonal och adult pankreatisk vävnad. Dessutom har vi med framgång använt detta protokoll för att isolera endotelceller från vuxna och neonatal bukspottkörteln 5, 17. Emellertid kan det inte vara lämplig för att erhålla ett reproducerbart encelliga suspension av pankreatiska epitelceller (alternativa protokoll beskrivs i referenserna 18, 23 och 24). Med användning av denna metod, fluorescensmärkta celler, antingen som uttrycker fluorescerande proteiner eller immunfärgades för ytmarkörer, kan renas genom FACS eller analyserades med flödescytometri. RNA kan extraheras från renade celler för att profilera sin genuttryck mönster. Alternativt kan renade celler odlas för att etablera en cellinje för efterföljande proteomik analys. Denna metod gör det möjligt för karakterisering av faktorer expressed av bukspottkörteln mikromiljö, som reglerar dess organogenes, fysiologi och patofysiologi.

Pankreas mesenkym stödjer vävnadsorgan genom att främja spridningen av prekursorer och differentierade celler 5, 9. Dessa celler visade sig stödja utbyggnaden av mänskliga embryonala stamceller (hESC) härledda bukspottkörteln stamceller 17, 25, 26. Därför skulle avgränsar identitet embryonala mesenkymala faktorer underlätta pågående ansträngningarna att skapa insulinproducerande betaceller från hESCs och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som en potentiell bot för diabetes. Mus genetiska studier medgav identifiering av tillväxtfaktorer, såsom Fgf10, som produceras av mesenkym att främja pancreatic epitel expansion under de tidiga stadierna av bukspottkörteln utveckling3, 9. I syfte att identifiera ytterligare faktorer uttryckta i embryonala mesenkym, isolerade vi dessa celler med hjälp av laser fångade microdissection, extraherades deras RNA, och utförde genexpressionsanalys 26. Men förutom att vara arbetsintensiva, förlitar sig denna metod på att identifiera celler baserat på deras morfologiska egenskaper, vilket begränsar dess användning till utvecklingsstadier före förgreningen av epitelet in i den omgivande mesenkym (dvs., E12.5). För att karakterisera mesenkymala celler i senare utvecklingsstadier, använde vi den här beskrivna metoden 5, 17.

Vi använde denna metod för att analysera ytan markör uttryck av neonatal bukspottskörteln mesenkym 5. Dessutom har mesenkymala celler isolerade från embryonal och neonatal pankreatisk vävnad av Nkx3.2 -Cre; R26-EYFP möss, baserat påderas fluorescensmärkning i denna mus linje, och odlades att etablera cellinjer 17. Den proteomik analys av dessa celler tillåts för identifiering av faktorer som utsöndras av pankreas mesenkym med förmåga att främja hESC-derived bukspottkörteln stamceller 17. Vi använde vidare denna cellisolering metod för att rena mesenkymala celler från vuxna pankreas vävnader för RNA-extraktion och genexpressionsanalys 17. Därför kan denna metod användas för att identifiera gener och proteiner som uttrycks av den pankreatiska mesenkym, med förmågan att stödja pankreatisk cellutveckling.

Pankreas mesenkymala celler vidare visat sig spela en roll i bukspottkörteln tumörbildning. PDAC kännetecknas av bildningen av en fibroblast-rika desmoplastic stroma består av fibroblaster, immunceller, och ECM 27. Medan stroma ansågs främja utvecklingen av mångatyper av cancer, visades det att hålla tillbaka PDAC progression 15, 16, 28. Detta tyder på att komponenterna i bukspottskörteln stroma utsöndrar faktorer som hämmar tumörbildning. Vidare kan förändringar i stroma cellulära sammansättning samt i cellfenotyp ligga bakom deras effekt på epitelceller 15, 16, 28. Den metod som beskrivs här kan därför bidra till att beskriva de olika celltyper som utgör en PDAC stroma jämfört med friska pankreasvävnad. Det skulle vidare tillåta reningen av de olika stromala celltyper för att karakterisera potentiella förändringar i deras genuttrycksprofilerna under PDAC progression. Men på grund av förändringar i bukspottskörteln ECM sammansättning under tumörbildning 27, justeringar av vävnad matsmältningen parametrar, såsom införandet av Additional kollagenas typer eller öka inkubationstiden, kan krävas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213865001
DNase Sigma-Aldrich D5025-15KU The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) Sigma-Aldrich H6648
Fetal Bovine Serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
EDTA Biological Industries 01-862-1A
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Goat IgG serum Sigma-Aldrich G9023
DAPI Sigma-Aldrich D9542
RNAse inhibitor Invitrogen N8080119
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965092
L-Glutamine Biological Industries 03-020-1B
Penicillin-streptomycin Biological Industries 03-031-1B
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537 Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride
1.5 mL tubes Sarstedt 72 690
15 mL conical tube Corning 430052
Round Bottom Polystyrene 5 mL tube Corning 352008 FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands
5 mL tube with 35 μm cell strainer Snap Cap Corning 352235 FACS tube
70 μm cell strainer  Miltenyi Biotec 130-098-462
Heating block with agitation  Eppendorf ThermoMixer C
Centrifuge ThermoFisher Heraeus Megafuge 40R
Steromicroscope Nikon SMZ 745
Cell sorter BD Biosciences FACSAria IIu
flow cytometer Beckman Coulter Gallios 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, (10), 2447-2457 (2002).
  2. Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -O., Caicedo, A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (7), 2334-2339 (2006).
  3. Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Developmental biology. 326, (1), 4-35 (2009).
  4. Villasenor, A., Cleaver, O. Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog. Seminars in cell & developmental biology. 1-8 (2012).
  5. Landsman, L., Nijagal, A., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9, (9), e1001143 (2011).
  6. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294, (5542), 564-567 (2001).
  7. Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Developmental biology. 347, (1), 216-227 (2010).
  8. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Developmental biology. 4, 242-255 (1962).
  9. Bhushan, A., Itoh, N., et al. Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis. Development. 128, (24), 5109-5117 (2001).
  10. Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation. Development. 142, (22), 3859-3868 (2015).
  11. Sasson, A., Rachi, E., et al. Islet pericytes are required for beta-cell maturity. Diabetes. 65, (10), 3008-3014 (2016).
  12. Stanley, S. A., Kelly, L., et al. Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism. Nature. 531, (7596), 647-650 (2016).
  13. Brissova, M., Aamodt, K., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes β cell regeneration. Cell metabolism. 19, (3), 498-511 (2014).
  14. Nikolova, G., Jabs, N., et al. The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation. Developmental cell. 10, (3), 397-405 (2006).
  15. Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer cell. 25, (6), 735-747 (2014).
  16. Özdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer cell. 25, (6), 719-734 (2014).
  17. Russ, H. A., Landsman, L., et al. Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation. Stem cells international. 2016, 6183562 (2016).
  18. Gout, J., Pommier, R. M., et al. Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), e50514 (2013).
  19. Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development. Gastroenterology. 136, (5), 1701-1710 (2009).
  20. Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton. Mech Dev. 65, (1-2), 145-162 (1997).
  21. Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2. Development. 131, (19), 4665-4675 (2004).
  22. Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. (2014).
  23. Morris, J. P., Greer, R., et al. Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation. PloS one. 9, (5), 95486 (2014).
  24. Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -A., et al. Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated β-cells. Diabetes. 63, (10), 3388-3393 (2014).
  25. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491, (7426), 765-768 (2012).
  26. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62, (5), 1581-1592 (2013).
  27. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324, (5933), 1457-1461 (2009).
  28. Raz, Y., Erez, N. An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer. Experimental cell research. 319, (11), 1596-1603 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics