लिम्फोसाइट परिस्त्राव के विश्लेषण से एक का उपयोग करना * These authors contributed equally

Immunology and Infection

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Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

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Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में लिम्फोसाइट परिस्त्राव प्रतिरक्षा निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है। लिम्फोसाइट परिस्त्राव के रोग से संबंधित परिवर्तन सीएनएस में pathophysiological परिवर्तन हो सकती है। इस प्रकार, सीएनएस में लिम्फोसाइट प्रवास के जांच भड़काऊ सीएनएस रोगों को समझने के लिए और नई चिकित्सा दृष्टिकोण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ हम मानव रक्त मस्तिष्क बाधा के इन विट्रो मॉडल लिम्फोसाइट परिस्त्राव अध्ययन करने के लिए प्रस्तुत करते हैं। मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (HBMEC) confluently एक झरझरा polyethylene terephthalate पर उगाए जाते हैं रक्त मस्तिष्क बाधा के अन्तःचूचुक नकल करने के लिए सम्मिलित Transwell। बैरियर समारोह zonula occludens इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री, transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) माप के साथ-साथ इवांस नीले पारगमन के विश्लेषण से मान्य है। एन के कोशिकाओं - यह मॉडल इस तरह के CD56 उज्ज्वल CD16 मंद / के रूप में दुर्लभ लिम्फोसाइट सबसेट diapedesis की जांच की अनुमति देता है। Furthermअयस्क, अन्य कोशिकाओं, साइटोकिन्स और chemokines, रोग से संबंधित परिवर्तन, और लिम्फोसाइटों के प्रवासी क्षमता पर अलग उपचार परहेज के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है। अंत में, भड़काऊ उत्तेजनाओं के प्रभाव के साथ-साथ endothelial बाधा पर विभिन्न उपचार परहेज का विश्लेषण किया जा सकता है।

Introduction

ऊतकों में रक्त से लिम्फोसाइट प्रवास प्रतिरक्षा निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है। विशिष्ट आणविक बातचीत के एक अनुक्रम छोटी आंत, त्वचा, लिम्फ नोड्स, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), और अन्य ऊतकों 1 में साइट विशिष्ट परिस्त्राव सुनिश्चित करता है। लिम्फोसाइट प्रवास में बदलाव व्यापक प्रसार रोगों 2 के एक नंबर के pathophysiology में शामिल हैं। प्रतिरक्षा विशेषाधिकार प्राप्त सीएनएस में प्रवासन कसकर नियंत्रित किया जाता है और उसके अनुसार इस प्रक्रिया के परिवर्तन इंसेफैलोमाईलिटिस 3, neuromyelitis ऑप्टिकल, स्ट्रोक, और मल्टिपल स्क्लेरोसिस (एमएस) 2, 4, 5, 6, 7 की तरह सीएनएस से संबंधित बीमारियों में शामिल हैं। इसलिए, यह लिम्फोसाइट परिस्त्राव अध्ययन करने के लिए बेहतर रोग pathophysiology को समझने के लिए और एक के लिए उपकरण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है इस बीमारी के बोझ 8, 9, 10, 11, 12 की उन्नति।

लिम्फोसाइटों अलग रास्तों से सीएनएस में चले जाते हैं। रंजित जाल के भीतर और भर में रक्त मस्तिष्क बाधा रक्त मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा के माध्यम से अंतरिक्ष अवजालतनिका में postcapillary venules के माध्यम से तरल पदार्थ का स्त्राव वर्णित किया गया है 1, 13, 14, 15। रक्त मस्तिष्क बाधा पार प्रवासन अंतर्कलीय कोशिकाओं 14 के साथ लिम्फोसाइट के बातचीत के द्वारा आयोजित किया जाता है। इसके विपरीत परिधि में endothelial कोशिकाओं में, सीएनएस के अंतर्कलीय कोशिकाओं, तंग जंक्शन अणुओं की उच्च मात्रा व्यक्त जिससे सख्ती से कोशिकाओं और प्रोटीन रक्त मस्तिष्क बाधा पार करने में सक्षम की मात्रा को सीमितलड़की = "xref"> 16। तंग जंक्शनों के ढीला में सूजन परिणाम और आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है; इस प्रकार, सीएनएस 1, 17, 18 में लिम्फोसाइट प्रवास को बढ़ाने।

रक्त मस्तिष्क बाधा के माध्यम से तरल पदार्थ का स्त्राव एक multistep प्रक्रिया है। Endothelial कोशिकाओं को टेदर लिम्फोसाइटों और फिर एक प्रक्रिया मुख्य रूप से selectins 1, 15 द्वारा मध्यस्थता में अन्तःचूचुक साथ रोल। बाद में, अन्तःचूचुक द्वारा स्रावित chemokines और संबंधित केमोकाइन रिसेप्टर्स के बीच संबंधों लिम्फोसाइटों पर व्यक्त इंटेग्रिन के गठनात्मक परिवर्तन को प्रेरित है, जिससे अंतर्कलीय कोशिकाओं 1 के लिए फर्म आसंजन को बढ़ावा देने के। अंत में, या तो रक्त प्रवाह के खिलाफ endothelial बाधा के साथ क्रॉल लिम्फोसाइटों परिवाहकीय अंतरिक्ष में transmigrating से पहले, या तुरंत और सीधे transm रोकनेफर्म आसंजन 1, 19, 20 के स्थल पर igrate। सभी लिम्फोसाइट परिस्त्राव के लिए निम्न चरणों का अलग तकनीक का उपयोग करते हुए 21 इन विट्रो में विश्लेषण किया जा सकता। समय-अंतराल वीडियो माइक्रोस्कोपी प्रारंभिक टेदरिंग और रोलिंग 15 अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। आसंजन assays फर्म गिरफ्तारी के बारे में विस्तृत जानकारी बाधाओं 22 endothelial उपलब्ध हैं। स्थानांतरगमन assays के रूप में यहां प्रदर्शन किया प्रतिरक्षा सेल स्थानांतरगमन 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 के विश्लेषण अनुमति देते हैं।

इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल में मानव का उपयोग करना, हम एक उच्च migr कि हाल ही में दिखा सकता हैउनके CD56 के लिए मंद CD16 + समकक्षों अंतः मस्तिष्कावरणीय डिब्बे 21 में इस एन.के. सेल सबसेट की प्रबलता से परिलक्षित किया गया था की तुलना में एन के कोशिकाओं - CD56 उज्ज्वल CD16 के atory क्षमता मंद /। इस प्रकार, हमारे प्रयोगात्मक सेटअप इन विवो स्थिति की नकल करने के उपयुक्त हो रहा है।

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Protocol

1. सेल मानव मस्तिष्क माईक्रवैस्कुलर अंतर्कलीय कोशिकाओं की संस्कृति (HBMEC)

  1. सेल संस्कृति बोतल की कोटिंग
    1. फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान तैयार करने के लिए, एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए 10 एमएल पीबीएस जोड़ें। 150 μL फ़ाइब्रोनेक्टिन जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
    2. नीचे कवर करने के लिए एक टी 25 सेल संस्कृति फ्लास्क फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान के 2 एमएल जोड़ें। इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 3 घंटे के लिए सेल संस्कृति फ्लास्क सेते हैं। फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित बोतल 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में 2 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता।
  2. बीज बोने की क्रिया और HBMEC की सेल संस्कृति
    1. सेल संस्कृति कुप्पी के नीचे से महाप्राण फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान। 7.2 x 10 4 HBMEC / सेमी² 6 एमएल ईसीएम-ख माध्यम में निलंबित जोड़ें (= ईसीएम-बी 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1% endothelial कोशिकाओं की वृद्धि के पूरक के साथ पूरक)। 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में सेते हैं। दैनिक कोशिकाओं की वृद्धि की जाँच करें एक खुर्दबीन के प्रयोग से।
    2. मध्यम बदले हर 3 दिन।हार्वेस्ट या विभाजित कोशिकाओं, जब HBMEC लगभग 80% संगम तक पहुँचते हैं। HBMEC शारीरिक गुणों की हानि से बचने के पारित होने के 1 से 15 के बीच किया जाना चाहिए।
  3. हार्वेस्ट HBMEC।
    1. 1 के अनुपात में पीबीएस के साथ accutase (1x) के मिश्रण से accutase समाधान तैयार: 1। आगे उपयोग तक एक जल स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर accutase समाधान रखें।
    2. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को सेल संस्कृति कुप्पी से ईसीएम-ख मध्यम स्थानांतरित करें। सेल संस्कृति कुप्पी की तह तक 5 एमएल पीबीएस जोड़कर HBMEC धो लें। पीबीएस Aspirate और धोने कदम दो बार दोहराएँ।
    3. 2 एमएल पूर्व गर्म accutase समाधान जोड़ें। 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। बाद में, HBMEC मजबूती से सेल संस्कृति फ्लास्क कई बार दोहन से फिर से निलंबित कर दिया गया है। सेल टुकड़ी एक खुर्दबीन का उपयोग कर नियंत्रित किया जाता है
    4. ईसीएम-बी-मध्यम पहले एक 15 एमएल ट्यूब में संग्रहीत के रूप में जल्द HBMEC अलग करने शुरू के रूप में वापस सेल संस्कृति फ्लास्क में जोड़ा जाता है। बार-बार कुप्पी के नीचे कुल्ला जब तक कि अधिकांश HBMEC हैंफिर से निलंबित कर दिया।
    5. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 एमएल ईसीएम-ख माध्यम में कोशिकाओं को फिर से रोक देते हैं। कोशिकाओं की गणना करें और कोशिका निलंबन पतला प्रति एमएल ईसीएम-ख मध्यम 3 x 10 5 HBMEC की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के।

2. सेल संस्कृति आवेषण की तैयारी

  1. सेल संस्कृति आवेषण के कोटिंग
    महत्वपूर्ण नोट: सेल संस्कृति आवेषण की झिल्ली को छू से बचें।
    1. 100 μL फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान (1.1.1 देखें) प्रत्येक सेल संस्कृति डालने के लिए (चित्रा 1 ए) और एक 96 अच्छी तरह से सपाट तल थाली में से एक अच्छी तरह से (ऑप्टिकल नियंत्रण में अच्छी तरह से) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 3 घंटे के लिए सेते हैं। ऊष्मायन महाप्राण फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान के बाद।
    2. 100 μL HBMEC सेल संस्कृति आवेषण के निलंबन और अच्छी तरह से ऑप्टिकल नियंत्रण जोड़ें। सेल के निचले डिब्बे को 600 μl ईसीएम-ख माध्यम जोड़ेंसंस्कृति आवेषण। 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 तक बाधा अखंडता (चित्रा 1 बी) तक पहुँच जाता है पर 4 दिन, अच्छी तरह से ऑप्टिकल नियंत्रण में HBMEC की सूक्ष्म मूल्यांकन द्वारा कोशिकाओं की वृद्धि की जांच - 3 के लिए सेते हैं। नोट: चार दिन से अधिक सेल विकास अनुशंसित नहीं है।
    3. वैकल्पिक: भड़काऊ शर्तों की नकल करने के लिए कम डिब्बे से मध्यम aspirate और ईसीएम-ख मध्यम 500 यू / एमएल IFN-γ / TNF-α प्रवास परख पहले 24 घंटे के साथ पूरक से बदल दें।

3. स्थानांतरगमन परख के दिन पर इवांस ब्लू के साथ गुणवत्ता नियंत्रण

  1. इवांस नीले समाधान की तैयारी
    1. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग कर 200 μl B27 पूरक के साथ पीबीएस / B27 समाधान मिश्रण 10 एमएल पीबीएस तैयार करना। इवांस नीले शेयर समाधान पतला (20 मिलीग्राम / एमएल पीबीएस) 1: पीबीएस / B27 के साथ 1,000।
  2. इवांस नीले पारगम्यता परख
    1. ऊपरी डिब्बे के बाद कम डिब्बे से मध्यम aspirateएक सेल संस्कृति एक संगामी HBMEC monolayer युक्त डालने की। 100 μL इवांस सेल संस्कृति डालने के लिए नीले समाधान जोड़ें।
    2. कम डिब्बे के लिए 600 μL पीबीएस / B27 जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर 60 मिनट के लिए सेते हैं। ध्यान से संदंश का उपयोग कर सेल संस्कृति डालने को हटा दें।
  3. इवांस नीले माप
    1. कम डिब्बे से निकालें पीबीएस / B27 और एक काले रंग की polystyrol 96-अच्छी तरह सपाट तल थाली के दो कुओं के लिए 100 μL प्रत्येक हस्तांतरण। एक Tecan अनंत M200 प्रो प्लेट रीडर में थाली डालें और इष्टतम z-स्थिति का निर्धारण।
    2. इवांस नीले संबंधित सेटिंग्स का उपयोग कर के उपाय उत्तेजना (उदाहरण के लिए: उत्तेजना: 620 एनएम, उत्सर्जन: 680 एनएम, उत्तेजना बैंडविड्थ: 9 एनएम, उत्सर्जन बैंडविड्थ: 20 एनएम, 175x वृद्धि, 25 चमक, एकीकरण के समय: 20 μs)।
    3. यह निर्धारित करने के HBMEC बाधा कार्यों के लिए एक मानक वक्र बीज के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर HBMEC भर इवांस नीले पारगमन का चित्रण करने के लिए डेटा का अधिग्रहण तुलनाing कोशिकाओं (चित्रा 1 बी, दाएं)।

4. प्रवासन परख

  1. परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) तैयार करना।
    1. 10 एमएल RPMI एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें और 200 μL B27 पूरक जोड़ें। 5 मिनट के लिए 300 XG पर PBMC और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं की गणना करें। 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल RPMI / B27 के अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित PBMC।
  2. प्रवास परख के सेट-अप
    1. संगामी HBMEC monolayers (चित्रा 1 ए) युक्त सेल संस्कृति आवेषण के ऊपरी डिब्बे के बाद कम डिब्बे से मध्यम Aspirate। प्रति दाता प्रति एक 24 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से (इन विट्रो नियंत्रण) करने के लिए सेल संस्कृति आवेषण के लिए 100 μL PBMC निलंबन प्रत्येक जोड़ सकते हैं और भी।
    2. सेल संस्कृति आवेषण और इन विट्रो नियंत्रण से PBMC के लिए 500 μL के निचले डिब्बे को 600 μL RPMI / B27 जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर सेते 6 एच।
    3. माइग्रेट PBMC के संचयन
      1. संदंश का उपयोग कर सेल संस्कृति डालने बाहर ले लो और ध्यान से झिल्ली को बिना छुए 400 μL पीबीएस के साथ नीचे कुल्ला। सेल संस्कृति डालने त्यागें।
      2. 20 μL प्रवाह गिनती fluorospheres जोड़े सेल संस्कृति के निचले डिब्बे को (लगभग 1000 मोती / μL) इन विट्रो नियंत्रित करने के लिए और साथ ही डालें और मिश्रण अच्छी तरह से। स्थानांतरण 1 PBMC निलंबन जिसके परिणामस्वरूप ट्यूब प्रवाह cytometry के एमएल।

    5. फ्लो

    1. नमूना तैयार करना
      1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र PBMC।
      2. 100 μL के fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़कर एंटीबॉडी समाधान तैयार बफर प्रवाह cytometry (पीबीएस / 1% बीएसए / 2 मिमी EDTA) नमूना प्रति। 1 μL सीडी 4-FITC नीचे प्रस्तुत परिणामों के लिए, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 μL CD56-PC7, 1 μL CD8-A700, और 1 μL CD16-A750 नमूना प्रति इस्तेमाल किया गया।
      3. पुनः निलंबित पंजाबएंटीबॉडी समाधान के 100 μL में एम सी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
      4. 250 μL 5 मिनट के लिए 300 XG पर बफर और अपकेंद्रित्र प्रवाह cytometry जोड़ें।
    2. नमूना अधिग्रहण
      1. आवश्यक राशि में PBMC फिर से निलंबित प्रवाह के बफर cytometry (प्रवाह कोशिकामापी इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है)।
      2. प्रवाह गिनती fluorospheres पता लगाने के लिए 525 और 700 एनएम तरंगदैर्ध्य के बीच एक सक्रिय डिटेक्टर के साथ कोशिकामापी एक प्रवाह का उपयोग रंगीन PBMC प्राप्त (उत्तेजना 488 एनएम, उत्सर्जन 525 - 700 एनएम)।
        (निम्न चरणों के एक उदाहरण अगर कोशिकामापी Kaluza जी सॉफ्टवेयर के साथ संचालित एक Gallios प्रवाह प्रयोग किया जाता है कर रहे हैं:। (1) कंप्यूटर शुरू (2) जब ऑपरेटिंग सिस्टम पूरी तरह से भरी हुई है, प्रवाह बटन "पर कोशिकामापी" दबाकर कोशिकामापी शुरू । (3) "खुले प्रोटोकॉल" बटन दबाकर संबंधित अधिग्रहण प्रोटोकॉल लोड करें। (4) के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल चुनें और "खुला" का चयन करें। (5) अधिकार के साथ क्लिक करके हर नमूने के लिए प्रोटोकॉल डुप्लिकेटप्रोटोकॉल आभासी हिंडोला और "डुप्लीकेट" मैदान पर एक लेफ्ट क्लिक में दिखाई दे रहा पर माउस बटन। (6) नमूना सूची में प्रत्येक नमूने लेबल करें। (7) हिंडोला का संकेत दिया पदों के लिए नमूने स्थानांतरण और अधिग्रहण शुरू करते हैं।)
    3. नमूना विश्लेषण
      1. cytometry डेटा ओपन जिसके परिणामस्वरूप प्रवाह संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर। इन विट्रो नियंत्रण कुओं से transmigrated PBMC के लिए ब्याज के साथ-साथ कोशिकाओं के उप-जनसंख्या की संख्या का निर्धारण और संबंधित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रवाह गिनती fluorospheres।
        (Gating रणनीति का एक उदाहरण परिणाम हिस्से में (चित्रा दिया जाता है 1 सी: एन.के. सेल सबसेट की स्थानांतरगमन का विश्लेषण करने के लिए, पहली बार एक बगल की ओर बिखराव चैनल (एसएससी) बनाम आगे बिखराव चैनल (एफएससी) साजिश में लिम्फोसाइटों चयन लिम्फोसाइटों हैं। तो बनाम CD56 साजिश एक CD3 और CD56 + CD3 में दिखाया गया है -। एन के कोशिकाओं का चयन किया जाता एन.के. सेल सबसेट के बीच अंतर करने के लिए, एन के कोशिकाओं में प्रदर्शित किए जाते हैंएक CD56 CD16 बनाम साजिश और CD56 उज्ज्वल CD16 मंद / - और साथ ही CD56 मंद CD16 + एन के कोशिकाओं चुने गए हैं। इसके अलावा, प्रवाह गिनती fluorospheres एक एफएससी एसएससी बनाम साजिश से चुने गए हैं और बाद में उनकी संख्या निर्धारित करने के लिए समय की तुलना में 525 और 700 एनएम के बीच एक उत्सर्जन के साथ एक चैनल के एक भूखंड में दिखाया गया है।)
      2. प्रत्येक नमूने की कुल सेल संख्या की गणना करने के लिए, प्रवाह गिनती fluorospheres का उपयोग कर कक्षों की संख्या का पता चला सामान्य:
        समीकरण
      3. कुल चले गए कोशिकाओं और इन विट्रो नियंत्रण में कुल कोशिकाओं के बीच अनुपात के रूप में चले गए कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करें।

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Representative Results

एन.के. सेल और टी सेल सबसेट मानव रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल (चित्रा 1 ए) का उपयोग कर की स्थानांतरगमन दिखा प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं। HBMEC monolayer की अखंडता तंग जंक्शन अणु ZO -1, transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) माप, और इवांस नीले पारगमन (चित्रा 1 बी) के धुंधला द्वारा मान्य किया गया था। 3 के बाद - 4 दिनों संस्कृति HBMEC तंग जंक्शन अणु ZO -1 (चित्रा 1 बी, बाएं) व्यक्त किया। इसके अलावा, HBMEC (दाएं चित्रा 1 बी,) इवांस नीले के लिए transendothelial विद्युत प्रतिरोध (चित्रा 1 बी मध्य) के साथ-साथ कम पारगमन का प्रदर्शन monolayers में वृद्धि हुई। और CD56 CD16 + एन.के. सेल सबसेट और सहित सीडी 4 + और सीडी 8+ टी दो पूर्व के रूप में कोशिकाओं टी कोशिकाओं मंद - HBMEC monolayers CD56 उज्ज्वल CD16 मंद / सहित एन के कोशिकाओं की स्थानांतरगमन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गयाamples (चित्रा -1 डी + ई, क्रमशः)। चले गए कोशिकाओं का प्रतिशत एक आंतरिक नियंत्रण (चित्रा 1C) के रूप में फ्लो और सामान्यीकृत का उपयोग कर प्रवाह गिनती fluorospheres द्वारा प्राप्त सेल की गिनती के आधार पर गणना की गई थी। HBMEC monolayer परख पहले IFN-γ और TNF-α 24 घंटों के साथ प्रेरित किया गया था भड़काऊ शर्तों नकल करने के लिए। साइटोकाइन उत्तेजना सभी का विश्लेषण किया लिम्फोसाइट आबादी की वृद्धि हुई प्रवास में हुई। (डेटा नहीं दिखाया गया है) यह 1-ICAM सहित आसंजन अणुओं का एक बढ़ा अभिव्यक्ति की वजह से हो सकता है। CD56 उज्ज्वल CD16 मंद / - एन के कोशिकाओं एक उच्च प्रवासी क्षमता का प्रदर्शन किया है जब उनके CD56 की तुलना में दोनों unstimulated (10.88% बनाम 0.86%) और IFN-γγ / TNF-α प्रेरित भर में मंद CD16 + एन.के. (18.22% बनाम 2.94%) HBMEC (चित्रा 1 डी)। हालांकि, सूजन की वजह से स्थानांतरगमन के रिश्तेदार वृद्धि CD56 के लिए CD16 मंद अधिक था + (मंद + 342% बनाम + 167 CD56 उज्ज्वल CD16 के लिए% / -) एन.के. सेल सबसेट। इन परिणामों की नकल इन विवो टिप्पणियों कि CD56 उज्ज्वल CD16 मंद / - एन के कोशिकाओं अंतः मस्तिष्कावरणीय डिब्बे में समृद्ध कर रहे हैं। इस प्रकार, रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल सीएनएस 21 में दुर्लभ लिम्फोसाइट आबादी की प्रतिरक्षा सेल diapedesis के बुनियादी सिद्धांतों का विश्लेषण करने के उपयुक्त हो रहा है। अंत में, सीडी 4 और CD8 टी सेल सबसेट के transmigratory क्षमता दिखाया गया है (चित्रा 1E)।

आकृति 1
चित्र 1: Uninflamed और सूजन HBMEC Monolayers भर में एन.के. सेल सबसेट की विभेदक प्रवासन। ए transwell आवेषण (बाएं) और प्रयोगात्मक सेटअप (दाएं) के चित्रण की एक तस्वीर। HBMEC बाधा कार्यों के बी मान्यकरण। वाम: तंग जंक्शन mol के प्रतिरक्षाऊतकरसायन धुंधलाecule ZO -1 खरगोश विरोधी मानव ZO-1 (Abcam, 1: 200) का उपयोग करते हुए और बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी-Cy3 (1: 300) HBMEC पर 3 दिनों के लिए खेती की जाती। केंद्र: दिन 2 और खेती के 4 दिन के बीच HBMEC की transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर)। अधिकार: के साथ साथ ( "सूजन", लाल) या बिना ( "uninflamed", काला) उत्तेजना HBMEC के लिए इवांस नीले पारगमन के लिए मानक वक्र 500 यू / एमएल IFN-γ और 24 घंटे के लिए TNF-α। HBMEC (काला तीर) के बोने के बाद 96 घंटे - स्थानांतरगमन assays 72 प्रदर्शन कर रहे हैं। सीई। PBMC 16 स्वस्थ व्यक्तियों से प्राप्त प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में प्रवास assays का शिकार हुए। परख करने से पहले 24 घंटे, सेल संस्कृति आवेषण के आधे के साथ प्रेरित किया गया 500 आइयू / एमएल IFN-γ और TNF-α। Transmigrated कोशिकाओं काटा और फ्लो द्वारा विश्लेषण किया गया। PBMC के लिए सी प्रतिनिधि परिणामों में इन विट्रो नियंत्रण में अच्छी तरह से (ऊपर) से और uninflamed HBMEC (नीचे) के लिए माइग्रेशन के बाद ली गई। एन.के. सेल मंद / CD56 + कोशिकाओं और CD56 उज्ज्वल CD16 में बिल्कुल अलग - - ( "CD56 उज्ज्वल") और CD56 मंद CD16 + ( "CD56 मंद") एन.के. सेल सबसेट ls CD3 के रूप में कुल लिम्फोसाइटों से गेटेड किया गया। फ्लो गिनती fluorospheres ( "मोती") एफएससी / एसएससी विशेषताओं के आधार पर गेटेड कर रहे थे और उनकी संख्या की तुलना में समय की साजिश एक FL3 में निर्धारित किया गया था। अनुकरणीय गणना चले गए CD56 उज्ज्वल और CD56 मंद एन के कोशिकाओं का प्रतिशत सही पर दिखाया जाता है निर्धारित करने के लिए। डी चले गए एन के कोशिकाओं का प्रतिशत के साथ-साथ CD56 उज्ज्वल और CD56 मंद एन.के. सेल सबसेट, और सहित सीडी 4 + और CD8 + टी सेल uninflamed (काला) भर में स्थानांतरगमन या सूजन (लाल) निम्नलिखित सबसेट चले गए टी कोशिकाओं की प्रतिशत HBMEC SEM ± मतलब के रूप में दर्शाया। पी-मूल्यों बनती छात्र टी परीक्षण द्वारा गणना कर रहे थे; ** p <0.01, *** पी <0.001।/ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ हम मानव रक्त मस्तिष्क बाधा पार लिम्फोसाइटों की स्थानांतरगमन की जांच के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करते हैं। सीएनएस को लिम्फोसाइट प्रवास के इन विट्रो विश्लेषण में लिम्फोसाइट परिस्त्राव, संभावित रोग से संबंधित परिवर्तन, और नए चिकित्सा दृष्टिकोणों के बुनियादी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल के कई संशोधनों संभव हो रहे हैं। उदाहरण के लिए, ऊपरी डिब्बे से कोशिकाओं को गैर-माइग्रेट सेल आबादी की संरचना की जांच के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, IFN-γ और 24 घंटे परख करने से पहले TNF-α के साथ HBMEC monolayer के उपचार भड़काऊ सीएनएस विकारों 21, 25 के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सूजन रक्त मस्तिष्क बाधा नकल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इसी तरह, अन्य तत्वों के साथ HBMEC या लिम्फोसाइटों के इलाज लिम्फोसाइट परिस्त्राव पर उनके प्रभाव की जांच की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए उनकेआसंजन अणुओं पर प्रभाव) 30, 31। निश्चित आसंजन अणुओं की भागीदारी इंटेग्रिन या उनके लाइगैंडों 32 के लिए अवरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता। इसके अलावा, प्रयोगात्मक यहां प्रस्तुत सेटअप chemokines या astrocytes या अन्य कोशिकाओं 33, 34 से प्राप्त supernatants से कीमोटैक्टिक प्रभाव के विश्लेषण की अनुमति देता है। प्राथमिक मानव मस्तिष्क व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं के साथ HBMEC के प्रतिस्थापन रक्त मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा 15 की जांच के लिए इस प्रयोगात्मक सेटअप के स्पेक्ट्रम बढ़ने लगते हैं। HBMEC अमर अंतर्कलीय कोशिकाओं या कोशिकाओं अन्य अंगों से ली गई मॉडल की सीएनएस विशिष्टता बनाए रखने के लिए के साथ बदल नहीं किया जाना चाहिए। हालांकि, अन्य प्रजातियों से मस्तिष्क व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं संबंधित जानवरों 35 में स्थानांतरगमन विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, रेटिनोइक एसिड या hydrocortisone बाधा कार्यों को बढ़ाने के लिए वर्णित किया गया है और इस तरह 36 नियोजित किया जा सकता है, 37। सीमित सेल नंबर के मामले में परख के अधीन कोशिकाओं की मात्रा को कम किया जा सकता है, क्योंकि हमारे मॉडल रैखिक वसूली की दरों में 2 6 के बीच x 10 5 और 1 x 10 PBMC (नहीं दिखाया डेटा) प्रदान करता है। स्थानांतरगमन निम्नलिखित दुर्लभ सेल आबादी का विश्लेषण करने के लिए यह आदेश फ्लो के लिए आवश्यक पर्याप्त कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए कई कुओं से पूल कोशिकाओं के लिए आवश्यक हो सकता है। अंत में, हमारे प्रयोगात्मक सेटअप भी सीएनएस 38 में दवा वितरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 3 सुक्ष्ममापी के एक छेद के आकार में आम तौर पर, लिम्फोसाइट स्थानांतरगमन अनुमति देने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि 0.4 सुक्ष्ममापी के एक छेद के आकार लिम्फोसाइट स्थानांतरगमन से बचाता है, लेकिन दवा वितरण 39, 40, 41, 42 अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है।

43 में रक्त मस्तिष्क बाधा अखंडता के आकलन के लिए प्रदर्शन किया। कम छ बलों और जल्दी मार्ग के उपयोग पर HBMEC की centrifugation (यानी

हालांकि प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित के पालन सार्थक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करता है, इस तकनीक कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, इन विवो रक्त मस्तिष्क बाधा कोशिकाओं है, जो विभिन्न तरीकों से बातचीत और टाइट जंक्शन 1 के गठन को प्रभावित करने से बाधा समारोह को मजबूत बनाने की एक संख्या से बना है। इसलिए, हालांकि यह रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल इन विवो स्थिति का एक अच्छा सन्निकटन है, महत्वपूर्ण पहलुओं याद कर रहे हैं। इसके अलावा, रक्त मस्तिष्क बाधा पार सीएनएस में लिम्फोसाइट परिस्त्राव एक multistep प्रक्रिया है। प्रत्येक एकल चरण अलग से जांच की जा सकता है, यहाँ प्रस्तुत तकनीक है जो के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता हैकतरनी बलों 2, 44, 45, 46 के प्रभाव में तरल पदार्थ का स्त्राव की le प्रक्रिया। अंत में, PBMC से पलायन कोशिकाओं के विश्लेषण ब्याज की कोशिकाओं की आवृत्ति के आधार पर चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि कोशिकाओं की आमतौर पर केवल एकल अंक आवृत्तियों बसना। इसलिए, परख या एक से अधिक सेल संस्कृति आवेषण भर में चले गए कोशिकाओं की पूलिंग से पहले ब्याज की आबादी के अलग होने के लिए आवश्यक हो सकता है। सीएनएस में ल्युकोसैट प्रवास के विश्लेषण के लिए अन्य मॉडल पहलुओं हमारे मॉडल में लापता के कुछ कवर किया। Astrocytes, pericytes, और / या न्यूरॉन्स के साथ सह-संस्कृति रक्त मस्तिष्क बाधा बेहतर 47 की जटिलता की नकल करने के लिए उपयोग किया जाता। इस तरह के DIV-BBB के रूप में कतरनी बलों सहित मॉडल अधिक शारीरिक स्थितियों को प्रतिबिंबित है, इस प्रकार, लिम्फोसाइट diapedesis 48 का एक और अधिक परिष्कृत विश्लेषण सक्षम करने से। सारांश में, हम मानव रक्त मस्तिष्क बाधा पार गुणात्मक और मात्रात्मक लिम्फोसाइट diapedesis की जांच के लिए उपयुक्त एक आसानी से सुलभ तकनीक प्रस्तुत करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

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