Análisis de linfocitos extravasación El uso de una * These authors contributed equally

Immunology and Infection

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Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

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Abstract

extravasación de linfocitos en el sistema nervioso central (SNC) es fundamental para la vigilancia inmune. alteraciones relacionadas con la enfermedad de extravasación de linfocitos podrían dar lugar a cambios fisiopatológicos en el SNC. Por lo tanto, la investigación de la migración de linfocitos en el SNC es importante entender las enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central y para desarrollar nuevos enfoques de terapia. Aquí presentamos un modelo in vitro de la barrera sangre-cerebro humano para estudiar la extravasación de linfocitos. células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC) se cultivan confluently en un tereftalato de polietileno poroso transwell insertar para imitar el endotelio de la barrera sangre-cerebro. La función de barrera es validado por zonula occludens inmunohistoquímica, la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) mediciones así como el análisis de evans permeación azul. Este modelo permite la investigación de la diapedesis de los subgrupos de linfocitos raros tales como CD56 CD16 brillante dim / - las células NK. Ademmineral, los efectos de otras células, citocinas y quimiocinas, alteraciones relacionadas con la enfermedad, y regímenes de tratamiento distintos sobre la capacidad migratoria de los linfocitos puede ser estudiado. Por último, el impacto de los estímulos inflamatorios, así como diferentes regímenes de tratamiento en la barrera endotelial pueden ser analizados.

Introduction

la migración de linfocitos de la sangre a los tejidos es crucial para la vigilancia inmune. Una secuencia de interacciones moleculares específicas asegura sitio extravasación específico en el intestino delgado, piel, ganglios linfáticos, el sistema nervioso central (SNC), y otros tejidos 1. Las alteraciones en la migración de linfocitos están implicados en la fisiopatología de una serie de enfermedades de amplia difusión 2. Migración en la inmuno-privilegiado CNS está estrechamente regulada y, en consecuencia alteraciones de este proceso están involucrados en las enfermedades relacionadas con el SNC como la encefalomielitis 3, neuromielitis óptica, derrame cerebral y la esclerosis múltiple (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Por lo tanto, es importante estudiar la extravasación de linfocitos para entender mejor la fisiopatología de la enfermedad y el desarrollo de herramientas para una mejoramiento del terreno de carga 8, 9, 10, 11, 12 enfermedad.

Los linfocitos migran al SNC a través de rutas distintas. La extravasación a través de las vénulas postcapilares en el espacio subaracnoideo a través de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo dentro del plexo coroideo y través de la barrera sangre-cerebro se han descrito 1, 13, 14, 15. La migración a través de la barrera sangre-cerebro se lleva a cabo por la interacción de los linfocitos con las células endoteliales 14. En contraste a las células endoteliales en la periferia, las células endoteliales de la CNS expresan altas cantidades de moléculas de unión estrecha, con lo estrictamente limitando la cantidad de células y proteínas capaces de cruzar la barrera sangre-cerebrolass = "xref"> 16. resultados inflamación en el aflojamiento de las uniones estrechas e induce la expresión de moléculas de adhesión; por lo tanto, la mejora de la migración de linfocitos en el SNC 1, 17, 18.

La extravasación a través de la barrera sangre-cerebro es un proceso de múltiples pasos. Linfocitos de sujeción para las células endoteliales y luego rodar a lo largo del endotelio en un proceso mediado principalmente por las selectinas 1, 15. Posteriormente, las interacciones entre las quimiocinas secretadas por el endotelio y los respectivos receptores de quimioquinas expresados en los linfocitos inducen cambios conformacionales de las integrinas, promoviendo así la adhesión firme a las células endoteliales 1. Finalmente, los linfocitos o bien arrastre a lo largo de la barrera endotelial contra el flujo de sangre antes de transmigrando en el espacio perivascular, o detener inmediatamente y directamente transmigrate en el sitio de la firma de la adhesión 1, 19, 20. Todos estos pasos de extravasación de linfocitos pueden ser analizados in vitro usando técnicas distintas 21. Time-lapse microscopía de vídeo se utiliza para estudiar la inmovilización inicial y 15 de rodamiento. Ensayos de adhesión proporcionan información detallada acerca de la detención firme endoteliales barreras 22. Ensayos de transmigración como se demuestra aquí permiten el análisis de la transmigración de células inmune 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Uso de la humana en sangre modelo in vitro de barrera cerebro, recientemente hemos podido demostrar que un Migr mayorcapacidad Atory de CD56 CD16 brillante dim / - células NK en comparación con su CD56 dim CD16 + homólogos se reflejó por un predominio de este subconjunto de células NK en el compartimento intratecal 21. Por lo tanto, nuestra configuración experimental parece ser adecuado para imitar la situación in vivo.

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Protocol

1. Cultivo celular de cerebro humano Las células endoteliales microvasculares (HBMEC)

  1. Recubrimiento de matraces de cultivo celular
    1. Para preparar la solución de fibronectina, añadir 10 ml de PBS a un tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir 150! L fibronectina y mezclar bien.
    2. Para cubrir la parte inferior de un frasco de cultivo de células T-25 Añadir 2 ml de la solución de fibronectina. Incubar el matraz de cultivo de células durante al menos 3 h a 37 ° C en la incubadora. Matraces recubiertos de fibronectina se pueden almacenar durante 2 semanas a 37 ° C / 5% de CO2.
  2. La siembra y cultivo de células de HBMEC
    1. solución de fibronectina Aspirar desde el fondo del matraz de cultivo celular. Añadir 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² en suspensión en 6 ml ECM-b medio (= ECM-b suplementado con 5% de suero bovino fetal, 1% de penicilina / estreptomicina y 1% de suplemento de crecimiento endotelial celular). Incubar a 37 ° C / 5% de CO2. Compruebe el crecimiento celular diariamente utilizando un microscopio.
    2. Cambiar el medio cada 3 días.Recoger o de células de división, cuando HBMEC alcanzan aproximadamente 80% de confluencia. HBMEC se debe utilizar entre el paso 1 y 15 para evitar la pérdida de propiedades fisiológicas.
  3. Cosecha HBMEC.
    1. Preparar Accutase solución mezclando Accutase (1x) con PBS en una proporción de 1: 1. Mantenga Accutase solución a 37 ° C en un baño de agua hasta su uso posterior.
    2. Transferencia ECM-b medio del matraz de cultivo celular a un tubo de centrífuga de 15 ml. Lavar HBMEC mediante la adición de 5 ml de PBS a la parte inferior del frasco de cultivo celular. Aspirar PBS y repetir la etapa de lavado dos veces más.
    3. Añadir 2 ml de solución pre-calentado Accutase. Incubar a 37 ° C durante 2 min. Después, HBMEC se resuspenden tocando firmemente el matraz de cultivo de células varias veces. desprendimiento de células se controla mediante un microscopio
    4. El ECM-b-medio almacenado previamente en un tubo de 15 ml se añadió de nuevo al matraz de cultivo celular tan pronto como se inicia HBMEC a separar. Enjuague el fondo del matraz varias veces hasta que la mayoría son HBMECre-suspendido.
    5. Transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y las células en 1 ml ECM-b medio resuspender. Recuento de células y diluir la suspensión de células para alcanzar una concentración final de 3 x 10 5 HBMEC por ml ECM-b medio.

2. Preparación de la Célula de Cultura Inserts

  1. Recubrimiento de insertos de cultivo celular
    Nota importante: Evitar tocar la membrana de los insertos de cultivo celular.
    1. Añadir 100! L solución de fibronectina (véase 1.1.1) para cada inserto de cultivo celular (Figura 1A) y un pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano (control óptico también). Incubar durante al menos 3 h a 37 ° C. Después de solución de incubación aspirado de fibronectina.
    2. Añadir 100 ml HBMEC suspensión a los insertos de cultivo celular y el control óptico también. Añadir 600 l ECM-b medio para el compartimiento inferior de la célulainsertos de cultivo. Incubar durante 3 - 4 días a 37 ° C / 5% de CO 2 hasta integridad de la barrera (Figura 1B) se alcanza, comprobar el crecimiento celular por evaluación microscópica de la HBMEC en el control óptico también. Nota: No se recomienda el crecimiento celular más allá de cuatro días.
    3. Opcional: Para imitar las condiciones inflamatorias Aspirar el medio desde el compartimiento inferior y reemplazarlo con ECM-b medio suplementado con 500 U / ml de IFN-γ / TNF-α 24 h antes el ensayo de migración.

3. Control de Calidad con azul de Evans en el Día del ensayo de transmigración

  1. Preparación de solución de azul de Evans
    1. Para preparar PBS / B27 mezcla de solución 10 ml de PBS con 200 l suplemento B27 usando un tubo de centrífuga de 15 ml. Diluir la solución madre de azul de Evans (20 mg / ml PBS) 1: 1000 con PBS / B27.
  2. ensayo de permeabilidad azul de Evans
    1. Aspirar el medio desde el compartimiento inferior seguido por el compartimiento superiorde un inserto de cultivo celular que contiene un confluente HBMEC monocapa. Añadir 100! L de solución de azul de Evans al inserto de cultivo celular.
    2. Añadir 600! L de PBS / B27 para el compartimiento inferior y se incuba durante 60 min a 37 ° C / 5% de CO2. Retire cuidadosamente la inserción de cultivo celular utilizando fórceps.
  3. medición de azul de Evans
    1. Retirar PBS / B27 desde el compartimiento inferior y transferir 100! L cada uno a dos pocillos de una poliestirol negro placa de 96 pocillos de fondo plano. Inserte la placa en un lector de placa Tecan Pro Infinito M200 y determinar z-posición óptima.
    2. Medida de excitación de azul usando ajustes respectivos Evans (por ejemplo: excitación: 620 nm, emisión: 680 nm, ancho de banda de excitación: 9 nm, ancho de banda de emisión: 20 nm, la mejora 175x, 25 parpadea, el tiempo de integración: 20 mu s).
    3. Para determinar las funciones de barrera HBMEC comparar datos adquiridos con una curva patrón que representa evans permeación azul a través HBMEC en diferentes puntos de tiempo después de semillacélulas ING (Figura 1B, derecha).

4. Ensayo de migración

  1. Preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
    1. Añadir 10 ml de RPMI en un tubo de centrífuga de 15 ml y añadir 200 l suplemento B27. Recuento de células PBMC y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Vuelva a suspender PBMC a una concentración final de 5 x 10 6 células / ml RPMI / B27.
  2. Puesta en marcha del ensayo de migración
    1. Medio Aspirar desde el compartimiento inferior seguido por el compartimiento superior de los insertos de cultivo de células que contienen confluente HBMEC monocapas (Figura 1A). Por donante añadir 100 l PBMC suspensión cada uno para los insertos de cultivo celular y también a un pocillo de una placa de 24 pocillos por (control in vitro).
    2. Añadir 600! L RPMI / B27 para el compartimiento inferior de los insertos de cultivo celular y 500 l a la PBMC del control in vitro y se incuba 6 horas a 37 ° C / 5% de CO2.
    3. La recolección de migrada PBMC
      1. Extraer el inserto de cultivo celular utilizando fórceps y enjuagar cuidadosamente la parte inferior con 400 l de PBS sin tocar la membrana. Desechar el inserto de cultivo celular.
      2. Añadir 20 l fluoroesferas de recuento de flujo (aproximadamente 1.000 cuentas / ml) al compartimento inferior del cultivo celular insertan así como para el control in vitro y se mezclan bien. Transferir 1 ml de resultante suspensión de PBMC a la citometría de flujo tubos.

    5. Citometría de Flujo

    1. preparación de la muestra
      1. Centrifugar PBMC a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
      2. Preparar la solución de anticuerpo mediante la adición de anticuerpos conjugados con fluorocromo a 100! L de tampón citometría de flujo (/ EDTA mM PBS / 1% BSA 2) por muestra. Para los resultados presentados a continuación 1 l CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 l CD56-PC7, 1 l CD8-A700, y 1 l CD16-A750 se utilizaron por muestra.
      3. Resuspender PBMC en 100 l de la solución de anticuerpo y se incuba durante 30 min a 4 ° C.
      4. Añadir 250! L de tampón de citometría de flujo y se centrifuga a 300 xg durante 5 min.
    2. la adquisición de muestras
      1. Vuelva a suspender PBMC en la cantidad requerida (varía dependiendo de la citómetro de flujo utilizado) de citometría de flujo de tampón.
      2. Adquirir manchado PBMC usando un citómetro de flujo con un detector activo entre 525 y 700 nm de longitud de onda para detectar fluoroesferas de recuento de flujo (excitación 488 nm, emisión de 525 - 700 nm).
        (Los pasos siguientes son un ejemplo si se usa un flujo Gallios citómetro operado con software Kaluza G:. (1) Iniciar el equipo (2) Cuando el sistema operativo se ha cargado completamente, inicie el citómetro de flujo pulsando la tecla "citómetro en" botón . (3) Cargar el protocolo de adquisición respectiva pulsando el botón "protocolo abierto". (4) seleccione el protocolo requerido y seleccione "abrir". (5) Duplicar el protocolo para cada muestra haciendo clic con el derechobotón del ratón sobre el protocolo visible en el carrusel virtual y un clic izquierdo en el campo "duplicado". (6) Etiqueta de cada muestra en la lista de muestras. (7) Transferir las muestras a las posiciones indicadas del carrusel y comenzar la adquisición.)
    3. análisis de las muestras
      1. Abrir flujo resultante citometría de datos utilizando el software respectivo. Determinar el número de subpoblaciones de interés para transmigrado PBMC así como las células de los pocillos de control in vitro y fluoroesferas de recuento de flujo usando el software de análisis respectiva.
        (Un ejemplo de la estrategia de gating se da en la parte resultados (Figura 1 C: Para analizar la transmigración de los subconjuntos de células NK, primero seleccionar linfocitos en un canal de dispersión lateral (SSC) frente hacia adelante canal de dispersión parcela (FSC) Los linfocitos son. a continuación, muestran en una CD3 frente trama CD56 y CD56 + CD3 -. se seleccionan las células NK Para distinguir entre subconjuntos de células NK, las células NK se muestran enuna parcela CD56 frente a CD16 y CD56 CD16 brillante dim / - las células NK, así como CD56 dim CD16 + se seleccionan. Además, fluoroesferas de recuento de flujo se seleccionan de una parcela FSC frente a SSC y, posteriormente, se muestra en una parcela de un canal con una emisión entre 525 y 700 nm frente al tiempo para determinar su número).
      2. Para calcular el número total de células de cada muestra, normalizar el número detectado de las células usando fluoroesferas de recuento de flujo:
        Ecuación
      3. Determinar el porcentaje de células migradas como la relación entre el total de células migradas y las células totales en el control in vitro.

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Representative Results

Se muestran los resultados representativos que muestran transmigración de las células NK y subconjuntos de células T utilizando el hematoencefálica modelo de barrera humana (Figura 1A). La integridad de la monocapa HBMEC fue validado por tinción de la molécula de unión estrecha mediciones de resistencia eléctrica transendotelial (TEER) ZO-1, y evans permeación azul (Figura 1B). Después de 3 - 4 días de cultivo HBMEC expresa la molécula de unión estrecha ZO-1 (Figura 1B, izquierda). Además, HBMEC creció en monocapas que exhiben resistencia transendotelial eléctrica (Figura 1B medio), así como la reducción de la permeación para azul de Evans (Figura 1B, derecha). HBMEC monocapas se utilizaron para estudiar la transmigración de las células NK incluyendo CD56 CD16 brillante dim / - y CD56 dim CD16 + subconjuntos de células NK y células T, incluyendo las células como dos ex CD4 + y CD8 + Tamples (Figura 1D + E, respectivamente). El porcentaje de células migradas se calculó basándose en los recuentos de células obtenidos por citometría de flujo y normalizados fluoroesferas usando recuento de flujo como un control interno (Figura 1C). La monocapa HBMEC se estimuló con IFN-γ y TNF-α 24h antes del ensayo para imitar las condiciones inflamatorias. la estimulación de citoquinas resultó en aumento de la migración de todas las poblaciones de linfocitos analizados. Esto podría ser debido a un aumento de la expresión de moléculas de adhesión incluyendo ICAM-1 (datos no mostrados). CD56 CD16 brillante dim / - células NK mostraron una capacidad migratoria superior en comparación con su CD56 dim CD16 + NK a través de ambos no estimulada (10,88% vs. 0,86%) y IFN-γγ / TNF-α estimulado (18,22% vs. 2,94%) HBMEC (Figura 1D). Sin embargo, el aumento relativo de la transmigración como resultado de la inflamación fue mayor para el CD56 dim CD16 + frente a + 167% para CD56 CD16 brillante dim / -). Estos resultados imitan las observaciones in vivo que CD56 CD16 brillante dim / - las células NK se enriquecen en el compartimento intratecal. Por lo tanto, el modelo de barrera hematoencefálica parece ser adecuado para analizar principios básicos de la diapedesis de células inmune de las poblaciones de linfocitos raros en el SNC 21. Por último, la capacidad transmigratoria de CD4 y CD8 subconjuntos de células T se muestra (Figura 1E).

Figura 1
Figura 1: migración diferencial de los subconjuntos de células NK a través de no inflamada e inflamada HBMEC monocapas. A. Una imagen de insertos transwell (izquierda) y la ilustración de la configuración experimental (derecha). B. Validación de las funciones de barrera HBMEC. Izquierda: tinción inmunohistoquímica de la mol unión estrechaecule ZO-1 de conejo anti-humano ZO-1 (Abcam, 1: 200) y de cabra anti-IgG de conejo-Cy3 (1: 300) en HBMEC cultivado durante 3 días. Centro: resistencia transendotelial eléctrica (TEER) de HBMEC entre el día 2 y el día 4 de cultivo. Derecha: curva estándar para evans permeación azul para HBMEC con la estimulación ( "inflamado", rojo) o sin ( "no inflamada", negro) con 500 U / ml de IFN-γ y TNF-α por 24 horas. ensayos de transmigración se llevan a cabo 72 - 96 horas después de la siembra de la HBMEC (flecha negro). CE. PBMC derivado de 16 individuos sanos se sometieron a ensayos de migración como se describe en la sección de protocolo. 24 h antes del ensayo, la mitad de los insertos de cultivo de células se estimularon con 500 UI / ml de IFN-γ y TNF-α. se recogieron las células transmigradas y se analizaron por citometría de flujo. C. Resultados representativos para PBMC derivan desde el control in vitro bien (parte superior) y después de la migración a través de HBMEC no inflamada (parte inferior). cel NK ls fueron cerrada a partir de linfocitos totales como CD3 - células CD56 + y distingue además en CD56 CD16 brillante dim / - ( "CD56 brillante ") y CD56 dim CD16 + (" CD56 dim") subconjuntos de células NK. fluoroesferas de recuento de flujo ( "perlas") fueron cerrada basado en FSC características / SSC y se determinó su número en un FL3 frente al tiempo. Cálculos a modo de ejemplo para determinar el porcentaje de células CD56 brillante y CD56 dim NK migradas se muestran a la derecha. D. Porcentaje de células NK migrados, así como CD56 brillante y CD56 subconjuntos de células NK tenue, y E. porcentaje de células T migrado incluyendo CD4 + y subconjuntos de células T CD8 + siguientes transmigración a través de no inflamada (negro) o inflamada (rojo) HBMEC representa como media ± SEM. Los valores de P se calcularon mediante la prueba t de Student pareado; ** p <0,01, *** p <0,001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí presentamos una técnica para investigar la transmigración de los linfocitos a través de la barrera sangre-cerebro humano. El análisis in vitro de la migración de linfocitos al SNC es importante para estudiar los procesos básicos de la extravasación de linfocitos, posibles alteraciones relacionadas con la enfermedad, y los nuevos enfoques terapéuticos.

Varias modificaciones del modelo de barrera hematoencefálica son posibles. Por ejemplo, las células del compartimiento superior podrían ser analizados para investigar la composición de la población de células no migradas. Además, el tratamiento de la monocapa HBMEC con IFN-γ y TNF-α 24 horas antes del ensayo se puede utilizar para imitar una barrera sangre-cerebro inflamado con el fin de estudiar el efecto de los trastornos del SNC inflamatorias 21, 25. Del mismo modo, el tratamiento de HBMEC o linfocitos con otras sustancias permite la investigación de sus efectos sobre la extravasación de linfocitos (por ejemplo, suefecto sobre las moléculas de adhesión) 30, 31. La participación de ciertas moléculas de adhesión puede ser estudiada usando anticuerpos bloqueantes para las integrinas o sus ligandos 32. Además, la configuración experimental presentado aquí permite el análisis de los efectos quimiotácticos de las quimiocinas o sobrenadantes derivados de astrocitos u otras células 33, 34. Sustitución de HBMEC con células epiteliales derivadas del cerebro humano primarios amplía el espectro de esta configuración experimental para la investigación de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo 15. HBMEC no debe ser sustituido con células endoteliales inmortalizadas o células derivadas de otros órganos para mantener CNS-especificidad del modelo. Sin embargo, las células endoteliales cerebrales derivados de otras especies pueden ser utilizados para analizar la transmigración en los animales respectivos 35. Además, el ácido retinoico o hidrocortisone se han descrito para aumentar las funciones de barrera y por lo tanto podrían emplearse 36, 37. En el caso de los números de células limitado la cantidad de células sometidas al ensayo podría reducirse, ya que nuestro modelo proporciona tasas de recuperación lineal entre 2 x 10 5 y 1 x 10 6 PBMC (datos no mostrados). Para analizar poblaciones de células raras siguientes transmigración podría ser necesario a las células de la piscina desde varios pozos con el fin de obtener células suficientes requeridas para citometría de flujo. Por último, nuestra configuración experimental también podría ser utilizado para estudiar la administración de fármacos en el SNC 38. Un tamaño de poro de 3 micras se utiliza típicamente para permitir que la transmigración de linfocitos, mientras que un tamaño de poro de 0,4 micras impide la transmigración de linfocitos, pero permite estudiar la administración de fármacos 39, 40, 41, 42.

43. La centrifugación de HBMEC a fuerzas g bajos y el uso de los primeros pasajes (es decir,

Aunque la adherencia con el protocolo descrito aquí asegura resultados significativos y reproducibles, esta técnica tiene algunas limitaciones. En primer lugar, in vivo la barrera sangre-cerebro está formado por un número de células, que interactúan de diversas maneras y reforzar la función de barrera al afectar a la formación de uniones estrechas 1. Por lo tanto, aunque este modelo de barrera hematoencefálica es una buena aproximación de la situación in vivo, aspectos importantes faltan. Además, la extravasación de linfocitos en el SNC a través de la barrera sangre-cerebro es un proceso de múltiples pasos. Mientras que cada solo paso puede ser investigado por separado, la técnica que aquí se presenta no proporciona información sobre la que sele proceso de extravasación bajo la influencia de fuerzas de cizallamiento 2, 44, 45, 46. Finalmente, el análisis de células migradas de PBMC puede ser un reto en función de la frecuencia de las células de interés, porque por lo general sólo frecuencias de un solo dígito de células transmigran. Por lo tanto, la separación de las poblaciones de interés antes del ensayo o la agrupación de células migradas a través de múltiples insertos de cultivo celular podría ser necesario. Otros modelos para el análisis de la migración de leucocitos en el SNC cubren algunos de los aspectos que faltan en nuestro modelo. Co-cultivo con astrocitos, pericitos, y / o las neuronas se utilizan para imitar la complejidad de la barrera sangre-cerebro mejor 47. Los modelos que incluyen fuerzas de cizallamiento, tales como DIV-BBB reflejan más las condiciones fisiológicas, por lo tanto, lo que permite un análisis más sofisticado de diapedesis de linfocitos 48. En resumen, presentamos una técnica fácilmente accesible para la investigación de la diapedesis de linfocitos cualitativa y cuantitativa a través de la barrera sangre-cerebro humano.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

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References

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