प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Biochemistry

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Summary

गठनात्मक लचीलापन प्रोटीन समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस के साथ साथ, हम समय-संकल्प लिया electrospray ionization जन त्वरित संरचनात्मक परिवर्तन है कि आदेश दिया और अव्यवस्थित प्रोटीन में समारोह ड्राइव की जांच के लिए हाइड्रोजन ड्यूटेरियम विनिमय के लिए युग्मित स्पेक्ट्रोमेट्री के उपयोग का वर्णन।

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Lento, C., Zhu, S., Brown, K. A., Knox, R., Liuni, P., Wilson, D. J. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. J. Vis. Exp. (122), e55464, doi:10.3791/55464 (2017).

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Abstract

आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन (आईडीपी) लंबे समय से स्थिर माध्यमिक संरचना तत्वों की कमी की वजह से संरचनात्मक जीव के लिए एक चुनौती की गई है। हाइड्रोजन-Deuterium एक्सचेंज (HDX) तेजी से समय पैमाने पर मापा विशिष्ट संरचनाओं और हाइड्रोजन संबंध नेटवर्क है कि संक्षेप में भर जाती है पता लगाने के लिए, देशी टुकड़ियों में क्षणिक conformers के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता अनुकूल है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए HDX के युग्मन उच्च संवेदनशीलता, कम नमूना खपत और प्रोटीन आकार पर कोई प्रतिबंध सहित कई प्रमुख लाभ, प्रदान करता है। इस तकनीक को पिछले कई दशकों में काफी उन्नत हुई है, मिलीसेकंड समय पैमाने पर HDX लेबलिंग बार पर नजर रखने की क्षमता भी शामिल है। इसके अलावा, एक अम्लीय प्रोटीज microreactor आवास एक microfluidic मंच पर HDX कार्यप्रवाह को शामिल करके, हम पेप्टाइड स्तर पर गतिशील गुण स्थानीय बनाना करने में सक्षम हैं। इस अध्ययन में, समय-समाधान किया electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (TRESI-एमएस) HDX वा के लिए युग्मितरों ताऊ प्रोटीन में अवशिष्ट संरचना का एक विस्तृत चित्र, साथ ही गठनात्मक बदलाव hyperphosphorylation पर प्रेरित प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया।

Introduction

पिछले कई दशकों में, महत्वपूर्ण प्रगति प्रोटीन संरचना और गतिशीलता 1, 2, 3, 4 को मापने के लिए तैयार किया गया है विश्लेषणात्मक तकनीकों के विकास में किए गए हैं। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी प्रोटीन संरचना निर्धारित करने के लिए सिद्धांत उपकरण बना रहता है, वहीं प्रोटीन की उच्च सांद्रता की जरूरत है और व्यापक अनुकूलन विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल का उत्पादन करने के लिए आवश्यक है। इस तरह के मेम्ब्रेन-संबंधी और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के रूप में प्रोटीन, जो कि मणिभ के लिए मुश्किल हैं, प्रतिष्ठित हाइड्रोजन ड्यूटेरियम विनिमय (HDX) एनएमआर 5 से अध्ययन किया गया है। हालांकि, हाल के दशकों में, electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-एमएस) HDX के युग्मन तेजी से लोकप्रियता 6, 7 हासिल की है।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक समाधान प्रदान करता हैएक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर से उत्पन्न प्रतिबंध के कई करने के लिए। विशेष रूप से, एमएस अत्यधिक संवेदनशील (माइक्रोन आवश्यक सांद्रता के एनएम), और प्रोटीन आकार पर कोई सीमा लगभग होती है। इसके अलावा, एमएस विश्लेषण के उच्च कर्तव्य चक्र प्रोटीन का अध्ययन कर के रूप में वे एंजाइमी कारोबार, misfolding, complexation और अन्य जैविक रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाओं से गुजरना करने की संभावना के लिए अनुमति देता है। इन प्रक्रियाओं अक्सर दूसरी बार पैमाने पर करने के मिलीसेकंड पर पाए जाते हैं और विश्लेषण करने से पहले अभिकर्मकों का तेजी से मिश्रण की आवश्यकता है।

2003 की अनुमति दी प्रतिक्रियाओं में समय-समाधान किया electrospray ionization (TRESI) विल्सन और Konermann द्वारा के विकास ईएसआई-एमएस द्वारा छद्म वास्तविक समय में नजर रखी जा करने के लिए। उनके सेटअप एक लगातार समायोज्य प्रतिक्रिया चैम्बर मात्रा 8 के साथ एक केशिका मिक्सर शामिल किया। डिवाइस संकीर्ण अंतर-capillar भीतर मिश्रण के लिए अनुमति देने के लिए दो संकेंद्रित केशिकाओं, भीतरी केशिका सील और एक पायदान अपने पक्ष में कटौती के साथ होते हैंभीतरी केशिका (आमतौर पर 2 मिमी) के अंत तक निशान से y अंतरिक्ष। HDX प्रयोगों के लिए आवेदन किया है, भीतरी केशिका ब्याज की प्रोटीन वहन करती है, बाहरी केशिका लेबलिंग डी किया जाता है 2 हे समाधान है, जो तब प्रोटीन के साथ समायोज्य प्रतिक्रिया कक्ष HDX लेबलिंग के लिए अनुमति प्रवेश करने से पहले पूर्व सीधा हस्तांतरण करने के लिए ईएसआई में मिश्रण की प्रक्रिया स्रोत।

संक्षेप में, HDX रीढ़ एमाइड समाधान 9, 10 में ड्यूटेरियम परमाणुओं के साथ आदान-प्रदान के दौर से गुजर हाइड्रोजन पर निर्भर करता है। विनिमय आधार उत्प्रेरित शारीरिक पीएच पर, एसिड कटैलिसीस नीचे पीएच लगभग 2.6 में प्रचलित होता जा रहा है। पीएच, तापमान, विलायक पहुंच और इंट्रामोलीक्युलर हाइड्रोजन संबंध: विनिमय की दर चार मुख्य कारकों पर आधारित है। के रूप में पूर्व दो कारकों प्रयोग, विनिमय की दर, विशेष रूप से पेप्टाइड रीढ़ एमाइड स्थानों पर में स्थिर रखा जाता है, मुख्य रूप से dependen हैप्रोटीन संरचना 11 पर टी। कसकर α-हेलिक्स और β-शीट में व्यापक, स्थिर हाइड्रोजन संबंध नेटवर्क के साथ क्षेत्रों मुड़ा हुआ छोरों और अव्यवस्थित क्षेत्रों (और कभी कभी बिल्कुल नहीं) 12 की तुलना में काफी धीमी दर पर ड्यूटेरियम तक लगेंगे। यह वैश्विक प्रोटीन विश्लेषण, के लिए अनुमति देता है जहां संरचना में अव्यवस्थाएं (जैसे।, एकत्रीकरण या सब्सट्रेट बंधन पर) ड्यूटेरियम तेज (चित्रा 1) भिन्न करने के लिए नेतृत्व।

गतिज केशिका मिक्सर ड्यूटेरियम तेज के स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटियोलिटिक चैम्बर युक्त एक microfluidic मंच में शामिल किया जा सकता है। यह प्रोटियोलिटिक कक्ष आदेश में प्रभावी रूप विनिमय प्रतिक्रिया बुझाने के लिए में कम पीएच में आयोजित, और आदेश स्थानीय पेप्टाइड्स (चित्रा 2) में प्रोटीन को पचाने में में एक स्थिर एसिड प्रोटीज की आवश्यकता है। दूसरी बार तराजू को मिलीसेकंड पर निगरानी रीढ़ आदान प्रदान के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैमुश्किल भीतर गठनात्मक परिवर्तन के लक्षण वर्णन पाश क्षेत्रों, पिघला हुआ ग्लोबुलेस और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन (आईडीपी) 13, 14 चिह्नित करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, TRESI-HDX भी प्रोटीन है कि वर्तमान में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर के तरीकों के माध्यम से एक हल परमाणु संरचना की जरूरत नहीं है चिह्नित करने के लिए, COREX एल्गोरिथ्म (DX-COREX) दृष्टिकोण 15, 16 के लिए युग्मित ड्यूटेरियम विनिमय का उपयोग किया जा सकता है। इस विस्तृत प्रोटोकॉल, ताऊ, एक आईडीपी का अध्ययन करने में दोनों यह मूल रूप है और साथ ही यह रोगजनक hyperphosphorylated राज्य है TRESI-HDX लागू होगी। जबकि देशी ताऊ सबसे अच्छी तरह से अध्ययन विस्थापितों में से एक है, थोड़ा अपने amyloidogenic समकक्ष 13 के बारे में जाना जाता है।

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Protocol

नोट: उपयोग करने से पहले कृपया सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। पाली (मिथाइल methacrylate) की लेजर पृथक (PMMA) द्वारा निर्मित धुएं विषाक्त हो सकता है। सुनिश्चित करें कि लेजर उकेरक एक काम वेंटिलेशन सिस्टम से जुड़ा है रहो। जब microfluidic युक्ति इंजीनियरिंग नियंत्रण (धूआं हुड, तेजधार कंटेनर) और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के उपयोग सहित (सुरक्षा चश्मा, चेहरे का मास्क, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूरी लंबाई पैंट बंद पैर की अंगुली जूते,) के निर्माण के सभी उचित सुरक्षा अभ्यासों का प्रयोग करें। यह उच्च निष्पादन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) ग्रेड अभिकर्मकों जब भी संभव हो उपयोग करने के लिए, एसीएस ग्रेड या अधिक की सभी अस्तित्व के साथ विश्लेषण के दौरान हस्तक्षेप दूषित पदार्थों को कम करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है।

1. microfluidic युक्ति की तैयारी

  1. PMMA microfluidic मंच का निर्माण
    1. एक मानक PMMA ब्लॉक (8.9 x 3.8 x 0.6 सेमी) और प्राप्त एक proteo अभिकर्मकों शुरू करने के लिए एक इनपुट चैनल लेजर काटकर अलग करना,lysis कक्ष, और एक आउटपुट चैनल एक लेजर उकेरक 17, 18 का उपयोग कर।
      नोट: एक लम्बी अंडाकार (30 x 5 x 0.05 मिमी) में प्रोटियोलिसिस कक्ष खोदना। इनपुट और आउटपुट चैनल PMMA ब्लॉक के अंत तक विस्तार करने और आदेश में एक 30 गा केशिका समायोजित करने के लिए कोई बड़ा दोनों चौड़ाई और गहराई में सुक्ष्ममापी 75 होना चाहिए।
    2. एक 1/64 "मोटी कट ऑफ डिस्क के साथ एक रोटरी उपकरण का उपयोग कर लगभग 10 सेमी प्रत्येक के दो टुकड़ों में एक 30 गा स्टेनलेस स्टील धातु केशिका काटें। केशिकाओं के सिरों (यह एक के तहत देखने से मदद की जा सकती सम करने के लिए sandpaper का उपयोग करें प्रकाश सूक्ष्मदर्शी)।
    3. नक्काशी की गयी पाली (मिथाइल methacrylate) ब्लॉक में केशिकाओं एक टांका लोहे का उपयोग कर पिघल। इनपुट चैनल स्वचालित सिरिंज पंप से जोड़ा जाएगा, और आउटपुट चैनल एमएस में युग्मन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. सतत-फ्लो समय-समाधान किया काइनेटिक मिक्सर का निर्माण
    1. प्राप्त एक जुड़े हुएसिलिका ग्लास केशिका (आईडी: 75 सुक्ष्ममापी, आयुध डिपो: 150 सुक्ष्ममापी) लगभग 40 सेमी की, और यह लगभग 15 सेमी की एक 28 गा स्टेनलेस स्टील धातु केशिका में डालें। प्रतिक्रिया समय की आवश्यकता के आधार पर, एक बड़ा आईडी के साथ एक लंबे समय तक बाहरी धातु केशिका या एक का उपयोग करें।
      नोट: धातु केशिका की 'सही' भीतरी व्यास का निर्धारण सही प्रतिक्रिया समय प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक एचपीएलसी के लिए धातु केशिका संलग्न द्वारा किया जा सकता है, हालांकि केशिका विलायक बहने, और वापस दबाव रिकॉर्डिंग। भीतरी व्यास गणना करने के लिए एक backpressure बनाया जा सकता है, और धातु केशिका का सच भीतरी व्यास निर्धारित। यह आण्विक वजन कैलक्यूलेटर सॉफ्टवेयर (Windows संस्करण 6.49 के लिए) का उपयोग कर की गणना की जा सकती है।
    2. भीतरी कांच केशिका के एक छोर पर कम शक्ति लेजर उकेरक सेटिंग्स का उपयोग कर एक 2 मिमी पायदान का उत्पादन और भीतरी कांच केशिका (चित्रा 2) के इस अंत सील। वैकल्पिक रूप से, एक चीनी मिट्टी कांच capillar का उपयोग कर पायदान बनानेy कटर उपकरण या जुर्माना काटने ब्लेड के साथ एक रोटरी ग्राइंडर।
    3. लाइन अप धातु केशिका के अंत के साथ भीतरी कांच केशिका (यह एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे देखने से मदद की जा सकती)।
    4. मिश्रण टी के एक छोर (चित्रा 2) को यह गतिज मिक्सर देते हैं।
    5. मिश्रण टी पर गतिज मिक्सर के विपरीत छोर को लगभग 40 सेमी की (150 सुक्ष्ममापी:: 75 सुक्ष्ममापी, आयुध डिपो आईडी) एक जुड़े हुए सिलिका ग्लास केशिका देते हैं। यह प्रतिक्रिया बुझाने के लिए एसिड (5% एसिटिक एसिड, पीएच 2.4) वितरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
      नोट: अभिकारक स्वचालित अर्क पंपों का उपयोग के माध्यम से polytetrafluoroethylene (PTFE) टयूबिंग गैस तंग सीरिंज के साथ डिवाइस के लिए आपूर्ति की जाती है।
  3. पेप्सिन एक्टिवेशन
    1. सुअर आमाशय mucosa से पेप्सिन की 20 मिलीग्राम बाहर वजन और युग्मन बफर (0.1 एम सोडियम फॉस्फेट, 0.15 एम NaCl, पीएच 6.0) के 1 एमएल में यह रोक देते हैं।
    2. , एन -hydroxysuccinimide (एनएचएस) -activated agarose मोती के 50 मिलीग्राम बाहर वजन फिर से रों में जोड़ेंuspended प्रोटीज और धीरे रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर बारी बारी से।
    3. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर नीचे स्पिन राल इकट्ठा करने के लिए।
    4. अनबाउंड प्रोटीज Aspirate।
    5. बफर (1 एम Tris-एचसीएल, पीएच 6.0) को बाधित करने के 1 एमएल में agarose सेते हैं और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर धीरे बारी बारी से।
    6. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर नीचे स्पिन राल इकट्ठा करने के लिए।
    7. अवरुद्ध बफर aspirate।
    8. 1 से 5 के एमएल% एसिटिक एसिड, 5 मिनट के लिए 2.4 पीएच के साथ पेप्सिन-agarose सेते हैं।
    9. राल इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर नीचे स्पिन।
    10. सतह पर तैरनेवाला Aspirate।
    11. दोहराएँ 1.3.8 कदम - 1.3.10 तीन धोने के लिए कुल।
    12. लंबी अवधि के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एसिटिक एसिड में मोतियों की दुकान।
  4. डिवाइस विधानसभा
    1. एक बाँझ लेपनी का उपयोग कर 5% एसिटिक एसिड में सक्रिय पेप्सिन-agarose मोती के घोल के साथ प्रोटियोलिसिस चैम्बर भरें।
    2. PMMA microfluidic platfor रखेंएक कवर डिवाइस सील करने के लिए के रूप में दो खाली PMMA ब्लॉकों के बीच में मीटर, एक तरल तंग सील बनाने के लिए सिलिकॉन रबर के साथ पंक्तिवाला।
    3. डिवाइस दबाव सील करने के लिए धातु clamping प्लेट का प्रयोग करें।
      नोट: क्लैंप कस्टम आदेश microfluidic मंच फिट करने के लिए बनाया गया था और 10.1 सेमी x 7.4 सेमी x 1.2 सेमी को मापने के दो प्लेटों से बना है।
    4. 10 μL / मिनट की दर से 5% एसिटिक एसिड, पीएच 2.4 प्रवाह। 1 μL / मिनट की दर से 50 मिमी अमोनियम एसीटेट बफर (पीएच 6.9), हालांकि प्रोटीन लाइन प्रवाह।
      नोट: यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि एसिटिक एसिड लगातार प्रयोग के पूरी तरह भर डिवाइस के माध्यम से बह रहा है। सुनिश्चित करें कोई लीकेज देखते हैं और उस तरल पदार्थ केवल उत्पादन चैनल है, जो ईएसआई स्रोत के रूप में काम करेगा से बाहर निकलने की जाती है कि।
    5. युगल एक संशोधित quadrupole समय के उड़ान (क्यू टीओएफ) बड़े पैमाने पर एक समायोज्य अछूता मंच का उपयोग कर इष्टतम electrospray की स्थिति प्राप्त करने के लिए स्पेक्ट्रोमीटर के सामने के छोर के लिए डिवाइस।
      नोट: एक बाईपास स्विचआदेश में एक वाणिज्यिक ईएसआई स्रोत की उपस्थिति अनुकरण में शुरू की है। 17

2. समय संकल्प लिया electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज

  1. पेप्सिन का अधिग्रहण और प्रोटीन केवल स्पेक्ट्रा
    नोट: ईएसआई-एमएस अधिग्रहण 5000-4500 के एक वोल्टेज के साथ सकारात्मक आयन मोड में किया जाता है, 60 वी declustering संभावित और 250-वी संभावित ध्यान केंद्रित। स्पेक्ट्रा 1 s की स्कैनिंग दर के साथ 350-1,500 मीटर / z की एक सीमा से अधिक अधिग्रहण कर रहे हैं -1।
    1. एक पेप्सिन केवल स्पेक्ट्रम हासिल। एक बार प्रोटीन जोड़ा जाता है इस स्पेक्ट्रम में प्रदर्शित होने के किसी भी चोटियों घटाया जाता है।
    2. 1 μL / मिनट जहां 50 मिमी अमोनियम एसीटेट बफर पहले से बह रहा था की दर से 50-100 माइक्रोन ताऊ / phospho-ताऊ प्रोटीन (शुद्ध और 19 के रूप में पहले से 13 में वर्णित तैयार) परिचय दें।
    3. एक प्रोटीन केवल स्पेक्ट्रम हासिल।
  2. अधिग्रहण ओच समय अंक
    1. 100 माइक्रोन ताऊ / phospho-ताऊ प्रोटीन 1 μL / मिनट बह रहा है, वहीं एक टी कनेक्टर के माध्यम से 3 μL / मिनट की दर से विकास 2 हे लागू करने और गतिज मिक्सर में प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देते हैं। स्पेक्ट्रम के अधिग्रहण से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए संतुलित करने के लिए प्रणाली के लिए अनुमति दें।
      नोट: विनिमय के बाद, लेबलिंग प्रतिक्रिया 10 μL / मिनट एसिटिक एसिड पीएच 2.4 के प्रवाह और लेबल प्रोटीन के पाचन से ठंडा है प्रोटियोलिटिक कक्ष में पाया जाता है।
    2. आदेश, लेबलिंग समय को बढ़ाने के लिए मैन्युअल रूप से 8 रों 42 एमएस के समय मिश्रण प्राप्त करने के लिए आंतरिक गिलास केशिका की स्थिति वापस खींचने में। प्रत्येक पुल वापस के बीच में कम से कम 10 मिनट के लिए संतुलित करने के लिए प्रणाली के लिए अनुमति दें।

3. डेटा और सांख्यिकी विश्लेषण

  1. पेप्टाइड्स की पहचान करना और Deuterium एक्सचेंज का प्रतिशत गिना जा रहा है
    1. एमएस स्पेक्ट्रा mMass सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण प्रदर्शन करना, संस्करण 5.5.0 20
    2. ExPASy FindPept प्रोटिओमिक सर्वर का उपयोग कर पेप्टाइड्स की पहचान करें और टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) ने इस बात की पुष्टि जब 21 की आवश्यकता है।
      नोट: यहाँ, ड्यूटेरियम तेज समावेश समस्थानिक वितरण विश्लेषण 22, 23 के लिए एक आंतरिक विकसित FORTRAN सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा गया था।
    3. स्फीयर वेब उपकरण 22, 24 का उपयोग कर प्राथमिक अनुक्रम के आधार पर सैद्धांतिक आंतरिक दरों की गणना।
    4. एकल घातीय गैर रेखीय प्रतिगमन का उपयोग कर डेटा फ़िट और एक रेखांकन और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर (जैसे, SigmaPlot) का उपयोग कर सामान्य बनाते हैं।
      नोट: के अनुपात कश्मीर पूर्णांक / k ओ बीएस पैदावार संरक्षण फैक्टर (पीएफ), डिग्री है कि एक विशेष क्षेत्र गठनात्मक कलाकारों की टुकड़ी के भीतर संरचित है की एक अर्द्ध मात्रात्मक माप।

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Representative Results

देशी और phospho-ताऊ के पाचन प्रोफाइल समान थे क्रमश: 77.1 और 71.7% की एक अनुक्रम कवरेज उपज। प्रत्येक पेप्टाइड की ड्यूटेरियम तेज मूल्यों उत्पन्न सैद्धांतिक वितरण के साथ मनाया समस्थानिक वितरण फिटिंग एक इन-हाउस विकसित FORTRAN सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। सबसे अच्छा फिटिंग वितरण जुड़े ड्यूटेरियम तेज मानों के साथ (चित्रा 3a) दिखाए जाते हैं। तेज गतिज प्रोफाइल तो उत्पन्न कर रहे हैं, और अच्छी तरह से एक घातीय भाव से वर्णित किया गया। 3 या उससे अधिक लेबलिंग समय पर मनाया सभी पेप्टाइड्स के लिए काइनेटिक प्रोफाइल (एन = 3) विश्लेषण किया गया। मनाया तेज मूल्यों के लिए ये एक घातीय फिट प्रत्येक पेप्टाइड के लिए विनिमय दर लगातार कश्मीर ओ बीएस उपज। यह प्राथमिक-अनुक्रम पर निर्भर "यादृच्छिक तार" आंतरिक दर स्थिर कश्मीर पूर्णांक की तुलना में है। गणना पीएफ (के पूर्णांक / k </ em> ओ बीएस) 1.52 रों में देशी और hyperphosphorylated ताऊ (चित्रा 4) के प्रतिनिधि संरचनाओं पर मैप किया गया है।

जैसी उम्मीद थी, कोई PFS सामान्य रूप से पुष्टि है कि देशी ताऊ दर्शाती कमजोर आंतरिक हाइड्रोजन संबंध माध्यमिक संरचना तत्वों के साथ जुड़े रेंज में देखे गए हैं। महत्वपूर्ण सुरक्षा एन और सी टर्मिनी, केंद्रीय डोमेन और एकत्रीकरण की आशंका वाले (मैं और द्वितीय hexapeptides) क्षेत्रों (चित्रा 4) में मनाया जाता है। 1.52 रों के बाद, प्रोटीन का 90% पूर्ण विनिमय 2 मिनट के तहत में होने वाली साथ deuterated है।

देशी प्रोटीन इस मामले में amyloidogenic hyperphosphorylated राज्य है, जहाँ हम प्रोटीन भर में ड्यूटेरियम तेज में एक सामान्य वृद्धि का निरीक्षण बदले राज्य की तुलना में किया जा सकता है,। वहाँ N- और सी टर्मिनी पर और एच 2 क्षेत्र में उल्लेखनीय वृद्धि कर रहे हैं। तेज में सामान्य वृद्धि ग का समर्थन करता हैपरिकल्पना है कि hyperphosphorylation प्रोटीन एक विस्तारित संरचना को अपनाने के लिए कारण बनता है urrent। दो hexapeptides से एच 2 ड्यूटेरियम तेज में सबसे ज्यादा वृद्धि, देशी राज्य में सबसे अत्यधिक संरक्षित क्षेत्रों में से एक होने hyperphosphorylated राज्य में लगभग कोई सुरक्षा के लिए से पता चलता है। यह पता चलता है कि एच 2 डोमेन के प्रदर्शन amyloidogenesis लिए महत्वपूर्ण है। दूसरी ओर, क्षेत्रों तेज में कमी का प्रदर्शन के कुछ S352 के लिए Q124 के लिए L114, और G326 फैले क्षेत्रों में शामिल हैं। बाद के क्षेत्र दोहराने डोमेन सूक्ष्मनलिका जुड़े R3 और R4 क्षेत्रों से मेल खाती है। नवगठित अवशिष्ट संरचना के इस खंड में पहले के अध्ययन का प्रदर्शन hyperphosphorylated ताऊ सूक्ष्मनलिका बाध्यकारी 25 एक कम संबंध है कि के साथ सहमत हैं। क्षेत्र Q124 के लिए L114 फैले पेचदार संरचना के लिए एक महत्वपूर्ण प्रवृत्ति होने के रूप में मूल राज्य की पहचान की है, और तेज में कमी सेको के एक उच्च व्याप्ति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है hyperphosphorylated राज्य में ndary संरचना।

आकृति 1
चित्र 1. एक प्रोटीन HDX के दौर से गुजर मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करने से पहले के योजनाबद्ध चित्रण। ब्याज की प्रोटीन ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी 2 हे) के घोल में पतला है, अस्थिर रीढ़ हाइड्रोजन समय के साथ ड्यूटेरियम साथ आदान-प्रदान करने के लिए अनुमति देता है। अत्यधिक गतिशील क्षेत्रों में तेजी से आदान-प्रदान करेंगे, और दूसरी बार पैमाने पर करने के मिलीसेकंड पर निगरानी की जानी चाहिए। अन्य अधिक कठोर माध्यमिक संरचनाओं युक्त क्षेत्रों और धीरे धीरे आदान-प्रदान करेंगे। विनिमय प्रतिक्रिया एसिड (2.4 पीएच) है, जो भी प्रोटीन एक एसिड प्रोटीज (जैसे, पेप्सिन) के साथ पाचन के लिए अनुमति करेंगी साथ बुझाने से समाप्त हो जाता है। पाचन प्रोटीन के विभिन्न क्षेत्रों में ड्यूटेरियम तेज के स्तर localizes। दुबला "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. प्रायोगिक TRESI-इस HDX एमएस के लिए सेट अप। गतिज मिक्सर का एक विस्तृत विवरण नीचे दिखाया गया है। मिक्सर दो संकेंद्रित केशिकाओं, एक बाहरी धातु केशिका भीतर एक आंतरिक जुड़े सिलिका ग्लास केशिका से बना है। एक पायदान एक खामियों को दूर अंत के साथ भीतरी केशिका के अंत से 2 मिमी किया जाता है, निशान से बाहर निकलें और भेजे ड्यूटेरियम साथ मिश्रण करने के लिए प्रोटीन की इजाजत दी। इस गतिज मिक्सर एक मिश्रण टी से जुड़ा हुआ है। मिक्सर के विपरीत दिशा में, (2.4 पीएच) एक चैनल 5% एसिटिक एसिड पहुंचाने जुड़ा हुआ है। प्रतिक्रिया के शमन के बाद, deuterated प्रोटीन प्रोटियोलिसिस कक्ष क्रम पेप्टिक पेप्टाइड्स का उत्पादन करने में पेप्सिन-agarose मोती के साथ पैक होकर गुजरता है। बाहर का केशिका एक ईएसआई स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है।es / ftp_upload / 55,464 / 55464fig2large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. देशी और hyperphosphorylated प्रोटीन से चयनित पेप्टाइड्स के लिए गतिज भूखंडों के लिए कच्चे डेटा से ठेठ कार्यप्रवाह। (क) चार पेप्टाइड्स (स्तंभ) के लिए कच्चे स्पेक्ट्रम की भविष्यवाणी की समस्थानिक वितरण करने लगे हैं तीन अलग अलग समय अंक (पंक्तियाँ) में ड्यूटेरियम तेज की% निर्धारित करने के लिए। (ख) बनाम प्रत्येक पेप्टाइड (ठोस लाइन) के लिए समय% ड्यूटेरियम तेज की गतिज भूखंडों मनाया कश्मीर ओ बीएस निकालने के लिए किया। सभी पेप्टाइड्स के लिए काइनेटिक भूखंडों 3 या उससे अधिक लेबलिंग बार में देखा गया (n = 3), त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व एसई गणना "यादृच्छिक कुंडली" प्रोफाइल (बिंदीदार रेखा) की तुलना के लिए दिखाया गया है। झू एट अल से reproduced। अनुमति के साथ 8।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. HDX प्रोटेक्शन फैक्टर डेटा (क) मूल पूरी लंबाई ताऊ और (ख) hyperphosphorylated ताऊ के प्रतिनिधि संरचनाओं पर मैप किया। hyperphosphorylated ताऊ की संरचना VADAR का उपयोग कर बाद में शोधन के साथ FRODAN अनुकरण का उपयोग कर बनाया गया था। के रूप में कथा (बाएं) में दिखाया गया है सुरक्षा कारकों में से डिग्री एक इंद्रधनुष योजना के रूप में रंग के होते हैं। झू एट अल से reproduced। अनुमति के साथ 8। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जबकि इस तरह के एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर के रूप में संरचनात्मक जीव विज्ञान के तरीकों फायदेमंद है क्योंकि वे प्रोटीन की अत्यंत विस्तृत संरचनाओं प्रदान कर रहे हैं, इन चित्रों को अक्सर स्थिर रहे हैं। क्षणिक प्रजातियों और दुर्बलता से संरचित डोमेन के लक्षण वर्णन है जब इन पारंपरिक तरीकों का अध्ययन मायावी बना हुआ है। इसलिए, सिस्टम के इन प्रकार पर गतिशील जानकारी पहुंचाने के लिए में यह तेजी से समय पैमाने पर काम करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम सफलतापूर्वक एक स्थानीय peptidic स्तर पर एक अच्छी तरह से अध्ययन किया आईडीपी के भीतर होने गठनात्मक परिवर्तन पर विस्तृत जानकारी प्राप्त करने के लिए TRESI-इस HDX एमएस आवेदन किया है। इस तकनीक के लिए महत्वपूर्ण सीमाओं की है कि पेप्सिन एक unspecific प्रोटीज है और, अपने दम पर, शायद ही कभी पूरी अनुक्रम कवरेज पैदा करता है। एक तरह से अनुक्रम कवरेज और विशिष्टता बेहतर बनाने में मदद करने के लिए पाचन कक्ष 26 को एस्परजिलस saitoi से प्रोटीज प्रकार तेरहवें गठबंधन करने के लिए है।

ऐसा नहीं है कि महत्वपूर्ण हैपाचन कक्ष आदेश में प्रभावी रूप विनिमय प्रतिक्रिया बुझाना और बैक-विनिमय 11 की मात्रा को कम करने के लिए प्रयोग की सम्पूर्णता के दौरान 2.4 के पीएच पर रखा जाता है। यह आवश्यक है कि किसी भी प्रोटियोलिसिस चरणों और बाद में विश्लेषण के रूप में जल्दी से जल्दी किया जाए। पिछले अध्ययनों से पाचन कक्ष के आकार अनुकूलित और व्यवस्था कमरे के तापमान 22 पर नगण्य स्तर (≤5%) करने के लिए पीठ के आदान-प्रदान का स्तर रखने के लिए प्रवाह की दर का सुझाव दिया है। यह सलाह दी जाती है कि चैम्बर के आकार कोई इस प्रोटोकॉल के भीतर सूचीबद्ध आयाम से बड़ा है। एक उच्च संरचित प्रोटीन नहीं दूसरी बार पैमाने पर करने के मिलीसेकंड पर ड्यूटेरियम के महत्वपूर्ण स्तर तक ले जाएगा और समय प्रोटियोलिसिस चैम्बर द्वारा अनुमति में पचाने के लिए कठिन हो जाएगा। इस तरह के प्रोटीन इस तकनीक का इस्तेमाल अध्ययन के लिए अनुशंसित नहीं हैं।

हम टी के लिए 50 मिमी अमोनियम एसीटेट बफर (पीएच 6.9) के उपयोग की अनुशंसा करते हैंवह प्रोटीन नमूना, नहीं सभी प्रोटीन इस एकाग्रता या पीएच मान के साथ संगत हो जाएगा। यह प्रोटीन का पीआई ध्यान दें, और समायोजित बफर तदनुसार ऊपर या नीचे कम से कम 1 pH इकाई होने के लिए महत्वपूर्ण है। यह है कि प्रोटीन आवश्यक सतह प्रभार उचित तह के लिए आवश्यक है सुनिश्चित करने और एकत्रीकरण कर पाएगा। अमोनियम एसीटेट की एकाग्रता बढ़ती आदेश घुलनशीलता बढ़ाने के लिए एकत्रीकरण का खतरा प्रोटीन के लिए सिफारिश की है, फिर भी सांद्रता 500 से ऊपर मिमी से परहेज किया है।

TRESI-इस HDX एमएस सबसे अच्छा बड़े पाश क्षेत्रों, पिघला हुआ ग्लोबुलेस या क्षणिक माध्यमिक संरचना तत्वों 22 से बना प्रणालियों के लिए लागू किया जाता है। इसके अलावा, इस तकनीक को विभिन्न आर्थिक फायदे हैं के रूप में यह सरल और लागू करने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती है। हाल ही में, दवाओं की खोज और विकास के लिए 27 दवा उद्योग में इस HDX एमएस के उपयोग में भारी उछाल की गई है। पिछले कई दशक के दौरानएस वहाँ जैविक अणुओं की एक तेजी से विकास किया गया है, सबसे विशेष रूप से मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MABS), एफडीए द्वारा अनुमोदित किया जा रहा। छोटे अणु दवाओं की तुलना में, प्रोटीन की उच्च आदेश संरचनाओं और उनकी गठनात्मक गतिशीलता दवा का प्रभावकारिता के निर्धारण में एक बड़ी भूमिका निभाते हैं। इस HDX एमएस सफलतापूर्वक biosimilar एंटीबॉडी 28 के उत्पादन के लिए एक पुष्टिकरण उपकरण, साथ ही एंटीबॉडी प्रतिजन 29, 30, 31, और प्रोटीन ligand बातचीत 32 के लक्षण वर्णन के रूप में इस्तेमाल किया गया है। सॉफ्टवेयर विकास और प्रयोगों के स्वचालन के क्षेत्र में अग्रिम निकट भविष्य में इस तकनीक के विस्तार के लिए अनुमति विश्लेषण समय की गति होगी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(methyl methacrylate) or PMMA Professional Plastics SACR.250CCP 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm
Fused Silica Glass Capillary Polymicro Technologies 106815-0018 ID: 75 µm, OD: 150 µm
Metal Capillaries McMaster-Carr 28 ga – 89875K97
30 ga  - 89875K99
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing IDEX 1477
1548
ID: 0.007”, OD: 1/16”
ID: 0.020”, OD: 1/16”
Standard Polymer Tubing Cutter IDEX A-327 for 1/16” and 1/8” OD tubing
Micro Static Mixing Tee IDEX M-540 for 1/16” OD tubing
or
Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore Valco Instruments Co., Inc. (VICI) ZT1C for 1/16” OD tubing
PEEK Tee for 1/16” OD Tubing IDEX P-727
10-32 Female to Female Luer IDEX P-659
10-32 PEEK Double-Winged Nut IDEX F-300
Ferrule for 1/16” OD Tubing IDEX F-142
100 Series Rotary Tool Dremel F013010001
Cut-Off Discs Jobmate 1/64” thickness
Stereomaster Digital Zoom Microscope Fisher Scientific 12-563-411
Soldering Iron Mastercraft 58-6301-2
VersaLaser Universal Laser
Syringes Hamilton 81220 500 µL capacity
Syringe Pumps Harvard Apparatus 70-4501
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
NHS-Activated Agarose Fisher Scientific 26196
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa Sigma-Aldrich P6887-250MG
Deuterium Oxide Sigma-Aldrich 151882-10X0.6ML
Acetic Acid Sigma-Aldrich 695092-100ML
HPLC Grade Water Fisher Scientific W5-4
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich A7330-500G
Sodium Phosphate Fisher Scientific S369-500
Sodium Chloride Fisher Scientific S671-3
Name Company Catalog Number Comments
Software/Online Tools
CorelDraw X3 Corel
Molecular Weight Calculator Version 6.49 Open Source MS Tool
mMass Version 5.5.0 Open Source MS Tool
ExPASy FindPept Swiss Institute of Bioinformatics
SigmaPlot Systat Software Version 11.0
PyMOL Schrödinger Version 1.5.0.4
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer AB SCIEX

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References

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