포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

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Biology

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Summary

스트레스 과립 (SGs)은 다양한 스트레스에 노출 된 세포에서 형성되는 비 세포 성 세포질 구조입니다. SG는 mRNA, RNA 결합 단백질, 작은 리보솜 서브 유닛, 번역 관련 인자 및 다양한 세포 신호 전달 단백질을 포함한다. 이 프로토콜은 선량있는 SG를 탐지, 특성화 및 정량화하기위한 몇 가지 실험적 방법을 사용하는 워크 플로를 설명합니다.

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Aulas, A., Fay, M. M., Szaflarski, W., Kedersha, N., Anderson, P., Ivanov, P. Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules. J. Vis. Exp. (123), e55656, doi:10.3791/55656 (2017).

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Abstract

세포는 갑작스런 환경 변화로 종종 어려움을 겪습니다. 스트레스 조건에 노출 된 세포에서 형성되는 세포질 리보 뉴클레오타이드 복합체 인 스트레스 과립 (SGs)은 세포 대사 및 생존의 다양한 측면과 연관되어있다. SG는 세포 신호 전달 경로, 전사 후 유전자 발현 및 스트레스 반응 프로그램을 조절합니다. 이러한 mRNA- 함유 과립의 형성은 세포 번역에 직접 연결된다. SG 어셈블리는 억제 된 번역 개시에 의해 유발되고, SG 해체는 번역 활성화 또는 억제 된 번역 신장에 의해 촉진된다. 이 관계는 SG 구성에 의해 더 강조됩니다. 핵심 SG 요소는 번역 사전 개시 복합체, mRNA 및 선택된 RNA 결합 단백질 (RBP)이 정지 된 것입니다. SG 어셈블리의 목적은 번역 적으로 정지 된 하우스 키핑 (housekeeping) mRNA를 격리함으로써 세포 에너지를 보존함으로써 스트레스 반응성 단백질의 향상된 번역을 허용하는 것입니다. additi에서stalled translation preinitiation complexes와 같은 핵심 구성물에 SG는 다른 단백질과 신호 분자를 과다하게 포함하고있다. SG 형성의 결함은 스트레스에 대한 세포 적응을 손상시킬 수 있고 따라서 세포 사멸을 촉진시킬 수있다. SG 및 이와 유사한 RNA 함유 과립은 신경 퇴행성 장애 및 암을 비롯한 다수의 인간 질환과 관련되어있어 RNA 과립 아형의 분류 및 정의에 최근 관심을 갖게되었습니다. 이 프로토콜은 포유류 SG를 특성화하고 정량하기위한 분석을 설명합니다.

Introduction

세포는 스트레스에 반응하는 많은 메커니즘을 사용합니다. 일부 반응은 전사 후 수준에서 일어나며 mRNA 번역 및 / 또는 안정성을 조절하는 것과 관련됩니다 1 , 2 . 스트레스 - 조절 된 mRNA 번역 정지 및 분해는 특이 적 비 막성 세포 초점의 형성과 관련되며, 가장 잘 특징 지어지는 스트레스 과립 (SGs) 3 . SG는 스트레스 ( 예 : 산화, 열 쇼크, 영양 결핍 및 바이러스 감염)에 반응하여 번역 상 체포 된 세포에 비 번역 mRNP를 집중시키는 세포질 초점입니다 4 . 비 번역 mRNA 외에도 SG에는 번역 개시 인자, RNA 결합 단백질 및 다양한 신호 단백질 5가 들어 있습니다. SG는 억제 된 단백질 번역 및 변형 된 RNA 신진 대사의 바이오 마커이며 세포 생존 및 세포 사멸, 신호 전달 경로와 관련되어있다s 및 핵 과정 5 .

SG는 동적 엔티티이며, 그 형성은 셀룰러 변환 6 의 상태와 밀접하게 관련되어 있습니다. 외관상으로 튼튼한 외관에도 불구하고, 대부분의 SG 단백질 성분은 초 단위의 체류 시간으로 빠르게 출퇴근합니다. SG는 몇 시간에서 몇 시간 동안 지속되지만 대부분의 구성 요소는 빠른 속도로 흐릅니다. 번역 개시의 억제와 번역 폴리 소메 우스의 결과적인 분해는 SG의 형성을 촉진한다. 따라서 SG는 번역 폴리 소문과 평형을 이룹니다. 이 polysome / SG 평형은 다른 스트레스 유발 성 초점과 진실 SG를 구별하는 데 중요합니다 6 , 7 .

정지 개시 정지는 mRNA, 번역 개시 인자 (eIF) 및 40S 리보솜 서브 유니트를 함유하는 번역 - 유능한 사전 - 개시 복합체의 전환을 수반한다 o-48S 복합체)를 SGs 4 , 6 으로 통합 할 수있는 번역 상 지연된 복합체 (소위 48S * 복합체)로 전환시키는 것이다. SGs는 48S 복합체 형성의 상류의 2 개의 다른 단계에서 번역 정지에 의해 촉진된다 : 캡 결합 eIF4F 복합체 ( 예를 들어, 그의 eIF4A 서브 유닛을 표적으로하는 것)의 기능과의 간섭 또는 번역 개시 인자 eIF2의 α 서브 유닛의 인산화 4 종의 eIF2 키나아제 중 하나 이상을 포함한다. 정지 된 48S 복합체 ( 즉, 40S 리보솜 서브 유닛 및 선택된 번역 개시 인자)의 존재는 SGs 8 , 9 의 특징이다.

SG는 바이러스 감염, 신경 변성,자가 면역 및 암과 같은 다양한 병리학 적 상태에 연관되어있다 3 , 10 , 11 ,ss = "xref"> 12 , 13 . 몇몇 SG 성분의 돌연변이 형태는 뉴런이 뉴런의 죽음에 적극적인 역할을 할 수있는 세포 내 병적 흠도를 나타내는 신경 퇴행성 질환 ( 예 : 근 위축성 측삭 경화증)과 관련되어있다. 일부 바이러스는 SG 성분을 납치하여 SG 형성을 억제하고 바이러스 복제를 촉진시킵니다 14 . 최근의 연구들은 또한 화학 요법 및 방사선 치료법 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 하에서 SG를 암 15 와 암 세포 생존과 연관시킨다. 이러한 발견이 SG 생물학에 큰 관심을 자극하는 동안, 많은 발표 된 보고서는 선의 SG의 형성을 다른 스트레스 유발 성 초점과 구별하는 중요한 통제가 부족하다.

SG는 처음에 T 세포 세포 내 항원 1 (TIA-1) 및 폴리 -A 결합 단백질 (PABP)을 포함하는 선택된 mRNA- 결합 단백질 (RBP)로 구성된 비 막성 세포질 초점으로 기술되었다; 번역 개시 요인; 폴리아 데 닐화 된 mRNA; 작은 리보솜 서브 유닛 4 , 6 , 21 , 22 . 전통적으로, 그들의 구성은 면역 염색과 형광 tagged 단백질 23 , 24 의 이소성 발현과 같은 기술에 의해 결정되었습니다. 그들의 매우 역동적 인 특성으로 인해, SG 단백질 및 / 또는 mRNA의 면역 로컬 ​​리 제이션은 SGs 23 , 24 를 검출하기위한 정의 방법으로 남아 있습니다. 지금까지 많은 RBP와 다른 단백질 (120 종 이상의 서로 다른 단백질)이 SG 구성 요소 11 로 묘사됩니다. 많은 SG- 지방화 된 단백질은 스트레스 의존성 및 독립적 인 방식으로 이들의 국소화를 변화시키고 다른 세포 내 구획 및 병소에 축적 될 수 있으므로, 정확한 SG 마커를 선택하고 SG를 다른 유형의 스트레스 유도 성 초점. 진실 된 SG는 mRNA, 번역 개시 인자 및 작은 리보솜 서브 유닛을 포함하며 번역과 동적 평형을 이룹니다.

이 간단한 작업 흐름은 스트레스에 의해 유발 된 초점이 진실한 SG인지 여부를 결정하도록 설계되었습니다. 이 워크 플로우에는 U2OS 세포를 사용하는 몇 가지 실험적 접근 방법이 포함되어 있습니다. SG는 SG를 연구하는 데 일반적으로 사용되는 세포입니다. 이 세포들은 큰 세포질을 가지고 비교적 평평하며 유리 커버 슬립에 강하게 부착되어 이상적입니다. SG를 연구하기 위해 다른 세포 유형을 사용할 수도 있지만 타이밍, 약물 농도 및 SG 핵 결정 단백질의 차이가 동질성을 변화시킬 수 있다는 사실을 알고 있어야합니다.상황. 또한 일부 세포는 세포 표면 표백제를 형성하여 파라 포름 알데히드 고정에 반응하여 일부 SG 마커의 점을 찍은 국소화를 유발하는 겉치레 모양을 나타낸다. 신중한 분석 없이는 SG로 잘못 분류 될 수 있습니다. 이것은 스트레스 유발 성 초점을 진실 SG로 식별하는 데 필요한 모든 기준을 평가할 필요성을 강조합니다. SG 22 를 촉진시키는 암 치료제 인 Vinorelbine (VRB)과 강력하고 잘 특성화 된 SG 유도제 인 Sodium Arsenite (SA)가이 프로토콜에서 실험을위한 스트레스로 사용됩니다.

표준 SG에는 세포질 초점에서 공존하는 여러 SG 마커 (단백질과 mRNA 모두)가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 단백질 마커와 polyadenylated mRNA 22 의 국한을 각각 감지하기 위해 immunofluorescence와 형광 in situ hybridization (FISH)을 사용합니다. 간략하게, 간접 면역 형광법은 항체 ( 즉,이자형. 일차 항체)를 세포 내에서 검출 할 수 있습니다. 그런 다음 형광 색소에 부착 된 2 차 항체 (보통 종 특이성)가 1 차 항체를 인식하고 표적 단백질의 위치를 ​​밝혀냅니다. 형광 현미경 검사는 세포 내에서 국부 신호를 감지하는 데 사용됩니다. 다른 종에서 생산 된 항체를 사용하고 색이 다른 2 차 항체로 검출하면 여러 항체의 동시 발현을 검출 할 수있어 단백질 표적이 동일한 위치에서 발견됨을 나타냅니다 23 . 진실 된 SG에서 공존하는 것으로 확인 된 마커를 선택하는 것이 중요합니다.

FISH는 특정 RNA 또는 DNA 서열과 염기쌍을 이루는 표지 된 프로브를 사용합니다 25 . mRNA를 검출하기 위해이 프로토콜은 mRNA의 polyA 꼬리 ( 즉, polyA FI)와 하이브 리다 이즈 (또는 염기쌍)하는 바이오 티 닐화 올리고 (dT) 40 프로브를 사용합니다SH). 그런 다음 streptavidin이 biotin에 대해 높은 친 화성을 가지기 때문에 형광 결합 형 streptavidin을 사용하여 biotinylated probe를 검출합니다. SG를 평가할 때 polyA FISH와 SG marker를 검출하는 immunofluorescence를 결합하는 것이 중요합니다. 실제 SG와 마찬가지로 두 신호가 함께 있어야합니다.

이 프로토콜을 사용하여 colocalization은 여러 가지 방법으로 평가됩니다. 다중 채널 ( 즉, RGB : 적색, 녹색 및 청색) 이미지에서 colocalization은 중첩 신호의 색상을 변경합니다 ( 예 : colocalized 빨간색과 녹색이 노란색으로 나타남). 또한, 각 색의 강도가 주어진 라인 8 , 20 에서 측정되는 라인 스캔 분석을 사용하여 동시 기록이 그래픽으로 정량화됩니다. 이 프로토콜은 ImageJ 26을 사용하는 두 개의 라인 스캔 분석 절차를 설명합니다. 하나의 절차는 수동이며 전체 프로세스를 진행합니다.다른 하나는 매크로를 사용하거나 수동 단계를 자동화하는 간단한 프로그램을 사용합니다. 매크로 절차를 이해하려면 수동 프로그램을 거치는 것이 중요합니다.

SG가 번역이 억제 된 세포에서 형성된다; 따라서 SG가있는 세포는 처리되지 않은 세포에 비해 전체적인 번역 수준이 감소해야합니다. 실험적으로 ribopuromycylation이 사용됩니다. puromycin과 emetine은 고정되기 전에 짧은 기간 동안 세포에 첨가되어 puromycin이 적극적으로 폴리 펩타이드를 형성하게하여 종결을 일으킨다. 재 시술을 막기 위해 emetine을 사용한 치료가 필요합니다 29 . Puromycin은 Anti-Puromycin 항체를 사용하여 검출 할 수 있으며 활성 번역의 스냅 샷을 제공합니다. 이 방법은 빠르고, 특정 아미노산이 결핍 된 배지를 미리 굶주 리지 않아도 (그리고 잠재적으로 세포에 압박을 가하는) 필요가 없기 때문에 사용됩니다.단백질 변환의 세포 내 지방화. "click-it"화학 물질 30 과 결합 된 메티오닌 아날로그 L- 아지도 모아 라 인 (AHA)과 같은 변형 된 아미노산 유사체를 사용하는 다른 방법은 SG를 함유하는 세포가 이웃 세포보다 훨씬 낮은 번역을 나타내는 것을 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나,이 기술은 메티오닌 기아와 15-30 분 동안의 펄스 표지가 필요합니다. 메티오닌 기아 현상은 추가적인 스트레스를 구성하는 반면, 긴 표지 시간 ( 즉, 15-30 분)은 누적 이동보다 누적 이동의 측정을 초래하고 새로 합성 된 단백질이 합성 위치에서 세포. 대조적으로, 리보 푸로 마이신 화는 훨씬 빠르며 포도당 결핍을 통해 SG를 유도하는 데 사용되는 글루코스가없는 배지와 같은 모든 배지와 호환됩니다.

정식 SG는 동적 평형 상태에있다.적극적으로 폴리 소문을 번역합니다. 이것은 polysomes를 안정화 시키거나 불안정하게하는 약물로 시료를 처리하여 SG와 polysomes 사이의 균형을 바꾸어 실험적으로 평가할 수 있습니다 23 . Cycloheximide (또는 유사하게 행동하는 emetine)는 mRNA에 리보솜을 "동결 시킴"으로써 신장을 막아 SG를 형성 할 수있는 유효한 non-polysomal mRNP의 수를 감소시킨다. 실험적으로, 이것은 두 가지 방법으로 사용할 수 있습니다 : SG 생성을 막기 위해 스트레스를 가하기 전에 cycloheximide (또는 emetine)를 첨가하거나 SG가 형성 된 후에 cycloheximide (또는 emetine)를 첨가하여 스트레스를 제거하지 않고도 SG 해체 선발 착물은 서서히 폴리 소메 분획으로 들어간다. 대조적으로 puromycin은 조기 종결을 일으키고 폴리섬 해체를 촉진하여 SG로 조립할 수있는 mRNA 개시 풀을 증가시킵니다. 실험적으로 puromycin 치료는 SG의 수를 늘리거나 threshol을 낮 춥니 다.d는 등급이 매겨진 스트레스 나 약물 복용량에 반응하여 형성됩니다. puromycin의 영향을 평가할 때, puromycin이 약물의 효과를 증가시키고 SG를 나타내는 세포의 비율을 증가시킬 것으로 기대되기 때문에, 관심있는 약물의 최대 이하의 수준을 사용하는 것이 중요합니다. 이것은 약물 / 스트레스는 초기에 세포의 100 %에서 SG를 일으킨다. 이는 SG를 분해하고 세포의 ~ 95 %가 SG를 처음 표시 할 때 가장 잘 작동하여 최대 감소 가능성을 관찰하고 정확하게 정량화 할 수있는 cycloheximide 치료법과 대조됩니다.

이 프로토콜은 포유류 세포에서 SG를 연구하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 방법은 다음과 같습니다 : (1) 추정 SG에서 전통적인 SG- 관련 마커 eIF4G, eIF3b 및 Ras GTPase- 활성화 단백질 - 결합 단백질 1 (G3BP1)을 동정 (colocalization)을 평가하기위한 면역 형광 염색 및 ImageJ 분석; (2) polyadenylated mRNA를 검출하기위한 올리고 (dT) 형광 in situ hybridization (polyA FISH); (3) 스트레스에 의해 유발 된 초점이 폴리 소메 움과 동적 평형에 있는지 여부를 결정하기위한 시클로 헥시 미드 및 푸로 마이신 치료; (4) 추정 SG를 함유하는 세포의 번역 상태를 평가하기위한 리보 푸로 마이신 화. 함께, 이러한 assays는 스트레스에 의해 유발 된 초점이 진실 된 SG로 분류 될 수 있는지 여부를 결정할 수 있습니다.

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Protocol

1. 세포 준비

  1. 그림 1A표시된 대로, 24 웰 플레이트의 12 우물에 autoclaved coverslips을 추가; 이것은 각 coverslip을 데리러 진공에 첨부 된 살균 파스퇴르 피펫을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 부드럽게 우물의 측면에 coverslip을 눌러서 coverslip가 우물에 떨어질 수 있도록 흡입을 해제하십시오.
  2. 플레이트 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteoscomcoma 세포를 최종 용적 500 μL의 배양액에 넣습니다. 플레이트의 측면을 위아래로 여러 번 움직여 셀이 고르게 분포되도록합니다.
  3. 부드럽게 coverslip 깨끗한 P1000 팁 coverslip가 우물의 바닥에 있는지 확인하고 coverslip 아래에 거품이 있는지 확인하십시오.

2. 스트레스 셀

  1. 다음날, 시각적으로 세포가 균등하게 흩어져 있는지 확인하고 커버 슬립을 가로 질러 균등하게 합쳐져 있는지 확인하십시오.mples은 결과의 재현성에 악영향을 줄 수 있습니다. 거꾸로 조직 문화 현미경에 10X 목적을 사용하십시오.
  2. 37 ° C로 매체를 예열하십시오. 차가운 충격이나 열 충격을 일으킬 수 있으므로 찬물 또는 뜨거운 종이를 셀에 가하지 마십시오.
  3. 예열 된 약물에서 약물을 희석하십시오. 각각의 다른 약물 농도에 대해 500 μL의 배지가 포함 된 2 개의 웰을 준비하십시오. pipetting 동안 손실을 허용하기 위해 추가 500 μL를 준비하십시오. 나누어지는 4 개의 튜브, 각각 1.5 mL가 들어 있습니다.
    1. 아비 산 나트륨 : 500 μL를 함유하는 각 웰에 100 mM 아비산 나트륨 (최종 농도 : 100 μM) 1.5 μL를 첨가하거나 100 mM 아질산 나트륨 (최종 농도 : 50 μM) 0.75 μL를 첨가한다.
    2. vinorelbine의 경우 : 500 μL를 함유 한 각 웰에 10 mM vinorelbine (최종 농도 : 150 μM) 22.5 μL를 넣거나 10 mM vinorelbine (최종 농도 : 100 μM) 18.75 μL를 넣으십시오.
      주 : 아질산 나트륨 잘 특성화되고 일반적으로 사용되는 스트레스 과립 유도제이며 따라서 고전적으로 긍정적 인 컨트롤로 사용됩니다.
  4. 웰 B1 - 4와 C1 - 4에서 미디어를 제거하고 버립니다. 약물로 미디어를 추가하고 60 분 (그림 1A)를 기다립니다.
    1. 우물 B1과 B2에 100 μM 아질산 나트륨과 함께 매체 500 μL를 추가합니다. 우물 B3과 B4에 50 μM 아질산 나트륨과 함께 매체 500 μL를 추가합니다.
    2. 우물 C1과 C2 150 μM vinorelbine와 매체의 500 μL를 추가합니다. 우물 C3와 C4에 125 μm의 vinorelbine과 매체 500 μL를 추가합니다.
  5. 고정 30 분 전에 컬럼 2의 우물을 5μL의 시클로 헥시 미드 (1 mg / mL 주식)로 처리하고 컬럼 4의 우물을 2 μL의 퓨로 마이신 (1.25 mg / mL 주식)으로 처리하십시오. 부드럽게 37 ° C 배양기에 다시 접시를 배치하기 전에 혼합 접시를 흔들어.

3. 세포 고정 및 Immunofluorescence

실험에 앞서 메탄올이 -20 ° C로 냉각되었는지 확인하십시오. 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), PBS (5 % 정상 말 혈청 (NHS)) 및 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA )을 PBS에 넣었다.

  1. 미디어를 폐기하고 PBS로 coverslips가 포함 된 우물을 씻으십시오. 사용 된 약물에 따라 마약이 들어있는 매체를 적절하게 버리는 것이 중요합니다. 자세한 지시 사항은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오. 효율적으로 씻으려면 PBS로 쥐어 짜는 병을 채우고 꽉 짜인 흐름이 아닌 부드러운 흐름이 가능하도록 팁을 잘라내고 원래 PBS를 흡입 한 후 각 웰에 PBS를 넣으십시오.
  2. 부드러운 교반하에 RT에서 15 분 동안 4 % PFA ~ 250 μL를 사용하여 세포를 고정. 완전히 PFA로 coverslip의 상단을 커버; 250 μL로 충분해야하지만, 그렇지 않은 경우 추가하십시오. 어떤 세포 (또는 세포의 스트레스 처리)가 부착을 변경할 수 있기 때문에 항상 coverslips에 직접 피펫을 피하십시오.그는 피펫 팅에서 세포를 제거 할 수 있습니다.
  3. PFA를 제거하고 올바르게 버립니다. 파라 포름 알데히드를 올바르게 폐기하는 방법에 대한 자세한 내용은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오.
  4. 메탄올 (-20 ° C) ~ 250 μL를 첨가하고 부드러운 흔들림하에 실온에서 5 분 동안 품을; 이것은 세포를 투과시키고 평평하게합니다.
  5. 제거하고 메탄올을 버리고 4 ℃에서 RT O / N에서 1 시간 동안 5 % NHS ~ 250 μL를 적용하여 세포를 차단하십시오. 메탄올을 올바르게 폐기하는 방법에 대한 자세한 내용은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오.
  6. 일차 항체의 경우 5 % NHS에서 항체를 희석합니다.
    참고 : 여러 SG 마커를 사용하면 관찰 된 알갱이가 진품 SG인지 여부를 확인할 수 있습니다. 사용할 수있는 SG 마커의 수는 현미경에서 사용할 수있는 필터에 따라 다릅니다. 표준 녹색, 적색 및 원적외선 필터 세트를 사용할 수있는 경우 1/250 희석으로 G3BP1, eIF4G 및 eIF3b를 사용하십시오.
  7. PBS로 웰을 3 회 세척하고 5 분 동안 각 세척을 배양한다.
  8. 2 차 항체의 경우 5 % NHS에서 모든 2 차 항체 (1/250 희석)와 Hoechst 염료 (1 / 1,000 희석)를 희석하십시오.
    1. 이 실험 (각각 250 μL 12 coverslips - 총 : 3 % 5 % NHS)에 Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit 및 Cy5-Goat (각각 1/250 희석액)을 12 μL 씩 넣으십시오 Hoechst 염료 3 μL를 넣는다.
    2. RT에서 1 시간 동안 이차 항체와 coverslips을 품어. 이 단계와 다음 단계 동안 상자를 사용하여 플레이트를 덮거나 조직 배양 접시 상단에 호일을 놓아 샘플을 빛으로부터 보호하십시오.
  9. 우리를 씻어 라.각각 5 분 동안 PBS로 3 회 주사합니다.
  10. 마운트 매체를 사용하여 레이블이 붙은 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재하십시오. 10 분 37 ° C 열 블록에서 장착 매체를 가열; 이것은 점성을 감소시키고 피펫을 더 쉽게 만듭니다. 컷 P200 팁, 유리 슬라이드에 coverslip 당 장착 매체 25 μL 피펫; 현미경 스테이지가 이것을 허용한다고 가정 할 때 4-8 coverslips는 하나의 유리 슬라이드에 들어갈 수 있습니다. 미세 포 셉를 사용하여 슬라이드에서 well에서 coverslip을 전송, 설치 매체에 세포 측면을 넣어 있는지 확인하십시오. 깨끗한 P200 팁을 사용하여 coverslip을 누르십시오.
  11. 모든 coverslips가 장착되면 접힌 실험실 조직을 사용하여 슬라이드에 매우 단단히 실험실 조직을 눌러 과도한 장착 매체를 청소합니다. 과도한 장착 매체를 제거하기 위해 H 2 O가 들어있는 짜낸 병을 사용하고 물을 제거하기 위해 접힌 실험실 조직으로 블로 팅을 반복하십시오.

4. 현장에서의 형광 </ em> 하이브리드 화 (FISH)

  1. 단계 1과 2.1-4를 지침으로 사용하여 세포를 처리하고 처리하십시오. 다음 실험에서는 단 3 개의 커버 슬립이 필요하기 때문에 컬럼 1에 세포를 플레이트 할 필요가 있습니다.
  2. 메탄올이 -20 ° C로 냉각되고 모든 완충액이 준비되었는지 확인하십시오 ( 예 : PBS에 4 % PFA, 물에 70 % 에탄올, 2x 염산 - 나트륨 - 시트르산 (SSC) 및 5 % NHS) 하이브리드 화 오븐은 적절한 온도까지 데워진다.
  3. 셀을 씻어 고치려면 3.1-3.3 단계를 수행하십시오.
  4. -20 ° C의 메탄올을 10 분간 첨가하여 세포를 침투시킨다.
  5. 메탄올을 제거하고 70 % 에탄올로 coverslips을 품어. 접시를 4 ° C에서 밤새 두십시오. 증발을 방지하기 위해 파라 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하십시오.
  6. 다음날, 에탄올을 제거하고 2x SSC 500 μL를 추가하여 세포를 재수 화하십시오. RT에서 부드러운 교반과 coverslips를 5 분 품어.
  7. 2x SSC를 제거하고 500을 더하십시오.μL의 2X SSC. 온화한 교반하에 5 분 동안 품어 낸다.
  8. 하이브리드 화 오븐의 바닥에 평행 한 파라핀을 놓습니다. 각 coverslip에 대한 parafilm에 하이브 리다이 제이션 버퍼의 피펫 25 μL. 24 - 잘 접시에서 coverslip을 제거 (이 시점에서, coverslips는 세포 측면입니다) 및 하이브 리다이 제이션 버퍼에 coverslip 셀쪽으로 내려 놓으십시오. 이것을 42 ° C에서 또는 65 ° C에서 15 분 동안 수행하십시오.
    참고 : 65 ° C에서이 단계를 완료하면 세포 RNA가 변성됩니다. 이것은 polyA가 단백질과의 상호 작용에 의해 가리워지면 신호를 향상시킬 수 있습니다.
  9. 하이브 리다이 제이션 버퍼에서 2 ng / μL의 농도로 Biotin-Oligo (dT) 프로브 (100 ng / μL)를 희석하십시오. coverslip 당 25 μL 충분합니다.
  10. 각 coverslip 들어, parafilm에 Biotin - Oligo (dT)를 포함하는 하이브 리다이 제이션 버퍼 25 μL을 피펫. 집게로 coverslip을 들고 부드럽게 초과 커버를 제거하기 위해 실험실 조직에 coverslip의 가장자리를 만지지하이브리드 화 완충액. Biotin - Oligo (dT)와 하이브 리다이 제이션 버퍼 coverslip을 전송; 셀을 아래로 향하게하십시오.
  11. 하이브 리다이 제이션 상자에 coverslips를 넣어 증발을 제한하십시오. 42에서 하이브 리다이 제이션 버퍼에 Biotin - Oligo (dT)와 coverslips를 품어 ° C.
  12. 하이브 리다이 제이션 오븐에 2x SSC를 놓고 42 ° C로 평형을 유지하십시오.
  13. 따뜻하게 2x SSC의 ~ 500 μL를 24-well dish의 well에 넣고 포셉을 사용하여 coverslips를 well로 옮깁니다. 10 분 동안 품어 낸다.
  14. 42 ° C에서 두 번 위 세척 단계를 반복 한 다음 RT에서 두 번 반복합니다.
  15. 3.5-3.10 단계를 완료하여 streptavidin fluorochrome을 사용하여 하나의 일반 항체 대신 Biotin-Oligo (dT)를 검출하십시오.

5. 번역 상태를 평가하기위한 Ribopuromycylation 분석

  1. 1 단계에 표시된대로 coverslips에 U2OS 세포를 플레이트하지만, 조건 당 하나의 coverslip을 플레이트 (이 있음케이스, 3 개의 커버 슬립 : 비 처리, 100 μM 아질산 나트륨, 150 μM vinorelbine) ( 그림 1A).
  2. 2 단계에서 프로토콜을 사용하여 세포에 스트레스를 가하고 2.1-2.4 단계를 완료하십시오.
  3. 고정 전에 5 분 puromycin (주식 : 1.25 밀리그램 / ML, 5 μg / ML의 최종 puromycin 농도를 얻기 위해 500 μL에 희석 2 μL) 2 μL를 추가하고 2.9 μL emetine (주식 : 20 μg / ML; 2.9 μL를 이미 puromycin을 함유 한 동일한 용액에) 0.5 mL를 함유하는 각 웰에 첨가 하였다.
  4. puromycin을 탐지하기 위해 anti-puromycin 항체 (1/1000 희석액)를 사용하여 위의 지시 된대로 3.1-3.10 단계를 완료하십시오. 이상적으로 나머지 채널에는 다른 두 개의 SG 마커를 사용하십시오.
  5. puromycin 신호를 정량화 할 때 동일한 노출을 사용하여 모든 이미지를 촬영하십시오. 가장 밝은 (응력이 가해지지 않은) 샘플을 사용하고 채도없이 가능한 한 밝은 이미지를 촬영하여이 노출을 선택하십시오.
    참고 : 안티 - puromycin 형광 신호의 강도 repres아미노산을 대신하는 퓨로 마이신 (puromycin)으로 진행되는 번역은 초기 단백질에 통합되어 단백질의 조기 종료를 강제합니다.

6. 이미지 수집 및 분석

  1. 스트레스 과립의 정량화
    1. SG를 정량화하기 위해 40X 대물 렌즈를 사용하여 샘플 당 총 100 개 이상의 세포를 3 ~ 5 개의 이미지로 수집합니다. 또는 다른 목표를 사용하여 이미지를 수집하지만 100 개 이상의 셀이 커버 슬립 당 계산되고 배율이 과립을 명확하게 시각화 할 수있을만큼 커야합니다. 커버 슬립을 5 개의 대략 동일한 영역으로 나누고 각 영역에서 임의로 필드를 선택하여이를 수행하십시오 ( 그림 1B ). 동일한 필드의 이미지에는 마커의 동시 표정을 평가하는 모든 채널이 포함되어야합니다.
    2. 모든 이미지를 가져 오면 채널을 병합하십시오. 일부 카메라 소프트웨어는 자동으로이 작업을 수행하지만 다른 작업에서는 수동 병합이 필요합니다. 이것으로 할 수있다.ImageJ를 열어 모든 이미지를 열고 [이미지 | 색상 | 병합 채널].
    3. Hoechst를 핵 마커로 사용하여 핵의 수를 세어 총 세포 수를 수동으로 계산합니다. 셀 당 2 개 이상의 SG를 포함하는 셀 수를 수동으로 계산하십시오.
      참고 : 예를 들어 G3BP1 (녹색), eIF4G (적색) 및 Hoechst (파랑)이 표시된 병합 된 3 채널 이미지를 사용하여 파란색 채널을 사용하여 핵 (또는 셀 수)을 계산합니다. 그런 다음 셀당 2 개 이상의 노란 초점을 가진 것으로 SG 양성 세포를 세십시오. 과립은 G3BP1에서 녹색으로, 노란색으로, colocalized 경우 eIF4G에서 빨간색으로 나타납니다.
    4. 3-5 개의 독립된 지역의 데이터를 결합하여 SG 양성인 세포의 비율을 결정한 후 다음을 계산하십시오 :
      SG 양성의 수 / 핵의 수) * 100 = SG- 양성 세포의 퍼센트
  2. 라인 스캔 분석을 통한 Colocalization 평가 - 수동 방법
    1. 열다ImageJ. ()에서 무료로 다운로드하십시오.
    2. 투자 수익 (ROI) 관리자를 엽니 다 : [분석 | 도구 | ROI 관리자 ...].
    3. ImageJ에서 병합 된 이미지를 엽니 다 : [File | 열다].
    4. ImageJ 도구 모음에있는 선 도구를 사용하여 SG를 통과하는 선을 추가하고 SG 앞뒤에 포함하십시오. ROI 관리자 창에서 [추가]를 클릭하여 ROI 관리자에이 행을 추가하십시오.
    5. 병합 된 이미지를 별도의 채널로 분할하여 과립에 대한 각 표식의 현지화를 평가합니다. [이미지 | 색상 | 채널 분할]; 그러면 병합 된 이미지가 3 개의 흑백 이미지로 분할됩니다.
    6. 흑백 이미지에서 선이 선택되었는지 확인하십시오. 이미지에 나타나면 선이 선택됩니다. 그렇지 않은 경우 ROI 관리자 창에서 패널의 라인을 클릭하십시오. 그러면 ROI 관리자 창에서 파란색 선이 강조 표시되고 흑백 이미지에 선이 표시됩니다. 회선이 여전히 표시되지 않으면 "모두 표시"가 chROI 관리자에서 확인한 다음 이미지의 선을 클릭하십시오.
    7. 선의 강도를 분석합니다 : [Analyze | 플롯 프로파일]; 이것은 "Plot Profile"창을 불러 오며,이 창은 선을 가로 지르는 신호의 강도를 나타냅니다.
    8. "Plot Profile"창에서 [List]를 클릭하면 그래프의 원시 데이터가 들어있는 창이 나타납니다. 이 창에있는 모든 데이터를 복사하여 스프레드 시트 파일에 붙여 넣으십시오. 이렇게하려면 창에있는 모든 데이터를 선택하십시오 : [Edit | 모두 선택]을 선택하십시오. 날짜 복사 : [편집 | 부]. 스프레드 시트 파일을 열고 데이터를 붙여 넣습니다 : [편집 | 풀].
    9. 각 채널에 대해 단계 6.2.6 - 6.2.8을 따로 완료하십시오. 평가중인 채널을 추적하십시오.
    10. 스프레드 시트에서 결과의 선 그래프를 생성합니다. [control] 키를 누르고 각 열의 맨 위에있는 문자를 클릭하여 데이터가 포함 된 열을 선택하십시오. 그런 다음 선 그래프를 선택하십시오 : [Insert | 선 그래프].
    11. mult에 대해이 분석을 반복하십시오.여러 개의 독립적 인 실험에 걸쳐 스트레스 과립.
  3. 라인 스캔 분석으로 Colocalization 평가 - ImageJ Plugin
    1. ImageJ 웹 사이트 (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt)에서 RGB 프로파일 도구를 다운로드하여 설치하십시오. 올바르게 설치되면 빨간색, 녹색 및 파란색 (RGB) 줄 아이콘이 도구 모음에 나타납니다.
    2. ImageJ에서 이미지 ( 예 : Tiff, JPG)를 엽니 다. [File | 열다].
    3. ImageJ 도구 모음에있는 RGB 아이콘을 클릭하십시오.
    4. 클릭하고 드래그하여 인접한 영역을 포함하여 SG를 통해 확장하는 선을 추가합니다. 히스토그램 이미지가 팝업 창에 나타납니다.
    5. 데이터를 이미지로 저장하십시오 : [File | 다른 이름으로 저장 | 사소한 말다툼]. 또는 위에서 6.2.8 단계를 사용하여 다른 그래프 작성 프로그램에서 데이터를 내보내고 그래프로 나타낼 수 있습니다.

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Representative Results

스트레스 유발 초점은 반드시 SG가 아닙니다. SG는 mRNA, 번역 개시 인자 및 RNA 결합 단백질을 포함하고 활성 번역과 평형을 이루는 세포질 초점으로 분류됩니다. 위의 프로토콜은 주어진 응력이 진정한 SG를 유도하는지 여부를 특성화하기위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다.

SGs는 단백질과 mRNA를 포함한 다른 알려진 SG 마커와 함께 국소화됩니다. SA와 VRB는 G3BP1, eIF4G 및 eIF3b를 포함하는 세포질 초점을 유도한다 ( 도 2A ). 이러한 마커의 동시 발색은 라인 스캔 분석 및 증가 된 확대율을 갖는 단일 채널 이미지를 사용하여 확인됩니다 ( 그림 2A ). 또한, 이러한 초점은 polyA FISH로 표시된 Mrna를 포함하고 oligo (dT) 신호는 G3BP1 immunofluorescence 신호 ( 그림 2B )와 colocalizes. 폴리 A-FISH스트레스가 여러 유형의 초점을 촉진 할 수 있으므로 알려진 SG 마커와 신호가 겹칩니다.

SG는 번역이 금지 된 상태에서 발생합니다. ribopuromycylation으로 실험적으로 평가 된 것처럼 VRB와 SA는 모두 번역 상 억압 상태를 촉진합니다 ( 그림 3 ). 선의의 SG는 적극적으로 폴리 소문을 번역하면서 역동적 인 평형을 이룹니다. SA 및 VRB로 유도 된 SG는 CHX로 분해되어 mRNA에서 폴리 소솜을 트랩하여 폴리 소메 드로 분해를 중단시키고 SG를 예방합니다 ( 그림 4A, 4B ). 반대로, puro가 polysome 분해를 촉진하여 SG 형성에 유리하므로 ( 그림 4A, 4C ),보다 많은 SA 및 VRB SG가 puro로 처리 한 후에 유도된다.

요약하면, 양성 대조군 SA와 마찬가지로, VRB는 (1) 공지 된 SG 마커와 함께 (2) 단백질 및 mRNA를 모두 포함하는 진정한 SG를 유도한다 ( Figu re2), (3)은 번역이 억제 된 세포에서 발견되며 (4) 활성 번역과 동적으로 평형을 이룬다 ( 그림 4A-4C ).

그림 1
그림 1 : 실험 다이어그램. ( A ) 표시된대로 이전에 24 잘 접시에 배치 coverslips에 세포를 씨앗. 표시된대로 농도를 사용하여 SA 또는 VRB로 60 분 동안 A 및 B 행을 처리하십시오. 60 분 후 약물 함유 배지에 CHX (최종 농도 : 컬럼 2의 경우 20 μg / mL) 또는 puro (컬럼 4의 경우 20 μg / mL puromycin)를 첨가하십시오. 고정 및 염색하기 전에 추가로 30 분 동안 배양을 계속하십시오. ( B ) 카운트를 위해 이미지화해야하는 필드를 나타내는 coverslip의 다이어그램. coverslip는 5 개의 대략 동등한 지구로 분할된다; 각 영역에서 하나의 이미지가 찍 힙니다."http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg"target = "_ blank">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : SA 및 VRB는 SG 마커 anPoly (A) mRNA를 포함하는 세포질 초점을 유도합니다. ( A ) G3BP1 (녹색), eIF3b (적색) 및 eIF4G (파란색)에 대해 U2OS 세포 immunostained. 세포를 100 μM SA 또는 150 μM VRB로 60 분간 처리하거나 치료하지 않았다 (대조군). 확대 된 영역은 확대 (2X)되고 흑백으로 별도의 채널로 표시됩니다 (아래). 그래프는 영역 (흰색 선) 과립의 라인 스캔 분석을 나타내며 중첩 또는 동일 국화의 정도를 보여줍니다. 눈금 막대는 10 μm를 나타냅니다. ( B ) 면역 염색과 결합 된 PolyA-FISH는 polyA mRNA를 올리고 (dT) 40 프로브 (적색)로 검출하고, G3BP1 (녹색)은 항 -G3BP 항체를 검출하고 핵 DNA는 Hoechst 염료 (청색)를 사용하여 검출한다. 확대 된 영역 (2X), 단일 채널 이미지 및 라인 스캔 분석은 동시 표기를 보여줍니다. 눈금 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : SA 및 VRB 치료 원인 번역 억제. 표시된 치료 후 5 분 동안 puromycin으로 펄스 표지 된 U2OS 세포의 면역 형광. Puromycin (녹색), eIF3b (적색) 및 Hoechst (파란색)로 염색 된 핵 DNA. 세포를 100 μM SA 또는 150 μM VRB로 60 분간 처리하거나 치료하지 않았다 (대조군). 눈금 막대 = 10 μm. 더 큰 내용을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 이온.

그림 4
그림 4 : SA와 VRB는 폴리 소메 움과 동적 평형 상태에있는 세포질 초점을 유도합니다. ( A ) 폴리 사이 / SG 관계를 기술하는 일반적인 계획. ( BC ) U2OS 세포는 G3BP1 (녹색), eIF3b (적색) 및 Hoechst (파란색)를 사용하는 핵 DNA로 염색되었습니다. 세포를 100 μM SA 또는 150 μM VRB로 60 분간 처리하거나 ( B ) CHX (cycloheximide, 20 μg / mL), ( C ) puro (Puromycin, 10 μg / mL)를 첨가하기 전에 처리하지 ), 또는 추가로 30 분 동안 배양하지 않아도된다. 숫자는 대표 실험에서 SG를 가진 세포의 비율에 해당합니다. 스케일 바 = 25 μm, in (BC). 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 버전.

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Discussion

만성 스트레스는 여러 질병에 대한 면역 조직 학적 연구에서 입증 된 바와 같이 다양한 세포 내 초점을 형성합니다. 예를 들어, 대부분의 신경 퇴행성 질환은 불용성 단백질의 세포 내 응집체를 특징으로합니다. 그러한 응집체에서 SG- 관련 단백질의 존재는 그러한 초점이 SG라고 결론을 내리기위한 기초가된다. SG 마커 양성 세포질 초점이 새로운 스트레스 자극으로 치료 된 세포에서 관찰되는 경우에도 유사한 결론이 도출된다. 이 프로토콜은 선의 SG를 식별하는 간단한 워크 플로를 제공합니다.

구성과 동역학의 특성을 포함하여 추정 SG를 확인하기 위해서는 몇 가지 기준을 충족해야합니다. 첫째, SGs는 translational stalled mRNPs를 포함하는 세포질 초점입니다. 따라서, 첫 번째 접근법은 두 가지 현미경 기반 기술, 즉 polyA-FISH 및 IF를 사용하여 조성을 특성화하는 것이다. 물고기는 시각적으로 신뢰할 수있는 방법입니다.SGs와 공존하는 mRNAs. 올리고 (dT) 40 프로브는 스트레스 조건 하에서 SG로 팩킹하는 폴리아 데 닐화 된 mRNA를 검출하는 데 사용됩니다. oligo (dT)는 프로세싱 바디 (PB)의 핵심 구성 요소 인 데 데네 닐화 된 mRNA를 검출하지 않기 때문에, 세포질 초점에서 강력한 oligo (dT) 신호의 존재가 이러한 초점이 SGs. 두 번째 테스트는 다른 SG 마커 ( 예 : G3BP1) ( 그림 2A )와 폴리 (A) 신호의 colocalization을 입증하는 것입니다. 이것은 SG 마커 단백질에 대해 IF를 수행하여 수행됩니다. eIF3b와 eIF4G는 48S * 복합체의 구성 요소로 알려진 번역 개시 인자이고 SG 형성에 G3BP1이 필요하기 때문에 SG 마커 eIF3b, eIF4G 및 G3BP1이 일상적으로 사용됩니다 ( 그림 2B ). 상이한 스트레스가 다른 SG 관련 요인을 SGs로 모으기 때문에 하나 이상의 SG 마커가 필요하다는 것을 강조하는 것이 중요하며, 일부 스트레스는 cSG 형성에 착오가 될 수있는 단백질 응집체.

둘째, SG는 번역 억제 때문에 형성된다. 번역의 억제는 다른 접근법 ( 예 : 전통적 [ 35 S] Met chase labeling)에 의해 감지 될 수 있지만, 리보 푸로 마이신 화가 처리 된 세포에서 진행되는 단백질 번역을 감지 할 때 선호된다. 이 기술은 SG 마커에 대한 표준 면역 형광성과도 호환되므로 개별 세포에서 SG 및 번역 저해 정도를 동시에 모니터링 할 수 있습니다. 그림 3 에서 볼 수 있듯이 SA와 VRB는 모두 SG 형성을 다른 정도로 촉진합니다. SA는 거의 100 %의 세포에서 SG를 일으키는 반면, VRB는 세포의 약 75 %에서 SG 형성을 촉진합니다. SG를 촉진시키는 능력은 번역 저해의 정도와 관련이 있습니다 : 치료되지 않은 세포는 높은 기초 수준의 번역을 가지지 만 SA는 번역을 완전히 억제하지만 VRB만이 partially 번역을 금지합니다 ( 그림 3 ).

셋째, SG는 역동적이고 폴리 소트 번역과 평형을 이룹니다. 스트레스가 가해지기 전에 또는 스트레스와 동시에 cycloheximide로 세포를 치료하면 폴리섬 해체 및 SG 형성을 예방할 수 있습니다. SG를 나타내는 스트레스 셀은 생산적으로 시작될 때마다 polysomes 또는 monosomes에 mRNA를 트랩하여 SG 해체를 시행하기 위해 cycloheximide로 처리 할 수 ​​있기 때문에 SG- polysome 평형은 양방향이다. 중요한 통제는 조기 종결을 촉진하여 신장을 억제하는 puromycin을 사용하여 SG 형성에 사용할 수있는 비 polysomal mRNP의 양을 증가시키는 것입니다. SG에서의 극적인 변화는 SA 또는 VRB 치료가 CHX 또는 puro 치료와 결합 될 때 관찰됩니다 ( 그림 4 ). 따라서 예상되는 SG가 cycloheximide 치료에 해소되었지만 puromycin에 의해 증가되거나 영향을받지 않는지 평가하는 것은 SG 식별에 사용하기위한 중요한 실험적 매개 변수이다양이온. 아주 작고 비 접착력이있는 원발성 골수성 CD34 + 세포에서 emetine-enforcement 된 SG 분해는 성공적으로 cytospinning 32 전에 현탁 된 세포를 처리함으로써 입증되었다.

arsenite는 eIF2-α 인산화를 유도하여 SGs를 유발하는 데 널리 사용되지만 33) 많은 단백질을 표적으로 삼고 여러 신호 전달 경로를 활성화하므로 주의 깊게 적정 해야한다. 상이한 세포주는 아질산 나트륨에 대해 다양한 정도의 감수성을 나타낸다. U2OS는 상대적으로 민감합니다 (100 μM). 반면 COS7, MEF 및 HeLa는 200 μM이 필요합니다. DU-145 6 , 일차 정상 인간 골수 CD34 + 세포 32 , 인간 림프구 36 , 마우스 피질 뉴런 37 및 Huh7 세포 31 은 500-1,000 μM이 필요합니다.

여기에 설명 된 실험 과정을 통해 서로 다른 셀에서 서로 다른 스트레스 하에서 SG를 탐지 할 수 있습니다. 이 워크 플로우의 가장 큰 장점은 간단하고 스트레스 처리 된 세포에서 세포 번역의 동시 프로빙뿐만 아니라 선의 SG의 명확한 검출을 가능하게한다는 것입니다. 이 프로토콜은 U2OS 세포를 사용하지만, 다른 세포주 또는 심지어 일차 세포에 대해서도 개정 될 수 있습니다. 스트레스 과립 연구에 사용되는 최근의 포괄적 인 세포 목록은 review 11 입니다. 약물 처리 당일에 세포의 수는 80 % confluency에 도달하도록 조정해야합니다. 세포가 다르게 반응하기 때문에 약물 치료의 농도와 기간도 조정해야합니다. 또한,이 프로토콜은 24 - 웰 형식으로 설정되어 있지만, coverslips (어떤 크기의) 도금 및 약물 treatme 동안 평평 누워 수있는 모든 크기의 접시 또는 요리로 조정할 수 있습니다nt. SG / PB 마커를 안정적으로 발현하는 세포주는 고 처리량, siRNA 기반 스크린 33 및 생세포 영상 38에 사용 되었습니다. 내재 SG 마커 PABP에 대해 염색 된 HeLa 세포를 사용하여 SG 어셈블리 39를 차단하는 화학적 화합물을 검출하는 이미지 기반 스크리닝을 사용 하였다. 이 워크 플로는 향후 연구 및 응용 프로그램에서 유용 할 것으로 예상됩니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 이바노프 (Ivanov)와 앤더슨 (Anderson) 연구소의 회원들에게 도움이되는 토론과이 원고에 대한 피드백에 감사드립니다. 이 연구는 폴란드의 국립 과학 센터 [UMO-2012 / 06 / M / NZ3 / 00054]를 국립 보건원 (PA)의 GM111700과 CA168872, NSO94918의 PI에게 지원했다. WS는 또한 폴란드에서 과학 및 고등 교육부 (Mobility Plus Program)와 폴란드 - 미국 풀 브라이트 (Fulbright)위원회가 미국에서 자신의 연구를 재정 지원 한 사실을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U-2 OS ATCC ATCC®HTB-96™ Commonly written "U2OS"
Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-013-CV Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red
Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin
Prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F2442-500ml Used to supplement media
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080 Used to supplement media
penicilline streptomycine Sigma P0781-100ml Used to supplement media
24-well plate Costar 3524
lab tissues (kimwipes) KIMTECH SCIENCE 34120
Coverglass for Growth Cover Glasses Fisher Scientific 12-545-82 Autoclaved before use
Keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) Sigma S7400-100G Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine (VRB) TSZ CHEM RS055 Dissolve in water to 10 mM
Puromycin Sigma P9620 Used to assess translation level (ribopuromycylation)
-Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate Sigma E2375 Used in combination with puromycin to assess general translation level
Used to assess SG connection with active translation
-Dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide (CHX) Sigma C4859 Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza / VWR 95042-486 Wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma P6148-500G Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved
Aliquots can be stored at -20 °C for several months
Hazardous, use ventilation
Discard in special waste
Methanol, ACS BDH / VWR BDH1135-4LP Prechill to -20 °C before use
Discard in special waste
Normal Horse Serum (NHS) Thermo Fisher Scientific 31874 Dilute to 5% in PBS
Add sodium azide for storage at 4 °C
Blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC Decon Labs / VWR 89125-188 Dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) Santa Cruz sc-81940 Store at 4 °C
1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300) Santa Cruz sc-11373 Store at 4 °C
1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody Santa Cruz sc-16377 eIF3η is also known as eIF3b
Store at 4 °C
1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody Millipore MABE343 Store at 4 °C
1/1,000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 715-225-150 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C
1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-165-152 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/2,500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 705-175-147 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/250 dilution
Hoechst 33258 solution Sigma 94403-1ML Incubate with secondary antibodies
Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light
-Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-084 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C
1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated Integrated DNA Technologies (IDT) / Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C
Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use
Custom order
hybridation box / / Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom
- prewarm the box prior use
20x SSC buffer Thermo fisher Ambion AM9763 Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)
Store at RT
Wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer Sigma H7033-50ml Block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media home made / Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS
Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT
Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT
Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet
Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C
Parafilm "M" Sigma P7793-1EA
Poly(vinyl alcohol) Sigma P-8136-250G Reagent to make vinol
Glycerol Sigma G5516-100ML Reagent to make vinol
sodium azide Fisher Scientific S2002-5G Preservative agent for blocking solution and vinol
Make a 20% dilution in water

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References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20, (2), 222-226 (2008).
  3. Buchan, J. R. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 11, (8), (2014).
  4. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13, (1), 195-210 (2002).
  5. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci. 38, (10), 494-506 (2013).
  6. Kedersha, N., et al. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. J Cell Biol. 151, (6), 1257-1268 (2000).
  7. Bley, N., et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43, (4), e26 (2015).
  8. Kedersha, N., et al. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell Biol. 212, (7), 845-860 (2016).
  9. Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics. J Cell Biol. 215, (3), 313-323 (2016).
  10. Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. Stress granules, P-bodies and cancer. Biochim Biophys Acta. 1849, (7), 861-870 (2015).
  11. Aulas, A., Van de Velde,, C, Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).
  12. Ivanov, P., Anderson, P. Post-transcriptional regulatory networks in immunity. Immunol Rev. 253, (1), 253-272 (2013).
  13. Wolozin, B. Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease. Discov Med. 17, (91), 47-52 (2014).
  14. Lloyd, R. E. Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, (3), 317-331 (2013).
  15. Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208, (7), 913-929 (2015).
  16. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. (2015).
  17. Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).
  18. Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation. Mol Biol Cell. 18, (7), 2603-2618 (2007).
  19. Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5, (5), 429-441 (2004).
  20. Szaflarski, W., et al. Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation. Oncotarget. 7, (21), 30307-30322 (2016).
  21. Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell. 15, (12), 5383-5398 (2004).
  22. Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol. 147, (7), 1431-1442 (1999).
  23. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  24. Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).
  25. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, (14), 4381-4385 (1982).
  26. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  27. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, (1), 45-57 (2012).
  28. Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells. Methods. 90, 57-64 (2015).
  29. David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells. Histochem Cell Biol. 139, (3), 501-504 (2013).
  30. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13, (7), 897-905 (2010).
  31. Ruggieri, A., et al. Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection. Cell Host Microbe. 12, (1), 71-85 (2012).
  32. Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells. Biochem Biophys Res Commun. 420, (4), 768-774 (2012).
  33. Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat Cell Biol. 10, (10), 1224-1231 (2008).
  34. Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite. Oncogene. 18, (54), 7794-7802 (1999).
  35. Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. Arsenic binding to proteins. Chem Rev. 113, (10), 7769-7792 (2013).
  36. McDonald, K. K., et al. TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1. Hum Mol Genet. 20, (7), 1400-1410 (2011).
  37. Aulas, A., et al. G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA. J Cell Biol. 209, (1), 73-84 (2015).
  38. Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells. J Vis Exp. (87), (2014).
  39. Wippich, F., et al. Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling. Cell. 152, (4), 791-805 (2013).

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