ريويرينغ الخلايا العصبية: طريقة جديدة للتوسع نيوريت سريع والوظيفي اتصال الخلايا العصبية

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يصف هذا الإجراء كيفية البدء بسرعة، وتوسيع وربط نيوريتس نظمت في غرف ميكروفلويديك باستخدام حبات بولي-D- يسين المغلفة ثابتة إلى ميكروبيبيتس أن دليل استطالة النوريت.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Magdesian, M. H., Anthonisen, M., Lopez-Ayon, G. M., Chua, X. Y., Rigby, M., Grütter, P. Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection. J. Vis. Exp. (124), e55697, doi:10.3791/55697 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إصابات الدماغ والحبل الشوكي قد تؤدي إلى العجز الدائم والموت لأنه لا يزال غير ممكن لتجديد الخلايا العصبية على مسافات طويلة وإعادة توصيلها بدقة مع الهدف المناسب. هنا يتم وصف الإجراء لبدء بسرعة، استطالة، وعلى وجه التحديد ربط الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات طويلة. معدلات التمدد التي تحققت تصل إلى أكثر من 1.2 ملم / ساعة، 30-60 مرات أسرع من معدلات الجسم الحي من الأسرع محاور الأسرع نموا من الجهاز العصبي المحيطي (0.02 إلى 0.04 ملم / ساعة) 28 و 10 مرات أسرع مما سبق ذكره لنفس نوع الخلايا العصبية في مرحلة مبكرة من التنمية 4 . أولا، تزرع مجموعات معزولة من الخلايا العصبية الحصين الفئران لمدة 2-3 أسابيع في الأجهزة ميكروفلويديك لوضع بدقة الخلايا، مما يتيح سهولة ميكرومانيبولاتيون والتكاثر التجريبية. المقبل، يتم وضع الخرز المغلفة مع بولي- D- يسين (بدل) على نيوريتس لتشكيل لاصق كونتوتستخدم ميكروومانيبولاتيون ماصة لنقل الناتج حبة نيوريت معقدة. كما يتم نقل حبة، فإنه يسحب نيوريت جديدة التي يمكن أن تمتد على مئات من ميكرومتر ومتصل وظيفيا إلى خلية الهدف في أقل من 1 ساعة. هذه العملية تمكن استنساخ التجريبية وسهولة التلاعب في حين تجاوز الاستراتيجيات الكيميائية أبطأ للحث على نمو العصبية. تظهر القياسات الأولية المعروضة هنا معدل نمو الخلايا العصبية تتجاوز بكثير تلك الفسيولوجية. الجمع بين هذه الابتكارات يسمح للإنشاء الدقيق للشبكات العصبية في الثقافة مع درجة غير مسبوقة من السيطرة. بل هو طريقة جديدة تفتح الباب أمام مجموعة كبيرة من المعلومات والأفكار في نقل الإشارات والاتصالات داخل الشبكة العصبية وكذلك كونها ملعبا فيها لاستكشاف حدود نمو الخلايا العصبية. التطبيقات والتجارب المحتملة على نطاق واسع مع آثار مباشرة على العلاجات التي تهدف إلى إعادة ربط نيورونال الدوائر بعد الصدمة أو في الأمراض العصبية التنكسية.

Introduction

الإصابات في الجهاز العصبي المركزي الكبار (نس) قد يؤدي إلى إعاقة دائمة بسبب آليات متعددة تحد من نمو محور عصبي 1 . بعد الإصابة، العديد من المحاور العصبية الجهاز العصبي المركزي لا تشكل مخروط نمو جديد وتفشل في جبل استجابة التجدد فعالة 2 . وعلاوة على ذلك، والضرر والأنسجة ندبة المحيطة الآفات الجهاز العصبي المركزي تمنع بشكل كبير نمو محور عصبي 1 ، 2 ، 3 . وقد ركزت العلاجات الحالية لتعزيز الجهاز العصبي المركزي تجديد بعد الإصابة على تعزيز إمكانات النمو الجوهري للخلايا العصبية المصابة وإخفاء مثبطات تمديد محور عصبي المرتبطة الحطام المايلين والندبة الدبقية 1 ، 3 . على الرغم من هذا، والقدرة على تجديد محاور عصبية طويلة إلى أهداف بعيدة وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية المناسبة لا تزال محدودة للغاية 4 ، 5 ، 6 ، 7 .

في العمل الحالي، وتستخدم ميكروبادس، ميكرومانيبولاتيون ماصة، وأجهزة ميكروفلويديك لبدء بسرعة، واستطالة، وعلى وجه التحديد ربط الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات طويلة. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن الخرز بولي-D- يسين المغلفة (بدل الخرز) للحث على التصاق الغشاء تليها تجميع المجمعات الحويصلة متشابك وتشكيل بوتونسابتيك بوريسينابتيك وظيفية 8 . وقد تبين أيضا أنه عندما يتم سحب PDL- حبة ميكانيكيا بعيدا بعد التمايز بريسينابتيك، وتتبع كتلة البروتين متشابك حبة، الشروع في نيوريت جديد 9 . الإجراء التالي يستغل هذه الحقيقة جنبا إلى جنب مع القدرة على ثقافة الخلايا العصبية قرن آمون الجنينية من الفئران في المناطق المنظمة على ساترة باستخدام بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) الأجهزة ميكروفلويديك على وجه التحديد جدد أسلاك العصبيةدائرة كهربائية.

هذه الأجهزة ميكروفلويديك بدمس غير سامة، شفافة بصريا وتتكون من غرفتين متصلة بواسطة نظام ميكروشانلز. مرة واحدة تجميعها على ساترة، كل جهاز بمثابة قالب لتوجيه نمو الخلايا العصبية والحفاظ على الثقافات العصبية صحية على أنماط دقيقة لمدة أطول من 4 أسابيع في المختبر .

هنا، يتم عرض الإطار الذي للتحقيق في حدود التمديد والوظائف من نيوريت جديدة. يتم إنشاء نيوريتس جديدة وظيفية ووضعها على كونترولابيلي (إعادة) شبكات الأسلاك العصبية. معدلات التمديد التي تحققت هي أسرع من 20 ميكرون / دقيقة على مسافات ملليمتر ملليمتر والتوصيلات الوظيفية. هذه النتائج تظهر، بشكل غير متوقع، أن القدرة الذاتية لهذه نيوريتس لاستطالة هو أسرع بكثير مما كان يعتقد سابقا. ويتجاوز هذا النهج الميكانيكي المقترح استراتيجيات كيميائية بطيئة ويتيح الاتصال المراقب لهدف محدد. ثهو تقنية يفتح آفاقا جديدة للدراسة في المختبر من العلاجات الجديدة لاستعادة اتصال الخلايا العصبية بعد الإصابة. كما أنه يتيح التلاعب وإعادة ربط شبكات الخلايا العصبية للتحقيق في الجوانب الأساسية لمعالجة الإشارات العصبية وظيفة الخلايا العصبية في المختبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات المفصلة أدناه من قبل لجنة رعاية الحيوان التابعة لجامعة ماكجيل وتتوافق مع المبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان.

1. توحيد الثقافات العصبية باستخدام أجهزة ميكروفلويديك: الجمعية الجهاز

  1. حدد جهاز ميكروفلويديك مناسبة لتجربة المطلوبة. لربط الخلايا العصبية داخل نفس السكان، واستخدام الأجهزة العصبية ( الشكل 1 ) ولربط الخلايا العصبية في مختلف السكان استخدام الأجهزة الثقافة المشتركة ( الشكل 6 ).
  2. تنظيف وإعداد العدد المطلوب من كوفرسليبس العقيمة أو أطباق أسفل الزجاج. للحصول على أفضل النتائج على الأسطح البلاستيكية استخدام أطباق 35 ملم، على استخدام الزجاج 25 مم كوفرسليبس، أو 35 ملم أطباق القاع الزجاج. حدد سمك الزجاج على أساس نظام التصوير، على سبيل المثال 0.15 ملم.
  3. معطف الأطباق أو كوفرسليبس مع 0.5-1 مل من 100 ميكروغرام / مل بدل لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها في غرفة المزاجature.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا واستئنافه في اليوم التالي إذا رغبت في ذلك. فورثيمور، يمكن أن تكون مغلفة الأطباق مع بورات العازلة المخفف بدل، بولي L- يسين (بل)، لامينين أو أي خلية أخرى التصاق الخلية.
  4. غسل الأطباق مرتين بالماء (لا تستخدم الفوسفات مخزنة المالحة (بس) كما بلورات الملح قد تمنع القنوات)، وإزالة كل السائل والسماح لها تجف في بيئة معقمة مثل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 5-10 دقيقة أو حتى والسطح هو جاف تماما.
    ملاحظة: كن حذرا للتأكد من أن كوفرسليبس جافة تماما، حيث أن أي السائل المتبقية سوف تتداخل مع الالتزام من أنظمة ميكروفلويديك.
  5. وضع الأجهزة ميكروفلويديك مع أنماط مواجهة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في بيئة معقمة (مجلس الوزراء السلامة الأحيائية) لمدة 10 دقيقة. تأكد من اتباع إجراءات معقمة عند العمل في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية 10 .
  6. باستخدام ملاقط وضع جهاز ميكروفلويديك مع نمط تواجه أسفل في اتصال مع كوفرسل نظيفةالملكية الفكرية / الطبق. استخدام ملاقط للضغط بهدوء الجهاز بحيث تلتزم الزجاج.
    ملاحظة: شفافية المنطقة الملتصقة سوف تكون مرئية عند النظر ضد الضوء. تأكد من أن جميع الزوايا تتصل بالزجاج. القيام بذلك لجميع الأجهزة ميكروفلويديك. انظر الشكل 1 أ .
  7. لملء الجهاز السكاني واحد مع المتوسطة، وأشر ماصة نحو القنوات وإضافة 50 ميكرولتر من وسط خلية كاملة تستكمل مع خالية من المصل B-27 (حجم نسبة 1:50) و 500 ميكروغرام / مل البنسلين / الستربتومايسين / الجلوتامين (مجتمعة ودعا نبم) إلى بئر العلوي الأيمن، ومن ثم إضافة 50 ميكرولتر آخر إلى الكذب جيدا قطريا لذلك. القيام بذلك لجميع الأجهزة، والتأكد من أن التدفقات المتوسطة بين الآبار. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولتر من المتوسطة إلى الآبار 2 المتبقية. انظر الشكل 2 أ .
    1. لملء الجهاز السكاني متعددة مع المتوسطة، نقطة ماصة نحو القنوات وإضافة 30 ميكرولترمن نبم كاملة إلى الآبار الصحيحة، راجع الشكل 6A . القيام بذلك لجميع الأجهزة، والتأكد من أن التدفقات المتوسطة بين الآبار. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولتر من المتوسطة إلى الآبار 4 المتبقية.
  8. وضع الأجهزة في لوحة أكبر مع طبق مفتوح مع الماء المعقم (غرفة الرطب) ووضعها في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 و 95٪ الرطوبة) لمدة 1-2 ساعة أثناء إعداد ثقافة الخلية. انظر الشكل 2 ب .

2. الطلاء الخلايا العصبية في أنظمة ميكروفلويديك

  1. بعد البروتوكول المبين في المرجع. 8 ، والحصول على فصل الحصين أو الخلايا العصبية القشرية من سبراغ داولي الأجنة الجرذان (إما الجنس).
  2. ريسوسبيند الخلايا العصبية الجنينية في نبم في تركيز 1-2 مليون الخلايا العصبية / مل. التحقق من تركيزات الخلية في المجهر باستخدام عدادة الكريات وبعد الإشارة 8 . ضبط تركيز الخلية أكوردينg إلى كثافة الخلية المطلوبة. لزيادة فرص الحصول على محاور عصبية الحصين واحدة لكل قناة، لوحة 10،000 الخلايا العصبية لكل جهاز. لديك محاور متعددة في نفس القناة، لوحة 60،000 الخلايا العصبية لكل جهاز.
    ملاحظة: هذه الأرقام تختلف وفقا لنوع الخلايا العصبية المستخدمة.
  3. إزالة المتوسطة من الأجهزة ميكروفلويديك دون تفريغ الآبار. ترك ما يقرب من 5 ميكرولتر في كل منهما.
  4. لخلايا لوحة في الجهاز السكان واحد، إضافة 50 ميكرولتر من نبم إلى أسفل الصحيح بشكل صحيح. عند هذه النقطة التدفقات المتوسطة في حد ذاته لملء بقية أقل. إضافة 20 ميكرولتر من محلول الخلية التركيز في أعلى يمين الجهاز ميكروفلويديك، كما هو مبين في الشكل 1B .
    1. لخلايا لوحة في جهاز السكان متعددة إضافة 20 ميكرولتر من محلول الخلية التركيز في كل من الآبار الصحيحة في الشكل 6A .
  5. تحقق في المجهر إذا الخلاياهي داخل الغرف ووضع الأجهزة في الحاضنة لمدة 15-30 دقيقة لتعزيز مرفق الخلية إلى الركيزة.
  6. تحقق في المجهر إذا كان هناك ما يكفي من الخلايا في الغرف. إذا كان هناك حاجة إلى المزيد، كرر الخطوتين 2.4 و 2.5.
  7. إضافة 50 ميكرولتر من نبم إلى آبار 2 العلوي من الجهاز السكاني واحد و 20 ميكرولتر من نبم في نفس جيدا كما تم حقن الخلايا في الجهاز السكاني متعددة. وسائل الإعلام يبرز قليلا لتشكيل الهلالة إيجابية إعطاء الآبار على الجانب الكعك العلوي. ومرة أخرى، انظر الشكل 2 أ .
  8. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 و 95٪ الرطوبة.

3. الحفاظ على الثقافات العصبية

  1. إزالة نبم (ما يقرب من 30 ميكرولتر مع ماصة) من الخلايا وتطبيق جديد نبم قبل تحسنت في اليوم التالي إدخالها إلى الأجهزة (وهذا هو 1 د بعد الخطوة 2).
  2. تحقق كل يومين إذا كان هناك ما يكفي من المتوسطة في كل قناة. إذا كان الكعك رالمرجع منخفض فقط إضافة المزيد من المتوسطة إلى الآبار العليا.
  3. خلايا الثقافة لا يقل عن 7 د قبل إزالة الأجهزة ميكروفلويديك. يمكن للخلايا البقاء على قيد الحياة في هذه الأجهزة لعدة أسابيع. إزالة الأجهزة 1-2 أيام قبل إجراء التجارب على العينات.

4. إزالة الأجهزة ميكروفلويديك

  1. 1 - 2 د قبل إزالة الأجهزة ميكروفلويديك، إضافة 2 مل من نبم بريوارمد إلى 37 درجة مئوية إلى كل طبق عينة، غمر الغرف، والحفاظ على الأجهزة في الحاضنة.
  2. استخدام ملاقط معقمة و طرف واحد لإزالة الأجهزة ميكروفلويديك من كوفرسليبس ترك تكوين نمط من الخلايا العصبية. استخدام غيض لعقد ساترة في مكان وملاقط لمشبك حافة الجهاز في الزاوية اليسرى السفلى من البئر. تطبيق دقيق التواء، ورفع الجهاز مع ملاقط بحيث تقشر قبالة ساترة. انظر الشكل 2c - 2d .
  3. كل 2-3 أيام، واستبدال هالف نبم حتى يتم استخدام العينة للتجارب.
  4. قبل إجراء تجارب تجديد الأسلاك على العينة، تحقق من أن نيوريتس في قنوات الجهاز السكان واحد والسكان السكان العصبية في الجهاز السكاني متعددة يتم عزلها من خلال فحص الفجوات بينهما في المجهر لضمان عدم وجود خيوط تربط السكان العصبية.

5. إعداد بدل المغلفة الخرز

  1. إضافة 2 × 50 قطرات ميكرولتر إما 4 أو 10 أو 20 ميكرون الخرز البوليسترين المخفف في الماء (1: 500) إلى 1 مل من بدل (100 ميكروغرام / مل). ترك لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا واستئنافه في اليوم التالي.
  2. أجهزة الطرد المركزي الحل في 8،820 x ج لمدة 1 دقيقة. إزالة بعناية طاف دون إزعاج الخرز المتراكمة في الجزء السفلي من الحاوية.
  3. غسل الخرز مرتين مع 1 مل من العقيمة 10 ملي هيبيس الرقم الهيدروجيني 8.4 الحل.
  4. ريسوسبيند الخرز بدل المغلفة في 200 مل من 10 ملي هيبيس درجة الحموضة 8.4حل.

6. إعداد ميكروبيبيتس

  1. إعداد ماصات من أنابيب زجاجية الشعرية (1 مم القطر الداخلي، 1.5 مم القطر الخارجي) باستخدام مجتذب القطب الأفقي. ضبط الإعدادات حتى الطرف الخارجي من ميكروبيبيت سحبت هو ~ 2-5 ميكرون. قبل سحب، ضمان أنابيب الزجاج نظيفة.
  2. إصلاح الماصات إلى الشرائح الزجاجية للتخزين، وضمان أن طرف لا الاتصال سطح الشريحة كما غيض هش. تخزينها في درجة حرارة الغرفة في حاوية مغطاة للحماية من الغبار. استخدام الماصات في نفس اليوم يتم سحبها.

7. بدل-حبة التصاق الخلايا العصبية

  1. إضافة 40-60 ميكرولتر من الخرز المغلفة بدل أعدت في الخطوة 5 إلى ثقافة الخلية أعدت في الخطوة 4. مركز طرف ماصة على الخلايا العصبية، والتي هي مرئية بضعف على ساترة، وإضافة الخرز (انظر الشكل 3 ).
  2. عودة العينة إلى حاضنة لمدة 1 ساعة لتعزيز تشكيل سياتصالات نابتيك 8 ، 9 .
  3. بعد الحضانة، وإزالة أي الخرز غير الملتصقة عن طريق غسل بلطف الثقافة مع نبم قبل تحسنت.

8. إعداد حل محلول الفسيولوجية (للتجارب درجة حرارة الغرفة)

  1. إعداد محلول ملحي الفسيولوجية من خلال الجمع بين المكونات المدرجة في المراجع 7 ، 8 . هذا هو لتنظيم بيئة الخلية خارج الحاضنة.
  2. تحقق من الأسمولية ودرجة الحموضة كما هو مبين في المراجع 7 ، 8 .
  3. يبث محلول باستمرار مع O 2 لتقليل تقلبات الرقم الهيدروجيني أثناء إجراء التجارب.
  4. الحرارة إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. إعداد نظام نضح عن طريق إدراج نهاية واحدة من أنبوب بلاستيكي (أبعاد اختياري) في O 2 -Invisused حل الفسيولوجية وتحديد ه آخرند إلى إبرة إدراجها في صاحب العينة. وضع الأنابيب والحل أعلى من العينة (انظر الشكل 4 ).
    1. قطع الأنبوب من الإبرة وتوصيله إلى حقنة. استخدام حقنة لممارسة الضغط ورسم السائل، وملء الأنبوب. ختم مع المشبك الأسطوانة وإعادة توصيل الإبرة.

9. حبة ميكرومانيبولاتيون

  1. تثبيت عينة في التجريبي انشاء بحيث الخلايا يمكن الوصول إليها من قبل اثنين من ميكروبيبيتس شنت في ميكرومانيبولاتورس والوصول إليها بصريا أدناه، على سبيل المثال مع الهدف 40X مرحلة (فتحة عددية من 0.6) من المجهر الضوئي مقلوب. في هذا التكوين، جبل كاميرا كسد لالتقاط الصور على المنفذ الجانبي للمجهر. ربط كل ماصة إلى 1 مل المحاقن عبر أنابيب بلاستيكية. في هذه الخطوة، استبدال نبم مع محلول ملحي الفسيولوجية (1-2 مل) (انظر الشكل 4 ).
  2. أثناء التجربة، يروي باستمرار الخلايا مع محلول ملحي الفسيولوجية أعدت في الخطوة 8 بمعدل 0.5-1 مل / دقيقة.
  3. حدد PDL- حبة لا تعلق على الخلايا العصبية في مجال الرؤية. محاذاة حبة مع طرف ميكروبيبيت من خلال التركيز على حبة ثم تصل إلى ميكروبيبيت. جلب طرف أسفل أقرب ما يمكن إلى حبة من خلال رصد ذلك من خلال المجهر.
  4. تطبيق الضغط السلبي مع حقنة 1 مل متصلة ماصة لالتقاط حبة. الحفاظ على الضغط السلبي طوال التجربة.

10. سحب نيوريتس

  1. حدد PDL- حبة تعلق على الخلايا العصبية في مجال الرؤية وإرفاقه إلى ميكروبيبيت الثاني باستخدام الشفط كما هو موضح في الخطوات 9.3-9.4.
  2. سحب بدل-حبة-الخلايا العصبية المعقدة عن طريق ببطء (~ 0.5 ميكرون / دقيقة) تتحرك إما ميكرومانيبولاتور أو مرحلة العينة التي كتبها 1 ميكرون وقفة لمدة 5 دقائق للسماح بدء نيوريت.
  3. كرر الخطوة 10.2 مرتين.
    ملاحظة: أول 3 &# 181؛ م يجب أن يتم سحبها ببطء شديد لضمان النجاح التجريبي، والذي يحدث أكثر من 95٪ من الوقت.
  4. سحب بدل-حبة-الخلايا العصبية المعقدة ببطء (~ 0.5 ميكرون / دقيقة) تتحرك إما ميكرومانيبولاتور أو مرحلة العينة من قبل 2 ميكرون وقفة لمدة 5 دقائق للسماح استطالة نيوريت.
  5. بعد بدء ناجحة وتمديد نيوريت لأول 5 ميكرون، وسحب النوريت في 20 ميكرون / دقيقة على مسافات على نطاق ملليمتر.
    ملاحظة: سحب يمكن أن يؤديها بشكل مستمر أو في خطوات وبأسعار متفاوتة. انظر الشكل 5 ب -5 ج .

11. ربط الخلايا العصبية

  1. حدد منطقة غنية في نيوريتس وانخفاض مجمع بدل-بيد-نيوريت بحيث يتصل به جسديا. استخدام الخرز الأخرى لقياس ارتفاع طرف فوق سطح ساترة. انظر الشكل 5 د .
  2. ترك بدل-حبة-نيوريت مجمع في اتصال مع نيوريت الهدف في حين التلاعب ميكروب الثانيpette. خفض ماصة الثانية مع بدل الثاني حبة على رأس نيوريت شكلت حديثا حوالي 20 ميكرون تشكل حبة الأولى. استخدام بدل-حبة الثاني لدفع خيوط نيوريت جديدة نحو الخلية المستهدفة.
  3. عقد كل من الخرز في مكان لمدة 1 ساعة على الأقل. التحقق من عدم وجود تورم التنسيق، سماكة من نيوريتس الاتصال حبة، مع المجهر 16 .
  4. خلال هذا الوقت، استخدم نضح لتغيير ببطء وسط العينة من المالحة الفسيولوجية إلى ما قبل تحسنت، كو 2 -Eilibibrated نبم.
  5. الافراج عن حبة من ماصة الثانية عن طريق الإفراج عن شفط. إذا تبقى العصبية الجديدة المرفقة، الافراج عن حبة الأولى كذلك. انظر الشكل 5 ه .
  6. إزالة بلطف محلول ملحي واستبدالها مع نبم (~ 2 مل).
  7. وضع بعناية العينة مرة أخرى في الحاضنة لتعزيز اتصال الخلايا العصبية للتجارب المستقبلية. هذا الاتصال مستقرة لمدة> 24 ساعة 7

12. التحقق من وظيفة الاتصال الجديد عن طريق تسجيلات المشبك التصحيح المشترك خلية كاملة

  1. اتبع المراجع 7 ، 18 ، 19 . لتجميع الفيزيولوجيا الكهربية.
  2. اتبع المراجع 7 . لإعداد الأقطاب الكهربائية قبل والمشبكي.
  3. جمع البيانات المشبك التصحيح، مرة أخرى بعد مراجع 18 ، 19 .
  4. قارن النتائج بإشارات طبيعية 7 لتحديد نوع الاتصال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم استزراع الخلايا العصبية الحصين الجرثومة الجنينية في الأجهزة ميكروفلويديك لتمكين تحديد المواقع بدقة من الخلايا، بدل-الخرز و ميكرومانيبولاتورس. الخطوة الأولى هي لتجميع صحيح الجهاز ميكروفلويديك على ساترة الزجاج أو الطبق. فمن الضروري أن يكون الجهاز ميكروفلويديك تعلق جيدا إلى الركيزة لتجنب الخلايا الخروج من الغرف والتحرك تحت أجزاء من الجهاز الذي ينبغي أن تكون مختومة ( الشكل 1A ). للحفاظ على ثقافات صحية لعدة أسابيع، فمن المهم لمنع التبخر المتوسط ​​عن طريق فحص المتوسطة خلية كل 2-3 أيام والحفاظ على الغضروف المفصلي إيجابي المتوسطة ( الشكل 2A ). يتم تجنب التبخر المتوسط ​​أيضا عن طريق الحفاظ على كل من الخلايا وطبق مفتوح من الماء داخل لوحة أكبر ( الشكل 2B ). يمكن إزالة الأجهزة ميكروفلويديك في أي وقت. للحصول على أفضل النتائج، نبم يجب أن تضاف إلى الخلية دينظام نائب على الأقل 1 د قبل إزالة الجهاز. هذا يقلل من الإجهاد الخلوي كما الخلايا العصبية في اتصال مع المتوسطة في درجة حرارة مثالية ودرجة الحموضة عندما يتم إزالة الأجهزة. عندما يتم مقشر الأجهزة ميكروفلويديك ببطء من الطبق ( الشكل 2C و 2 D) الخلايا ستبقى في موقف منقوشة ( الشكل 3 والشكل 5A ).

يتم استخدام نوعين من الأجهزة ميكروفلويديك: الجهاز العصبي وجهاز الثقافة المشتركة. الأولى تمكن من السهل تحديد محاور، التشعبات والهيئات الخلية. يبقى سوما في غرفة سوما العليا في حين محاور عصبية وتشعبات تنمو على طول القنوات ميكروفلويديك ( الشكل 5A ) نحو غرفة محور عصبي.

فمن المستحسن أن تضاف بدل الخرز إلى الخلايا بنسبة 10: 1 وأن ​​معظم الخرز التي هافي لا تلتزم ثقافة إزالتها عن طريق غسل الخلايا مرة واحدة مع نبم بعد حضانة 1 ساعة ( الشكل 3 ). بعد التصاق بدل حبة ل نيوريتس، ​​يتم سحبها بد-حبة نيوريت المعقدة ويمكن تمديدها على مسافات كبيرة. النوريت شكلت حديثا يمكن أن تكون مرتبطة على وجه التحديد إلى نيوريتس أو سوما ملليمتر بعيدا ( الشكل 5B -5e ). معدل النجاح لسحب نيوريت جديدة لأول 3 ميكرون بسرعات أقل من 1 ميكرون / دقيقة هو> 95٪ (ن = 206). معدل النجاح لربط نيوريت جديدة إلى خلية أخرى هو 70٪ (ن = 30). اتصال هشة جدا في أول 18 ساعة، ويرجع ذلك أساسا إلى نيوريت جديد هو خيوط أقل من 1 ميكرون في قطر الراسية من قبل 10 ميكرون بدل-حبة. إذا تم نقل الطبق بسرعة خلال الدقائق الأولى من الاتصال، فإن اضطراب الناتجة من المتوسطة قد يسبب حبة للفة وبالتالي التصاق أن تضيع. ومع ذلك، إذا كانت العينة ليست شاكين، في 30 دقيقة حبة تعلق على نيوريتس على الطبق ويظل الاتصال الجديد لمدة 48 ساعة على الأقل. انظر الشكل 4 للحصول على التخطيطي من الإعداد.

و بدل-حبة موقف على الثقافة ويمكن أيضا أن تستخدم لتحديد بسهولة موقع نيوريت متصلة ( أرقام 6D-6E ). بعد بدء وتمديد وتوصيل نيوريت جديدة، الثانية، غير ملتصقة PDL- حبة، التقطت عن طريق ميكرومانيبولاتور، ويستخدم لإنشاء موقع التصاق الثاني بين النوريت بدأت والسكان السكان العصبية الثانية. يتم وضع بدل-حبة الثانية على رأس نيوريت جديدة، وضغط ذلك أن نيوريت جديد يتصل فقط السكان العصبية الثانية 11 . وهذا من شأنه تعزيز الالتصاق مع السكان العصبية الثانية ( الشكل 5F).

إناب الجهاز السكاني متعددةليس نمو 4 السكان العصبية معزولة على نفس الطبق. ويقتصر كل السكان العصبية إلى مستطيل 4 × 7 مم فصل عن السكان العصبية الأخرى بنسبة 100 أو 200 ميكرون الفجوات ( الشكل 6A ). الخلايا العصبية السليمة يمكن أن تنمو داخل الأجهزة لعدة أسابيع. عادة، يبقى السكان العصبية معزولة تصل إلى 48 ساعة بعد إزالة الجهاز. بعد هذه الفترة 48 ساعة، تميل الخلايا العصبية إلى النمو نحو السكان العصبية المجاورة وتشكيل وصلات طبيعية. قبل ربط اثنين من السكان معزولة، فإنه ينبغي التحقق من أن السكان هي في الواقع معزولة حقا من خلال فحص كامل الفجوة مع المجهر لتأسيس أنه لا يوجد أي صلة بين السكان العصبية اثنين ( الشكل 6B ).

بعد الاتصال، واحتضنت العينات لمدة 24 ساعة وأجريت خلية كاملة اقتران التصحيح المشبك الكهربائية للتحقيق في ما إذا كان حديثاشكلت نيوريت تستخدم لربط اثنين من السكان العصبية معزولة كان وظيفيا وقادرة على نقل الإشارات الكهربائية. الخلايا العصبية في السكان واحد، وتقع أقل من 100 ميكرون دائرة نصف قطرها من الموقع حيث بدأ نوريت المستحث، تم اختيار لتسجيل إمكانيات العمل قبل المشبكي (المتضررين). واعتبر هذا الخلايا العصبية الخلية بريسينابتيك. تم تسجيل النشاط استثارة أو مثبطة بوستسينابتيك من الخلايا العصبية في السكان اثنين، على الجانب الآخر من الفجوة، وتقع في أقل من 100 ميكرون دائرة نصف قطرها من اتصال ميكرومانيبولاتد ( الشكل 7A -7C ). تم تحليل التسجيلات المشتقة من الاتصالات التي يسببها ميكانيكيا ومقارنتها مع تلك من السكان العصبية المتصلة طبيعيا والسكان غير متصلين ( الشكل 7 ). الاستجابات الكهربائية بعد باب مسجلة من الخلايا العصبية متصلة بشكل طبيعي والتفاعل ميكرومانيبولاتيون هي أعلى بكثير ويرتبط زمنيا مع بريسينابتيكالنشاط ( الشكل 7 ).

شكل 1
الشكل 1: توحيد الثقافات العصبية باستخدام الأجهزة ميكروفلويديك 7 . ( أ ) التجمع الجهاز: عندما يتم تجميعها الأجهزة ميكروفلويديك بشكل صحيح على سطح جاف جميع الدوائر مرئية. ( ب ) طلاء الخلايا: لوحة الخلايا على أعلى يمين جيدا والخلايا يجب أن تتحرك نحو اليسار الأيسر. ( ج ) كثافة الخلية: بعد الطلاء مباشرة، تحقق في المجهر إذا كان تركيز الخلايا كافية. ( د ) بعد 1 د في الثقافة، والخلايا العصبية قرن آمون ويلتزم بشكل جيد بالقرب من ميكروشانلز والبدء في تشكيل نيوريتس. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر إيه نسخة من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2 : الحفاظ على الثقافات العصبية صحية لعدة أسابيع 7 . ( أ ) إضافة المتوسطة كل 2-3 د والحفاظ على الغضروف المفصلي إيجابي في الآبار العليا من الدوائر ميكروفلويديك حتى الخلايا سيكون لها إمدادات مستمرة من المواد الغذائية. ( ب ) إبقاء الخلايا داخل لوحة أكبر مع طبق يحتوي على المياه للحد من التبخر المتوسط. ( ج ) استخدام طرف العقيمة وملاقط ل ( د ) بسهولة تقشر ميكروديفيسس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

p_upload / 55697 / 55697fig3.jpg "/>
الشكل 3 : موقع ماصة إيداع الخرز في الثقافات. مرة واحدة وقد تم إزالة جهاز ميكروفلويديك، الخلايا العصبية مرئية على ساترة. عند إيداع الخرز، موقف طرف ماصة بحيث يكون في وسط الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: تخطيطي من نموذجي نيوريت سحب مجموعة المتابعة. وتستند العينة على مرحلة (بيزو-أتواتد) ويمكن الوصول إليها من فوق من قبل 2 ميكروبيبيتس عقد في ميكرومانيبولاتورس وتوصيلها إلى 1 مل المحاقن عبر الأنابيب البلاستيكية. يتم الوصول إلى العينة بصريا من أسفل من قبل هدف متصلا كاميرا كسد التي ترسلالصورة إلى وحدة المعالجة المركزية. أنبوب مدخل يغذي الأوكسجين محلول ملحي الفسيولوجية للعينة، التي تقع أدناه، وأنبوب منفذ متصلا حقنة يسمح انسحاب الحل في حالة تجاوز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5
الشكل 5 : بدل-حبة التصاق الخلايا العصبية و ميكرومانيبولاتيون ماصة 7 . ( أ ) تبقى الخلايا العصبية منظمة في أنماط بعد إزالة غرف ميكروفلويديك مما يتيح التعرف السهل من سوما و نيوريتس. ( ب ) ميكرومانيبولاتيون من PDL- الخرز التمسك نيوريتس تمكن بدء نيوريت، التمديد ( ج ) والاتصال ( د )،تليها الافراج عن بدل-حبة من ماصة ( ه ). ( و ) بعد الاتصال اثنين من السكان العصبية معزولة (السهم السفلي)، ويستخدم ثاني بدل-حبة وميكرومانيبولات ماصة (السهم العلوي) لإنشاء نقطة التصاق الثانية، بضع مئات من ميكرون بصرف النظر عن نقطة الاتصال الأولى، وضمان وظيفية روابط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6
الشكل 6 . استهلال، استطالة واتصال نيوريتس جديدة لربط اثنين من السكان المعزولة باستخدام جهاز السكان متعددة والتلاعب الميكروميكي 7 . ( أ ) يعزل الجهاز 4 السكان العصبيةبين 3 فجوات من 100 أو 200 ميكرون لكل منهما. ( ب ) بعد إزالة الجهاز، حدد فجوة واحدة ويصدق على أن أي نيوريتس ربط 2 السكان الفردية. ( ج ) التخطيطي للتجريبية انشاء كما ينبغي أن تكون مرئية في المجهر الضوئي، يشير إلى موقف اثنين ميكروبيبيتس وجود الخرز بد المغلفة. ( د ) من خلال تطبيق الضغط السلبي على ماصة، يتم سحب بدل حبة انضمت إلى السكان العصبية واحدة مع طرف ماصة، وبالتالي الشروع في نيوريت جديدة. من خلال الحفاظ على الضغط السلبي في ماصة، و PDL- حبة نيوريت معقدة (الأخضر) يمكن سحبها، وتمديد النوريت. ( ه ) ماصة ميكرومانيبولاتيون أدلة تمديد نيوريت جديدة على الفجوة وتشكيل اتصال مع السكان العصبية الجديدة. لضمان الالتصاق من نيوريت جديدة إلى السكان الثانية، يتم وضع بدل-حبة (الأحمر) مع ماصة الثانية على رأس كل من نيوريت ثيكستندد والعصبيةنال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7
الشكل 7: نيوريت المستحث حديثا، ممدود ومتصلة يمكن نقل المعلومات بين اثنين من السكان العصبية المعزولة 7 . تم استزراع السكان العصبية معزولة مفصولة فجوة 100 ميكرون في ميكروديفيسس بدمس. وقد أجريت تسجيلات المشبك التصحيح المقترنة في تكوين خلية كاملة من الخلايا العصبية في السكان واحد والخلايا العصبية في السكان اثنين (على الجانب الآخر من الفجوة) عندما تم توصيل مجموعتين من خلال التلاعب الميكانيكية ( أ )، سمح للربط الطبيعي عبر الفجوة ( ب ) أو لا تزال غير متصلة بواسطة مينت( ج ). يتم عرض آثار تمثيل التسجيلات المقترنة لكل حالة (دف). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

باستخدام ميكرومانيبولاتيون القياسية والأجهزة ميكروفلويديك مبتكرة، تم تطوير تقنية جديدة للبدء بسرعة، استطالة ودقة ربط جديد الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات كبيرة. ميكرومانيبولاتيون ماصة هو أداة مشتركة في معظم مختبرات علم الأعصاب 4 ، 13 . وكان التحدي الحقيقي لتحقيق نتائج استنساخه وموثوق بها وتوحيد الثقافات العصبية صحية، وتحديدا على وجه التحديد لمدة التجربة (والتي يمكن أن تكون على مر الزمن من أسابيع) من خلال تطوير أجهزة ميكروفلويديك لتنظيم الثقافات الخلية مع دقة ميكرومتر. ثقافات الخلايا عالية الجودة هي حجر الزاوية في التحقق من صحة البيانات. هذا يسهم في التصوير الأسرع المجهري أسهل وأسرع وتوحيد الثقافات والنتائج. تم تصميم الأجهزة ميكروفلويديك لخلايا الثقافة في المختبر مع تنظيم مماثل كما هو الحال في الجسم الحي . الجهاز السكاني واحد تمكنونمو العصبية طويلة وسهلة تحديد المحاور، نيوريتس و سوما. عدد الخلايا مطلي في غرف ميكروفلويديك يحدد كثافة الخلايا العصبية. لذلك، من خلال الطلاء عدد أقل من الخلايا لكل جهاز فمن السهل التعرف على الخلايا العصبية واحدة قريبة من القنوات. محور عصبي وتشعبات متعددة من واحد عصبون واحد ينمو داخل قناة واحدة. التشعبات تنمو على الأقل 5 مرات أبطأ من المحاور 6 و 17 وبعد 2-3 أسابيع في المختبر نموها في القنوات عادة ما تقتصر على 200 ميكرون في حين محاور عصبية سريعة النمو يمكن أن تصل إلى أبعد من 2 مم 17 . لذلك، بعد إضافة بدل الخرز إلى العينات، فمن السهل نسبيا لتقدير ما إذا كانت الخرز والتمسك معظمها لمحاور عصبية أو المحاور العصبية والتشعبات ( الشكل 5B - 5F ). هناك فرص أعلى لسحب محاور عصبية جديدة والتشعبات عند سحب PDL- الخرز تعلق على نيوريتس أقصر من 200 ميكرون، وإيل هناك احتمالات أكبر من سحب محاور عصبية جديدة فقط عند سحب PDL- الخرز تعلق على نيوريتس أطول من 500 ميكرون. الجهاز السكاني المتعدد هو مفيد لنمو استنساخه من السكان فصل صحي صحي لعدة أسابيع. هذا النظام من القنوات مفيد لدراسة ما يصل إلى 4 أنواع مختلفة من الخلايا أو مقارنة نفس الخلايا مع العلاجات المختلفة.

وعلاوة على ذلك، بيئة ثقافة الخلية التي تسيطر عليها وقابلة للتكرار يوفر إطارا مثاليا لتحليل الخلايا والتلاعب. تحديد المواقع بدقة من الخلايا على طبق يسهل تحديد المناطق ذات الاهتمام وكذلك التوجه والملاحة من خلال هذه المجالات من الفائدة في نهاية المطاف السماح السيطرة غير مسبوقة على موقع بدء نيوريت. توزيع الخلايا التي تسيطر عليها يجعل من الأسهل لتصور اتصال شكلت حديثا وأسرع بكثير للعثور على اتصال جديد مع المجهر في الأيام التالية الحضانة. وبالإضافة إلى ذلك، تكوينات استنساخه من الخلاياتمكين تحديد المواقع سهلة ودقيقة من الإشارات الكيميائية، مثل الخرز المغلفة بدل، على سوما، التشعبات أو المحاور 8 . أخذت معا، والتصوير وتحليل الخلايا التي تزرع في الأجهزة ميكروفلويديك هي أسرع بسبب تنظيم الخلوية القياسية مستنسخة في جميع الأطباق. وعلاوة على ذلك، مصنوعة من مواد متوافقة حيويا وشفافة وقابلة للإزالة المواد، مما يتيح التصوير في جميع موجات مرئية والبقاء على قيد الحياة داخل الخلايا لعدة أسابيع. التصغير من المقايسات الخلوية يساعد أيضا على جمع المزيد من البيانات مع عدد أقل من الخلايا. انخفاض حجم استهلاك الأجهزة ميكروفلويديك يقلل من عدد الخلايا اللازمة لكل تجربة ويزيد من فعالية تجريبية. على سبيل المثال، بدلا من قضاء عدة ساعات في البحث مع المجهر ربما 1 أو 2 محاور عصبية معزولة في طبق، يمكن استخدام جهاز السكان واحد للوصول فورا أكثر من 100 محاور عصبية معزولة لكل عينة الخلية. أجهزة ميكروفلويديك تقدم مصغر موثوق بها والسيطرة عليهابيئة ثقافة الخلية لصالح تحليل عينات نادرة مع مرور الوقت لإجراء اختبارات متعددة.

الاختلافات المحتملة لهذه التقنية تنطوي على ارتباط مباشر من حبة إلى ميكروبيبيت. في البروتوكول الحالي، يتم وصف طريقة لربط حبة إلى طرف عن طريق الشفط، ولكن يمكن أيضا لصقها حبة إلى طرف. الغراء هو الخيار الأفضل إذا اتصال مستقر للغاية بين طرف وحبة مرغوب فيه، على سبيل المثال إذا تم إجراء قياسات القوة باستخدام ماصة كمستشعر أو إذا كان التحقيق في التصاق بين بدل و نيوريت هو الهدف التجريبي الرئيسي. في الوريد الآخر، شفط مفيد لأنه يسمح الافراج عن حبة بعد التنسيب دون قطع نيوريت حبة معقدة مما يتيح العديد من الاتصالات إلى أن يتم بالتوازي. شفط يوفر وسائل لارتفاع إنتاجية التجارب تجديد الأسلاك، وتحسين على تقنيات التلاعب الأخرى مثل المجهر القوة الذرية (عفم) 7 </ سوب> ، 16 . كل من التعديلات من هذا الأسلوب تسمح موقع بدء النوريت ليتم اختيارها ببساطة عن طريق الحفاظ على حبة في اتصال مع تغصن بحيث يتم تشكيل نقاط الاشتباك العصبي. ومع ذلك، فإن استراتيجية احتضان العديد من الخرز كما هو موضح في الخطوة 7 يوفر الوقت في مرحلة التلاعب ويوصى إذا كانت السيطرة الدقيقة على موقع البدء غير ضرورية في التجربة.

ويمكن أن تسعى البحوث المستقبلية إلى معالجة مختلف القيود الأساسية، وهي التحكم في درجة الحرارة وإمكانية الوصول إلى العينات. الخصائص الميكانيكية للغشاء الخلوي يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في درجات حرارة مختلفة 27 . من الناحية المثالية جميع التجارب ينبغي أن يؤديها في 37 درجة مئوية في ظروف الخلايا العصبية المتوسطة والكافية (الصحيح كو 2 الضغط والضوابط الرطوبة). ومع ذلك لم يكن من الممكن استخدام حاضنة الخلية المغلقة، لأن الوصول إلى عينات من أعلى هو مطلوب ل ميكرومانيبولاتورس، منأسفل للمجهر ومن الجانب لتحريك المرحلة. لذلك تم استخدام نضح في درجة حرارة الغرفة. في سياق مماثل، منذ انشاء فقط لديه مساحة كافية لاستيعاب 2 ميكرومانيبولاتورس ويستغرق ما يقرب من 1 ساعة لإنشاء اتصال واحد، وهناك حد لعدد التجارب يمكن للمرء أن يؤديها. يمكن معالجة هذه المشكلة مع مناور التي تسحب أكثر من حبة واحدة في وقت واحد. آخر التحسين المحتمل لهذا البروتوكول هو القدرة على تسجيل ارتفاع مجمع حبة ماصة من سطح العينة. عدم القدرة على القيام بذلك يمكن أن يؤدي إلى عدم الدقة عند إسقاط حبة الثانية ووضعه على نيوريت الناجم لإصلاحه. يتم خفض حبة على رأس نيوريت جديدة في المنطقة الغنية بالنوريت حتى يكمن نيوريت جديدة وتلك الموجودة على الطبق في نفس المستوى البؤري. النوريت الجديد هو أبدا بين حبة والطبق، ولكن دائما بين وسادة من مسألة الخلية وحبة، وبالتالي يتم تقليل ضغط.وبالإضافة إلى ذلك،ويلاحظ نيوريت جديدة لمدة 10 دقيقة في المجهر لتقييم إذا تم تشكيل تورم العصبية التنسيقية بالقرب من حبة. كما هو موضح في المرجع 16 ، وجود تورم يشير إلى تنكس نيوريت. ومع ذلك، منذ تطبيق كميات متفاوتة من الضغط لمحاور عصبية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات فسيولوجية 16 ، يمكن أن تركز البحوث المستقبلية على تكييف تحقيقات ماصة عن طريق تحديد العاكس لهم ورصد النزوح عمودي على سطح العينة مع أساليب عفم. وأخيرا، ربما أكبر تحد لهذا البروتوكول هو لاختبار وظائف الاتصال التلاعب بها. وتقترن تقنية الأكثر مباشرة وموثوق بها وثابتة كامل خلية التصحيح المشبك التسجيلات. ومع ذلك، فإن نسبة نجاح تسجيل الاقتران التصحيح الاقتران العادية منخفضة جدا (<25٪) 18 . كله خلية التصحيح المشبك لديه العديد من العيوب بما في ذلك مجموعة طويلة حتى الوقت، عدد محدود من التجارب / يوم، محدود وقت التسجيل (~ 30دقيقة)، وانخفاض العائد التجريبي للتسجيلات المشبك التصحيح الاقتران والموت الخلية بعد القياسات. بسبب هذه التحديات التقنية العائد التجريبي من خلية كاملة التصحيح المشبك يقترن التسجيلات بعد ميكرومانيبولاتيون منخفضة جدا. وهناك حاجة إلى منصات وتقنيات أفضل لتحفيز أكثر دقة وتسجيل ومقارنة النشاط العصبي في الاتصالات الطبيعية وميكرومانيبولاتد.

وقد عرفت أهمية التوتر في نمو محور عصبي منذ الأيام الأولى من العصبية - مشيرا إلى أنها تمتد السلبي 20 . خلال العصبية التطور المبكر الجنينية تهاجر من خلال مسافات صغيرة للوصول إلى أهدافهم. كما معظم الخلايا تقسيم وتكرار، تتعرض محاور عصبية لقوى مستمرة لاستطالة وضبط طولها إلى النمو الجنيني 20 ، 21 . وقد حاولت عدة مجموعات لاختبار حدود نمو النوريت من خلال تطبيق الإشارات الكيميائية و / أو التوتر الميكانيكي إلى نيورونس (للمراجعة انظر المرجع 22 ). في هذه التقارير 23 ، 24 ، 25 ، 26 وكذلك خلال النمو الفسيولوجي، يتم سحب نيوريتس في حين تعلق على الركيزة. الفرق الرئيسي في الإعداد لدينا هو أنه في التقنية الحالية نيوريتس جديدة فقط اثنين من التصاق الاتصالات. في قاعدة يعلق النوريت على الخلايا العصبية وعلى طرف و نيوريت تعلق على حبة. خلال استطالة مكونات نيوريت جديدة لديهم حرية تفريق في أكثر الطرق كفاءة لاستيعاب القوات سحب. الأهم من ذلك، يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج هذه التجارب دون التسبب في تمزق العصبية ولا انحطاط، استنادا إلى دراسات سابقة على تشكيل الاتصالات متشابك 8 وعلى مقاومة المحاور العصبية للضغط 16 تبين كيفية استخدام الصغرى و نانوتولز إلىباستمرار سحب نيوريتس مع القوة المناسبة. معدلات تمديد نيوريت وصفها هنا (1.2 ملم / ساعة) هي 30-60 مرات أسرع من معدلات الجسم الحي من محاور عصبية الأسرع نموا من الجهاز العصبي المحيطي (0.02 إلى 0.04 ملم / ساعة) 28 . بالمقارنة مع نفس نوع الخلايا العصبية في المختبر ، ومعدلات تمديد محور عصبي وصفها هنا هي 7.5 مرات أسرع من معدلات النمو وصفها المؤلفين الآخرين في مرحلة مبكرة من التنمية (0.1 ملم / ساعة) 4 . وقد وجدت أنواع مختلفة من الخلايا العصبية لتوسيع محاور عصبية بمعدلات جوهرية مختلفة تختلف من عدة أضعاف 29 . وبالإضافة إلى ذلك، محاور عصبية الجهاز العصبي المركزي عادة ما تفقد نسبة عالية من نمو محور عصبي بعد التعصيب الهدف في الجسم الحي 29 و 3 د من الثقافة في المختبر 6 . ولذلك يجب أن يتم اختبار تقنية تمديد محور عصبي الحالية مع أنواع مختلفة من الخلايا العصبية لفهم أفضل ثحدود ه من تمديد نيوريت.

ميكرومانيبولاتيون ماصة وأجهزة ميكروفلويديك هي تقنيات أثبتت لخلق نيوريتس وظيفية جديدة وموقف كونترولابلي أو (إعادة) شبكات الخلايا العصبية. هذه المنصة مثالية لقياسات منهجية، موحدة. فإنه يدخل استنساخه والسيطرة في الجسم الحي في التجارب على شبكات معقدة من الخلايا العصبية. معدلات التمديد التي تحققت هي أسرع من 20 ميكرون / دقيقة على مسافات ملليمتر ملليمتر والتوصيلات الوظيفية. هذه النتائج تظهر، بشكل غير متوقع، أن القدرة الذاتية للمحاور عصبية لاستطالة، بما في ذلك مكوناتها الهيكل الخلوي، هو أسرع بكثير مما كان يعتقد سابقا 10 ، 11 ، 12 . هذا النهج الميكانيكية المقترحة يتجاوز استراتيجيات كيميائية بطيئة، وبالتالي يمثل نقلة نوعية للتطورات العلاجية لاستعادة الربط العصبية بعد الإصابةو نيوروينجينيرينغ الصغرى من الشبكات العصبية الاصطناعية لدراستهم التي تسيطر عليها في المختبر . هذه النتائج لها أيضا تأثير كبير على الطب التجديدي والنهج الهندسة العصبية مع الآثار المباشرة للعلاجات التي تهدف إلى إعادة ربط الدوائر العصبية بعد الصدمة أو في الأمراض العصبية التنكسية. هذه المنصة تفتح الباب للحصول على بيانات عن الاتصالات العصبية، وتشكيل إشارة فضلا عن النمو والتجديد. بل هو وسيلة جديدة لتجديد الجهاز العصبي المركزي ميكانيكيا وتقنيات مماثلة قد تسمح استعادة وظيفة بعد الإصابة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لإنشاء شبكات الخلايا العصبية هندسيا بشكل منهجي كما منصات بيولوجية جديدة للاكتشاف المخدرات والتحقق من صحة الهدف. بل هو مقدمة للأسلاك مباشرة من واجهات الدماغ والجهاز قوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلف مارغريت H ماغديسيان هو الرئيس التنفيذي لشركة أناندا الأجهزة التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المادة.

Acknowledgments

نود أن نشكر يواشي مياهارا للعديد من المناقشات المفيدة والرؤى. ما و بغ تعترف بتمويل من نسيرك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Co-culture devices Ananda Devices Commercially available at http://www.anandadevices.com
Neuro devices Ananda Devices Commercially available at http://www.anandadevices.com
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round Warner Instruments 64-0705
35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated MatTex Incorporation P35G-0-20-C
35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile Corning Inc 430165
95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene Fisherbrand FB0875714G
50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps VWR 89039-656
15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile Falcon 352097
Neurobasal Medium Life Technologies 21103-049 Extracellular solution
B-27 Supplement (50X), serum free B-27 Supplement (50X), serum free 17504044 Extracellular solution
Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine Thermo Fisher Scientific  11995-065 Extracellular solution
200 μ L Pipettors VWR 89079-458
2 - 20 μL Pipettors Aerosol Resistant Tips 2149P
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] BD Falcon 357524
Glucose Gibco 15023-021 Extracellular solution
HEPES Sigma 7365-45-9 Extracellular solution/Beads
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 Extracellular solution
KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7 Extracellular solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Extracellular solution
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3 Extracellular solution
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm World Precision Instruments 500233
Dissection tools Braun, Aesculap
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P6407
Micro particles based on polystyrene, 10 μm Sigma-Aldrich 72986
Borosilicate tubes King Precision Glass, Inc. 14696-2
Horizontal Pipette Puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Micromanipulators, PCS-5000 Series SD Instruments MC7600R
1 mL Syringe BD Luer-Lok 309628
Inverted Microscope Olympus  IX71
Objective Olympus UIS2, LUCPLFLN 40X
CCD Camera Photometrics Cascade II: 512
Leibovitz's (1x) L-15 Medium Life Technologies 11415-064 Rat Dissection
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red Life Technologies 25300054 Rat Dissection
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] Life Technologies 11995-065 Rat Dissection
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] Life Technologies 14170-112 Rat Dissection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13, (4), 189-193 (2012).
  3. Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
  4. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, (3), 499-508 (2002).
  5. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108, (4), 1507-1516 (1989).
  6. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, (4), 1454-1468 (1988).
  7. Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36, (3), 979-987 (2016).
  8. Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29, (40), 12449-12466 (2009).
  9. Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
  10. General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
  11. Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
  12. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, (9), 1741-1754 (2012).
  13. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  14. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
  15. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  16. Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103, (3), 405-414 (2012).
  17. Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2, (4), 001925 (2010).
  18. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
  20. Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. 155-196 (1935).
  21. Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). 153-203 (1941).
  22. Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50, (4), 953-963 (1992).
  23. Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
  24. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  25. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  26. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27, (3), 135-155 (1995).
  27. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24, (36), 7978-7983 (2004).
  28. Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. Oxford University Press, USA. (1995).
  29. Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
  30. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics