न्यूरोनल सर्किट पुनर्जीवित: फास्ट न्यूरैट एक्सटेंशन और फंक्शनल न्यूरॉनल कनेक्शन के लिए एक नई विधि

Neuroscience

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Summary

यह प्रक्रिया बताती है कि माइक्रो-फ्लोट्यूइडिक कक्षों में नियोजित न्यूरिटियों को तेजी से शुरू, विस्तार और कनेक्ट करने के लिए कैसे पॉली-डी-लाइसिन-लेपित मोतियों का उपयोग माइक्रोप्रोप्टेट्स के लिए तय किया गया है जो कि न्यूरैट फैलेगेट को मार्गदर्शन करता है।

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Magdesian, M. H., Anthonisen, M., Lopez-Ayon, G. M., Chua, X. Y., Rigby, M., Grütter, P. Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection. J. Vis. Exp. (124), e55697, doi:10.3791/55697 (2017).

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Abstract

मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की चोट से स्थायी अक्षमता और मृत्यु हो सकती है क्योंकि यह अभी भी लंबी दूरी पर न्यूरॉन्स को पुनर्जन्म करने के लिए संभव नहीं है और उन्हें उचित लक्ष्य के साथ फिर से जोड़ने के लिए संभव नहीं है। यहां एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है कि लंबी दूरी पर नए फंक्शनल न्यूरोनल सर्किट को तेजी से आरंभ, बढ़ाना और सटीक रूप से जोड़ना। विस्तार दर 1.2 मिलीमीटर से अधिक तक पहुंच गई, जो कि परिधीय तंत्रिका तंत्र (0.02 से 0.04 मिमी / एच) से सबसे तेजी से बढ़ते अक्षरों के विवो दरों की तुलना में 30-60 गुना तेजी से 28 और 10 गुना तेज होती है, इससे पहले की तुलना में इसकी तुलना में 10 गुना तेज है विकास के पहले चरण में न्यूरॉनल टाइप 4 सबसे पहले, चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की पृथक आबादी माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में 2-3 सप्ताह के लिए विकसित होती है जिससे कि कोशिकाओं को सटीक रूप से पेश किया जा सके, जिससे आसान माइक्रोमैनलिपीलेशन और प्रयोगात्मक प्रजननशीलता को सक्षम किया जा सके। इसके बाद, पाली-डी-लाइसिन (पीडीएल) के साथ लेपित मोती न्यूरेट्स पर चिपकने वाले कंटेनर बनाने के लिए रखे जाते हैंकार्य और विंदुक micromanipulation के परिणामस्वरूप मनका- neurite जटिल ले जाने के लिए प्रयोग किया जाता है। जैसा कि मनका ले जाया जाता है, यह एक नया न्यूरेट निकालता है जिसे सैकड़ों माइक्रोमीटर तक बढ़ाया जा सकता है और 1 घंटे से कम समय में एक लक्ष्य सेल से कार्यात्मक रूप से जुड़ा हो सकता है। यह प्रक्रिया प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता और हेरफेर में आसानी बनाता है जबकि धीमी रासायनिक रणनीतियों को न्यूरेट विकास को प्रेरित करने के लिए छोड़कर। यहां प्रस्तुत प्रारंभिक मापन एक न्यूरोनल विकास दर को दर्शाता है जो शारीरिक स्तरों से अधिक है। इन नवाचारों के संयोजन से अभूतपूर्व नियंत्रण के साथ संस्कृति में न्यूरॉनल नेटवर्क की सटीक स्थापना की अनुमति मिलती है। यह एक नई पद्धति है जो न्यूरोनल नेटवर्क के भीतर सिग्नल ट्रांसमिशन और संचार के साथ-साथ न्यूरॉनल ग्रोथ की सीमाओं का पता लगाने के लिए एक खेल का मैदान होने के साथ-साथ सिग्नल ट्रांसमिशन और संचार की अधिक जानकारी और अंतर्दृष्टि के लिए दरवाजा खोलता है। न्यूरोना को फिर से जोड़ने का लक्ष्य रखने वाले चिकित्सा के लिए संभावित प्रभावों और प्रयोगों के प्रत्यक्ष प्रभाव के साथ व्यापक हैंएल सर्किट आघात के बाद या neurodegenerative रोगों में।

Introduction

वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की चोटों की वजह से कई तंत्रों की वजह से स्थायी अक्षमता हो सकती है जो अक्षतंतु रेग्रोथ 1 को सीमित करती हैं। चोट के बाद, कई सीएनएस अक्षतंतु एक नया विकास शंकु नहीं बनाते हैं और एक प्रभावी पुनर्योजी प्रतिक्रिया 2 माउंट करने में विफल हैं। इसके अलावा, सीएनएस घावों के आस-पास क्षति और निशान ऊतक काफी अक्षत वृद्धि 1 , 2 , 3 को बाधित करते हैं। चोट के बाद सीएनएस पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए वर्तमान उपचार घायल न्यूरॉन के आंतरिक विकास की क्षमता को बढ़ाने और मायेलिन मलबे और ग्लेल निशान 1 , 3 से जुड़े अक्षीय विस्तार के अवरोधकों को मास्क करने पर केंद्रित है। इसके बावजूद, लंबे अक्षरों को दूर के लक्ष्यों को पुनर्जीवित करने और उचित कार्यात्मक संक्रमणों को बनाने की क्षमता गंभीर रूप से सीमित होती है 4 , 5 , 6 , 7

वर्तमान कार्य में, लंबी दूरी पर नए फंक्शनल न्यूरोनल सर्किटों को तेजी से आरंभ, लम्बी और सटीक रूप से जुड़ने के लिए माइक्रोबॉइड्स, विंदुक माइक्रोमैनिप्युलेशन, और माइक्रॉफ़्लिडिक डिवाइस का उपयोग किया जाता है। पिछला काम से पता चला है कि पॉली-डी-लाइसिन-लेपित मोती (पीडीएल-मोती) ने झिल्ली के आसंजन को अन्तर्ग्रथनी पुटिका परिसरों के क्लस्टरिंग के बाद और कार्यात्मक प्रीसंन्प्टिक बॉटन 8 का निर्माण किया । यह भी दिखाया गया था कि जब प्रीपेनैप्टिक भेदभाव के बाद पीडीएल-मनका तंत्रिकी रूप से खींचा जाता है, तो अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन क्लस्टर मढ़ते, एक नया न्यूरेट 9 की शुरुआत करता है। निम्न प्रक्रिया इस तथ्य को साथ ही साथ एक न्यूरॉनल रिवायर करने के लिए पॉलिडीमेथाइलसिलोक्सीन (पीडीएमएस) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइसों का उपयोग कर एक कंडोली पर संगठित क्षेत्रों में संस्कृतियों के भ्रूण के हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की क्षमता के साथ काम करती है।सर्किट।

इन PDMS माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस गैर विषैले, ऑप्टिकली पारदर्शी होते हैं और माइक्रोचैनेल की एक प्रणाली से जुड़े दो कक्षों से मिलकर होते हैं। एक बार कंडोली पर इकट्ठा होने पर, प्रत्येक डिवाइस न्यूरोनल विकास की मार्गदर्शिका के रूप में कार्य करता है और इन विट्रो में 4 सप्ताह से अधिक समय तक सटीक पैटर्न पर स्वस्थ न्यूरोनल संस्कृतियों को बनाए रखता है।

यहां, एक रूपरेखा प्रस्तुत की गई है जिसमें नए न्यूरेट के विस्तार और कार्यक्षमता की सीमाओं की जांच करना है। नए, कार्यात्मक neurites बनाए गए हैं और (पुनः) तार neuronal नेटवर्क को नियंत्रित करने के लिए तैनात मिली विस्तार की दर 20 मिलीमीटर / मिनट से मिलीमीटर की दूरी पर होती है और कार्यात्मक कनेक्शन स्थापित होते हैं। ये परिणाम, अप्रत्याशित रूप से दिखाते हैं, कि विस्तार के लिए इन न्यूरियों की आंतरिक क्षमता पहले सोचा था कि पहले से कहीं ज्यादा तेज है। यह प्रस्तावित यांत्रिक दृष्टिकोण धीमी रासायनिक रणनीतियों को छोड़कर और एक विशिष्ट लक्ष्य को नियंत्रित कनेक्शन सक्षम बनाता है। गुतकनीक है कि चोटों के बाद न्यूरोनल कनेक्टिविटी को बहाल करने के लिए इनवेरो अध्ययन में इनवेस्ट्रॉल के नए रास्ते खुलता है। यह इन्रोरो में न्यूरॉनल सिग्नल प्रोसेसिंग और न्यूरोनल फ़ंक्शन के मौलिक पहलुओं की जांच करने के लिए न्यूरॉनल नेटवर्क के हेरफेर और रेविंग को भी सक्षम बनाता है।

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Protocol

नीचे दी गई सभी प्रक्रियाएं मैकगिल यूनिवर्सिटी की पशु देखभाल समिति द्वारा मंजूरी दे दी गई थीं और कनाडाई पशु परिषद परिषद के दिशानिर्देशों के अनुरूप हैं।

1. माइक्रोफ़्लुइड उपकरणों का उपयोग करने वाले न्यूरोनल कल्चर के मानकीकरण: उपकरण विधानसभा

  1. वांछित प्रयोग के लिए एक उपयुक्त माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस का चयन करें। एक ही आबादी के भीतर न्यूरॉन्स से जुड़ने के लिए, न्यूरो उपकरण ( चित्रा 1 ) का प्रयोग करें और विभिन्न जनसंख्या में न्यूरॉन्स को जोड़ने के लिए सह-सांस्कृतिक उपकरण ( चित्रा 6 ) का उपयोग करें।
  2. स्वच्छ और वांछित बाँझ coverslips या गिलास नीचे व्यंजन तैयार करें। प्लास्टिक सतहों पर अच्छे परिणाम के लिए 35 मिमी व्यंजन का उपयोग करें, गिलास का उपयोग 25 मिमी के कवरलिप्स या 35 मिमी कांच के नीचे के व्यंजन। इमेजिंग सिस्टम पर आधारित ग्लास मोटाई का चयन करें, उदाहरण के लिए 0.15 मिमी
  3. डिब्बों या कतरे का डिब्बे 0.5-1 एमएल के साथ 100 μg / एमएल पीडीएल के लिए 2 घंटे या रात भर कमरे में गुस्साature।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है और यदि वांछित हो तो अगले दिन फिर से शुरू हो सकता है। फर्टहेमोर, व्यंजन बोरेट बफर-पतला पीडीएल, पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल), लैमिनिन या किसी अन्य सेल आसंजन अणु के साथ लेपित हो सकते हैं।
  4. पानी से दो बार व्यंजन धो लें (फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) का उपयोग न करें क्योंकि नमक क्रिस्टल चैनल को अवरुद्ध कर सकते हैं), सभी तरल हटा दें और 5-10 मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट जैसे बाँझ वातावरण में सूखा दें सतह पूरी तरह सूखी है
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरतें कि कवर लिपियां बिल्कुल सूखी हों, क्योंकि शेष तरल माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम के अनुपालन में हस्तक्षेप करेगा।
  5. 10 मिनट के लिए एक बाँझ पर्यावरण (जैव सुरक्षा कैबिनेट) में पराबैंगनी प्रकाश के ऊपर का सामना करने वाले पैटर्न वाले माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस रखें। जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करते समय बाँझ प्रक्रियाओं का पालन करना सुनिश्चित करें 10
  6. चिमटी का प्रयोग एक माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस को रखता है, जो कि स्वच्छ कंसल के संपर्क में नीचे के पैटर्न के साथ होता हैआईपी ​​/ पकवान। चिमटी का उपयोग उपकरण को धीरे से दबाएं ताकि वह कांच का पालन करे।
    नोट: प्रकाश के विरुद्ध देखे जाने पर पालन किए गए क्षेत्र की पारदर्शिता दिखाई देगी। सुनिश्चित करें कि सभी कोने कांच से संपर्क कर रहे हैं यह सब माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों पर करें आकृति 1 ए देखें
  7. माध्यम के साथ एकल जनसंख्या डिवाइस को भरने के लिए, पिपेट को चैनलों के ऊपर इंगित करें और सीरम मुक्त बी -27 (वॉल्यूम अनुपात 1:50) और 500 ग्राम / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / ग्लूटामाइन (सामूहिक रूप से) के पूरक के साथ-साथ पूर्ण सेल माध्यम के 50 μL जोड़ें। एनबीएम कहलाता है), और उसके बाद दूसरे 50 μL को झुका हुआ झुका हुआ है। यह सभी उपकरणों के लिए करें, सुनिश्चित करें कि मध्यम कुओं के बीच बहती है। इसके बाद, शेष 2 कुओं में 50 μL मध्यम जोड़ें। चित्र 2a देखें
    1. मध्यम के साथ कई आबादी डिवाइस को भरने के लिए, पिपेट को चैनलों के ऊपर इंगित करें और 30 μL जोड़ेंसही एनबीएम से सही कुएं तक, चित्रा 6 ए देखें। यह सभी उपकरणों के लिए करें, सुनिश्चित करें कि मध्यम कुओं के बीच बहती है। इसके बाद शेष 50 कुओं को 50 μL मध्यम जोड़ें।
  8. एक बड़ी प्लेट में उपकरणों को आटोक्लेव पानी (गीला कक्ष) के साथ एक खुली डिश के साथ रखें और इनक्यूबेटर (1-2 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 95% नमी) में 1-2 घंटे के लिए सेल संस्कृति की तैयारी करते समय जगह करें। चित्र 2b देखें

2. माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में चढ़ाना न्यूरॉन्स

  1. रेफरी में रेखांकित प्रोटोकॉल के बाद 8 , स्प्रैग दावेली चूहे भ्रूण (या तो लिंग) से अलग-अलग हिप्पोकैम्पल या कॉर्टिकल न्यूरॉन्स प्राप्त करें।
  2. 1-2 मिलियन न्यूरॉन्स / एमएल की एकाग्रता में एनबीएम में भ्रूण न्यूरॉन्स को फिर से खोलें। माइक्रोस्कोप में एक हेमोसाइटोमीटर का प्रयोग करके और निम्नलिखित संदर्भ 8 में सेल सांद्रता की पुष्टि करें। सेल एकाग्रता accordin समायोजित करेंवांछित सेल घनत्व के लिए जी प्रति चैनल एकल हिप्पोकैम्पल एक्सॉन प्राप्त करने की संभावना में वृद्धि करने के लिए, डिवाइस प्रति प्लेट 10,000 न्यूरॉन्स। एक ही चैनल में कई एक्सॉन हैं, प्लेट प्रति डिवाइस 60,000 न्यूरॉन्स।
    नोट: ये संख्या न्यूरॉनल प्रकार के इस्तेमाल के अनुसार अलग-अलग होते हैं।
  3. कुओं को खाली किए बिना माइक्रोफ़्लुइड डिवाइस से मध्यम निकालें। प्रत्येक में लगभग 5 μL छोड़ दें
  4. एकल जनसंख्या डिवाइस में प्लेट कोशिकाओं के लिए, निचले दाएं खैर में 50 μL एनबीएम जोड़ें। इस बिंदु पर मध्यम कम प्रवाह अन्य निचले अच्छी तरह से भरने के लिए। चित्रा 1 बी में बताए अनुसार, माइक्रॉफ्लिडिक डिवाइस के शीर्ष दाईं ओर ध्यान केंद्रित सेल समाधान के 20 μL जोड़ें।
    1. एकाधिक जनसंख्या डिवाइस में प्लेट कोशिकाओं को चित्रा 6 ए में प्रत्येक अधिकार कुएं में एकाग्र सेल सेल के 20 μL जोड़ें।
  5. माइक्रोस्कोप में जांचें अगर कोशिकाएंकक्षों के अंदर हैं और सब्सट्रेट को सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए इनक्यूबेटर में डिवाइस को 15-30 मिनट के लिए रखें।
  6. यदि कक्षों में पर्याप्त कोशिकाएं हैं तो माइक्रोस्कोप में जांचें अगर ज़्यादा ज़रूरी हो, तो 2.4 और 2.5 चरण दोहराएं।
  7. एकल जनसंख्या डिवाइस के 2 शीर्ष कुओं और एनबीएम के 20 μL को एनबीएम के 50 μL को एक साथ जोड़ने के साथ ही कोशिकाओं को कई आबादी डिवाइस में इंजेक्ट किया गया था। मीडिया एक सकारात्मक मेस्किशन बनाने के लिए थोड़ा-थोड़ा फैलता है जिससे कुएं को एक मफिन शीर्ष पहलू देता है। दोबारा, चित्र 2a देखें
  8. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 95% आर्द्रता पर कोशिकाओं को बनाए रखें।

3. न्यूरोनल कल्चर को बनाए रखना

  1. कोशिकाओं से एनबीएम (मोटे तौर पर 30 μL पिपेट के साथ) निकालें और दिन के शुरू होने के बाद नए प्री-हॉट एनबीएम को लागू करें (जो चरण 2 के बाद 1 घ है)।
  2. प्रत्येक चैनल में पर्याप्त माध्यम होने पर हर 2 दिनों की जांच करें। यदि मफिन टीसेशन कम है सिर्फ शीर्ष कुओं में अधिक माध्यम जोड़ें।
  3. माइक्रोफ्लिडिक उपकरणों को हटाने से पहले कम से कम 7 डी के लिए संस्कृति कोशिकाओं। कोशिकाओं इन उपकरणों में कई हफ्तों के लिए जीवित रह सकते हैं। नमूने पर प्रयोग किए जाने से 1-2 दिन पहले उपकरणों को निकालें।

4. माइक्रोफ़्लुइड उपकरणों का हटाया जाना

  1. माइक्रो-फ्लूइडिक उपकरणों को हटाने से पहले 1 - 2 डी, प्रत्येक नमूना डिश में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एनबीएम की तैयारी करनी पड़ती है, कक्षों में बाढ़ आती है, और इनक्यूबेटर में उपकरणों को बनाए रखता है।
  2. न्यूरॉन्स के नमूनों के विन्यास को छोड़कर कवरलीप से माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को निकालने के लिए बाँझ चिमटी और एक टिप का उपयोग करें। अच्छी तरह से निचले बाएं कोने पर डिवाइस के किनारे को कसने के लिए कवच को कवर करने के लिए टिप का उपयोग करें और चिमटी को दबाएं। मसालेदार ढंग से मरोड़ लागू करते हैं, उपकरण को चिमटी के साथ ऊपर उठाकर बढ़ाया जाता है जिससे कि यह कंसलिप बंद हो जाए। चित्र 2 सी - 2 डी देखें
  3. प्रत्येक 2-3 दिनों में, हे प्रतिस्थापित करेंजब तक नमूना प्रयोगों के लिए प्रयोग नहीं किया जाता तब तक एनबीएम में एलएफ।
  4. न्यूरोनल आबादी को जोड़ने वाले कोई भी तंतु नहीं हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना पर प्रयोगों को रीवायरिंग करने से पहले, एकल जनसंख्या डिवाइस चैनलों में न्यूरिट्स और कई जनसंख्या डिवाइस में न्यूरॉनल आबादी माइक्रोस्कोप में अंतराल की जांच करके अलग-थलग हैं।

5. पीडीएल-लेपित मोती तैयार करना

  1. पीडीएल (100 माइक्रोग्राम / एमएल) में 1 एमएल (1: 500) पानी में पतला 4, 10 या 20 माइक्रोन पॉलीस्टाइन मोती या तो 2 एक्स 50 μ एल बूंदें जोड़ें। कमरे के तापमान पर कम से कम 2 घंटे के लिए छोड़ दें
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है और अगले दिन फिर से शुरू हो सकता है।
  2. 1 मिनट के लिए 8,820 xg पर समाधान अपकेंद्रित्र कंटेनर के नीचे संचित मोतियों को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को ध्यान से हटा दें।
  3. मोती को 1 एमएल बाँझ 10 एमएम HEPES पीएच 8.4 समाधान के साथ दो बार धोएं।
  4. 10 एमएम HEPES पीएच 8.4 के 200 एमएल में पीडीएल-लेपित मोती resuspend 8.4उपाय।

6. माइक्रोप्रोपेलेट तैयार करना

  1. क्षैतिज इलेक्ट्रोड खींचने वाले कांच केशिका ट्यूबों (1 मिमी भीतरी व्यास, 1.5 मिमी बाहरी व्यास) से पिपेट तैयार करें। सेटिंग्स समायोजित करें ताकि खींचा माइक्रोप्रोपेट के बाहरी टिप ~ 2-5 माइक्रोन हो। खींचने से पहले, सुनिश्चित करें कि ग्लास ट्यूब साफ हैं
  2. भंडारण के लिए कांच के स्लाइड्स के लिए पिपेट को ठीक करें और सुनिश्चित करें कि टिप स्लाइड की सतह से संपर्क नहीं करता है क्योंकि टिप नाजुक है। धूल से बचाने के लिए एक कंटेनर में कमरे के तापमान पर स्टोर करें। पिपेट का प्रयोग उसी दिन करें जिन्हें वे खींचा जाते हैं।

7. न्यूरॉन्स के लिए पीडीएल-मनका आसंजन

  1. चरण 4 में तैयार की गई एक सेल संस्कृति में चरण 5 में तैयार किए गए पीडीएल-लेपित मोती के 40-60 μL जोड़ें। न्यूरॉन्स पर विंदुक टिप करें, जो कसलीप पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, और मोती जोड़ते हैं ( चित्र 3 देखें)।
  2. SY के गठन को बढ़ावा देने के लिए 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर का नमूना वापस करेंनैपटिक संपर्क 8 , 9
  3. ऊष्मायन के बाद, पूर्व गर्म एनबीएम के साथ धीरे-धीरे संस्कृति को धोने से किसी भी गैर-अनुरक्षित मोती को हटा दें।

8. शारीरिक सॉलन समाधान तैयार करना (कक्ष तापमान प्रयोगों के लिए)

  1. सन्दर्भ 7 , 8 में सूचीबद्ध सामग्रियों के संयोजन से शारीरिक खारा समाधान तैयार करें। यह इनक्यूबेटर के बाहर सेल के वातावरण को विनियमित करना है।
  2. संदर्भों में बताए अनुसार ओएसएमएलआरटी और पीएच स्तर की पुष्टि करें 7 , 8
  3. प्रयोगों का संचालन करते समय पीएच में उतार-चढ़ाव को कम करने के लिए O 2 के साथ लगातार समाधान डालना।
  4. कमरे के तापमान पर गर्मी
  5. O 2 -infused शारीरिक समाधान में एक प्लास्टिक ट्यूब (वैकल्पिक आयाम) के एक छोर को सम्मिलित करके और अन्य ई निदान करके छिड़काव प्रणाली को स्थापित करेंनमूना धारक में डाला एक सुई के लिए एन डी। टयूबिंग और समाधान नमूना से अधिक रखें ( चित्रा 4 देखें)
    1. सुई से ट्यूब को डिस्कनेक्ट करें और इसे सिरिंज से कनेक्ट करें। ट्यूब को भरने के लिए दबाव डालने और तरल आकर्षित करने के लिए सिरिंज का उपयोग करें। रोलर क्लैंप से सील करें और सुई को फिर से कनेक्ट करें।

9. मनका Micromanipulation

  1. एक प्रायोगिक सेट-अप में नमूना स्थापित करें, इस तरह से कोशिकाओं को माइक्रोप्रोप्पुलेटर्स में माउंट किए गए दो माइक्रोप्रोप्टेट्स से ऊपर से पहुंचा जा सकता है और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के 40 एक्स चरण के उद्देश्य (0.6 का संख्यात्मक एपर्चर) के साथ ऑप्टिकली नीचे तक पहुंचा जा सकता है। इस विन्यास में माइक्रोस्कोप के साइड पोर्ट पर छवि कैप्चर के लिए एक सीसीडी कैमरा माउंट करें। प्लास्टिक टयूबिंग के माध्यम से प्रत्येक विंदुक को 1 एमएल सिरिंज से कनेक्ट करें। इस कदम पर, एनबीएम को शारीरिक खारा समाधान (1-2 एमएल) ( चित्रा 4 देखें) के साथ बदलें।
  2. अनुभव के दौरानमस्तिष्क, नियमित रूप से शारीरिक खारा समाधान के साथ कोशिकाओं को छिलकाएं जो चरण 1 9 में 0.5-1 एमएल / मिनट की दर से तैयार किया गया था।
  3. दृश्य के क्षेत्र में एक न्यूरॉन से जुड़ी एक पीडीएल-बीड का चयन करें। मादा पर ध्यान केंद्रित करके माइक्रोप्रोपेट टिप के साथ मोती संरेखित करें। सूक्ष्मदर्शी के माध्यम से इसकी निगरानी करके मोती को जितना संभव हो उतना करीब टिप नीचे लाएं।
  4. मोती लेने के लिए विंदुक से जुड़े 1 एमएल सिरिंज के साथ नकारात्मक दबाव लागू करें। प्रयोग के दौरान नकारात्मक दबाव बनाए रखें

10. न्यूरिट्स खींचने

  1. दृश्य के क्षेत्र में एक न्यूरॉन से जुड़ी एक पीडीएल-बीड का चयन करें और इसे चूषण का उपयोग करते हुए दूसरे माइक्रोप्रोपेत के साथ संलग्न करें जैसा कि चरण 9.3-9.4 में वर्णित है।
  2. धीरे-धीरे (~ 0.5 माइक्रोन / मिनट) पीडीएल-मनका-न्यूरॉन कॉम्प्लेक्स को या तो माइक्रोनिपुलेटर या नमूना चरण को 1 माइक्रोन तक ले जाना और 5 मिनट के लिए विराम दें न्यूरैट दीक्षा की अनुमति दें।
  3. चरण 10.2 दोहराएँ दो बार
    नोट: पहले 3 &# 181; मी को प्रायोगिक सफलता की गारंटी के लिए बहुत धीरे से खींचा जाना है, जो कि समय के 95% से अधिक होता है
  4. धीरे-धीरे (~ 0.5 माइक्रोन / मिनट) पीडीएल-मनका-न्यूरॉन कॉम्प्लेक्स को या तो माइक्रोमैनेप्युलेटर या नमूना चरण को 2 माइक्रोन तक ले जाने और 5 मिनट के लिए रोकें, न्यूरैट बढ़ाव की अनुमति दें।
  5. पहले 5 सुक्ष्ममापी के लिए सफल दीक्षा और न्यूरैट एक्सटेंशन के बाद, न्यूरैट को मिलीमीटर की दूरी पर 20 माइक्रोग्राम / मिनट पर खींचें।
    नोट: खींचना लगातार या चरणों में और अलग-अलग दरों पर किया जा सकता है। चित्र 5 बी -5 सी देखें

11. न्यूरॉन्स कनेक्ट करना

  1. न्यूरिट्स में समृद्ध क्षेत्र का चयन करें और पीडीएल-बीड-न्यूरेट कॉम्प्लेक्स को कम करें ताकि यह शारीरिक रूप से संपर्क कर सके। कवच की सतह के ऊपर टिप ऊंचाई को मापने के लिए अन्य मोती का उपयोग करें चित्र 5 डी देखें
  2. पीडीएल-मनका-न्यूरेट कॉम्प्लेक्स को लक्ष्य न्यूरैइट के संपर्क में छोड़ दो जबकि दूसरी माइक्रोफोन को जोड़करPette। नवनिर्मित न्यूरेट के शीर्ष पर दूसरे पीडीएल-बीड के साथ दूसरे पिपेट को कम करें, लगभग 20 माइक्रोन के रूप में पहले बीड बनाते हैं। नए न्यूरेट फिलामेंट को लक्ष्य सेल की तरफ खींचने के लिए दूसरे पीडीएल-बीड का प्रयोग करें।
  3. कम से कम 1 घंटे के लिए जगह में दोनों मोती पकड़ो फोकल सूजन की अनुपस्थिति को सत्यापित करें, सूक्ष्मदर्शी 16 के साथ मनका से संपर्क करने वाले न्यूरिटियों का एक मोटा होना।
  4. इस समय के दौरान, छिड़काव का उपयोग करने के लिए धीरे धीरे शारीरिक खारा से पूर्व गर्म, सीओ 2 -विभाषित एनबीएम नमूने के माध्यम को बदलने।
  5. चूषण जारी करके द्वितीय विंदुक से मनका रिलीज। यदि नया न्यूरेट संलग्न रहता है, तो पहले मनका को भी छोड़ दें। चित्र 5e देखें
  6. धीरे से खारा समाधान को हटा दें और एनबीएम (~ 2 एमएल) के साथ बदलें।
  7. भावी प्रयोगों के लिए न्यूरॉनल कनेक्शन को मजबूत करने के लिए इनक्यूबेटर में नमूना को ध्यान से वापस रखें। यह कनेक्शन> 24 घंटे 7 के लिए स्थिर है

12. पूरे सेल में पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के माध्यम से नई कनेक्शन की कार्यक्षमता की पुष्टि करना

  1. संदर्भों का पालन करें 7 , 18 , 1 9 । एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेट अप इकट्ठा करने के लिए
  2. संदर्भ 7 का पालन करें प्री- और पोस्टसीनैप्टिक इलेक्ट्रोड तैयार करने के लिए
  3. पैच दबाना डेटा इकट्ठा, फिर से निम्नलिखित संदर्भ 18 , 1 9
  4. कनेक्शन के प्रकार को निर्धारित करने के लिए स्वाभाविक रूप से होने वाले 7 संकेतों के परिणामों की तुलना करें।

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Representative Results

भ्रूणिक चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में सुसंस्कृत किया जाता है जिससे कि कोशिकाओं, पीडीएल-मोती और माइक्रोमैनिपूलर्स के सटीक स्थिति को सक्षम किया जा सके। पहला कदम एक ग्लास कंसलिप या डिश पर ठीक से माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को इकट्ठा करना है। यह आवश्यक है कि माइक्रोफ्ल्यूइडिक डिवाइस सब्सट्रेट से अच्छी तरह से जुड़ा हो ताकि कक्षों से बाहर निकलने वाली कोशिकाओं से बचने और डिवाइस के कुछ हिस्सों के नीचे आगे बढ़ने से रोक दिया जाए ( चित्रा 1 ए )। कई हफ्तों तक स्वस्थ संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए, हर 2-3 दिनों में सेल माध्यम की जाँच करके और मध्यम ( चित्रा 2 ए ) के एक सकारात्मक मेस्किन्स को संरक्षित करके मध्यम वाष्पीकरण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। एक बड़े प्लेट ( चित्रा 2 बी ) के अंदर दोनों कोशिकाओं और एक खुले डिश के पानी को रखने से मध्यम वाष्पीकरण भी बचा है। Microfluidic उपकरणों को किसी भी समय हटाया जा सकता है। इष्टतम परिणामों के लिए, एनबीएम सेल-डी में जोड़ा जाना चाहिएउपाध्यक्ष प्रणाली हटाने से पहले कम से कम 1 डी। यह सेलुलर तनाव को कम करता है क्योंकि न्यूरॉन्स आदर्श तापमान पर मध्यम के संपर्क में होते हैं और पीएच जब डिवाइस निकाल दिए जाते हैं। जब माइक्रोफ़्लिडिक डिवाइस धीरे-धीरे डिश ( चित्रा 2 सी और 2 डी ) कोशिकाएं नमूनों की स्थिति ( चित्रा 3 और चित्रा 5 ए ) में रहेगी।

दो प्रकार के माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग किया जाता है: न्यूरो डिवाइस और सह-संस्कृति डिवाइस। पहले कुल्हाड़ियों, डेंड्राइट्स और सेल बॉडीज की आसान पहचान सक्षम करता है। सोमा शीर्ष सोमा कक्ष में बना रहता है, जबकि axons और dendrites axonal चैम्बर की ओर microfluidic चैनलों ( चित्रा 5 ए ) के साथ बढ़ता है।

यह अनुशंसा की जाती है कि पीडीएल-मोती को 10: 1 के अनुपात में कोशिकाओं में जोड़ा जाये और यह सबसे अधिक मोती जो हा1 एच के ऊष्मायन ( चित्रा 3 ) के बाद एनबीएम के साथ कोशिकाओं को धोने से संस्कृति का पालन नहीं किया जाता है। न्यूरिटियों के लिए पीडीएल-बीड आइडियेशन के बाद, पीडीएल-बीड-न्यूरेट कॉम्प्लेक्स खींचा जाता है और बड़े दूरी पर विस्तार किया जा सकता है। नवनिर्मित न्यूरेट ठीक न्यूरिटी या सोमा मिलीमीटर दूर ( चित्रा 5 बी -5 ए ) से जुड़ा हो सकता है । 1 माइक्रोन / मिनट से कम की गति पर पहले 3 माइक्रोन के लिए एक नया न्यूरेट खींचने की सफलता दर> 95% (एन = 206) है नए न्यूरेट को दूसरे कक्ष में जोड़ने के लिए सफलता दर 70% (एन = 30) है। पहला 18 घंटे में कनेक्शन बहुत नाजुक है, मुख्य रूप से क्योंकि नया न्यूरेट 10 माइक्रोन पीडीएल-बीड द्वारा लंगर के व्यास में 1 माइक्रोग्राम से कम का रेशा है। यदि डिश के संपर्क के पहले मिनट के दौरान तेजी से चले जाते हैं, तो मध्यम के परिणामस्वरूप अशांति के कारण मनका को रोल किया जा सकता है और फलस्वरूप आसंजन खो जाना पड़ सकता है। हालांकि, अगर नमूना शा नहीं हैकेन, 30 मिनट में मनका डिश पर न्यूरिट्स को जोड़ता है और नया कनेक्शन कम से कम 48 घंटे तक रहता है। सेट अप के एक योजनाबद्ध के लिए आकृति 4 देखें

संस्कृति पर पीडीएल-बीड की स्थिति का उपयोग आसानी से जुड़े न्यूरेट ( आंकड़े 6 डी -6 ए) के स्थान की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है। शुरूआत, विस्तार और एक नए न्यूरेट, एक दूसरे, गैर-अनुरुप पीडीएल-मनका के कनेक्शन के बाद, माइक्रोमैनिपुलेटर के माध्यम से उठाया जाता है, आरंभिक न्यूरेट और दूसरी न्यूरोनल आबादी के बीच एक दूसरी आसंजन साइट बनाने के लिए उपयोग किया जाता है। दूसरा पीडीएल-मनका नई न्यूरैइट के शीर्ष पर रखा गया है, इस तरह यह नया न्यूरेट दूसरे न्यूरोनल आबादी 11 के संपर्क में आता है। यह दूसरे न्यूरोनल आबादी ( चित्रा 5 एफ ) के साथ आसंजन को बढ़ावा देगा।

बहु जनसंख्या डिवाइस एनएबीएक ही पकवान पर 4 पृथक न्यूरॉनल आबादी के विकास में वृद्धि। प्रत्येक न्यूरोनल आबादी को 4 x 7 मिमी की आयत में 100 या 200 माइक्रोन अंतराल ( चित्रा 6 ए ) द्वारा अन्य न्यूरोनल आबादी से अलग रखा गया है। स्वस्थ न्यूरॉन्स उपकरणों के अंदर कई हफ्तों तक बढ़ सकता है। आमतौर पर, डिवाइस को हटाने के बाद न्यूरोनल आबादी 48 घंटों तक अलग रहती है। 48 घंटे की अवधि के बाद, न्यूरॉन्स पड़ोसी न्यूरोनल आबादी की ओर बढ़ते हैं और प्राकृतिक कनेक्शन बनाती हैं। दो पृथक आबादी को जोड़ने से पहले, यह सत्यापित होना चाहिए कि दो न्यूरोनल आबादी ( चित्रा 6 बी) के बीच कोई संबंध नहीं है यह स्थापित करने के लिए कि माइक्रोस्कोप के साथ पूरे अंतराल की जांच करके वास्तव में आबादी वास्तव में अलग हो गई है।

कनेक्शन के बाद, नमूने 24 घंटे के लिए incubated थे और इलेक्ट्रिकल पूरे सेल युग्मित पैच दबाना रिकॉर्डिंग जांच के लिए आयोजित किया गया था कि क्या नवदो पृथक न्यूरोनल आबादी से जुड़ने के लिए इस्तेमाल किया गया न्यूरेट कार्यात्मक था और विद्युत संकेतों को संचारित करने में सक्षम था। जनसंख्या में एक न्यूरॉन, जिस साइट पर प्रेरित न्यूरेट शुरू किया गया था, उस स्थान से 100 μm से कम त्रिज्या स्थित है, जिसे पूर्व-पूर्व-क्रियात्मक ऐक्शन पोटेंशिअल (पीएपी) रिकॉर्ड करने के लिए चुना गया था। इस न्यूरॉन को पूर्वसंयोजन कोशिका माना जाता था। पोस्ट अन्तर्ग्रथनी उत्तेजक या निरोधक गतिविधि, अंतर की दूसरी तरफ, जनसंख्या दो में न्यूरॉन से दर्ज की गई, जो सूक्ष्म-सूक्ष्म कनेक्शन ( चित्रा 7 ए -7 सी ) की 100 माइक्रोन त्रिज्या से कम स्थित है। यांत्रिक रूप से प्रेरित कनेक्शन से प्राप्त रिकॉर्डिंग का विश्लेषण किया गया था और स्वाभाविक रूप से जुड़े न्यूरोनल आबादी और गैर-जुड़े आबादी ( चित्रा 7 ) से तुलना की गई थी। पीएपी के बाद विद्युत प्रतिक्रियाएं स्वाभाविक रूप से जुड़े हुए न्यूरॉन्स से दर्ज की गईं और micromanipulation द्वारा काफी अधिक है और अस्थायी रूप से प्री-एनानेटेटिकगतिविधि ( चित्रा 7 )।

आकृति 1
चित्रा 1: Microfluidic उपकरणों का उपयोग कर न्यूरॉनल कल्चर के मानकीकरण 7 ( ) डिवाइस असेंबली: जब सूक्ष्म सतह पर माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस ठीक से इकट्ठे होते हैं तो सभी कक्ष दिखाई देते हैं। ( बी ) सेल चढ़ाना: शीर्ष सही पर कोशिकाओं को प्लेटें और कोशिकाओं को बायीं कंधे की तरफ बढ़ना चाहिए। ( सी ) सेल घनत्व: चढ़ाना के बाद, माइक्रोस्कोप में जांचें, यदि कोशिकाओं की एकाग्रता पर्याप्त है ( डी ) संस्कृति में 1 डी के बाद, हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स अच्छी तरह से माइक्रोचैनल के करीब पालन करते हैं और न्यूरेट्स बनाने लगते हैं। कृपया एक बड़े पैमाने पर देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े के एर संस्करण

चित्र 2
चित्रा 2 : कई हफ्तों के लिए स्वस्थ न्यूरोनल संस्कृतियों का रखरखाव 7 ( ) हर 2-3 डी में मध्यम जोड़ें और माइक्रो्रोफ्लुइडिक कक्षों के ऊपरी कुएं में एक सकारात्मक मेस्किन रखें ताकि कोशिकाओं को पोषक तत्वों की लगातार आपूर्ति हो सके। ( बी ) एक बड़े प्लेट के अंदर कोशिकाओं को रखें, जिसमें वाष्पीकरण को कम करने के लिए पानी युक्त डिश होता है। ( सी ) बाँझ टिप और चिमटी का उपयोग करें ( डी ) आसानी से microdevices छील। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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चित्रा 3 : संस्कृतियों में पिपेट जमा करने की मोती का स्थान। एक बार microfluidic डिवाइस हटा दिया गया है, न्यूरॉन्स coverslip पर दिखाई दे रहे हैं। मोती जमा करते समय, पिपेट टिप की स्थिति बनाएं ताकि यह कोशिकाओं के बीच में हो। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: एक ठेठ न्युरैट-खींचने के सेट-अप की योजनाबद्ध नमूना एक (पाईज़ो-एक्ट्यूएटेड) चरण पर टिकी हुई है और इसे माइक्रोमैनिपुलेटर में 2 माइक्रोप्रेटेट्स के ऊपर से पहुंचा जा सकता है और प्लास्टिक टयूबिंग के माध्यम से 1 एमएल सिरिंज से जुड़ा हो सकता है। नमूना एक सीसीडी कैमरे से जुड़े उद्देश्य से नीचे ऑप्टिक रूप से उपयोग किया जाता है जो भेजते हैंएक सीपीयू के लिए छवियाँ एक इनलेट ट्यूब ऑक्सीजनयुक्त शारीरिक खारा समाधान नमूने के लिए फ़ीड करता है, जो इसे नीचे स्थित है, और एक सिरिंज से जुड़ी एक आउटलेट ट्यूब अतिप्रवाह की स्थिति में समाधान की वापसी की अनुमति देता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5 : न्यूरॉन्स और पिपेट माइक्रोमैनेटिलेशन के लिए पीडीएल-बीड आसंजन 7 ( ) न्यूरॉन्स सोमा और न्यूरेट्स की आसान पहचान की अनुमति वाले माइक्रोफ़्लुइडिक कक्षों को हटाने के बाद पैटर्न में व्यवस्थित रहते हैं। ( बी ) न्यूरियेट्स का पालन करने वाले पीडीएल-मोती के सूक्ष्म जननशक्ति नेरोइट दीक्षा, विस्तार ( सी ) और कनेक्शन ( डी )पिपेट से पीडीएल-बीड की रिहाई के बाद ( ) ( एफ ) दो पृथक न्यूरोनल आबादी (नीचे तीर) से संपर्क करने के बाद, एक दूसरा पीडीएल-बीड और विंदुक माइक्रोमैनिपुलेटर (शीर्ष तीर) का उपयोग दूसरे आसंजन बिंदु को स्थापित करने के लिए किया जाता है, कुछ सैकड़ों माइक्रोन अलग-अलग पहले संपर्क बिंदु बनाते हैं और कार्यात्मक गारंटी देते हैं कनेक्शन। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6 मल्टीपल पॉप्युलेशन डिवाइस और माइक्रोबैनिप्यूलेशन 7 का उपयोग करके दो अलग-अलग आबादी कनेक्ट करने के लिए नए न्यूरिट्स का आरंभ और विस्तार ( ) डिवाइस 4 न्यूरोनल आबादी को अलग करता है100 या 200 माइक्रोन प्रत्येक के 3 अंतराल के बीच ( बी ) डिवाइस को हटाने के बाद, एक अंतर का चयन करें और प्रमाणित करें कि कोई भी न्यूरेट्स 2 व्यक्ति आबादी से कनेक्ट नहीं करते हैं ( सी ) ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में दिखाई देने वाले प्रायोगिक सेट-अप के योजनाबद्ध, दो माइक्रोप्रोप्टेस की स्थिति और पीडीएल-लेपित मोती की उपस्थिति को इंगित करता है। ( डी ) विंदुक में नकारात्मक दबाव लगाने से, एक न्यूरोनल आबादी का पालन करने वाला पीडीएल-बीड विंदुक टिप से खींचा जाता है, जिससे एक नया न्यूरेट शुरू होता है। विंदुक में नकारात्मक दबाव बनाए रखने से, पीडीएल-मनका-न्यूरेट परिसर (हरा) खींचा जा सकता है, न्यूरैइट को बढ़ाया जा सकता है। ( ) पिपेट माइक्रोमैनिपुलेशन, नए न्यूरेट के विस्तार के विस्तार और एक नए न्यूरोनल आबादी के साथ संबंध बनाने का मार्गदर्शन करता है। दूसरी आबादी के लिए नए न्यूरेट के आसंजन को सुनिश्चित करने के लिए, पीडीएल-बीड (लाल) एक दूसरे विंदुक के साथ तैनात है जो कि ऊष्मायनित न्यूरेट और न्यूरो दोनों के ऊपर है।जनसंख्या जनसंख्या इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 7
चित्रा 7: नव प्रेरित, लम्बी और जुड़ी हुई न्यूरैट दो पृथक न्यूरोनल पॉप्युलेशन के बीच सूचना स्थानांतरित कर सकता है पृथक न्यूरॉनल आबादी पीडीएमएस माइक्रोप्रोसेसरों में 100 माइक्रोन अंतर से अलग की गई थी। दो जनसंख्या यांत्रिक हेरफेर ( ) के माध्यम से जुड़ी हुई थी, जो आबादी में एक न्यूरॉन से एक और एक न्यूरॉन आबादी के दो (अंतर के दूसरी तरफ) से सम्मिलित पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग को प्रदर्शन किया गया था, जो स्वाभाविक रूप से पार अंतर ( बी ) या रखरखाव के द्वारा गैर-जुड़ा रहनाअंतर ( सी ) युगल की रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि निशान प्रत्येक स्थिति (डीएफ) के लिए दिखाए जाते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

मानक माइक्रोमैनिपुलेशन और अभिनव माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करना, बड़ी दूरी पर नए फंक्शनल न्यूरोनल सर्किटों को तेजी से आरंभ, लम्बी और सटीक रूप से जोड़ने के लिए एक नई तकनीक विकसित की गई थी। पिपेट माइक्रोमैनिप्युलेशन सबसे तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशालाओं 4 , 13 में एक सामान्य उपकरण है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए असली चुनौती सूक्ष्म परिशुद्धता के साथ सेल संस्कृतियों को व्यवस्थित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के विकास के माध्यम से प्रयोग की अवधि (जो सप्ताह के क्रम पर हो सकती है) के लिए स्वस्थ, सटीक स्थित न्यूरोनल संस्कृतियों का मानकीकरण था। उच्च गुणवत्ता वाली सेल संस्कृतियां डेटा सत्यापन का आधारशिला हैं। यह आसान और तेज माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और संस्कृतियों और परिणामों के मानकीकरण में योगदान देता है। विवो में समान संगठन के साथ इन विट्रो में संस्कृति कोशिकाओं के लिए माइक्रोफ़्लुइड डिवाइस तैयार किए गए थे। एकल जनसंख्या डिवाइस सक्षम बनाता हैलंबी न्यूरिटियों का विकास और एक्सॉन, न्यूरिटी और सोमा की आसान पहचान माइक्रोफ़्लुइडिक कक्षों में चढ़ायी जाने वाली कोशिकाओं की संख्या न्यूरॉनल घनत्व को निर्धारित करती है। इसलिए, प्रत्येक डिवाइस प्रति कोशिकाओं को चढ़ाना करके चैनलों के करीब एकल न्यूरॉन्स की पहचान करना आसान है। एक चैनल के अंदर अक्षतंतु और एक एकल न्यूरॉन के एकाधिक dendrites बढ़ते हैं। डेन्ड्रैक्ट्स एक्सॉन 6 , 17 के मुकाबले कम से कम 5 बार बढ़ते हैं और विट्रो में 2-3 सप्ताह के बाद बढ़ते हैं, आमतौर पर चैनलों में उनकी वृद्धि 200 माइक्रोन तक सीमित होती है, जबकि तेज़ बढ़ते एक्सॉन 2 एमएम 17 से अधिक तक पहुंच सकते हैं। इसलिए, नमूने के लिए पीडीएल-मोतियों को जोड़ने के बाद, अनुमान लगाने में अपेक्षाकृत आसान है कि मोती ज्यादातर ऐशंस या एक्सॉन और डेन्ड्रैक्ट्स ( चित्रा 5 बी -5 एफ ) का पालन कर रहे हैं या नहीं। 200 माइक्रोन से छोटी न्यूरियों से जुड़ी पीडीएल-मोती खींचते समय नए एक्सॉन और डेन्ड्रैक्ट्स खींचने की अधिक संभावना हैआईआईएल में 500 माइक्रोन से अधिक न्यूरियेट्स से जुड़ी पीडीएल-मोती खींचते समय केवल नए एक्सॉन खींचने की बड़ी मुश्किलें हैं I कई आबादी वाले यंत्र कई हफ्तों तक स्वस्थ अलग आबादी की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वृद्धि के लिए उपयोगी है। चैनलों की यह प्रणाली 4 अलग-अलग सेल प्रकारों के अध्ययन के लिए या अलग-अलग उपचार वाली एक ही कोशिका की तुलना करने के लिए उपयोगी है।

इसके अलावा, एक नियंत्रित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल संस्कृति पर्यावरण सेल विश्लेषण और हेरफेर के लिए एक आदर्श ढांचा प्रदान करता है। डिश पर कोशिकाओं की सटीक स्थिति ब्याज के क्षेत्रों के साथ-साथ उन्मुखीकरण और नेविगेशन की सुविधा प्रदान करती है, ब्याज के इन क्षेत्रों के माध्यम से अंततः न्यूरैट दीक्षा साइट पर अभूतपूर्व नियंत्रण की अनुमति देती है। नियंत्रित सेल वितरण ने नवगठित कनेक्शन की कल्पना करना आसान बना दिया है और ऊष्मायन के बाद के दिनों में माइक्रोस्कोप के साथ नए कनेक्शन को खोजने के लिए बहुत तेज़ है। इसके अलावा, कोशिकाओं के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कॉन्फ़िगरेशनसोमा, डेंड्राइट्स या एक्सॉन 8 पर रासायनिक संकेतों की आसान और सटीक स्थिति, जैसे पीडीएल-लेपित मोती, सक्षम करें माइक्रोइफ्लिडिक उपकरणों में विकसित कोशिकाओं का इमेजिंग और विश्लेषण, सभी व्यंजनों में प्रत्यायित मानक सेल्युलर संगठन के कारण तेजी से होता है। इसके अलावा, उपकरणों को जैव-संगत, पारदर्शी और हटाने योग्य सामग्री से बना दिया जाता है, जिससे सभी दृश्य तरंग दैर्ध्यों पर इमेजिंग सक्षम हो जाता है और कई हफ्तों के लिए उपकरणों के अंदर सेल अस्तित्व बना सकता है। सेलुलर एलेज़ के लघुकरण भी कम कोशिकाओं के साथ अधिक डेटा इकट्ठा करने में मदद करता है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की कम मात्रा में खपत प्रति प्रयोग की आवश्यक कोशिकाओं की संख्या कम करती है और प्रयोगात्मक प्रभावकारिता बढ़ जाती है। उदाहरण के लिए, एक डिश में शायद 1 या 2 पृथक एक्सॉन के लिए एक माइक्रोस्कोप के साथ खोज करने में कई घंटे खर्च करने के बजाय, एकल जनसंख्या डिवाइस का उपयोग सेल नमूना प्रति 100 अलग-अलग ऐशंस तक पहुंचने के लिए किया जा सकता है। माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस एक छोटा विश्वसनीय और नियंत्रित नियंत्रित करते हैंकई संस्कृतियों के प्रदर्शन के लिए समय के साथ दुर्लभ नमूनों के विश्लेषण के पक्ष में सेल संस्कृति पर्यावरण।

इस तकनीक की संभावित विविधता में मादक द्रव्य की सीधे लगाव को माइक्रोप्रोपेट में शामिल किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, चूषण के माध्यम से टिप को मनका संलग्न करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है, लेकिन मनका को टिप से चिपकाया जा सकता है। गोंद बेहतर विकल्प है यदि टिप और मनका के बीच एक बेहद स्थिर कनेक्शन वांछनीय है, उदाहरण के लिए यदि बल माप सेंसर के रूप में विंदुक के प्रयोग से किया जाता है या अगर पीडीएल और न्यूरेट के बीच आसंजन की जांच मुख्य प्रायोगिक उद्देश्य है। एक अन्य नस में, चूषण फायदेमंद है क्योंकि यह न्यूरेट-बीड कॉम्प्लेक्स को बिना किसी प्लेसमेंट के बाद मनका को रिलीज करने की अनुमति देता है और इस प्रकार समानांतर में कई कनेक्शन बनाने में सक्षम बनाता है। सक्शन हाई थ्रिप्ट रिवायरिंग प्रयोगों के लिए साधन प्रदान करता है, अन्य हेरफेर तकनीकों जैसे कि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) 7 // सुपर> , 16 इस पद्धति के दोनों संशोधनों से न्यूरैट दीक्षा साइट को एक डैन्ड्रैक्ट के संपर्क में एक मनका बनाए रखने की अनुमति मिलती है, इसलिए सिंकैप्स बनते हैं। हालांकि, चरण 7 में बताए गए अनुसार कई मोतियों को शामिल करने की रणनीति हेरफेर चरण में समय बचाता है और अनुशंसा की जाती है कि अगर दीक्षा साइट पर सटीक नियंत्रण प्रयोग में अनावश्यक है।

भविष्य के शोध में विभिन्न साधनों की सीमाओं, जैसे तापमान नियंत्रण और नमूना पहुंच का समाधान करने की आवश्यकता हो सकती है। सेलुलर झिल्ली के मैकेनिकल गुण भिन्न तापमान 27 पर काफी भिन्न हो सकते हैं। आदर्श रूप से सभी प्रयोगों को न्यूरॉनल माध्यम और पर्याप्त परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस (सही सीओ 2 दबाव और आर्द्रता नियंत्रण) पर किया जाना चाहिए। हालांकि, बंद सेल इनक्यूबेटर का उपयोग करना संभव नहीं था, क्योंकि माइक्रोमैनिपुलेटर के लिए शीर्ष से नमूनों तक पहुंच आवश्यक हैमंच को स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोस्कोप और पक्ष से नीचे इसलिए कमरे के तापमान पर छिड़काव इस्तेमाल किया गया था। एक समान नस में, चूंकि सेट-अप में केवल 2 माइक्रोमैनिपूलर्स को समायोजित करने के लिए पर्याप्त स्थान है और एक कनेक्शन को स्थापित करने के लिए लगभग 1 घंटे लगते हैं, एक प्रयोग करने वाले प्रयोगों की संख्या की सीमा होती है। इस मुद्दे को एक मैनिपुलेटर के साथ संबोधित किया जा सकता है जो एक समय में एक से अधिक मढ़ा खींचती है। इस प्रोटोकॉल में एक और संभावित सुधार नमूना सतह से मनका-विंदुक जटिल की ऊंचाई को दर्ज करने की क्षमता है। ऐसा करने में असमर्थता, दूसरे मनका को नीचे लाने और इसे प्रेरित करने के लिए प्रेरित न्यूरैइट पर रखने के दौरान अशुद्धियों को जन्म दे सकता है। न्यूरेट युक्त अमीर इलाके में नए न्यूरेट के शीर्ष पर मढ़ा कम हो जाता है जब तक नयी न्यूरेट नहीं होता है और डिश पर ही फोकल प्लेन में झूठ होते हैं। नए न्यूरेट कभी मनका और डिश के बीच नहीं होता है, लेकिन हमेशा सेल विषय और मोती के बीच में होता है, इसलिए सम्पीडन कम हो जाती है। इसके अलावा,न्यूरैइट को सूक्ष्मदर्शी में 10 मिनट के लिए मनाया जाता है ताकि मूरा के न्यूरेट फोकल सूज का निर्माण हो सके। संदर्भ 16 में वर्णित के रूप में, सूजन की उपस्थिति न्यूरेटी अध: पतन को दर्शाती है। इसके बावजूद, एसिंस के दबाव में अलग-अलग दबाव लागू करने से शारीरिक परिवर्तन हो सकते हैं 16 , भावी अनुसंधान इन्हें रिफ्लेक्टर को फिक्स करके और AFM के तरीकों के साथ नमूना सतह पर लंबवत विस्थापन की निगरानी द्वारा विंदुक-जांच को अनुकूल बनाने पर ध्यान केंद्रित कर सकता है। अंत में, शायद इस प्रोटोकॉल के लिए सबसे बड़ी चुनौती है, हेरफेर किए गए कनेक्शन की कार्यक्षमता का परीक्षण करना। सबसे प्रत्यक्ष, विश्वसनीय और अच्छी तरह से स्थापित तकनीक पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग बनती है। हालांकि, नियमित रूप से जोड़ा पैच दबाना रिकॉर्डिंग की सफलता दर बहुत कम है (<25%) 18 पूरे सेल पैच क्लैंप में कई सेट अप हैं, जिसमें लंबे सेट अप समय, सीमित संख्या प्रयोगों / दिन, सीमित रिकॉर्डिंग समय (~ 30न्यूनतम), माप के बाद जोड़ा पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग और सेल की मृत्यु के लिए कम प्रायोगिक उपज। इन तकनीकी चुनौतियों के कारण माइक्रो -मैनलिपुलम बहुत कम है, पूरे सेल पैच क्लैंप युग्मित रिकॉर्डिंग की प्रयोगात्मक उपज। प्राकृतिक प्लेटफार्मों और तकनीकों को प्राकृतिक और सूक्ष्म संयोजी कनेक्शनों में न्यूरोनल गतिविधि को और अधिक सटीक रूप से उत्तेजित, रिकॉर्ड और तुलना करने के लिए आवश्यक है।

अक्षीय वृद्धि में तनाव का महत्व न्यूरॉएटॉमी के शुरुआती दिनों से जाना जाता है - यह उल्लेखनीय रूप से 20 को खींचने के रूप में दर्शाता है। शुरुआती भ्रूणीय विकास के दौरान न्यूरॉइट्स अपने लक्ष्य तक पहुंचने के लिए छोटी दूरी के माध्यम से पलायन करते हैं। जैसा कि अधिकतर कोशिकाओं को विभाजित और डुप्लिकेट होता है, एक्सॉन को निरंतर बलों के अधीन होता है ताकि उनकी लंबाई बढ़ाकर भ्रूण की वृद्धि 20 , 21 हो । कई समूहों ने neu को रासायनिक संकेतों और / या यांत्रिक तनाव लगाने से न्यूरेट विकास की सीमाओं का परीक्षण करने की कोशिश की है(समीक्षा के लिए 22 संदर्भ देखें) इन रिपोर्टों में 23 , 24 , 25 , 26 तथा साथ ही शारीरिक विकास के दौरान, न्यूरिट्स को एक सब्सट्रेट से जुड़े हुए निकाला जाता है। हमारे सेटअप में बड़ा अंतर यह है कि वर्तमान तकनीक में नए न्यूरॉइट्स में केवल दो आसंजन संपर्क होते हैं; आधार पर न्यूरेट न्यूरॉन से जुड़ा होता है और टिप पर न्यूरेट मोती से जुड़ा होता है। विस्तार के दौरान नए न्यूरेट के घटकों में खींचने वाले बलों को समायोजित करने के लिए सबसे प्रभावी तरीके से फैलाने की स्वतंत्रता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि इन प्रयोगों को न्यूरैट विच्छेदन और न ही गिरावट के कारण, अन्तर्ग्रथनी संपर्कों के निर्माण पर पिछले अध्ययनों के आधार पर और एक्सॉन के प्रतिरोध पर 16 दबाव को दिखाने के लिए कैसे माइक्रो-और नैनोटूल्स का उपयोग करनालगातार उचित बल के साथ neurites खींच। यहाँ वर्णित neurite विस्तार दर (परिधीय तंत्रिका तंत्र) (0.02 से 0.04 मिमी / एच) 28 से सबसे तेजी से बढ़ते अक्षरों के विवो दर से 30-60 गुना अधिक तेज है। इन विट्रो में एक ही न्यूरॉनल टाइप की तुलना में , यहां वर्णित अक्षीय विस्तार दर, विकास के पहले चरण (0.1 मिमी / एच) 4 में अन्य लेखकों द्वारा वर्णित विकास दर से 7.5 गुना तेज है। अलग-अलग प्रकार के न्यूरॉन्स को अलग-अलग आंतरिक दर पर ऐशंस का विस्तार करने के लिए पाया गया है जो कि कई गुना 29 के अनुसार भिन्न है। इसके अलावा, सेंट्रल नर्वस सिस्टम ऐक्शंस आमतौर पर विवो में 6 9 वीं और 3 डी संस्कृति में लक्ष्यों के निरंतरता के बाद अक्षीय वृद्धि के उच्च दर को खो देते हैं। इसलिए वर्तमान अक्षतंतु विस्तार तकनीक को विभिन्न न्यूरोनल प्रकारों के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए ताकि वे बेहतर समझ सकेंNeurite विस्तार की ई सीमाएं

पिपेट माइक्रोमैनिप्युलेशन और माइक्रॉफ़्लुइडिक डिवाइस, नए कार्यात्मक न्यूरिट्स बनाने और नियंत्रित स्थान या (पुनः) तार न्यूरॉनल नेटवर्क के लिए तकनीक का प्रदर्शन करते हैं। यह मंच व्यवस्थित, मानकीकृत माप के लिए आदर्श है। यह न्यूरॉन्स के जटिल नेटवर्क पर प्रत्यारोपण और प्रयोगों में विवो नियंत्रण में पेश करता है। मिली विस्तार की दर 20 मिलीमीटर / मिनट से मिलीमीटर की दूरी पर होती है और कार्यात्मक कनेक्शन स्थापित होते हैं। ये परिणाम, अप्रत्याशित रूप से दिखाते हैं, कि उनके साइटोस्केलेटल घटकों सहित विस्तार के लिए अक्षांश की आंतरिक क्षमता पहले से 10 , 11 , 12 की तुलना में बहुत तेज है। यह प्रस्तावित यांत्रिक दृष्टिकोण धीमी रासायनिक रणनीतियों को छोड़ देता है और इस प्रकार चोट के बाद न्यूरोनल कनेक्टिविटी को बहाल करने के लिए चिकित्सीय विकास के लिए एक बदलाव का प्रतिनिधित्व करता है।और इन विट्रो में उनके नियंत्रित अध्ययन के लिए कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क के सूक्ष्म-न्यूरोएन्जिनियरिंग के लिए इन परिणामों का पुनर्योजी चिकित्सा और न्यूरो-इंजीनियरिंग दृष्टिकोण पर भी एक बड़ा प्रभाव पड़ता है जो उपचार के लिए सीधे प्रभाव के साथ न्युरोनल सर्किट या न्यूरोडेनरेटिव रोगों में फिर से जोड़ने का लक्ष्य रखते हैं। यह मंच न्यूरॉन संचार, संकेत मॉडुलन के साथ-साथ विकास और उत्थान पर डेटा प्राप्त करने के लिए दरवाजे खोलता है। यह यंत्रवत् सीएनएस को पुनर्जन्मा करने का एक नया तरीका है और इसी प्रकार की तकनीक चोट के बाद समारोह की बहाली की अनुमति दे सकती है। इसके अलावा, इस तकनीक का इस्तेमाल तंत्रज्ञानी रूप से इंजीनियर न्यूरोनल नेटवर्क बनाने के लिए किया जा सकता है क्योंकि नशीली दवाओं के खोज और लक्ष्य सत्यापन के लिए उपन्यास जैवसै प्लेटफार्म। यह मजबूत मस्तिष्क मशीन इंटरफेस के सीधे तारों के लिए एक अग्रदूत साबित हुआ है।

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Disclosures

लेखक मार्गरेट एच Magdesian आनंद उपकरणों के सीईओ हैं जो इस अनुच्छेद में इस्तेमाल किए गए उपकरणों का उत्पादन करते हैं।

Acknowledgments

हम कई उपयोगी चर्चाओं और अंतर्दृष्टि के लिए योइची मियाहारा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। एमएसए और पीजी ने एनएसईआरसी से धन का स्वीकार किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Co-culture devices Ananda Devices Commercially available at http://www.anandadevices.com
Neuro devices Ananda Devices Commercially available at http://www.anandadevices.com
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round Warner Instruments 64-0705
35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated MatTex Incorporation P35G-0-20-C
35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile Corning Inc 430165
95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene Fisherbrand FB0875714G
50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps VWR 89039-656
15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile Falcon 352097
Neurobasal Medium Life Technologies 21103-049 Extracellular solution
B-27 Supplement (50X), serum free B-27 Supplement (50X), serum free 17504044 Extracellular solution
Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine Thermo Fisher Scientific  11995-065 Extracellular solution
200 μ L Pipettors VWR 89079-458
2 - 20 μL Pipettors Aerosol Resistant Tips 2149P
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] BD Falcon 357524
Glucose Gibco 15023-021 Extracellular solution
HEPES Sigma 7365-45-9 Extracellular solution/Beads
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 Extracellular solution
KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7 Extracellular solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Extracellular solution
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3 Extracellular solution
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm World Precision Instruments 500233
Dissection tools Braun, Aesculap
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P6407
Micro particles based on polystyrene, 10 μm Sigma-Aldrich 72986
Borosilicate tubes King Precision Glass, Inc. 14696-2
Horizontal Pipette Puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Micromanipulators, PCS-5000 Series SD Instruments MC7600R
1 mL Syringe BD Luer-Lok 309628
Inverted Microscope Olympus  IX71
Objective Olympus UIS2, LUCPLFLN 40X
CCD Camera Photometrics Cascade II: 512
Leibovitz's (1x) L-15 Medium Life Technologies 11415-064 Rat Dissection
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red Life Technologies 25300054 Rat Dissection
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] Life Technologies 11995-065 Rat Dissection
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] Life Technologies 14170-112 Rat Dissection

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References

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