Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu prosedür, nevrit uzamasını yönlendiren mikropipetlere sabitlenmiş poli-D-lizin kaplı boncuklar kullanarak mikroakışkan odacıklar içerisinde düzenlenen nöritlerin hızla nasıl başlatılacağını, genişletileceğini ve bağlanacağını açıklamaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Magdesian, M. H., Anthonisen, M., Lopez-Ayon, G. M., Chua, X. Y., Rigby, M., Grütter, P. Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection. J. Vis. Exp. (124), e55697, doi:10.3791/55697 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Beyin ve omurilik yaralanması kalıcı sakatlık ve ölümle sonuçlanabilir, çünkü nöronları uzun mesafelerde yeniden üretmek ve onları uygun bir hedefle doğru bir şekilde yeniden oluşturmak mümkün değildir. Burada yeni işlevsel nöronal devreleri uzun mesafelere hızla başlatmak, uzatmak ve tam olarak bağlamak için bir prosedür anlatılmıştır. Elde edilen uzatma hızları periferik sinir sisteminden (0.02 ila 0.04 mm / s) en hızlı büyüyen aksonların in vivo hızlarına göre 30 kat daha hızlı 1.2 mm / s üzerine ulaşır ve aynı için daha önce rapor edilenlerden 10 kat daha hızlıdır Gelişimin erken safhasındaki nöronal tip 4 . İlk olarak, sıçan hipokampal nöronlarının izole edilmiş popülasyonları 2-3 hafta boyunca mikroakışkan aygıtlarda yetiştirilir ve böylece hücrelerin hassas konumlandırılması kolay mikromanipülasyon ve deneysel tekrarlanabilirlik sağlar. Daha sonra, poli-D-lisin (PDL) ile kaplanmış boncuklar yapışkan madde oluşturmak üzere nevrit üzerine yerleştirilirEylemler ve pipet mikromanipülasyon elde edilen boncuk-nevrit kompleksi taşımak için kullanılır. Boncuk hareket ettikçe, yüzlerce mikrometreden uzatılabilen ve 1 saatten daha kısa bir sürede bir hedef hücrenin işlevsel olarak bağlanabilen yeni bir nevriti çıkartır. Bu süreç, nevrit büyümesini başlatmak için daha yavaş kimyasal stratejileri atlayarak, deneysel tekrarlanabilirlik ve manipülasyon kolaylığı sağlar. Burada sunulan ön ölçümler, nöronal büyüme oranını fizyolojik olanları aşmaktadır. Bu yenilikleri bir araya getirmek, benzeri görülmemiş derecede kontrol ile kültürdeki nöronal ağların kesin olarak oluşturulmasını sağlar. Sinir ağı içinde sinyal aktarımı ve iletişimi ile sinir ağının sınırlarını keşfetmek için bir oyun alanı olmanın yanı sıra, bol miktarda bilgi ve anlayışa kapı açan yeni bir yöntemdir. Potansiyel uygulamalar ve deneyler, nörona yeniden bağlanmayı amaçlayan terapiler için doğrudan etkileri olan yaygınL devrelerinde veya nörodejeneratif hastalıklarda.

Introduction

Erişkin merkezi sinir sistemi (CNS) yaralanmaları aksonal yeniden büyümeyi sınırlayan çoklu mekanizmalara bağlı kalıcı sakatlıklara neden olabilir 1 . Yaralanmadan sonra, birçok CNS aksonları yeni bir büyüme konisi oluşturmaz ve etkili bir rejeneratif yanıt 2 oluşturmaz. Dahası, MSS lezyonlarını çevreleyen hasar ve skar dokusu , aksonal büyümeyi 1 , 2 , 3 önemli ölçüde inhibe eder. Hasardan sonra SSS yenilenmesini teşvik eden güncel terapiler yaralı nöronun intrinsik büyüme potansiyelini arttırmaya ve miyelin enkazı ve glial skarla ilişkili aksonal uzantı inhibitörlerini maskelemeye odaklanmıştır 1 , 3 . Buna rağmen, uzun aksonları uzak hedeflere yeniden üretme kapasitesi ve uygun fonksiyonel sinapslar oluşturma kapasitesi ciddi derecede sınırlı kalır 4 , 5 , 6 , 7 .

Bu çalışmada, mikro kapsüller, pipet mikromanipülasyonu ve mikroakışkan aygıtlar, yeni işlevsel nöronal devreleri uzun mesafelere hızla başlatmak, uzatmak ve tam olarak birleştirmek için kullanılmaktadır. Önceki çalışma, poli-D-lizin kaplı boncukların (PDL-boncuklar), sinaptik vezikül komplekslerinin kümelenmesi ve işlevsel presinaptik butonların oluşumunu takiben membran yapışmasını indüklediğini göstermiştir 8 . Ayrıca, presinaptik farklılaşma sonrasında PDL-boncuk mekanik olarak çekildiğinde, sinaptik protein kümesi boncuk izleyerek yeni bir nörit başlatan 9 da gösterildi. Aşağıdaki prosedür, bu gerçeği, sıçanların embriyonik hipokampal nöronlarını, nöronalin tam olarak yeniden bağlanması için polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan aygıtları kullanarak lamel üzerinde organize bölgelere kültürleme yeteneği ile birlikte kullanmaktadırdevre.

Bu PDMS mikroakışkan aygıtları, zehirli değildir, optik olarak şeffaftır ve mikrokanalların bir sistemi ile bağlı iki bölmeden oluşur. Bir lamel üzerine monte edildikten sonra, her cihaz, nöronal büyümeyi yönlendirmek ve in vitro ortamda 4 haftadan daha uzun süre kesin kalıplarda sağlıklı nöronal kültürleri korumak için bir kalıp görevi yapar.

Burada, yeni nevritin uzantısı ve işlevselliğinin sınırlarını araştırmak için bir çerçeve sunulmuştur. Yeni, işlevsel nöritler, nöronal ağları kontrol ederek (yeniden) tellemek üzere oluşturulur ve konumlandırılır. Elde edilen uzatma oranları, milimetre ölçeğine göre 20 μm / dakikadan daha hızlıdır ve fonksiyonel bağlantılar kurulmuştur. Bu sonuçlar beklenmedik bir şekilde, bu nevritlerin uzama için içsel kapasitesinin önceden düşünülenden çok daha hızlı olduğunu göstermektedir. Bu önerilen mekanik yaklaşım yavaş kimyasal stratejileri atlar ve belirli bir hedefe kontrollü bağlantı sağlar. th, Yaralanmadan sonra nöron bağlantısını geri getirmek için yeni terapilerin in vitro çalışması için yeni yollar açıyor. Aynı zamanda, in vitro olarak nöronal sinyal işleme ve nöronal fonksiyonun temel yönlerini araştırmak için nöronal ağların manipülasyonunu ve yeniden kablolanmasını sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan tüm prosedürler McGill Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmış ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi kurallarına uymuştur.

1. Mikroakışkan Aygıtları Kullanarak Nöronal Kültürlerin Standardizasyonu: Aygıt Meclisi

  1. İstenen deney için uygun bir mikroakışkan aygıtı seçin. Aynı popülasyonda nöronları bağlamak için Nöron Cihazlarını ( Şekil 1 ) kullanın ve farklı popülasyonlarda nöronları bağlamak için Eş-Kültür Cihazlarını kullanın ( Şekil 6 ).
  2. Steril lamelleri veya cam altı yemekleri istediğiniz sayıda temizleyin ve hazırlayın. Plastik yüzeylerde en iyi sonucu elde etmek için, 35 mm tabaklar, cam kullanırken 25 mm lameller veya 35 mm cam alt tabaklar kullanın. Görüntüleme sistemine göre cam kalınlığını seçin, örneğin 0.15 mm.
  3. Bulaşıkları veya lamelleri 0,5-1 mL 100 ug / mL PDL ile 2 saat boyunca veya oda temperinde bir gece boyunca kaplayınature.
    Not: Protokol burada duraklatılabilir ve istenirse ertesi gün yeniden başlatılabilir. Furthemore, bulaşıklar borat tamponu ile seyreltilmiş PDL, Poly-L-Lizin (PLL), laminin veya herhangi bir başka hücre adezyon molekülü ile kaplanabilir.
  4. Bulaşıkları suyla iki kez yıkayın (tuz kristalleri kanalları tıkayabileceğinden fosfat tamponlu salin (PBS) kullanmayın), tüm sıvıyı alın ve 5-10 dakika biyogüvenlik kabini gibi steril bir ortamda kurutun. Yüzey tamamen kurudur.
    Not: kalan tüm sıvı mikroakışkan sistemlerin yapışmasına müdahale edecek şekilde lamelleri kesinlikle kuru olduğundan emin olmak için dikkatli olun.
  5. Modelleri mor ötesi ışıklı mikroakışkan cihazları UV ışığı altında steril bir ortamda (biyolojik güvenlik kabini) 10 dakika bekletin. Biyogüvenlik kabininde çalışırken steril prosedürlere uyduğunuzdan emin olun 10 .
  6. Cımbızın kullanılması, desenleri temiz örtülerle temas halinde aşağı bakacak şekilde mikro-akışkan bir cihaz yerleştirir.ip / çanak. Cihazı camın üzerine yapışacak şekilde yavaşça bastırmak için cımbız kullanın.
    Not: Yapışan bölgenin saydamlığı ışığa baktığınızda görülecektir. Tüm köşelerin camla temas ettiğinden emin olun. Bunu tüm mikroakışkan cihazlara uygulayın. Bkz. Şekil 1a .
  7. Tek popülasyon cihazını ortamla doldurmak için, pipete kanallara doğru bakınız ve serumsuz B-27 (hacim oranı 1:50) ve 500 μg / mL penisilin / streptomisin / glutamin (toplu olarak) takviye edilmiş 50 μL komple hücre ortamı ilave edin. NBM olarak adlandırılır) sağ üst kuyucuğa yerleştirin ve çapraz olarak kuyubaşıya başka bir 50 uL ekleyin. Ortamın kuyular arasında aktığından emin olarak bunu tüm cihazlar için yapın. Ardından kalan 2 kuyucuğa 50 μL orta madde ekleyin. Bkz. Şekil 2a .
    1. Birden fazla popülasyon cihazını ortam ile doldurmak için, pipet kanallarına doğru tutun ve 30 μLTam NBM'nin sağ kuyulara atanması için bkz. Şekil 6a . Ortamın kuyular arasında aktığından emin olarak bunu tüm cihazlar için yapın. Ardından kalan 4 oyuğa 50 μL orta madde ekleyin.
  8. Hücre kültürünü hazırlarken 1-2 saat boyunca otoklavlanmış su (ıslak oda) ve 37 ° C,% 5 CO 2 ve% 95 nem inkübatör yerleştirin açık bir çanak ile cihazları daha büyük bir plaka yerleştirin. Bkz. Şekil 2b .

2. Mikroakışkan Sistemlerde Nöron Kaplama

  1. Referansta açıklanan protokolün ardından. 8 , Sprague Dawley sıçan embriyolarından ayrılmış hippokampal veya kortikal nöronlar elde edin (ya cinsiyet).
  2. Embriyonik nöronları 1-2 milyon nöron / mL konsantrasyonda NBM'ye tekrar süspanse edin. Hemositometre ve referans 8 kullanarak mikroskopta hücre konsantrasyonlarını doğrulayın. Hücre konsantrasyonunu accordin ayarlayınG arzu edilen hücre yoğunluğuna getirir. Kanal başına tek bir hipokampal akson elde etme şansını artırmak için cihaz başına 10.000 nöron plaka yerleştirin. Aynı kanalda birden fazla akson olması için cihaz başına 60.000 nöron plak uygulayın.
    Not: Bu sayılar kullanılan nöronal türe göre değişir.
  3. Ortamı, kuyuları boşaltmadan mikroakışkan aygıtlardan çıkarın. Her biri yaklaşık 5 μL bırakın.
  4. Tek popülasyon cihazındaki hücreleri plaklamak için sağ alt kuyunun 50 uL NBM'sini ekleyin. Bu noktada orta, diğer alt kuyuyu doldurmak için kendiliğinden akar. Şekil 1b'de belirtildiği gibi, konsantre hücre çözeltisinin 20 uL'sini mikroakışkan aygıtın sağ üst kuyucuğuna ekleyin.
    1. Çok sayıda popülasyon cihazındaki plak hücrelerine, Şekil 6a'daki sağ çukurların her birine 20 μL konsantre hücre çözeltisi ekleyin.
  5. Mikroskopta hücreler varsa kontrol edinHücreler arasına yerleştirilir ve cihazları substrata hücre eklenmesini teşvik etmek için 15-30 dakika inkübatöre yerleştirir.
  6. Odacıkta yeterli hücre olup olmadığını mikroskopta kontrol edin. Daha fazla gerekiyorsa 2.4 ve 2.5 adımlarını tekrarlayın.
  7. Tek popülasyon cihazının 2 üst kuyusuna 50 uL NBM ekleyin ve hücrelerin birden çok popülasyon cihazına enjekte edildiği aynı kuyuya 20 uL NBM ekleyin. Ortamlar, pozitif bir menisküs oluşturmak üzere hafifçe çıkıntı yapar ve kuyuları bir kek üstü açı oluştururlar. Yine, Şekil 2a'ya bakınız.
  8. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 C02'de ve% 95 nemde muhafaza edin.

3. Nöronal Kültürlerin Korunması

  1. Hücrelerden NBM'yi (bir pipetle kabaca 30 μL) çıkartın ve cihazlara giriş yaptıktan sonraki gün yeni önceden ısıtılmış NBM uygulayın (adım 2'den sonra 1 d'dir).
  2. Her kanalda yeterli ortam varsa 2 günde bir kontrol edin. Eğer çörek tOp düşük, sadece üst çukurlara daha fazla orta katın.
  3. Mikroakışkan cihazların çıkarılmasından önce en az 7 gün boyunca kültür hücreleri. Hücreler bu cihazlarda birkaç hafta hayatta kalabilirler. Deneyler numuneler üzerinde gerçekleştirilmeden 1-2 gün önce cihazları çıkarın.

4. Mikroakışkan Cihazların Sökülmesi

  1. Mikroakışkan cihazların çıkarılmasından 1-2 gün önce, her bir numune çanağına önceden 37 ° C'ye ısıtılmış 2 mL NBM ekleyin, bölmeleri sular altında bırakın ve cihazları inkübatörde muhafaza edin.
  2. Nöronların desenli bir konfigürasyon bırakarak lamelleri mikroakışkan cihazları kaldırmak için steril cımbız ve bir ipucu kullanın. Lameri yerinde tutmak için ucu kullanın ve cihazın kenarını kuyunun sol alt köşesine tutturmak için cımbız kullanın. Torsiyonu dikkatli bir şekilde uygulayın, cımbızla cihazı yukarı kaldırın, böylece lamel soyulur. Şekil 2c - 2d'ye bakın.
  3. Her 2-3 günde, ha'yı değiştir.Numune kadar NBM deneyler için kullanılırsa.
  4. Örnek üzerinde tekrar kablolama deneyleri yapmadan önce, tek nüfuslu cihaz kanallarındaki nöritlerin ve birden fazla popülasyon cihazındaki nöronal popülasyonların, nöronal popülasyonları birbirine bağlayan filamentlerin olmamasını sağlamak için mikroskopta aralarındaki boşlukları inceleyerek izole edildiğini doğrulayın.

5. PDL kaplı Boncukların hazırlanması

  1. 1 mL PDL (100 μg / mL) suya (1: 500) seyreltilmiş 4, 10 veya 20 μm polistiren boncuklarından 2 x 50 μL damla ekleyin. Oda sıcaklığında en az 2 saat bekletin.
    Not: Protokol burada duraklatılabilir ve ertesi gün yeniden başlatılabilir.
  2. Çözümü 8,820 xg'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Kabın altındaki birikmiş boncukları rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
  3. Boncukları 1 mL steril 10 mM HEPES pH 8.4 solüsyonu ile iki kez yıkayın.
  4. PDL kaplı boncukları 200 mL, 10 mM HEPES pH 8.4 içinde tekrar süspansiyon haline getirinçözüm.

6. Mikroipipetlerin Hazırlanması

  1. Yatay bir elektrot çekici kullanarak cam kılcal tüplerden (1 mm iç çap, 1.5 mm dış çap) pipetler hazırlayın. Çekilen mikropipetin dış ucu ~ 2-5 μm olacak şekilde ayarları yapın. Çekmeden önce, cam tüplerin temiz olduğundan emin olun.
  2. Pipetleri saklamaya yönelik cam slaytlara sabitleyin ve ucu kırılgan olduğu için ucun slayt yüzeyine değmemesine dikkat edin. Tozdan korunmak için kapalı bir kapta oda sıcaklığında saklayın. Çekildikleri gün pipet kullanın.

7. Nöronlara PDL-boncuk Yapışması

  1. 4. adımda hazırlanan bir hücre kültürüne 5. adımda hazırlanan 40-60 μL PDL kaplı boncuk ekleyin. Lamel üzerinde hafifçe görünen nöronların üzerine pipet ucu koyun ( Şekil 3'e bakın).
  2. Sf oluşumunu teşvik etmek için numuneyi inkübatöre 1 saat geri getirinNaptik kontaklar 8 , 9 .
  3. Kuluçkadan sonra, önceden ısıtılmış NBM ile kültürü hafifçe yıkayarak yapışmamış boncukları çıkarın.

8. Fizyolojik Salin Çözeltisinin Hazırlanması (Oda Sıcaklığı Deneyleri için)

  1. Kaynaklar 7 , 8'de listelenen bileşenleri birleştirerek fizyolojik tuzlu su çözeltisi hazırlayın. Bu, inkübatör dışındaki hücre ortamını düzenlemek için.
  2. Referans 7 , 8'de gösterildiği gibi osmolarite ve pH düzeylerini doğrulayın.
  3. Deneyler yaparken pH dalgalanmalarını en aza indirgemek için çözeltiyi sürekli olarak O 2 ile infüze edin.
  4. Oda sıcaklığına ısıtın.
  5. Perfüzyon sistemini, bir plastik tüpün bir ucunu (isteğe bağlı boyutlar) O2 ile infüze edilen fizyolojik çözeltiye sokarak ve diğer eVe numune tutacağına bir iğne takın. Boruyu ve çözeltiyi numunenin üstünde yerleştirin (Bkz. Şekil 4 ).
    1. Boruyu iğneden ayırın ve bir şırıngaya bağlayın. Basınç uygulamak ve sıvıyı çekmek için tüpü doldurmak için şırıngayı kullanın. Silindir kelepçesiyle yapıştırın ve iğneyi tekrar bağlayın.

9. Boncuk Mikrom Manipülasyonu

  1. Numuneyi, deney hücrelerine hücrelere mikromanipülatörler üzerine monte edilmiş iki mikropipet ile erişilebilecek ve örneğin 40X fazlı bir objektifle (sayısal diyafram açıklığı 0.6 olan ters çevrilmiş optik mikroskop) optik olarak erişilebilecek şekilde monte edin. Bu konfigürasyonda, mikroskopun yan portuna görüntü yakalama için bir CCD kamera monte edin. Her pipeti 1 mL'lik enjektörlere plastik boru vasıtasıyla bağlayın. Bu aşamada, NBM'yi fizyolojik salin solüsyonu (1-2 mL) ile değiştirin (Bkz. Şekil 4 ).
  2. Tecrübe esnasındaAdım 8'de hazırlanan fizyolojik salin solüsyonu ile 0.5-1 mL / dakika oranında perfüze edin.
  3. Görünüm alanında bir nörona takılı DEĞİL bir PDL boncuk seçin. Boncuk üzerine mikro pipet üzerine odaklanarak boncuğu bir mikropipet ucuyla hizalayın. Ucu mikroskopta izleyerek boncuka olabildiğince yakın getirin.
  4. Boncuğu almak için pipete bağlı 1 mL şırınga ile negatif basınç uygulayınız. Deney boyunca negatif basınç uygulayın.

10. Neuritleri çekme

  1. Görünüm alanında bir nörona tutturulmuş bir PDL boncuk seçin ve adım 9.3-9.4'te açıklandığı gibi emmeyi kullanarak ikinci mikropipere takın.
  2. Nevrit başlatılmasına izin vermek için mikromanipülatörü veya numune aşamasını 1 μm ile yavaşça hareket ettirerek (~ 0.5 μm / dakika) PDL-boncuk-nöron kompleksini çekin ve 5 dakika bekleyin.
  3. Adım 10.2'yi iki kere tekrarlayın.
    Not: İlk 3 &# 181; zamanın% 95'inde gerçekleşen deneysel başarıyı garanti altına almak için çok yavaş çekilmeliyiz.
  4. Nevrit uzatılmasını sağlamak için mikromanipülatörü veya örnek tabakasını 2 μm ile yavaşça hareket ettirerek (~ 0.5 μm / dakika) PDL-boncuk-nöron kompleksini çekin ve 5 dakika bekleyin.
  5. İlk 5 μm için başarılı başlatma ve nörit uzatımı sonrasında, nöriti milimetre ölçekli mesafelerde 20 μm / dakika çekin.
    Not: Çekme işlemi sürekli veya aşamalı olarak ve farklı oranlarda yapılabilir. Bakınız Şekil 5b- 5c .

11. Bağlanma Nöronları

  1. Nörit bakımından zengin bir bölge seçin ve PDL-boncuk-nörit kompleksini fiziksel olarak onunla temas edecek şekilde indirin. Lamel sathının üstündeki ucu yüksekliğini ölçmek için diğer boncukları kullanın. Bakınız Şekil 5d .
  2. PDL-boncuk-nevrit kompleksini hedef nevritle temas halinde bırakın ve ikinci mikropi'yi manipüle edinPette. İkinci pipeti, ilk boncuktan yaklaşık 20 μm biçiminde yeni oluşan nevritin üzerine ikinci PDL boncukla indirin. Yeni nevrit filamanı hedef hücreye doğru itmek için ikinci PDL boncuk kullanın.
  3. Her iki boncuk da en az 1 saat tutulmalıdır. Odak şişmesi yokluğunu, boncukla temas eden nöritlerin kalınlaşmasını mikroskop 16 ile doğrulayın.
  4. Bu süre zarfında, örnek ortamını fizyolojik tuzlu sudan önceden ısıtılmış, CO2 ile dengelenmiş NBM'ye yavaşça değiştirmek için perfüzyon kullanın.
  5. Emmeyi bırakarak boncuğu ikinci pipetten ayırın. Yeni nörit bağlı kalırsa, ilk boncuk da serbest bırakın. Bakınız Şekil 5e .
  6. Hafifçe salin solüsyonu çıkarın ve NBM (~ 2 mL) ile değiştirin.
  7. Gelecekteki deneyler için nöron bağlantısını güçlendirmek için numuneyi kuluçka makinesine dikkatlice yerleştirin. Bu bağlantı> 24 saat 7 için sabittir 7

12. Tüm Hücreli Eşleştirilmiş Yama Kelepçesi Kayıtları İle Yeni Bağlantı İşlevselliklerinin Doğrulanması

  1. Referans 7 , 18 , 19'a uyun. Bir elektrofizyoloji kurulumu yapmak için.
  2. Referansları izleyin 7 . Pre-ve postsinaptik elektrotları hazırlamak.
  3. Yama klempi verilerini toplayın, yine 18 , 19 referanslarını izleyin.
  4. Bağlantı türünü belirlemek için sonuçları doğal olarak oluşan sinyallerle 7 karşılaştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Embriyonik sıçan hipokampal nöronları, hücrelerin, PDL boncuklarının ve mikromanipülatörlerin hassas konumlandırılmasını sağlamak için mikroakışkan aygıtlarda kültürlenir. İlk adım, bir cam lamel veya tabağa mikroakışkan cihazı düzgün bir şekilde monte etmektir. Mikroakışkan cihazın, hücrelerin odacıklardan çıkmasını ve mühürlenmesi gereken cihazın parçaları altında hareket etmesini önlemek için ( Şekil la ) alt tabakaya yapıştırılması esastır. Sağlıklı kültürleri birkaç hafta korumak için, her 2-3 günde bir hücre ortamını kontrol ederek ve pozitif menisküs ortamı koruyarak orta buharlaşmayı önlemek önemlidir ( Şekil 2a ). Orta buharlaştırma, hem hücreleri hem de açık bir su kabını daha büyük bir plaka içerisinde tutarak önlenir ( Şekil 2b ). Mikroakışkan cihazlar her an çıkarılabilir. En iyi sonucu elde etmek için hücreye NBM eklenmelidir-deCihaz kaldırmadan önce en az 1 gün önce yedek yardım sistemi. Cihazlar çıkarıldığında nöronlar ideal sıcaklıkta ve pH'da ortam ile temas ettiği için hücresel stres en aza indirgenir. Mikroakışkan cihazlar çanaktan yavaş yavaş soyulduğunda ( Şekil 2c Ve 2d ) hücreleri desenli konumda kalacaktır ( Şekil 3 ve Şekil 5a ).

İki tür mikroakışkan cihaz kullanılır: Nöro Cihazı ve Ortak Kültür Cihazı. Birincisi, aksonların, dendritlerin ve hücre cisimlerinin kolay tanımlanmasını sağlar. Aksamlar ve dendritler, aksonal bölüme doğru mikroakışkan kanalları ( Şekil 5a ) boyunca büyürken, soma üst soma odasında kalır.

PDL-boncukların hücrelere 10: 1 oranında eklenmesi ve bu boncukların çoğu ha1 saatlik kuluçkadan sonra hücreleri bir kez NBM ile yıkayarak çıkarın ( Şekil 3 ). Nöritlere PDL-boncuk yapışmasını takiben, PDL-boncuk-nevrit kompleksi çekilir ve büyük mesafelerde uzatılabilir. Yeni oluşturulan nörit kesin olarak nevritlere veya soma milimetre uzaklıklara bağlanabilir ( Şekil 5b- 5e ). Yeni bir nöritin ilk 3 μm için 1 μm / dk'dan daha düşük hızlarda çekilmesi için başarı oranı>% 95 (n = 206) 'dır. Yeni nöritin bir başka hücreye bağlanmasında başarı oranı% 70'dir (n = 30). Bağlantı ilk 18 saatte çok kırılganlık gösterir, çünkü esas olarak yeni nevrit 10 μm'lik bir PDL boncukla çaprazlanmış 1 μm'den daha az çapta bir filamenttir. Çanak, temasın ilk dakikalarında hızla hareket ederse, ortamın türbülansı dökülüp boncuğun kaybolmasına ve dolayısıyla yapışmanın kaybolmasına neden olabilir. Ancak, numune değilseKen, 30 dakika içinde boncuk çanak üzerindeki nöritlere bağlanır ve yeni bağlantı en az 48 saat kalır. Kurulum şeması için Şekil 4'e bakın.

Kültür üzerindeki PDL boncuk pozisyonu, bağlı nevritin yerini kolayca tanımlamak için kullanılabilir ( Şekil 6d-6e ). Başlatıldıktan sonra, başlatılan nevrit ve ikinci nöronal popülasyon arasında ikinci bir yapışma bölgesi oluşturmak için mikromanipülatör vasıtasıyla toplanan ikinci bir yapışkan olmayan PDL boncuk olan yeni bir nevritin uzatılması ve bağlanması kullanılır. İkinci PDL boncuk, yeni nevritin üstüne konur ve onu yeni nevritin sadece ikinci nöronal popülasyonla temas edecek şekilde sıkıştırır 11 . Bu, ikinci nöronal popülasyonla yapışmayı teşvik edecektir ( Şekil 5f ).

Birden çok popülasyon cihazı enabAynı çanakta 4 izole nöronal popülasyonun büyümesi. Her nöronal popülasyon, diğer nöronal popülasyonlardan 100 veya 200 μm boşluklarla ayrılmış 4 x 7 mm'lik bir dikdörtgenle sınırlıdır ( Şekil 6a ). Sağlıklı nöronlar cihazların içinde birkaç hafta büyüyebilir. Genellikle, nöronal popülasyonlar cihazın çıkarılmasından 48 saate kadar izole kalır. Bu 48 saatlik sürenin sonunda, nöronlar komşu nöronal popülasyonlara doğru büyümekte ve doğal bağlantılar oluşturmaktadır. İki izolasyon popülasyonunu bağlamadan önce, popülasyonların, iki nöronal popülasyon arasında hiçbir bağlantı olmadığına karar vermek için tüm boşluğu mikroskop ile inceleyerek gerçekten de izole edildiğinden emin olunmalıdır ( Şekil 6b ).

Bağlandıktan sonra numuneler 24 saat süreyle inkübe edildi ve elektrikli tüm hücre birleştirilmiş yama tutam kayıtları, yeniİki izole nöronal popülasyonun bağlanması için kullanılan oluşmuş nevrit, işlevsel ve elektrik sinyalleri iletebildi. Nüfusun birinde, indüklenen nevritin başlatıldığı yerden 100 um yarıçaptan daha az bir mesafede bulunan bir nöron, presinaptik aksiyon potansiyellerini (PAP'ler) kaydetmek için seçildi. Bu nöron presinaptik hücre olarak düşünülmüştür. Gazın ikinci tarafında, mikromanyetik olarak bağlantının 100 μm'den daha az yarıçapında bulunan, postsinaptik eksitatör veya inhibe edici aktivite, nüfus ikisinde kaydedildi ( Şekil 7a- 7c ). Mekanik olarak indüklenen bağlantılardan elde edilen kayıtlar analiz edildi ve doğal olarak bağlı nöronal popülasyonlardan ve bağlı olmayan popülasyondan elde edilen kayıtlarla karşılaştırıldı ( Şekil 7 ). PAP sonrası doğal olarak bağlı nörondan ve mikromanipülasyonla kaydedilen elektriksel yanıtlar, anlamlı olarak daha yüksektir ve presinaptik ile geçici olarak korelasyon gösterir( Şekil 7 ).

Şekil 1
Şekil 1: Mikroakışkan Aygıtları Kullanarak Nöronal Kültürlerin Standartlaştırılması 7 . ( A ) Cihaz montajı: Mikroakışkan cihazlar kuru bir yüzeye düzgün bir şekilde monte edildiğinde tüm odalar gözükür. ( B ) Hücre kaplaması: Hücreleri sağ üst köşeye yerleştirin ve hücreler sol kuyuya doğru hareket ettirin. ( C ) Hücre yoğunluğu: Kaplama işleminden hemen sonra, hücrelerin konsantrasyonu yeterlise mikroskopta kontrol edin. ( D ) Kültürde 1 gün sonra, hipokampal nöronlar mikrokanalların yakınında iyi yapışır ve nörit oluşturmaya başlarlar. Largayı görmek için lütfen tıklayınız. Bu rakamın bir sürümü.

şekil 2
Şekil 2 : Birkaç hafta boyunca sağlıklı nöronal kültürlerin bakımı 7 . ( A ) 2-3 d' lik bir ortam ekleyin ve mikroakışkan odaların üst kuyularına pozitif bir menisküs tutun, böylece hücreler sürekli bir besin kaynağı sağlayacaktır. ( B ) Orta buharlaşmayı azaltmak için hücreleri daha büyük bir tabağa koyun ve suyu içeren bir çanakla tutun. ( C ) Mikro cihazları kolayca soymak için steril uç ve cımbız kullanın ( d ). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

P_upload / 55697 / 55697fig3.jpg "/>
Şekil 3 : Boncukların Kültürlere Yerleştirdiği Pipet Yerleri. Mikroakışkan cihaz kaldırıldıktan sonra, nöronlar lamel üzerinde görülebilir. Boncukları yerleştirirken, pipet ucunu hücrelerin merkezinde olacak şekilde konumlandırın. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4: Tipik bir Neurit Çekme Seti Şeması. Numune, (piezo-aktive edilmiş) bir aşamada bulunur ve mikromanipülatörler içinde tutulan ve plastik boru vasıtasıyla 1 mL şırıngalara bağlanan 2 mikropipet ile yukarıdan erişilebilir. Numune, optik olarak bir CCD kamerasına bağlanan bir objektifle aşağıdan gönderilirS görüntülerini bir CPU'ya çevirir. Bir giriş tüpü, oksijenli fizyolojik tuzlu su solüsyonunu numunenin altına tutar; buna, bir şırıngaya bağlı bir çıkış borusu, taşma durumunda çözeltinin geri çekilmesini sağlar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5
Şekil 5 : Nöronlara ve Pipet Mikromanipülasyona PDL-boncuk Yapışması 7 . ( A ) Mikroakışkan odacıklar çıkarıldıktan sonra, soma ve nevritlerin kolay tanımlanmasına izin veren nöronlar düzen içinde kalmaya devam etmektedir. ( B ) Nöritlere yapışmış PDL boncuklarının mikromanipülasyonu, nörit başlatma, uzatma ( c ) ve bağlantı ( d )Ardından PDL boncuk pipet ( e ) serbest bırakılması. ( F ) İki izole nöronal popülasyona (alt ok) başvurduktan sonra ikinci bir PDL-boncuk ve pipet mikromanipülatörü (üst ok), birinci temas noktasından birkaç yüz mikron ayrık ikinci bir yapışma noktası oluşturmak ve fonksiyonelliği garanti etmek için kullanılır bağlantıları. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 6
Şekil 6 . Çoklu Nüfus Aygıtı ve Mikromanipülasyon Kullanılarak İki Yalıtımlı Nüfusun Bağlanması İçin Yeni Nöritlerin Başlatılması, Uzatılması ve Bağlanması 7 . ( A ) Cihaz 4 nöronal popülasyonu izole ederHer biri 100 veya 200 um'lik 3 boşluk arasında. ( B ) Cihazın çıkarılmasının ardından, bir boşluk seçin ve 2 ayrı popülasyonu hiçbir nevritin bağlamadığını onaylayın. ( C ) Optik mikroskopta görülebileceği üzere deney düzeneğinin şeması, iki mikropipet'in konumunu ve PDL kaplı boncukların varlığını gösterir. ( D ) Bir pipete negatif basınç uygulayarak, bir nöronal popülasyona yapışmış bir PDL boncuğu pipet ucuyla çekilir ve böylece yeni bir nevrit başlar. Pipet içindeki negatif basıncı koruyarak, PDL-boncuk-nörit kompleksi (yeşil) çekilebilir ve nevriti uzatabilir. ( E ) Pipet mikromanipülasyon, yeni nöritin boşluk üzerine uzatılmasına ve yeni bir nöronal popülasyonla bir bağlantı oluşturulmasına kılavuzluk eder. Yeni nevritin ikinci popülasyona yapışmasını sağlamak için, bir PDL-boncuk (kırmızı), uzatılmış nevrit ve nöro üzerinde, ikinci bir pipetle yerleştirilirNal nüfus. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 7
Şekil 7: Yeni Oluşturulan, Uzatılmış ve Bağlanmış Neurit, İki İzole Nöronal Popülasyon Arasında Bilgi Aktarabilir 7 . İzole edilmiş nöronal popülasyonlar, PDMS mikrodevrelerinde 100 um'lik bir boşluk ile ayrılmış olarak kültürlendi. Eşleştirilmiş yama kelepçesi kayıtları, popülasyon birinde bir nörondan (popülün diğer tarafında) olan nöronlardan tam hücre konfigürasyonunda, iki popülasyon mekanik manipülasyonla ( a ) bağlandığında, doğal popülasyonda Boşluk ( b ) veya maint tarafından bağlı kalmaya devam etBoşluğu incelemek ( c ). Eşleştirilmiş kayıtların temsili izleri her koşul için gösterilir ( df ). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Standart mikromanipülasyon ve yenilikçi mikroakışkan cihazları kullanarak, yeni işlevsel nöronal devreleri büyük mesafelerde hızlı bir şekilde başlatmak, uzatmak ve hassas bir şekilde bağlamak için yeni bir teknik geliştirildi. Pipet mikromanipülasyon, çoğu nörobilim laboratuvarında yaygın bir araçtır 4 , 13 . Yeniden üretilebilir ve güvenilir sonuçlar elde etmek için asıl meydan, mikrometre hassasiyetli hücre kültürleri düzenlemek için mikroakışkan aygıtların geliştirilmesi yoluyla deney süresince (haftalarca olabilir) sağlıklı, tam yerleştirilmiş nöronal kültürlerin standartlaştırılmasıydı. Yüksek kaliteli hücre kültürleri, veri geçerliliğinin temel taşıdır. Bu, daha kolay ve hızlı mikroskopi görüntüleme ve kültürlerin ve sonuçların standartlaştırılmasına katkıda bulunur. Mikroakışkan cihazlar , in vivo olarak benzer organizasyona sahip hücreleri kültür ortamında kültürlemek üzere tasarlandı. Tek nüfus aygıtı,Uzun nöritlerin büyümesi ve aksonlar, nevritler ve soma'nın kolay tanımlanması. Mikroakışkan bölmelerde kaplanan hücrelerin sayısı nöronal yoğunluğu belirler. Bu nedenle, cihaz başına daha az hücre kaplayarak kanallara yakın tek nöronların tanımlanması kolaydır. Tek bir nöronun akson ve çoklu dendritleri bir kanalda büyür. Dendritler, akson 6 , 17'den en az 5 kat daha yavaş büyür ve in vitro 2-3 hafta sonra kanallardaki büyümeleri genellikle 200 μm ile sınırlanırken, hızla büyüyen aksonlar 2 mm'nin üzerine çıkabilir 17 . Bu nedenle, numunelere PDL boncuk ekledikten sonra boncukların çoğunlukla aksonlara mı, aksonlara ve dendritlere mi yapıştığını tahmin etmek nispeten kolaydır ( Şekil 5b - 5f ). 200 um'den daha kısa nevritlere tutturulmuş PDL boncuklarını çekerken yeni akson ve dendritleri çekme şansları yüksektir.Ile 500 um'den daha uzun nevrizma bağlı PDL boncuklarını çekerken yalnızca yeni aksonları çekme ihtimali daha yüksektir. Birden fazla popülasyon cihazı, sağlıklı ayrılmış popülasyonların tekrarlanabilir büyümesi için birkaç hafta boyunca faydalıdır. Bu kanal sistemi, 4 farklı hücre türünü incelemek veya aynı hücreleri farklı muamelelerle karşılaştırmak için yararlıdır.

Dahası, kontrollü ve tekrarlanabilir bir hücre kültürü ortamı, hücre analizi ve manipülasyonu için ideal bir çerçeve sunar. Hücrelerin bir çanakta hassas bir şekilde konumlandırılması, ilgi alanlarının belirlenmesini kolaylaştırmakta ve nihai olarak nurite başlatma sahası üzerinde benzeri görülmemiş şekilde kontrol olanağı sağlayan bu ilgi alanları boyunca yönlendirme ve gezinme kolaylaştırmaktadır. Kontrollü bir hücre dağılımı, yeni oluşan bağlantıyı görselleştirmeyi kolaylaştırır ve inkübasyondan sonraki günlerde mikroskop ile yeni bağlantıyı bulmak için çok daha hızlıdır. Ek olarak, hücrelerin tekrarlanabilir konfigürasyonlarıPDL kaplı boncuklar gibi kimyasal ipuçlarının soma, dendritler veya aksonlar üzerinde kolay ve hassas konumlandırılmasını sağlar 8 . Birlikte ele alındığında, mikroakışkan aygıtlarda yetiştirilen hücrelerin görüntülenmesi ve analizi, tüm bulaşıklarda üretilen standart hücresel organizasyon nedeniyle daha hızlıdır. Ayrıca cihazlar, biyouyumlu, şeffaf ve çıkarılabilir materyalden yapılmıştır ve birkaç haftalık cihazlarda görünür dalga boylarında ve hücre sağkalımında görüntüleme imkanı sağlar. Hücre tahlillerinin küçültülmesi, daha az hücre ile daha fazla veri toplanmasına yardımcı olur. Mikroakışkan cihazların düşük hacimli tüketimi, deney başına gerekli olan hücre sayısını azaltır ve deneysel etkinliği arttırır. Örneğin, bir çanakta belki de 1 veya 2 izole akson için birkaç saat mikroskop ile arama yapmak yerine, tek popülasyon cihazı, hücre örneği başına 100'den fazla izole aksonza derhal erişmek için kullanılabilir. Mikroakışkan cihazlar, minyatürleştirilmiş güvenilir ve kontrollüHücre kültür ortamında nadir bulunan örneklerin analizine zaman kazandırarak çoklu testlerin yapılması.

Tekniğin potansiyel varyasyonları, boncukun mikropipete doğrudan bağlanmasını içerir. Mevcut protokolde, boncuğu emme yoluyla uca tutturmak için bir yöntem tarif edilmiştir, ancak boncuk da uça yapıştırılabilir. Eğer uç ölçüm cihazı ile boncuk arasında son derece dengeli bir bağlantı isteniyorsa tutkal daha iyi bir seçenektir, örneğin kuvvet ölçümleri pipet kullanılarak bir sensör kullanılarak yapılırsa veya PDL ile nörit arasındaki yapışmanın araştırılması ana deney amacıdır. Bir başka damarda, emme, nevrit-boncuk kompleksini koparmadan yerleştirmeden sonra boncuğun serbest bırakılmasına izin verdiği için avantajlıdır, böylece birçok bağlantı paralel yapılabilir. Emme, yüksek verimli yeniden iletme deneyleri için, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) gibi diğer manipülasyon tekniklerinde bir iyileştirme sağlar 7 </ Sup> , 16 . Bu yöntemin her iki modifikasyonu, sinirit başlatma alanının bir dendrite temas eden bir boncuk muhafaza ederek seçilmesine izin verir, böylece sinapslar oluşur. Bununla birlikte, 7. adımda anlatıldığı gibi birkaç boncuk kuluçka stratejisi manipülasyon aşamasında zaman kazandırır ve deneyde başlatma sahası üzerinde hassas kontrol gerekmiyorsa önerilir.

Gelecekteki araştırmalar, sıcaklık kontrolü ve numunenin erişilebilirliği gibi çeşitli enstrümantal sınırlamaları ele almaya çalışabilir. Hücresel membranın mekanik özellikleri, farklı sıcaklıklarda önemli ölçüde değişebilir 27 . İdeal olarak tüm deneyler 37 ° C'de nöronal ortamda ve yeterli koşullarda gerçekleştirilmelidir (doğru CO 2 basınç ve nem kontrolleri). Bununla birlikte, kapalı hücreli bir kuluçka makinesi kullanmak mümkün değildi, çünkü mikromanipülatörler için üstten numunelere erişim gerekliMikroskop için taban, sahneyi hareket ettirmek için ise yan taraftan. Bu nedenle oda sıcaklığında perfüzyon kullanıldı. Benzer bir şekilde, kurulumun sadece 2 mikromanipülatörü yerleştirmek için yeterli alana sahip olması ve tek bir bağlantı kurmak için neredeyse 1 saat sürmesi nedeniyle bir kişinin uygulayabileceği deney sayısının bir sınırı vardır. Bu sayı bir seferde birden fazla boncuk çeken bir manipülatörle ele alınabilir. Bu protokoldeki bir diğer potansiyel iyileştirme, numune yüzeyinden boncuk-pipet kompleksinin yüksekliğini kaydetme kabiliyetidir. Bunu yapamama, ikinci boncuğu indirirken ve bunu düzeltmek için onu indüklenen nevrit üzerine yerleştirirken yanılgılara yol açabilir. Boncuk, yeni nevritin üstünde, nörit açısından zengin bir bölgede, yeni nevrit ve tabak üzerindeki nesneler aynı odak düzlemine gelene dek indirilir. Yeni nevrit asla boncuk ve çanak arasında değil, daima hücre maddesi yastığı ile boncuk arasındadır, bu nedenle sıkıştırma azaltılır. Buna ek olarak,Yeni nevrit, boncuk çevresinde nörit odaksal şişmelerin oluşup oluşmadığını değerlendirmek için mikroskopta 10 dakika boyunca gözlemlenir. Referans 16'da tarif edildiği gibi şişme mevcudiyeti nevrit dejenerasyonunu belirtir. Bununla birlikte, aksonlara değişik basınç miktarları uygulandığında fizyolojik değişiklikler 16'ya yol açabileceği için, gelecekteki araştırmalar, reflektörleri kendilerine sabitleyerek ve AFM yöntemleri ile numune yüzeyine dikey yer değiştirmeyi izleyerek pipet-sondaları adapte etmeye odaklanabilir. Son olarak, belki de bu protokole karşı olan en büyük zorluk, manipüle edilmiş bağlantı işlevselliğini test etmektir. En direkt, güvenilir ve iyi kurulmuş teknik, çift hücreli patch clamp kayıtlarıdır. Bununla birlikte, düzenli eşlenmiş patch clamp kayıt başarısı oranı çok düşüktür (<% 25) 18 . Tam hücre yama kelepçesi, uzun kurulum süresi, sınırlı sayıda deney / gün, sınırlı kayıt süresi (~ 30Dak), çiftleştirilmiş yama tutucu kayıtlar için düşük deneysel verim ve ölçümlerden sonra hücre ölümü. Bu teknik zorluklar nedeniyle mikromanipülasyondan sonra tam hücre yama kelepçesi ile çift kayıtların deneysel verimi çok düşüktür. Doğal ve mikromanyetik olarak bağlanan bağlantılardaki nöronal aktiviteyi daha kesin bir şekilde uyarmak, kaydetmek ve karşılaştırmak için daha iyi platformlar ve teknikler gereklidir.

Aksonal büyümedeki gerginliğin önemi, nöroanatominin ilk günlerinden beri bilinir - buna pasif germe 20 denir. Erken embriyonik gelişim sırasında nöritler hedeflerine ulaşmak için küçük mesafelerden geçerler. Çoğu hücre bölünür ve çoğaltılır, aksonlar uzatmak ve boylarını embriyonik büyümeye ayarlamak için kesintisiz kuvvete maruz kalırlar 20 , 21 . Birkaç grup, neuite büyümesinin sınırlarını, neu'ya kimyasal ipuçları ve / veya mekanik gerilim uygulayarak test etmeye çalıştıRons (inceleme için referans 22'ye bakınız). Bu raporlarda 23 , 24 , 25 , 26 ve fizyolojik büyüme sırasında nöritler bir substrata tutturulurken çekilir. Kurulumumuzdaki en büyük fark, mevcut tekniğin yeni nöritlerin sadece iki yapışkan kontağının olmasıdır; Tabanda nörit nörona bağlanır ve uçta nevrit tapaya bağlanır. Uzama esnasında, yeni nevrit bileşenleri, çekme kuvvetlerini yerleştirmek için en etkin şekilde dağılma özgürlüğüne sahiptir. Daha da önemlisi, bu protokol, sinaptik temasların 8 oluşumuyla ilgili daha önceki çalışmalara ve basınçlara axonsın direncine dayanan nurite rüptürü veya dejenerasyona neden olmaksızın bu deneylerin nasıl çoğaltılacağını anlatmaktadır 16 , mikro ve nanotool'ların nasıl kullanılacağını göstermektedir.Nöritleri uygun kuvvetle sürekli çekin. Burada açıklanan nörit büyüme oranları (1.2 mm / saat) periferik sinir sisteminden en hızlı büyüyen aksonların (0.02 ila 0.04 mm / s) in vivo hızlarına göre 30-60 kat daha hızlıdır. In vitro aynı nöronal tip ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan aksonal ekspansiyon hızları, gelişmenin daha erken bir aşamasında (0.1 mm / s) diğer yazarlar tarafından tanımlanan büyüme oranlarının 7.5 kat daha hızlıdır4. Farklı türdeki nöronların, akson sayısını birkaç katına kadar değişen aksonları uzattığı bulunmuştur. Buna ek olarak, merkezi sinir sistemi aksonları genellikle in vivo 29 ve 3 d kültürü in vitro 6 hedef innervation sonra aksonal büyüme yüksek oranını kaybeder. Bu nedenle mevcut aksonal ekspansiyon tekniği, farklı nöronal tiplerle daha iyi anlaşılabilmesi için test edilmelidir.E nevrit uzantısı sınırları.

Pipet mikromanipülasyonu ve mikroakışkan aygıtlar, yeni işlevsel nevritleri yaratmak ve nöronal ağları kontrollü olarak konumlandırmak (veya yeniden telleştirmek) için gösterilen tekniklerdir. Bu platform sistematik, standartlaştırılmış ölçümler için idealdir. Nöronların karmaşık ağlarında deneylerde tekrarlanabilirlik ve in vivo kontrol sağlar. Elde edilen uzatma oranları, milimetre ölçeğine göre 20 μm / dakikadan daha hızlıdır ve fonksiyonel bağlantılar kurulmuştur. Bu sonuçlar beklenmedik bir şekilde aksonların uzamaya yönelik intrensek kapasitesinin, bunların sitoskeletal bileşenleri dahil olmak üzere, önceden düşünülenden 10 , 11 , 12'den daha hızlı olduğunu göstermektedir. Bu önerilen mekanik yaklaşım yavaş kimyasal stratejileri atlar ve böylece yaralanmadan sonra nöron bağlantısını geri getirmek için terapötik gelişmeler için paradigma kaymasını temsil ederVe in vitro kontrollü çalışma için yapay sinir ağlarının mikro-nöro-mühendisliği için. Bu sonuçların, rejeneratif tıp ve nöro-mühendislik yaklaşımları üzerinde, travmadan sonra veya nörodejeneratif hastalıklarda nöronal devreleri yeniden bağlamayı amaçlayan terapiler için doğrudan etkileri ile de büyük etkisi vardır. Bu platform, nöron iletişimi, sinyal modülasyonunun yanı sıra büyüme ve yenilenme hakkında veri edinme kapısını açar. Mekanik olarak CNS yenilenmesinin yeni bir yoludur ve benzer teknikler yaralanmadan sonra işlevin yeniden kazanılmasına izin verebilir. Ayrıca, bu teknik, ilaç keşfi ve hedef doğrulama için yeni biyoassay platformları olarak sistematik olarak tasarlanmış nöronal ağlar oluşturmak için kullanılabilir. Sağlam beyin-makine arayüzlerinin doğrudan bağlantısının öncüsüdür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar Margaret H Magdesian, bu Maddede kullanılan araçları üreten Ananda Devices'ın CEO'udur.

Acknowledgments

Yoichi Miyahara'ya çok sayıda faydalı tartışma ve fikirler için teşekkür etmek istiyoruz. MA ve PG, NSERC'den finansman sağladığını onayladı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Co-culture devices Ananda Devices Commercially available at http://www.anandadevices.com
Neuro devices Ananda Devices Commercially available at http://www.anandadevices.com
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round Warner Instruments 64-0705
35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated MatTex Incorporation P35G-0-20-C
35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile Corning Inc 430165
95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene Fisherbrand FB0875714G
50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps VWR 89039-656
15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile Falcon 352097
Neurobasal Medium Life Technologies 21103-049 Extracellular solution
B-27 Supplement (50X), serum free B-27 Supplement (50X), serum free 17504044 Extracellular solution
Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine Thermo Fisher Scientific  11995-065 Extracellular solution
200 μ L Pipettors VWR 89079-458
2 - 20 μL Pipettors Aerosol Resistant Tips 2149P
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] BD Falcon 357524
Glucose Gibco 15023-021 Extracellular solution
HEPES Sigma 7365-45-9 Extracellular solution/Beads
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 Extracellular solution
KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7 Extracellular solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Extracellular solution
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3 Extracellular solution
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm World Precision Instruments 500233
Dissection tools Braun, Aesculap
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P6407
Micro particles based on polystyrene, 10 μm Sigma-Aldrich 72986
Borosilicate tubes King Precision Glass, Inc. 14696-2
Horizontal Pipette Puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Micromanipulators, PCS-5000 Series SD Instruments MC7600R
1 mL Syringe BD Luer-Lok 309628
Inverted Microscope Olympus  IX71
Objective Olympus UIS2, LUCPLFLN 40X
CCD Camera Photometrics Cascade II: 512
Leibovitz's (1x) L-15 Medium Life Technologies 11415-064 Rat Dissection
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red Life Technologies 25300054 Rat Dissection
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] Life Technologies 11995-065 Rat Dissection
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] Life Technologies 14170-112 Rat Dissection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13, (4), 189-193 (2012).
  3. Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
  4. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, (3), 499-508 (2002).
  5. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108, (4), 1507-1516 (1989).
  6. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, (4), 1454-1468 (1988).
  7. Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36, (3), 979-987 (2016).
  8. Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29, (40), 12449-12466 (2009).
  9. Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
  10. General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
  11. Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
  12. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, (9), 1741-1754 (2012).
  13. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  14. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
  15. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  16. Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103, (3), 405-414 (2012).
  17. Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2, (4), 001925 (2010).
  18. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
  20. Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. 155-196 (1935).
  21. Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). 153-203 (1941).
  22. Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50, (4), 953-963 (1992).
  23. Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
  24. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  25. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  26. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27, (3), 135-155 (1995).
  27. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24, (36), 7978-7983 (2004).
  28. Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. Oxford University Press, USA. (1995).
  29. Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
  30. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics