Метаболизм Glycoengineering, сиаловые кислоты, с помощью N-ацил-изменение Mannosamines

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Сиаловая кислота — это типичный моносахаридов единица в гликоконъюгаты. Он участвует в многочисленных молекулярных и клеточных взаимодействий. Здесь мы представляем метод изменения клеток поверхности сиаловая кислота выражение с использованием метаболических glycoengineering с N- acetylmannosamine производных.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Сиаловая кислота (Sia) является очень важной составляющей гликоконъюгаты, как N-, O- гликанов или гликолипидов. Благодаря своей позиции в Термини-уменьшение олиго - и полисахаридов, а также его уникальных химических характеристик сиаловая кислота участвует в множество различных рецептор лиганд взаимодействий. Изменяя выражение сиаловые кислоты на поверхности клеток, поэтому будет влиять сиаловая кислота зависимые взаимодействия. Это может быть полезно исследовать сиаловая кислота зависимые взаимодействия и имеет потенциал, чтобы влияние некоторых заболеваний в выгодным способом. Через обменные glycoengineering (MGE) можно модулировать выражение сиаловые кислоты на поверхности клеток. Здесь клетки, ткани или даже целые животных относятся с C2-модифицированные производные N- acetylmannosamine (ManNAc). Эти аминокислоты сахара выступать в качестве прекурсоров молекулы сиаловые кислоты и поэтому метаболизируется до соответствующих видов сиаловая кислота и выразил на гликоконъюгаты. Применяя этот метод производит интригующим воздействие на различных биологических процессов. Например он может резко сократить выражение polysialic кислоты (polySia) в обработанных нейрональных клеток и таким образом влияет на нейрональных роста и дифференцировки. Здесь, мы показываем химического синтеза двух наиболее распространенных производных - acylmannosamine C2-изменение N, N- propionylmannosamine (ManNProp), а также N- butanoylmannosamine (ManNBut) и далее показать, как эти ненатуральных Амино сахара могут быть применены в культуре клеток экспериментов. Выражение видов модифицированных сиаловая кислота количественно высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и далее анализируется через масс-спектрометрии. Воздействие на polysialic кислоты выражение освещены через западную помарку использование коммерчески доступных polysialic кислоты антитела.

Introduction

Сиаловая кислота является моносахаридов, которые обычно могут быть найдены на-уменьшение Термини гликоконъюгаты, как N-, O- гликанов или гликолипидов. Среди всех моносахаридов сиаловая кислота имеет некоторые уникальные химические характеристики. Она имеет 9 C-атом позвоночника, карбоксильные группы в положении C-1, что депротонированная и тем самым отрицательно заряженных в физиологических условиях и аминокислоты функцию в C-5 положении. Хотя более 50 естественные варианты сиаловые кислоты характеризовались Дата1, преобладающей формой сиаловые кислоты найдены в организме человека является N- ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac). Другие млекопитающие также выразить большее количество N- glycolylneuraminic кислоты (Neu5Gc)2,3.

Благодаря своей открытой позиции в гликоконъюгаты сиаловая кислота участвует во множестве рецептор лиганд взаимодействий, например, зависимые привязки гемагглютинина вируса гриппа принимающей ячейки4. Сиаловая кислота epitope с важных биологических функций, особенно во время эмбриогенеза и в нервной системе, является polysialic кислоты. Polysialic кислота является полимером до 200 альфа 2,8-связаны сиаловых кислот. Основной белок перевозчик polysialic кислоты является нейронных клеток молекулы адгезии (NCAM). Polysialic кислоты выражение модулирует адгезивные свойства NCAM в том, что выражение polysialic кислоты уменьшает адгезию и повышает пластичность нервной системы5.

Изменения в выражении (поли) сиаловые кислоты будет в конечном итоге влияет на множество различных биологических взаимодействий. Это могут быть использованы для изучения известных сиаловая кислота зависимых процессов на молекулярном уровне, чтобы раскрыть Роман гликоконъюгаты взаимодействия, или исследовать возможные терапевтические подходы. Существуют различные методы, которыми можно модулировать выражение сиаловые кислоты на поверхности клетки, например лечение с конкретным основу сиаловая кислота (sialidases), ингибирование ферментов, участвующих в биосинтезе сиаловая кислота6 ,7,8, или стучать вниз или изменение выражения ключевых ферментов биосинтеза сиаловая кислота9.

Еще один универсальный метод, чтобы модулировать сиаловая кислота выражение является MGE (также известный как метаболические олигосахарида инжиниринг, МО). Здесь клетки, ткани или даже животные лечатся ненатуральных производные ManNAc, которые несут C2-аминокислоты изменения. Будучи прекурсоров молекулы для сиаловая кислота, после клеточного поглощения, эти ManNAc аналогов однонаправленный метаболизируется ненатуральных сиаловые кислоты и может быть выражена на sialylated гликоконъюгаты. Клетки лечат ManNAc производные, перевозящих алифатических C2-модификации, такие как ManNProp или ManNBut, N- propionylneuraminic кислоты (Neu5Prop) или N- butanoylneuraminic кислоты (Neu5But) в их гликоконъюгаты10 , 11. с помощью функциональных групп представлен в C2-положение ManNAc, происходя ненатуральных сиаловые кислоты могут быть связаны, например, через Штаудингера перевязки или азид среднесульфидная циклоприсоединения, флуоресцентными красителями и поэтому визуализируется на поверхности клеток12.

Выражение этих ненатуральных сиаловые кислоты имеет интригующий воздействие на многие биологические процессы, включая возбудителя инфекции, адгезии и миграции опухолевых клеток, общей клеточной адгезии, а также васкуляризации и дифференциации (для обзора см.: Wratil и др. 13). интересно, что МГЕ с N-ацил изменения mannosamines может также использоваться для вмешиваться с выражением polysialic кислоты. Polysialic кислота вырабатывается два разных polysialyltransferases (ST8SiaII и ST8SiaIV). Было продемонстрировано, что polysialyltransferase ST8SiaII тормозится неестественным сиаловая кислота прекурсоров, таких как ManNProp или ManNBut14,15. Кроме того было продемонстрировано в клетках человека нейробластомы ManNProp или ManNBut приложений также снижает sialylation всего15.

МГЕ с N-ацил изменения mannosamines это легко применять метод, который успешно используется, не только в млекопитающих и культуры клеток бактерий, но и во всей животных разных видов, таких как Caenorhabditis elegans16, Данио рерио17, или мышей18,19,,2021. Подшипник алифатического ряда изменений, в том числе ManNProp и ManNBut, особенно на ManNAc производные пренебрежимо цитотоксических, даже в millimolar концентрациях в ячейку культуры среднего или плазме крови. Кроме того они относительно легко синтезировать.

Здесь, мы предоставляем подробную информацию о том, как использовать МГЕ с N-ацетил изменение mannosamines. Во-первых химический синтез двух из наиболее широко используемых производных ManNAc в этой области, ManNProp и ManNBut, объяснил. Далее мы покажем, как МГЕ могут быть применены в качестве эксперимента в естественных условиях . В качестве примера, нейробластома клеточная линия Келли был выбран продемонстрировать уменьшение выражение polysialic epitope западной помарки после лечения с ManNAc производные. Ненатуральных сиаловых кислот на поверхности клеток были количественно ВЭЖХ и далее анализируются через масс-спектрометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка буферов и реагенты

  1. Подготовка раствор метоксида натрия 3 мм
    1. 8.1 мг натрия метоксида в 50 мл метанола (3 мм) растворяют в стеклянная бутылка 100 мл с баром перемешать. Хранить при комнатной температуре (RT) на несколько недель.
  2. Подготовка буфера Tris-HCl
    1. Объединить 8.766 г NaCl, 157 мг трис-HCl и 146 мг ЭДТА в стеклянная бутылка 100 мл с баром перемешать и растворяются в воде 80 мл.
    2. Добавление перемешивания раствора, гидроксид натрия (1 М, в воде) или HCl (20%, в воде) при соблюдении pH с pH метр и скорректировать рН 8.0.
    3. Добавьте объем воды, необходимой для достижения окончательный объем 100 мл. Фильтр решения с помощью системы стерильного фильтра 0.22 мкм.
      Примечание: 100 мл трис-HCl буфере будет содержать 150 NaCl, 10 мм трис-HCl и 5 мм ЭДТА (рН 8,0). Раствор может храниться при температуре 4 ° C на несколько недель.
  3. Приготовление раствора Апротинин
    1. Растворите Апротинин 10 мг в 1 мл воды (1.54 мм). Алиготе Апротинин раствора в 10 x 1.5 мл пластиковые трубы (по 100 мкл). Хранить при температуре от-20 ° C в течение нескольких недель.
  4. Приготовление раствора leupeptin
    1. Растворяют leupeptin 10 мг в 2 мл воды (10 мм). Алиготе решение leupeptin 10 x 1.5 мл пластиковые трубы. Хранить при температуре от-20 ° C в течение нескольких недель.
  5. Приготовление раствора phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF)
    1. Растворите 34,8 мг PMSF в 2 мл этанола (100 мм). Алиготе PMSF раствора в 10 x 1.5 мл пластиковые трубы. Хранить при температуре от-20 ° C в течение нескольких недель.
  6. Приготовление раствора 1,2-диамино-4,5-methyldioxybenzol дигидрохлорид (ДМБ)
    1. Объединить 15,62 мг DMB, 352 мкл β-меркаптоэтанол и 48 мкл натрия бисульфит решение (39%) и добавить 9,6 мл воды (6,9 мм DMB, 500 мм β-меркаптоэтанол и бисульфит натрия 0,19%). Алиготе DMB решение в 40 x 1.5 мл пластиковые трубы (по 250 мкл). Магазин, защищенном от света при-20 ° C в течение нескольких недель.
  7. Подготовка раствора кислоты (ТФК) 1 M trifluoroacetic
    1. Мкл 770.3 100% TFA 9.23 мл воды в пластиковых труб 15 мл (1 М). Хранить при 4 ° C на несколько недель.
  8. Приготовление раствора TFA 120 мм
    1. Мкл 92.4 TFA (100%) в 9.91 мл воды (120 мм) в пластиковой трубке 15 мл. Хранить при 4 ° C на несколько недель.
  9. Подготовка раствора гидроксида натрия (NaOH) 400 мм
    1. Растворяют 160 мг NaOH в 10 мл воды (400 мм) в пластиковой трубке 15 мл. Хранить при 4 ° C на несколько недель.
  10. Подготовка буфера lysis иммуноблоттинга
    1. Распустить 5.84 г NaCl, 0,1 г трис (гидроксиметил)-aminomethan (Tris), 0,1 г CaCl2, 0,95 g MgCl2и 1 g Тритон-X100 в 100 мл воды и скорректировать рН 7,8. Хранить при 4 ° C. 100 мкл каждого ингибитор протеазы (апротинин, leupeptin и PMSF), перед использованием буфера lysis.
  11. Подготовка натрия Додециловый сульфат геля полиакриламида буфер электрофореза (SDS-PAGE)
    1. Распустить 0,3 г трис и 1,5 г глицина 0,1 g SDS в 100 мл воды и скорректировать рН 7.3. Магазин на RT.
  12. Подготовка буфера иммуноблоттинга
    1. Растворяют 0,3 г трис, глицин 1.1 g в 90 мл воды и добавляют 10 мл этанола. Магазин на RT.
  13. Подготовка преграждая разрешение
    1. Растворите 1 г жира бесплатно молоко власти в 25 мл фосфатный буфер (PBS). Всегда готовить свежие.

2. синтез ManNProp и смежных N-ацил-изменение Mannosamines

  1. Растворяют mannosamine гидрохлорид 431.2 мг в 10 мл 3 мм раствор метоксида натрия в стеклянной бутылке 50 мл с баром перемешать.
  2. Охлаждать смесь на льду до 0 ° C. Для перемешивания раствора медленно добавьте каплям 210 мкл propionyl хлорид (2,4 ммоль), или 248 мкл butanoyl хлорид (2,4 ммоль) синтезировать ManNProp или ManNBut, соответственно. Инкубируйте перемешивания смесь при 0 ° C в течение 4 ч.
  3. Передача решения в пластиковый Тюбик 50 мл. Совать 4-8 отверстий в крышке пластиковой трубки с тонкой иглой. Быстро заморозить решения с помощью жидкого азота и впоследствии lyophilize (замораживание сухой) за 48 ч или до тех пор, пока он полностью высох.
  4. Смешайте 350 g силикагель 60 с 750 мл этиловый ацетат/метанол/воды (15:2:1) (это подвеска). Заполните столбец стекла (длина 70 см и диаметром 35 мм) с подвеской силикагель 60 и промойте подготовленный колонку с еще 100 мл этиловый ацетат/метанол/воды (15:2:1) перед использованием.
  5. Распустить сушеных продуктов из шага 2.3 (5 г сушеных продуктов) в 10 мл этиловый ацетат/метанол/воды (15:2:1) и загрузки их с помощью пипетки на кремния гель колонке. Соберите 4 мл фракции после 500 мл (для ManNProp). Примечание: ManNBut будет элюировать из столбца примерно после 700 мл.
  6. Перевести eluted фракций в 15 мл пластиковых труб. ПОК 3-6 отверстий в крышке пластиковой трубки с тонкой иглой. Быстрое замораживание решения с помощью жидкого азота и впоследствии lyophilize его до тех пор, пока она полностью высохнет.
    Примечание: Лиофилизированные продукты могут храниться в течение нескольких месяцев на RT.
  7. Проверьте чистоту продукции, масс-спектрометрия (см. раздел 9).
    Примечание: в качестве альтернативы, чистоты могут также быть проверены 1H ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

3. клеточная культура

  1. Культура клетки нейробластома Келли в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) среде, содержащей 10% плода бычьим сывороточным 100 U пенициллин, стрептомицин 100 мг, 2 мм L-глютамин, содержащих 5 ManNAc, 5 мм ManNProp или 5 мм ManNBut, при 37 ° C и 5% CO2.
    Примечание: Клетки культивировали в среде без ManNAc или его аналоги используются в качестве элемента управления.
  2. Перед нанесением mannosamines отсоедините клетки нейробластома Келли, инкубации их на 10 мин с трипсина/ЭДТА (0,25%, 0,02%, в PBS) и рассчитывать, используя счетчик Нойбауэр палата или ячейки. Семя клетки на определенные номера, на основе размера пластины/блюдо.
    1. Чтобы измерить сиаловая кислота моносахаридов, семян 1 х 105 клеток в 500 мкл среднего в плиту 48-ну тканевые культуры. Для анализа polysialic кислот семян 1 х 106 клеток в среде 3 мл на 6 см диаметр клетки культуры блюдо. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2. Замените носитель каждые 24 ч.
      Примечание: Эффект МГЕ увеличивает общее время лечения. Для высокой метаболической эффективности лечения клетки для 5-7 дней.
  3. После лечения сцеживаться среды. Мыть тарелки/блюда с PBS. Отсоедините клетки путем инкубации их на 10 мин с трипсина/ЭДТА (0,25%, 0,02%, в PBS). Нейтрализовать трипсина, добавив такой же объем ячейки питательной среды на отдельные ячейки. Отдельные клетки перехода в 15 мл пластиковых труб. Центрифугуйте образцы на 3 мин на 500 x g и удалить супернатант.
    1. Добавьте 5 мл PBS и центрифуги клетки (см. шаг 3.3). Стиральные процедуру Повторите еще два раза.
      Примечание: Пелле мыть ячейки без супернатант могут храниться при температуре-20 ° C в течение нескольких дней. Если выражение polysialic кислоты должна быть выяснены продолжают раздела 10.

4. клетки Lysis для ВЭЖХ анализа

  1. Подготовка буфера lysis ВЭЖХ
    1. Комбинат 5 мл трис-HCl буфере, 5 мкл раствора Апротинин, 20 мкл leupeptin решение и 50 мкл PMSF решения.
      Примечание: 5 мл ВЭЖХ литического буфера будет содержать 150 мм NaCl, 10 мм трис-HCl, 5 мм ЭДТА, 1,54 мкм Апротинин, 40 мкм Leupeptin и 1 мм PMSF (рН 8,0). Этот буфер всегда должен быть подготовлен свежие до лизис клеток.
  2. Вновь приостановить собранных ячейки гранулы (шаг 3.3) каждый в 500 мкл ледяной ВЭЖХ-буфера lysis и ультра sonicate пробы с ультра-звуковой процессор иглы три раза за период 30 s на средне высокой амплитуды. Прохладный образцы на льду, по крайней мере 1 мин между циклами.

5. разделение мембраны дроби

  1. Центрифугуйте образцы лизированных ячейки для 2 ч на 20000 x g и 4 ° C. Отдельные супернатант (около 480 мкл), представляющих цитозольной белков, в 1,5 мл пластиковых труб. Определите концентрацию белка этих фракций, используя, например, Брэдфорд или bicinchoninic кислоты (BCA) анализа.
    Примечание: Концентрация белка (около 1 мг/мл) цитозольной фракции позднее могут быть связаны с измеренного количества видов уважаемых сиаловая кислота. Пелле представляет мембраны фракция, которая используется в шаге 6.1.

6. кислотный гидролиз

Примечание: Олиго - и полисахаридов в клеточных мембранах гидролизуется до моносахаридов. Кроме того, возможные O-гидролизованный изменения в моносахариды, как хорошо. Это необходимо для количественного анализа ВЭЖХ, потому что подавляющее большинство сиаловых кислот в долях мембраны естественно включены в гликоконъюгаты и возможно может нести O-ацетил или O- lactolyl модификации.

  1. Добавить 150 мкл 1 М TFA-решение для разлученных мембраны фракций (гранулы из раздела 5). Проинкубируйте образцы для 4 ч при 80 ° C при встряхивании в 200-600 об/мин.
  2. Центрифугуйте образцы на около 30 минут на 20000 x g и 21 ° C, с помощью фильтра 0,5 мл трубки с 3 кДа исключения мембраны, до тех пор, пока верхний этап объем составляет менее 20 мкл.
    Примечание: Этот шаг важен распоряжаться выше молекулярный мусора.
  3. Передача нижней фазе, содержащие небольшие молекулы, включая виды сиаловая кислота, в 2 мл пластиковых труб. Совать 2-4 отверстия в шапки пластиковых трубок с помощью тонкой иглы. Быстрое замораживание образцов, с использованием жидкого азота и затем lyophilize их на ночь.
    Примечание: Высушенные образцы могут храниться в течение нескольких дней на RT. заменить крышки без отверстий для более длительного хранения.

7. флуоресцентные метки

  1. Вновь приостановить высушенных образцов в растворе TFA 120 мм 10 мкл и добавьте 50 мкл DMB решения. Передача образцов в темный 1.5 мл пробирок для их защиты от ультрафиолетового излучения.
  2. Для стандартов, растворяют в 1 мкл Neu5Ac (60 нг/мл, в воде) или 1 мкл Neu5Gc (60 нг/мл, в воде) в растворе TFA 120 мм 10 мкл в темный 1.5 мл пробирок. Добавьте 50 мкл DMB решение.
  3. Проинкубируйте образцы клеточной мембраны и стандарты для 1,5 h 56 ° c, защищенном от света. После инкубации мкл 4 400 мм раствор NaOH для каждого образца, чтобы остановить обозначая реакции.

8. ВЭЖХ анализ

Примечание: Приклеенные этикетку образцы анализируются на ВЭЖХ системы оснащены столбцом C18 RP (110 Å, размер частиц 3 мкм, 4.6 x 150 мм), детектор флуоресценции и коллектор фракций. Растворителей, используемых являются метанол, ацетонитриле и воды. Убедитесь в том, Дега все растворители до измерения, если ВЭЖХ системы не хватает внутреннего дегазатор.

  1. Установите температуру столбца до 40 ° C и настроить детектор флуоресценции с 373 Нм для возбуждения и 448 Нм для выбросов, соответственно. Придать 10 мкл пример тома и отдельные датчики для 50 мин на 0,5 мл/мин скорость потока с метанолом/Ацетонитрил/воды (6:8:86) как элюента. Для анализа масс-спектрометрии Соберите пики интерес.
    Примечание: Neu5Gc ожидается элюата после 6-8 мин, Neu5Ac после 9-12 мин, Neu5Prop после 17-23 мин и Neu5But после 38-44 мин. Фракционированных образцов может храниться несколько ч при 4 ° C, защищать от света.
  2. После измерения каждого образца, промойте колонку для 7,5 мин в 1,0 мл/мин скорость потока (≈ 1.5 столбец тома) с метанолом/Ацетонитрил/воды (6:25:69) и заново сбалансировать системы для 7,5 мин в 1,0 мл/мин скорость потока с метанолом/Ацетонитрил/воды (6:8:86).
  3. Для количественного анализа Вычислите площадь под кривой сиаловая кислота пики интерес, используя программное обеспечение соответствующих ВЭЖХ системы22.
    Примечание: Полученные данные могут быть связаны с Neu5Ac или Neu5Gc стандарт и концентрации измеряемых белка в цитозольной фракции (см. раздел 5.1).

9. масс-спектрометрии анализ сиаловая кислота моносахаридов

Примечание: ВЭЖХ удержания пиков интерес может быть далее проанализированы жидкостной хроматографии (LC) электроспрей ионизационная масс-спектрометрия (ESI-МС), чтобы проверить неестественным сиаловая кислота видов.

  1. Для анализа масс-спектрометрии придать 20 мкл собранных образцов LC/масса селективного детектора (MSD) системы с метанолом 79,9%, 20% изопропиловый спирт и 0.1% муравьиной кислоты как элюента, 0,5 мл/мин скорость потока, капиллярные напряжение 4 кв и капиллярной температуры 350 ° C 22 , 23.
  2. В программное обеспечение оценки соответствующей системы LC/MSD выберите пиковые интерес всего Ион хроматограммы. Просмотр массовые спектр решена пик. Показать положительный массы/заряд соотношение между 300 и 700.
    Примечание: ДМБ маркировки сиаловые кислоты приводит к увеличению в молекулярной массе 116.2 г/моль. ДМБ меченых сиаловая кислота видов имеют следующие молекулярных масс: ДМБ-Neu5Ac = 424.2 г/моль, DMB-Neu5Gc = 441.8 г/моль, DMB-Neu5Prop = 436.2 г/моль, DMB-Neu5But = 453.2 g/mol. общего аддукты являются Ацетонитрил, натрия или изопропиловый спирт.

10. Западный анализ помаркой Polysialic кислоты в клетках нейробластома Келли

  1. Подготовка lysates клетки
    1. Добавьте 1 мл буфера lysis иммуноблоттинга клетки гранулы из шагу 3.3 и вихрь. Инкубируйте 30 мин на льду. Вихрь каждые 5 мин. Центрифугуйте образцы на 1,5 ч на 20000 x g и 4 ° C. Соберите супернатанта, содержащие белки от лизированных клетках.
    2. Определите концентрацию белка белковых фракций, например, Брэдфорд или BCA assay. Развести образцы к концентрации протеина 1,5 мкг/мкл литического буфера.
    3. Подготовка образцов для SDS-страницы путем добавления 10 мкл буфер Лэмли образца 90 мкл белковые фракции (1,5 мкг/мкл) и варить образца для 5 минут24.
  2. Immunoblotting
    1. Используйте 8% SDS-Полимерность гелей с 20-30 мкл карманы и 0,75 или 1 мм толщиной. Побегите гель на 25 мА 2 h на RT.
    2. Осторожно снимите крышку стекла от геля. Вырезать и удалить верхнюю часть геля, содержащего загрузки карманы. Поместите гель на нитроцеллюлозную мембрану (0,2 мкм), ранее смоченной в западной помарке буфера. Передачи белков на нитроцеллюлозную согласно рекомендации системы (например, 250 мА на 1 час при температуре 4 ° C).
    3. Удаление нитроцеллюлозную мембрану из переноса системы. Пятно пятно с Понсо красный визуализировать белки. Передача нитроцеллюлозную мембрану в пластиковых камеру и добавляют 10 мл, преграждая разрешение. Инкубировать 1 час на RT или на ночь при 4 ° C.
    4. Декант блокирования решения и добавьте моноклонального анти polySia 735 антитела (1 мкг/мл) в PBS. Проинкубируйте мембрану за 1 час на RT или на ночь при 4 ° C. После инкубации Промойте мембрану по крайней мере три раза за 5 мин с PBS.
    5. Добавьте поликлональных вторичное антитело против мыши IgG (1 мкг/мл) в сочетании с пероксидазой хрена (ПХ) или флуоресцентные метки в PBS. Проинкубируйте мембрану за 1 час на RT. После инкубации Промойте мембрану по крайней мере три раза за 5 мин с PBS.
    6. Передача мембраны на тарелку соответствующие тепловизор. Обнаружить сигнал согласно инструкциям производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ВЭЖХ хроматограммы люминесцентные, Neu5Ac и Neu5Gc стандарты изображены на рисунке 2. С помощью метода здесь описано, DMB-меченых Neu5Gc обычно elutes между 7-9 мин элюции время и DMB-Neu5Ac между 10-12 мин. Несколько меньше пиков в Хроматограмма обычно появляются между 2-6 мин. Эти пики представляют непрореагировавшего DMB и реакции промежуточные25.

Рисунок 3 показывает представитель хроматограммы lysates клетки. По сравнению с хроматограммы DMB-меченых стандартов (рис. 2), в эти хроматограммы видны несколько неопределенным пиков. Это скорее всего объясняется внутренней примеси lysates клетки и тот факт, что ДМБ не только реагирует с сиаловая кислота видов, но и с другими α-кето кислот, присутствующих в lysates клетки, включая пируват, сукцинат и альфа-кетоглутарата26. Наличие небольших количеств сиаловых кислот, принимая O-ацетил изменения, которые не были расщепляется уксусной гидролиза также может обсуждаться в качестве причины этих неопределенных пиков23. Хроматограммы от лизированных необработанных клетки сравниваются с хроматограммы из клеток, которые ранее были обработаны с ManNAc или его аналогов. Как показано здесь, лечение с ManNAc часто приводит к почти весь истощение Neu5Gc на поверхности клеток. В хроматограммы лизированных клетках, обработанных с Neu5Prop или Neu5But, видны вершины, не появляются в хроматограммы необработанных клеток. Эти пики (для ManNProp лечение клетки примерно 19 мин элюции время и для ManNBut лечение клетки в 42 мин) указывают на появление соответствующего ненатуральных сиаловых кислот, Neu5Prop и Neu5Gc. Как описано в разделе 8.3 протокола, ВЭЖХ хроматограммы могут быть проанализированы для того, чтобы подсчитать количество видов различных сиаловая кислота в lysates клетки.

Тот факт, что собственный ВЭЖХ удержания пиков соответствуют определенные виды сиаловая кислота была проверена через масс-спектрометрии. На рисунке 4изображены представитель ESI-MS данных из собранных ВЭЖХ пики интерес: спектр собранных пик DMB-Neu5Ac крепления в верхней левой панели, DMB-Neu5Gc в верхней правой панели и два вида ненатуральных сиаловая кислота, ДМБ-Neu5Prop и DMB-Neu5But в нижней левой и правой панелями. Реакции с DMB приводит к увеличению в молекулярной массе 116.2 Да, по сравнению с сиаловая кислота видов, которые не помечены с этой краской. В массовых спектры, при отображении положительный массы/заряд соотношение введенного образцов от 300 до 700 видны несколько пиков. Это объясняется аддукт формирования уважаемых DMB-меченых зонда. Помимо протонированных Ион [M + H]+, натрия аддукты [M + Na]+ и [M + 2На H]+ появляются. Как Ацетонитрил (ACN) присутствует в ходе анализа LC, он может найти как аддукт в массовых спектры (ДМБ-Neu5Gc, рис. 4показано: верхней правой панели). Из-за фрагментации, вызванных Столкновительное декомпенсация активаций, созданных в регионе electronspray транспорта между капилляра и первый скиммер обезвоженной сиаловая кислота, которую можно также наблюдать видов [M + H]+-H2O (показано для DMB-Neu5Ac, Рисунок 4: верхней левой панели)23,27. В настройках LC DMB-Neu5Gc elutes вскоре после непрореагировавшего или частично отреагировал DMB-видов. Таким образом собранные DMB-Neu5Gc зонд может содержать примеси, вызванных этими интермедиатов реакции. Это служит объяснение для появления неопределенных пиков в массовых спектр DMB-Neu5Gc (Рисунок 4: верхней правой панели).

Лечение Келли нейробластома клеток с ManNProp или ManNBut приводит к сокращению выражение polysialic кислоты на NCAM, как показано на Западный анализ помаркой клеточной мембраны из лизированных клетках (рис. 5). Polysialic кислота обычно появляется как мазок его неоднородности в размер и заряд (≈ 200 кДа). Лечение с аналогами ManNAc приводит к уменьшению polysialic кислоты на поверхности клетки: чем дольше алифатических N-ацил боковой цепи, тем сильнее сокращение28.

Figure 1
Рисунок 1: Общий принцип МГЕ с N-ацил изменение mannosamines. После лечения с N-ацил изменение mannosamines, эти ManNAc аналогами являются однополярно метаболизируется (внутриклеточный метаболизм) для соответствующего ненатуральных сиаловые кислоты. Они перевезены в Гольджи, переданные соответствующие олигосахарида акцепторной sialyltransferases и выраженный sialosides (здесь, гликопротеин) на поверхности клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель хроматограммы стандартов DMB-меченых сиаловая кислота. ДМБ меченых Neu5Ac (Верхняя панель) и Neu5Gc (Нижняя панель) были проанализированы ВЭЖХ. Удержание раз (пунктирные линии) и пик областях обоих сиаловых кислот были определены после инъекций 10 нг уважаемых DMB-меченых видов в систему ВЭЖХ. В здесь показано представитель хроматограм, DMB-Neu5Gc этого eluted после примерно 8 мин время удержания и DMB-Neu5Ac в 11 мин, соответственно. Несколько меньше пиков в Хроматограмма обычно появляются между 2-6 мин, представляющих непрореагировавшего DMB и реакция интермедиатов. Небольшая часть DMB-меченых Neu5Ac появляется как незначительные примеси в DMB-Neu5Gc стандарт (Нижняя панель). Этот показатель изменяется ссылка22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: характеристика мембраны прыгните сиаловых кислот, DMB-ВЭЖХ. Клетки были культивировали в отсутствие (необработанных, верхняя панель) или присутствие с 5 мм ManNAc (вторая группа сверху), ManNProp (третья группа сверху), или ManNBut (Нижняя панель), соответственно, за 7 дней. Средство было изменено каждые 24 ч. клетки были собраны мембраны фракций были подготовлены и, помечены с DMB, проанализированы ВЭЖХ. По сравнению с хроматограммы стандартов DMB-меченых сиаловая кислота (рис. 2) пики на время удержания между 8-9 мин были определены как DMB-Neu5Gc и вершины между 10-11 мин как DMB-Neu5Ac. По сравнению с вершины, полученные от инъекций стандартов DMB-меченых сиаловая кислота, хроматограммы от lysates клетки показать дополнительное, неопределенное пиков. Это обусловлено внутренней примеси зондов, а также тот факт, что DMB может реагировать не только с сиаловая кислота присутствует в lysates клетки, но и с другими α-кето кислот, присутствующих в lysates клетки, включая пируват, сукцинат и альфа-кетоглутарата. Пики, которые появляются только в хроматограммы образцов из клетки культивировали в присутствии N-ацил изменения mannosamine аналогов указывают соответствующий DMB-меченых ненатуральных сиаловые кислоты. Этот показатель изменяется ссылка22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: массовые спектры DMB-меченых сиаловая кислота, обитающих в lysates клетки. ВЭЖХ удержания пиков интерес (см. рис. 3) были собраны и впоследствии проанализированы ESI-г-жа 20 мкл собранных удержаний пиков вводили в системе LC-MSD. Реакция с DMB приводит к увеличению в молекулярной массе 116.2 Да, по сравнению с соответствующих видов непрореагировавшего сиаловые кислоты. Изображены спектрограмм соотношение положительных массы/зарядки, полученные из видов различных сиаловая кислота (ДМБ-Neu5Ac: Верхняя левая панель, DMB-Neu5Gc: верхней правой панели, DMB-Neu5Prop: нижней левой панели, DMB-Neu5But: нижней правой панели). Из-за в аддукт формирования видны несколько пиков. Помимо протонированных Ион [M + H]+, натрия аддукты [M + Na]+ и [M + 2На H]+ появляются. Ацетонитрил, которая присутствует в ходе анализа LC, можно также найти как аддукт (верхней правой панели). Обезвоженный DMB-Neu5Ac, который генерируется фрагментации в инструмент [M + H]+-H2O можно наблюдать (верхняя левая панель). Собранные DMB-Neu5Gc зонд может содержать примеси, вызванных непрореагировавшего DMB, а также реакция интермедиатов, рассматривать как дополнительные неопределенным пиков (верхней правой панели). ACN, Ацетонитрил; H, водорода; Na, натрия. Этот показатель изменяется ссылка22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: анализ polysialylation NCAM. Келли нейробластома клетки были культивировали в отсутствие или наличие 5 мм ManNAc, ManNProp или ManNBut для 7 дней. Клетки были собраны и белки были разделены на 8% SDS-Полимерность гелей и анализируется Западная помарка, с использованием моноклонального анти polySia антитела 735. Обратите внимание, что polySia появляется как мазок из-за его неоднородности в количество Sia, разных размеров и обвинения в polySia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Если химически синтезированные производные ManNAc, ManNProp и ManNBut анализируются через масс-спектрометрии, только правильное массового пик для обоих образцов должны быть определены. Таким образом можно предположить продукты иметь чистоту свыше 99%. Небольшое количество Neu5Gc, который обычно не встречается в клетки человека29, обнаруживаются в долях мембраны лизированных клетках. Это наиболее вероятно происходит через поврежденный путь, который нанимает Neu5Gc от плода бычьим сывороточным sialoglycoconjugates в СМИ-30. Лечение с естественной прекурсор биосинтеза сиаловая кислота, ManNAc, резко снижает проявление Neu5Gc epitope на поверхности клеток.

Применение модифицированных mannosamines незначительн токсичен для всех клеток, расследование до настоящего времени. Клетки принимают более millimolar сахара концентрации в среде, которая необходима, поскольку есть без конкретных транспортеры для N- acylmannosamines. Было продемонстрировано, что сигнальных путей активируются после применения N- acylmannosamines, которые могут повлиять на31,роста и дифференцировки клеток32. Пока не известно ли это из-за изменившейся sialylation шаблон или отражает прямое воздействие на изменение sialylation. Рост клеток в присутствии ManNAc C2-модифицированных аналогов, ManNProp или ManNBut результатов в выражении видов ненатуральных сиаловая кислота, перевозящих соответствующий N-ацил замещения. Метаболические эффективность двух испытания N-ацил изменение mannosamines меняется. Лечение с ManNProp обычно приводит к выражению соответствующего Neu5Prop на поверхности клеток и снижение выражение Neu5Ac, а также Neu5Gc. Другие N-ацил изменения mannosamine заменители, как N- cyclopropylcarbamyl mannosamine, склонны иметь даже более высокой метаболической эффективности22.

Предыдущие исследования показали, что сиаловых прекурсоров вмешиваться с polysialylation. Polysialic кислоты выражаются почти исключительно на NCAM. Интересно, что NCAM может быть polysialylated на двух отдельных polysialyltransferases, выраженная в Гольджи (ST8SiaII и ST8SiaIV). Оказалось, что ManNProp, ManNBut и другие N-ацил-модифицированных mannosamines вмешиваться с polysialylation, и что это преимущественно за счет взаимодействия с ST8SiaII14. Этот sialyltransferase выражается во время разработки и имеет важное значение для развития мозга. Интересно также, многие опухоли из нейронов происхождения вновь выразить ST8SiaII повышения их злокачественности и дальнейшего их обнаружить от иммунной системы33. Напротив применение ManNAc приводит к увеличению polySia, поскольку это приводит к увеличению CMP-Neu5Ac, который является естественным субстратом обоих polysialyltransferases.

МГЕ — это уникальный метод ввести Роман сиаловые кислоты на протеинов интереса (например, эритропоэтин) и таким образом модулировать свою функцию. Кроме того она может использоваться для модуляции поверхности гликозилирования ячейки, которая могла бы представлять интерес во многих заболеваний, таких как рак, так как многие раковые клетки пытаются спастись иммунной системы, выражая высокий уровень сиаловые кислоты. Представленные здесь метод позволяет: во-первых, выполнять glycoengineering с помощью клеточных культур, и во-вторых, для анализа инженерии гликанов доказать успешных glycoengineering. Этот метод является очень надежной и до сих пор, сообщается без ошибок; в отличие от этого метод был расширен представить химических активные группы выполнить клик химия на клетки13.

Здесь мы представляем два ManNAc аналогов алифатических N-ацил стороне цепи изменения, которые являются сравнительно простыми синтезировать, даже лабораториями с меньше оборудования и меньше опыта в химическом синтезе. Группы, которые более знакомы программистам органической химии может синтезировать других аналогов ManNAc с более сложные структуры и использовать их для MGE, включая так называемые «bioorthogonal» аналогами, которые могут быть использованы, например, для визуализации sialylated гликоконъюгаты. Обзор статей, давая обзор N-ацетил-mannosamine производные, которые были синтезированы на сегодняшний день13,34. N- azidoacetyl mannosamine (Манназ), вещество, которое часто используется, чтобы визуализировать sialylated гликаны, коммерчески доступна. Из-за низкой мембраны проницаемость ManNAc аналогов это может быть выгодно использовать производные этих сахаров с защищенным гидроксильных групп, например, peracetylated ManNAc аналогов. После ввода в цитоплазму, защиты групп расщепляется на цитоплазматической эстераз, высвободив тем самым активный моносахаридов35,,3637. Однако peracetylated ManNAc аналогов разоблачить выше цитотоксичность, по сравнению с соответствующего незащищенного производных.

В этой рукописи мы выбрали увековечен нейробластома клетки для наших экспериментов с MGE. Как правило MGE (особенно с ManNProp и ManNBut) могут применяться в самых разнообразных клеточных линий, включая увековечен клеточных линий (см. Wratil и др. 13 для примеров) и главные ячейки38,39. Кроме того МГЕ успешно использовался для изменения sialylation в естественных условиях в C. elegans40, данио рерио17,41, мыши19,20,42и крыса 43 , 44. время лечения и концентрация ManNAc аналогов в MGE экспериментов можно варьировать влиять на метаболические эффективность данного метода. Из нашего опыта длительного лечения и более высокие концентрации соответствуют с лучшей заменой естественно-происходя видов сиаловая кислота в гликоконъюгаты на изменение Neu5R. Если очень высокие концентрации ManNAc производные будут использоваться, следует оценивать цитотоксичность лечения, например, пробирного МТТ или резазурина сокращения assay.

В этой рукописи мы предлагаем использовать ультра sonication для гомогенизации клеток. Другие методы лизис клеток были протестированы в нашей лаборатории, в том числе douncing на льду (приблизительно 250 ударов) и французский пресс нарушения (10000 psi, 4 ходов), с сопоставимые результаты относительно количества сиаловые кислоты обнаружен в образцах. Преимуществом ультра-звуковой гомогенизации является что она требует немного времени и не требуют добавления DNAase образцов до лизис.

Мы уделили наш анализ мембраны фракций lysates клетки, потому что мы хотели показать привязанное гликоконъюгаты изменения в sialylation мембраны. Сиаловая кислота производных и их концентрации также может измеряться в цитозоле клеток, после того, как была отделена часть мембраны высокоскоростной центрифугированием, используя тот же метод, как описано выше. Однако концентрации сиаловые кислоты в цитозоле, до 100 x ниже по сравнению с выражением сиаловые кислоты на клеточной мембране7. Таким образом большее количество клеток необходимы для создания надежных результатов. Бассейн цитозольной, активированные CMP-сиаловых кислот может быть измерен косвенно предварительной обработки цитозольной фракции lysates клетки с натрия боргидрид до гидролиза7,45. Чтобы гидролизуют сиаловые кислоты в гликоконъюгаты и сиаловая кислота, с изменениями, гидроксил, клетки инкубировали с 1 M TFA. Другие кислые решения может использоваться для гидролиза, а также, например, 2 M Пропионовая кислота, уксусная кислота 2 M или 1 M HCl.

Возможно возникающих во время анализа ВЭЖХ проблема перекрывающихся пиков интерес с неопределенным пиков. Это особенно проблематичным, когда количество сиаловые кислоты в образце необходимо рассчитать площадь под кривой определенного максимума. Чтобы отделить от неопределенного пик пик интереса, Ацетонитрил концентрация в растворителе ВЭЖХ могут быть изменены (± 3%). Мы рекомендуем использовать устойчивый растворителей концентрации для анализа ВЭЖХ, давая преимущество подготовки жидкостной смеси перед хроматографии. Таким образом наш метод требует только один насос ВЭЖХ и осуществимым для широкого круга различных систем ВЭЖХ. Если более чем один насос в системе ВЭЖХ, Изократические градиент с увеличением концентрации Ацетонитрил может применяться, например, 4-9% в 35 минут45. С помощью этого метода, время хранения определенных вершин ВЭЖХ будет значительно изменилась. Эта стратегия может также помочь добиться лучшего разделения перекрывающихся пиков. Ионизация десорбции при содействии матрицы лазерной масс-спектрометрия (MALDI-МС) была успешно создана для проверки выражения изменения видов сиаловые кислоты на поверхности клеток45и таким образом служит как эквивалент метода ESI-MS, представленные здесь .

Благодаря гидрофильность ManNAc аналогов и отсутствие конкретных транспортеры для поглощения этих дериватах46высокие концентрации необходимы в MGE экспериментов с этими соединениями. Таким образом в экспериментах, масштабирование вверх и, особенно в естественных условиях испытаний, большое количество соответствующих аналогов ManNAc необходимы показаны возможные ограничения этой техники. С другой стороны в зависимости от клеточных линий используется, определенные минимальное количество обработанных клеток необходимо получить достоверные результаты при анализе ВЭЖХ. Из нашего опыта как минимум около 100000 адэрентных клеток или 150000 подвеска ячейки (1-2 Уэллс 96-луночных плиты с вырожденная клетки) является достаточным. Это может стать узким местом, если анализ должен быть сокращен, например в скрининг подходы.

С методы, представленные в этой рукописи сиаловая кислота и ее производные могут быть обнаружены в lysates клетки. Однако структура и состав гликоконъюгаты в клетках, обработанных с ManNAc производные не может оцениваться с здесь описано техникой. Разрешение структура гликоконъюгаты, e.g.,N- и O- гликанов, обычно требует большего опыта и Фонда glycomics47. Насколько нам известно пока данные не доступны на четкую структуру гликоконъюгаты из клеток, которые были обработаны с ManNAc аналогов.

Западный анализ помаркой polysialic кислоты является очень быстрый и простой метод. Однако данные, полученные этим методом не количественные, поскольку использует обнаружение антител и хемилюминесценции. Таким образом использование методов ВЭЖХ является преимуществом над Западный blotting. Тем не менее мы предлагаем с помощью метода immunoblotting, так как это легко применять и известны очень надежно работать.

Выражение сиаловые кислоты на поверхности клеток может быть изменено также методы, отличные от MGE. Как описано выше, клетки можно лечить с sialidase, фермент, который расщепляет сиаловая кислота остатков от гликоконъюгаты относительно неконкретным образом. Лечение sialidase следовательно индуцирует hyposialylation в очищенной ячейки. К сожалению sialidase лечение методика довольно ограничены, как это цитотоксических, не представляется возможным для долгое время лечения и не применяется в экспериментах в естественных условиях . Другой способ, чтобы побудить hyposialylation в клетках, используя ингибиторы биосинтеза сиаловые кислоты. Целый ряд ингибиторов доступен, либо целевых ключевых ферментов биосинтеза сиаловая кислота, UDP -N- acetylglucosamine-2-epimerase /N- acetylmannosamine-киназы (сбой/MNK), или группа sialyltransferases6, 7,8,48. Один из этих соединений, C3-фторированные сиаловая кислота аналоговые, было показано, снизить выражение сиаловые кислоты в жизни мышей49. Животных лечение с этим веществом, однако, показал печени обесценения, необратимой почечной дисфункции и отказ процветать49. Эти результаты подтверждают решающую роль Neu5Ac в функции печени и почек и далее указать пределы sialylation ингибиторов для экспериментов в естественных условиях . Третий метод для генерации клеток с поверхности sialylation измененных клеток является, сталкиваясь с проявлением ферментов, которые имеют решающее значение для биосинтеза сиаловые кислоты. Нок даун сбой/MNK увековечен клеток, например, был показан для отображения этих клеток hyposialylated 9. Возможность сравнительно легко стук в и - генов в сотовых и в естественных условиях с использованием Роман и признанным ТРИФОСФАТЫ-Cas9 техника может привести к Роман открытий относительно сиаловая кислота биосинтез и клетки поверхности sialylation.

Преимуществом MGE, по сравнению с методов, описанных здесь, является, что это легко применять и адаптированы для множества различных экспериментов, испытаний в пробирке в ячейку на основе проб и экспериментов в естественных условиях . Альтернативный метод для измерения выражение и концентрации видов различных сиаловая кислота в образцы клетки является высокая производительность Анионообменная хроматографии (HPAEC) с импульсной электрохимической обнаружения50. Используя этот метод, выражение сиаловые кислоты измеряется непосредственно и не после маркировки с флуоресцентной краской. Преимуществом этого метода является, что она может использоваться также для анализа моносахаридов помимо сиаловая кислота и ее производные в образцы клеток и белков. К сожалению чувствительность HPAEC ниже по сравнению с флуориметрический обнаружения DMB-сиаловых кислот. Таким образом HPAEC ограничивается эксперименты с наличием большой выборки составляет51.

Здесь описанных методов может использоваться для выявления неизвестных характеристики гликоконъюгаты. Множество примеров использования МГЕ расследовать сиаловая кислота зависимые взаимодействия уже существует13, показаны возможности этого метода в контексте широкого круга экспериментальных установок.

В настоящее время МГЕ с N- acetylmannosamines в основном используется исследователями в области гликобиологов. Мы надеемся, что этот метод будет признана более широкой аудитории как универсальный инструмент для изменения гликоконъюгаты. Другие поля, включая онкология, Неврология, иммунологии и вирусологии выиграют, адаптируя эту технику в своих собственных целях. Такие исследования кросс старше может включить обнаружение еще неизведанных областей и поэтому дают лучшего понимания здоровья и болезней. В ранних исследованиях к примеру, этот метод был использован производить гликопротеины с модифицированных гликозилирования, которые впоследствии служат для вакцинации в естественных условиях . В некоторых случаях лечение с такой вакцины glycoengineered привести к выработку антител, которые подвергаются передовых алчность и токсичности для соответствующих целей52,53. Другие успешно использовали МГЕ разработать модель для целевых опухоли терапии в мышей54. Другое исследование показало, что системных в vivo инъекции ManNProp способствует регенерации нервных55. В случае polySia было показано, что уменьшение выражение этой epitope в клетках нейробластомы, методы, представленные в этой рукописи, повышает чувствительность этих опухолевых клеток излучение или обращения с противораковые препараты56.

Количество сиаловые кислоты измеряется в пределах образцы могут отличаться в зависимости от метода, используемый для отсоединения обработанные клетки. В этой рукописи инкубация с трипсином был использован для отсоединения клетки. Если другие методы должны быть использованы, например, соскоб клеток или длительного лечения с PBS + ЭДТА, количество сиаловые кислоты измеряется на образцах могут отличаться. Даже адаптации время инкубации с трипсином может иметь влияние на позднее сиаловые кислоты концентрации. Из нашего опыта влияние метода отряд клеток на количество сиаловые кислоты измеряется находится ниже 15%, но если быть нормализованы и сравнить результаты, это может стать важным узким местом. Кроме того метод для лизиса клеток может повлиять на результат анализа ВЭЖХ. Таким образом мы рекомендуем читателю стандартизировать клетки отряда и lysis в своих экспериментах.

Для достижения разделения мембраны дроби lysates клетки, мы использовали центрифугирования для 2 ч на 20000 x g и 4 ° C (раздел 5.1). Другие протоколы центрифугирования может повлиять на разделение и поэтому количество сиаловые кислоты обнаружен в образцах. Критические соединение в этот протокол является DMB, потому что он очень чувствителен к свету и ухудшается с течением времени. Здесь мы рекомендуем вам аликвота небольшими порциями DMB-решения и хранить его в качестве запасов на уровне - 20 ° C, защищать от света (раздел 1.6.1). Таким образом DMB-раствор может храниться в течение нескольких недель. Если по результатам анализа DMB-ВЭЖХ увеличения или уменьшения сигналов для сиаловая кислота видов сигналов в течение первых 6 мин измерения ВЭЖХ, представляющие DMB и продукты его реакции, Новый ДМБ раствор должен быть подготовлен. Не вновь заморозить и повторно использовать DMB-решение после оттаивания его. После DMB маркировки все образцы должны быть проанализированы немедленно. Если большее количество образцов (> 10) должны быть проанализированы, эти образцы следует разделить на меньшие значки и постепенно помечены DMB. А как DMB-меченых датчики должны быть защищены от света на всех раз оба обозначая реакции. После элюции DMB-меченых сиаловая кислота видов должны быть проанализированы сразу путем прямого ESI-г-жа муфт ВЭЖХ с системой ESI-мс (в установке LC-ЭСИ-MS) не является необходимым, но может быть выгодным для достижения более высокого качества масс-спектрометрии анализ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим Нгуен D. L. для корректуры рукописи и плодотворных обсуждений. Кроме того мы благодарим за помощь в подготовке съемок J. Dernedde и H. G. Нгуен. Большинство сцен видео были расстреляны в лабораториях р. Таубер. Мы также благодарим Институт Макса Планка для коллоидов и интерфейсов и за предоставленную нам бесплатный доступ к их объекте масс-спектрометрии. RH была поддержана DFG (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics