Metabolische Glykan der Sialinsäure Säure mit N-Acyl-Mannosamines geändert

Bioengineering

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Summary

Sialinsäure Säure ist eine typische Monosaccharid-Einheit in Glykokonjugate gefunden. Es ist in einer Vielzahl von molekularen und zellulären Interaktionen beteiligt. Hier präsentieren wir eine Methode zur Zelle Oberfläche Sialinsäure Säure Ausdruck mit metabolischen Glykan mit N- Acetylmannosamine Derivate zu ändern.

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Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

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Abstract

Sialinsäure Säure (Sia) ist ein sehr wichtiger Bestandteil des Glykokonjugate, wie N- O- Glykanen und Glycolipide. Wegen seiner Lage am Termini-Reduzierung von Oligo- und Polysaccharide, sowie seine einzigartigen chemischen Eigenschaften ist Sialinsäure Säure in einer Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptor-Ligand-Interaktionen beteiligt. Durch Ändern des Ausdrucks der Sialinsäure Säure auf der Zelloberfläche, werden folglich Sialinsäure Säure-abhängige Interaktionen beeinflusst werden. Dies kann hilfreich sein, Sialinsäure Säure-abhängige Interaktionen zu untersuchen und hat das Potenzial, bestimmte Krankheiten in eine positive Weise zu beeinflussen. Über metabolische Glykan (MGE) kann der Ausdruck der Sialinsäure Säure auf der Zelloberfläche moduliert werden. Hierin werden Zellen, Gewebe oder sogar ganze Tiere mit C2-modifizierte Derivate von N- Acetylmannosamine (ManNAc) behandelt. Diese Aminozucker sind fungieren als Sialinsäure-Vorläufer Moleküle und daher zu den entsprechenden Sialinsäure Säure Arten verstoffwechselt und über Glykokonjugate zum Ausdruck gebracht. Anwendung dieser Methode produziert faszinierende Effekte auf verschiedene biologische Prozesse. Z.B. es kann drastisch reduziert die Expression von Polysialic Säure (PolySia) im behandelten neuronalen Zellen und wirkt sich somit auf neuronale Wachstum und Differenzierung. Hier zeigen wir die chemische Synthese von zwei der am häufigsten verwendeten C2-modifizierten N- Acylmannosamine Derivate, N- Propionylmannosamine (ManNProp) sowie N- Butanoylmannosamine (ManNBut), und weiter zeigen, wie diese nicht-natürliche Aminozucker können in Kultur Zellexperimente angewendet werden. Der Ausdruck veränderter Sialinsäure Säure Arten durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) quantifiziert und weiter per Massenspektrometrie analysiert. Die Auswirkungen auf die Polysialic Säure Ausdruck sind über Western-Blot mit einem im Handel erhältlichen Polysialic Säure Antikörper aufgeklärt.

Introduction

Sialinsäure Säure ist ein Monosaccharid, die in der Regel an die nicht-reduzierende Termini der Glykokonjugate, z. B. N- und O- Glykanen oder Glycolipide gefunden werden kann. Unter alle Monosaccharide hat Sialinsäure Säure einige einzigartigen chemische Eigenschaften. Es hat eine 9 C-Atom Rückgrat, eine carboxylic Gruppe in der c-1-Position, das deprotonierten und dadurch negativ geladenen unter physiologischen Bedingungen und eine amino-Funktion in der c-5-Position. Obwohl mehr als 50 natürlich vorkommenden Varianten der Sialinsäure Säure Datum1charakterisiert wurden, ist die vorherrschende Form der Sialinsäure Säure findet man bei Menschen N- Acetylneuraminic Säure (Neu5Ac). Andere Säugetiere express auch höhere Mengen von N- Glycolylneuraminic Säure (Neu5Gc)2,3.

Aufgrund seiner exponierten Lage in Glykokonjugate ist Sialinsäure Säure in einer Vielzahl von Rezeptor-Ligand-Interaktionen, z. B. die Hämagglutinin abhängige Bindung des Influenza-Virus zu Host Zellen4beteiligt. Ein Epitop Sialinsäure Säure mit wichtige biologische Funktionen, vor allem in der Embryogenese und im Nervensystem, ist Polysialic Säure. Polysialic Säure ist ein Polymer von bis zu 200 2,8 verknüpft Sialinsäure Alphasäuren. Der große Protein Träger der Polysialic Säure ist das neuronale Zelle Adhäsionsmolekül (NCAM). Polysialic Säure Ausdruck moduliert die Hafteigenschaft NCAM in diesem Polysialic Säure Ausdruck die Adhäsion verringert und erhöht die Plastizität mit dem Nervensystem-5.

Veränderungen in der Expression von (Poly) Sialinsäure Säure beeinflußt schließlich eine Vielzahl von verschiedenen biologischen Wechselwirkungen. Dies kann zur bekannten Sialinsäure Säure abhängigen Prozesse auf molekularer Ebene, um neuartige Glycoconjugate Interaktionen zu entdecken, oder erkunden mögliche therapeutische Ansätze zu studieren. Es gibt verschiedene Methoden zur Verfügung mit denen die Expression von Sialinsäure Säure auf der Zelloberfläche moduliert werden kann, z. B. Behandlung mit Sialinsäure Säure bestimmte Glycosidases (Sialidases), Hemmung der Enzyme bei der Sialinsäure Säure-Biosynthese6 ,7,8, oder umzuwerfen oder den Ausdruck des wichtigsten Enzyms der Sialinsäure Säure Biosynthese9ändern.

Eine weitere vielseitige Methode zu modulieren, Sialinsäure Säure Ausdruck ist MGE (auch bekannt als metabolische Oligosaccharid Engineering, MOE). Hierin werden Zellen, Gewebe oder sogar Tiere mit nicht-natürliche Derivate des ManNAc behandelt, die C2-amino Modifikationen zu tragen. Als Vorläufer-Moleküle für Sialinsäure Säure nach zelluläre Aufnahme, diese ManNAc-Analoga sind unidirektionale metabolisiert, naturfremde Sialinsäure Säuren und auf Sialylated Glykokonjugate ausgedrückt werden können. Zellen mit ManNAc Derivate mit aliphatischen C2-Änderungen, wie z. B. ManNProp oder ManNBut, integrieren, N- Propionylneuraminic Säure (Neu5Prop) oder N- Butanoylneuraminic Säure (Neu5But) in ihrer Glykokonjugate10 behandelt , 11. mithilfe von funktionellen Gruppen in der C2-Position des ManNAc eingeführt, die auftretenden naturfremde Sialinsäure Säuren koppelbar, z. B. über die Staudinger Ligation oder Azid Alkin Cycloaddition, mit Fluoreszenz-Farbstoffen und daher auf der Zelle Oberfläche12visualisiert.

Der Ausdruck dieser naturfremde Sialinsäure Säuren hat faszinierende Wirkung auf viele biologische Prozesse, einschließlich Erreger Infektionen, die Adhäsion und Migration von Tumorzellen, allgemeine Zelladhäsion, sowie Vaskularisierung und Differenzierung (zur Überarbeitung siehe: Wratil Et Al. 13). Interessanterweise MGE mit N-Acyl geändert Mannosamines kann auch verwendet werden, mit dem Ausdruck der Polysialic Säure zu stören. Polysialic Säure wird durch zwei verschiedene Polysialyltransferases (ST8SiaII und ST8SiaIV) erzeugt. Es wurde nachgewiesen, dass Polysialyltransferase ST8SiaII durch unnatürliche Sialinsäure Säure Vorläufer, z. B. ManNProp oder ManNBut14,15gehemmt wird. Darüber hinaus wurde in menschlichen Neuroblastoma Zellen nachgewiesen, dass ManNProp oder ManNBut Anwendung auch Sialylation in insgesamt15reduziert.

MGE mit N-Acyl geändert Mannosamines ist eine einfach anzuwendende Methode, die erfolgreich, nicht nur in Säugetieren und Zellkultur Bakterien sondern auch im gesamten Tiere verschiedener Arten, wie Caenorhabditis Elegans16 eingesetzt wurden, Zebrafisch17oder Mäuse18,19,20,21. Vor allem ManNAc Derivate mit aliphatischen Änderungen, einschließlich ManNProp und ManNBut, sind geringfügig zytotoxische, auch bei millimolaren Konzentrationen im Zellkulturmedium oder Blutplasma. Darüber hinaus sind sie relativ leicht zu synthetisieren.

Hier bieten wir Informationen zur Verwendung von MGE mit N-Acetyl geändert Mannosamines. Zunächst ist die chemische Synthese von zwei der am häufigsten verwendete ManNAc-Derivate in diesem Bereich, ManNProp und ManNBut, erläutert. Als Nächstes zeigen wir, wie MGE in einem in-Vivo -Experiment angewendet werden kann. Als Beispiel der Neuroblastom-Zelllinie Kelly wurde gewählt, um verminderte Expression von Polysialic Epitop demonstrieren durch Western blot nach der Behandlung mit den ManNAc-Derivaten. Die naturfremde Sialinsäure Säuren auf der Zelloberfläche wurden mittels HPLC quantifiziert und weiter per Massenspektrometrie analysiert.

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Protocol

1. Vorbereitung der Puffer und Reagenzien

  1. Vorbereitung von 3 mM Natrium метоксида Lösung
    1. 8,1 mg Natrium метоксида in 50 mL Methanol (3 mM) in einer 100 mL-Glasflasche mit Stir Bar auflösen. Lagerung bei Raumtemperatur (RT) für mehrere Wochen.
  2. Vorbereitung der Tris-HCl-Puffer
    1. 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl und 146 mg EDTA in einer 100 mL-Glasflasche mit Stir Bar zu kombinieren und in 80 mL Wasser auflösen.
    2. Die bewegende Lösung unter Beachtung des pH-Wertes mit einem pH-Meter von Natriumhydroxid (1 M, in Wasser) oder HCl (20 % in Wasser) hinzu, und stellen Sie den pH-Wert auf 8.0.
    3. Fügen Sie das Volumen des Wassers benötigt, um ein finales Volumen von 100 mL zu erreichen. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 µm Sterilfilter System.
      Hinweis: 100 mL Tris-HCl-Puffer enthält 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl und 5 mM EDTA (pH 8,0). Die Lösung kann für mehrere Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.
  3. Vorbereitung der Aprotinin-Lösung
    1. 10 mg Aprotinin in 1 mL Wasser (1,54 mM) auflösen. Aliquot der Aprotinin-Lösung in 10 x 1,5 mL-Kunststoff-Rohre (100 µL). Bei-20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren.
  4. Vorbereitung der Leupeptin Lösung
    1. Lösen Sie 10 mg Leupeptin in 2 mL Wasser (10 mM). Aliquoten Leupeptin Lösung 10 x 1,5 mL-Kunststoff-Rohre. Bei-20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren.
  5. Vorbereitung der Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) Lösung
    1. Auflösen von 34,8 mg PMSF in 2 mL Ethanol (100 mM). Aliquoten PMSF Lösung in 10 x 1,5 mL-Kunststoff-Rohre. Bei-20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren.
  6. Herstellung von 1,2-Diamino-4,5-Methyldioxybenzol-Dihydrochloride (DMB) Lösung
    1. Kombinieren Sie 15,62 mg DMB, 352 µL β-Mercaptoethanol und 48 µL Natrium Bisulfit-Lösung (39 %) und 9,6 mL Wasser (6,9 mM DMB, 500 mM β-Mercaptoethanol und 0,19 % Natrium Bisulfit). Aliquoten die DMB-Lösung in 40 x 1,5 mL-Kunststoff-Rohre (250 µL). Shop für mehrere Wochen lichtgeschützt bei-20 ° C.
  7. Vorbereitung der Lösung 1 M Trifluoroacetic Säure (TFA)
    1. Fügen Sie 770.3 µL 100 % TFA in 9,23 mL Wasser in ein Kunststoffrohr 15 mL (1 M). Seit einigen Wochen bei 4 ° C lagern.
  8. Vorbereitung von 120 mM TFA Lösung
    1. 9,91 mL Wasser (120 mM) in 15 mL Kunststoffhülse 92,4 µL TFA (100 %) hinzufügen. Seit einigen Wochen bei 4 ° C lagern.
  9. Vorbereitung von 400 mM (NaOH) Natronlauge
    1. 160 mg NaOH in 10 mL Wasser (400 mM) in einem 15 mL Kunststoff Rohr zu lösen. Seit einigen Wochen bei 4 ° C lagern.
  10. Vorbereitung der Western-Blot-Lyse-Puffer
    1. Lösen Sie 5,84 g NaCl, 0,1 g Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2und 1 g Triton-X100 in 100 mL Wasser und den pH-Wert 7,8 einstellen. Shop bei 4 ° C. Fügen Sie 100 µL jeder Protease-Inhibitor (Aprotinin, Leupeptin und PMSF) vor der Verwendung des Lyse-Puffers.
  11. Vorbereitung von Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Puffer
    1. 0,3 g Tris, 1,5 g Glycin und 0,1 g SDS in 100 mL Wasser auflösen und den pH-Wert 7,3 einstellen. Shop bei RT
  12. Vorbereitung der Western-Blot-Puffer
    1. 0,3 g Tris, 1,1 g Glycin in 90 mL Wasser auflösen und 10 mL Ethanol hinzufügen. Shop bei RT
  13. Vorbereitung der Lösung blockieren
    1. Lösen Sie 1 g Fett Milch macht in 25 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Immer frisch zubereiten.

(2) Synthese von ManNProp und damit verbundenen N-Acyl-Mannosamines geändert

  1. 431,2 mg Mannosamine Hydrochlorid in 10 mL 3 mM Natrium метоксида Lösung in einer 50 mL-Glasflasche mit Stir Bar zu lösen.
  2. Abkühlen der Mischung auf Eis, 0 ° C. Der mitreißende Projektmappe fügen Sie langsam tropfenweise 210 µL Propionyl Chlorid (2,4 Mmol) oder 248 µL-Butanoyl-Chlorid (2,4 Mmol), ManNProp oder ManNBut, bzw. zu synthetisieren hinzu. Inkubieren Sie die mitreißende Mischung bei 0 ° C für 4 h.
  3. Übertragen Sie die Lösung in ein 50 mL-Kunststoff-Rohr. Stechen Sie 4-8 Löcher in den Deckel des Kunststoffrohres mit einer dünnen Nadel. Schnell die Lösung mit Flüssigstickstoff Einfrieren und später lyophilize (Einfrieren trocken) für 48 h oder bis es vollständig getrocknet ist.
  4. Mischen Sie 350 g Kieselgel 60 mit 750 mL Ethyl-Acetat/Methanol/Wasser (15:2:1) (Dies ist eine Suspension). Füllen Sie eine Glassäule (35 mm Durchmesser und 70 cm Länge) mit Kieselgel 60 Federung und waschen Sie die vorbereitete Spalte mit einem zusätzlichen 100 mL Ethyl-Acetat/Methanol/Wasser (15:2:1) vor Gebrauch.
  5. Die Trockenprodukte aus Schritt 2.3 auflösen (5 g getrocknete Produkt) in 10 mL Ethyl-Acetat/Methanol/Wasser (15:2:1) und laden Sie sie mit einer Pipette auf die Silica gel-Spalte. Sammeln Sie 4 mL Fraktionen nach 500 mL (für ManNProp). Hinweis: ManNBut wird aus der Spalte nach etwa 700 mL eluieren.
  6. Übertragen Sie der eluierten Brüche in 15 mL-Kunststoff-Rohre. Stechen Sie 3-6 Löcher in den Deckel des Kunststoffrohres mit einer dünnen Nadel. Rapid die Lösung mit flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend lyophilize, bis es vollständig getrocknet ist.
    Hinweis: Die gefriergetrockneten Produkte können für mehrere Monate bei RT gelagert werden
  7. Überprüfen Sie die Reinheit der Produkte durch Massenspektrometrie (siehe Abschnitt 9).
    Hinweis: Alternativ kann Reinheit auch um 1H Kernspinresonanz (NMR) überprüft werden.

3. die Zellkultur

  1. Kultur-Kelly-Neuroblastom-Zellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 10 % fötalen Rinderserum, 100 U Penicillin, 100 mg Streptomycin, 2 mM L-Glutamin mit 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp oder 5 mM ManNBut, bei 37 ° C und 5 % CO2-haltigem Medium.
    Hinweis: Zellen kultiviert in Medium ohne ManNAc oder seine Analoga sind als Kontrolle verwendet.
  2. Vor der Anwendung von der Mannosamines die Kelly-Neuroblastom-Zellen durch Inkubation sie für 10 min mit Trypsin/EDTA (0,25 %, 0,02 %, mit PBS-Puffer) abnehmen und Neubauer-Kammer oder Zelle Zähler zählen. Samen der Zellen auf definierten Zahlen basierend auf der Größe der Platte/Schale.
    1. Zur Messung der Sialinsäure Säure Monosaccharide Samen Sie 1 x 105 Zellen in 500 µL Medium in einer Gewebekultur 48-Well-Platte. Samen Sie für die Analyse der Polysialic Säuren 1 x 106 Zellen in 3 mL Medium auf einem 6 cm Durchmesser Zelle Kulturschale. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2. Ersetzen Sie das Medium alle 24 h.
      Hinweis: Die Wirkung von MGE steigt mit der Gesamtzeit der Behandlung. Für hohe Stoffwechseleffizienz behandeln Sie die Zellen für 5-7 Tage.
  3. Nach der Behandlung Dekantieren des Mediums. Waschen Sie die Platten/Geschirr mit PBS. Lösen Sie die Zellen, indem Inkubation sie für 10 min mit Trypsin/EDTA (0,25 %, 0,02 %, mit PBS-Puffer). Die Trypsin zu neutralisieren, indem die freistehenden Zellen die gleiche Menge an Zellkulturmedium hinzufügen. Übertragen Sie die freistehenden Zellen in 15 mL-Kunststoff-Rohre. Zentrifugieren Sie Proben für 3 min bei 500 X g und verwerfen Sie den überstand.
    1. Fügen Sie 5 mL PBS und Zentrifuge Zellen (siehe Punkt 3.3 hinzu). Wiederholen Sie den Waschvorgang zwei weitere Male.
      Hinweis: Das gewaschene Zelle Pellet ohne Überstand kann bei-20 ° C für mehrere Tage gespeichert werden. Wenn der Ausdruck der Polysialic Säure ist geklärt werden weiter zum Abschnitt 10.

(4) Zell-Lyse für HPLC-Analytik

  1. Vorbereitung der HPLC-Lyse-Puffer
    1. Kombinieren Sie 5 mL Tris-HCl-Puffer, 5 µL Aprotinin Lösung, 20 µL Leupeptin Lösung und 50 µL PMSF Lösung.
      Hinweis: enthält 5 mL HPLC Lysis Puffer 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM Aprotinin 40 µM Leupeptin, und 1 mM PMSF (pH 8,0). Dieser Puffer sollte immer vor der Zelle Lysis frisch zubereitet werden.
  2. Neu die gesammelten Zelle Pellets (Schritt 3.3) jeder in 500 µL eiskalte HPLC Lyse-Puffer, und Ultra-beschallen die Proben mit einer Ultraschall-Prozessor Nadel dreimal für einen Zeitraum von 30 s bei mittleren bis hohen Amplituden. Kühlen Sie die Proben auf Eis für mindestens 1 Minute zwischen den Zyklen.

5. Trennung der Membran-Fraktion

  1. Zentrifugieren der lysierten Zellproben für 2 h bei 20.000 x g und 4 ° C. Den überstand (ca. 480 µL), Vertretung cytosolischen Proteine in 1,5 mL-Kunststoff-Rohre zu trennen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration dieser Fraktionen verwenden, z. B.der Bradford oder der Bicinchoninic Säure (BCA) Test.
    Hinweis: Die Konzentration des Proteins (ca. 1 mg/mL) der cytosolischen Fraktionen kann die gemessenen Mengen der Gattung angesehenen Sialinsäure Säure später verwandt. Das Pellet Bruchteil der Membran, die in Schritt 6.1 verwendet wird.

6. saure Hydrolyse

Hinweis: Oligo- und Polysaccharide in den Zellmembranen zu Monosacchariden hydrolysiert. Weitere, mögliche O-Änderungen in den Monosacchariden hydrolysiert, sowie. Dies ist notwendig für quantitative HPLC-Analytik, da die überwältigende Mehrheit der Sialinsäure Säuren in den Membran-Fraktionen natürlich in Glykokonjugate fließen und möglicherweise zu O tragen könnten-Acetyl oder O- Lactolyl Änderungen.

  1. Fügen Sie 150 µL 1 M TFA-Lösung für die getrennte Membrane Brüche (Pellet aus Abschnitt 5). Inkubieren Sie die Proben für 4 h bei 80 ° C mit Schütteln bei 200-600 u/min.
  2. Zentrifugieren Sie Proben für ca. 30 min bei 20.000 x g und 21 ° C mit 0,5 mL Filterschläuche mit 3 kDa Ausgrenzung Membranen, bis die obere Phase weniger als 20 µL beträgt.
    Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, höher molekulare Schutt entsorgen.
  3. Die untere Phase enthält kleinere Moleküle, einschließlich der Sialinsäure Säure-Arten in 2 mL-Kunststoff-Rohre zu übertragen. Stechen Sie 2-4 Löcher in das Kappen der Kunststoffrohre mit einer dünnen Nadel. Rapid der Proben mit flüssigem Stickstoff eingefroren und dann lyophilize sie über Nacht.
    Hinweis: Die getrockneten Proben können über mehrere Tage bei RT ersetzen eine Kappe ohne Löcher für eine längere Lagerung gelagert werden.

(7) fluoreszierende Kennzeichnung

  1. Erneut die getrockneten Proben in 10 µL 120 mM TFA Lösung auszusetzen und 50 µL DMB Lösung hinzufügen. Proben in dunklen 1,5 mL Röhrchen zum Schutz vor UV-Licht zu übertragen.
  2. Normen, lösen sich in 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, in Wasser) oder 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, in Wasser) in 10 µL 120 mM TFA Lösung in dunklen 1,5 mL-Tuben. 50 µL DMB Lösung hinzufügen.
  3. Brüten die Zellmembran Proben und die Standards für 1,5 h bei 56 ° C, vor Licht geschützt. Fügen Sie nach der Inkubation 4 µL 400 mM NaOH Lösung jede Probe, die Kennzeichnung Reaktion zu stoppen hinzu.

(8) HPLC-Analytik

Hinweis: Markierte Proben werden analysiert, auf einem HPLC-System, ausgestattet mit einer RP C18-Säule (110 Å, 3 µm Partikelgröße, 4.6 x 150 mm), ein Fluoreszenz-Detektor und Fraktionssammler. Die verwendeten Lösungsmittel sind Methanol, Acetonitril und Wasser. Stellen Sie sicher, alle Lösungsmittel vor den Messungen, Entgasen, fehlt der HPLC-Anlage eine interne Degasser.

  1. Die Temperatur der Spalte auf 40 ° C einstellen und konfigurieren den Fluoreszenz-Detektor mit 373 nm für Anregung und 448 nm bei Emission, beziehungsweise. Injizieren Sie 10 µL Probenvolumen zu und trennen Sie die Sonden für 50 min bei 0,5 mL/min Durchflussmenge mit Methanol-Acetonitril/Wasser (6:8:86) als der Eluent. Für die Massenspektrometrie Analyse sammeln Sie die Gipfel von Interesse.
    Hinweis: Neu5Gc Eluat nach 6-8 min, Neu5Ac nach 9-12 min, Neu5Prop nach 17-23 min und Neu5But nach 38-44 min erwartet. Die fraktionierten Proben können mehrere Stunden bei 4 ° C, vor Licht geschützt gelagert werden.
  2. Nach jeder Probe wird gemessen, die Spalte für 7,5 min. bei 1,0 mL/min Durchflussmenge (≈ 1,5 Spalte Bände) mit Methanol-Acetonitril/Wasser (6:25:69) waschen und wieder equilibrate das System für 7,5 min bei 1,0 mL/min Durchflussmenge mit Methanol-Acetonitril/Wasser (6:8:86).
  3. Berechnen Sie für die Quantitative Analyse die Fläche unter der Kurve der Sialinsäure Säure-Gipfel mit der Betriebssoftware der jeweiligen HPLC-System22.
    Hinweis: Gewonnene Daten können die Neu5Ac oder den Neu5Gc-Standard und die gemessenen Proteinkonzentrationen in den cytosolischen Fraktionen (siehe Abschnitt 5.1) bezogen werden.

9. Massenspektrometrie Analyse der Sialinsäure Säure Monosaccharide

Hinweis: HPLC Retention Spitzen von Interesse können weitere massenspektrometrisch Flüssigchromatographie (LC) Elektrospray-Ionisation (ESI-MS), analysiert werden um zu überprüfen, die unnatürliche Sialinsäure Säure-Arten.

  1. Injizieren Sie für die Massenspektrometrie Analyse 20 µL gesammelten Probe in ein LC/Mass selektive Detektor (MSD) System mit 79,9 % Methanol, 20 % Isopropyl-Alkohol und 0,1 % Ameisensäure als Laufmittel, 0,5 mL/min Durchflussmenge, 4 kV Kapillare Spannung und Kapillare Temperatur 350 ° C 22 , 23.
  2. Wählen Sie in der Auswertungs-Software des jeweiligen LC/MSD-Systems den Gipfel des Interesses an der gesamten Ion Chromatogramm. Das Massenspektrum des gelöst Peak anzeigen Das positive Masse/Ladung-Verhältnis zwischen 300 und 700 anzeigen
    Hinweis: DMB Kennzeichnung von Sialinsäure Säuren führt zu einem Anstieg der Molekülmasse von 116,2 g/Mol. Die DMB-Label Sialinsäure Säure-Arten haben die folgenden molekularen Massen: DMB-Neu5Ac = 424,2 g/Mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/Mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/Mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/mol gemeinsamen Addukte sind Acetonitril, Natrium oder Isopropyl-Alkohol.

10. Western-Blot Analyse der Polysialic Säure in Kelly Neuroblastom-Zellen

  1. Vorbereitung der Zelle lysates
    1. Fügen Sie 1 mL Western-Blot Lyse Puffer auf die Zelle Pellets aus Schritt 3.3 und Vortex. Inkubieren Sie für 30 min auf Eis. Vortex: alle 5 Minuten. Zentrifugieren Sie Proben für 1,5 h bei 20.000 x g und 4 ° C. Den Überstand enthält die Proteine aus lysierten Zellen zu sammeln.
    2. Die Konzentration des Proteins von der Protein-Fraktionen, z. B., der Bradford oder der BCA-Test zu bestimmen. Verdünnen Sie die Proben zu einer Proteinkonzentration von 1,5 µg/µL in Lyse Puffer.
    3. Die Proben für die SDS-PAGE durch Zugabe von 10 µL Laemmli Probenpuffer zu 90 µL Proteinfraktion (1,5 µg/µL) vorbereiten und Kochen der Probe für 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. Verwenden Sie 8 % SDS-Acrylamid Gele mit 20-30 µL Taschen und 0,75 oder 1 mm Dicke. Führen Sie das Gel bei 25 mA für 2 h bei RT
    2. Entfernen Sie vorsichtig die Glasabdeckung aus dem Gel. Ausschneiden und den oberen Teil des Gels mit der Laden-Taschen zu verwerfen. Legen Sie das Gel auf eine Nitrocellulose-Membran (0,2 µm), zuvor eingeweicht in Western-Blot-Puffer. Übertragen Sie die Proteine auf Nitrozellulose entsprechend der Empfehlung des Systems (z. B. 250 mA für 1 h bei 4 ° C).
    3. Entfernen Sie die Nitrozellulose-Membran aus dem Blot System. Fleck Fleck mit Ponceau rot, die Proteine zu visualisieren. Übertragen der Nitrozellulose-Membran in eine Kunststoff-Kammer und 10 mL Lösung blockiert. 1 h bei RT inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C.
    4. Dekantieren Sie die blockierende Lösung und fügen Sie monoklonalen Anti-PolySia 735 Antikörper (1 µg/mL) in PBS. Die Membran für 1 h bei RT inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C. Waschen Sie nach der Inkubation der Membran mindestens drei Mal für 5 min mit PBS.
    5. Fügen Sie polyklonale Anti-Maus IgG Sekundärantikörper (1 µg/mL) mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder eine fluoreszierende Label mit PBS-Puffer gekoppelt. Die Membran für 1 h bei RT inkubieren Waschen Sie nach der Inkubation der Membran mindestens drei Mal für 5 min mit PBS.
    6. Übertragen Sie die Membran auf einen Teller mit einem entsprechenden Imager. Erkennen Sie das Signal entsprechend den Anweisungen des Herstellers.

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Representative Results

HPLC-Chromatogramme von Leuchtstofflampen, die mit der Bezeichnung Neu5Ac und die Neu5Gc-Standards sind in Abbildung 2dargestellt. Verwendung der hierin beschriebenen Methode elutes DMB-Label Neu5Gc in der Regel zwischen 7-9 min Elution Zeit und DMB-Neu5Ac zwischen 10-12 min. Einige kleinere Gipfel in das Chromatogramm erscheinen in der Regel zwischen 2-6 min. Diese Spitzen sind nicht umgesetztes DMB und Reaktion Zwischenprodukte25.

Abbildung 3 zeigt repräsentative Chromatogramme der Zelle Lysates. Im Vergleich zu den Chromatogrammen der DMB-Label Standards (Abbildung 2), in diese Chromatogramme mehrere undefinierten Peaks sichtbar sind. Dies liegt höchstwahrscheinlich an der internen Unreinheit der Zelle Lysates und die Tatsache, dass DMB nicht nur mit Sialinsäure Säure Arten, sondern auch mit anderen α-Keto-Säuren in Zelle Lysates, darunter Pyruvat, Succinat und α-Ketoglutarate26reagiert. Die Anwesenheit von geringen Mengen an Sialinsäure Säuren mit O-Acetyl-Modifikationen, die nicht durch Essigsäure Hydrolyse gespalten worden könnte auch als Grund für diese undefinierte Gipfeln23diskutiert werden. Chromatogramme aus lysierten unbehandelten Zellen sind gegenüber Chromatogramme aus Zellen, die zuvor mit ManNAc oder seine Analoga behandelt wurden. Wie hier gezeigt, führt die Behandlung mit ManNAc oft zu einer fast gesamte Erschöpfung der Neu5Gc auf der Zelloberfläche. In Chromatogramme lysierten Zellen behandelt mit Neu5Prop oder Neu5But, Spitzen sind sichtbar, die nicht in Chromatogramme von unbehandelten Zellen angezeigt. Diese Spitzen (für ManNProp Zellen ungefähr 19 min. Elution Zeit für ManNBut behandelt und Zellen bei 42 min) zeigen die Darstellung der entsprechenden naturfremde Sialinsäure Säuren, Neu5Prop und Neu5Gc. Wie in Abschnitt 8.3 des Protokolls beschrieben, können die HPLC-Chromatogramme analysiert werden, um die Mengen der verschiedenen Sialinsäure Säure Spezies in der Zelle Lysates zu quantifizieren.

Die Tatsache, dass verschiedene HPLC Retention Spitzen bestimmten Sialinsäure Säure-Arten entsprechen wurde durch Massenspektrometrie überprüft. Vertreter ESI-MS Daten aus gesammelten HPLC-Gipfel von Interesse sind in Abbildung 4dargestellt: das Spektrum der gesammelten DMB-Neu5Ac Aufbewahrung Spitze im oberen linken Bereich, DMB-Neu5Gc im rechten oberen Bereich, und die beiden Arten der naturfremde Sialinsäure Säure, DMB-Neu5Prop und DMB-Neu5But in den unteren linken und rechten Panels. Die Reaktion mit DMB führt zu einem Anstieg der Molekülmasse von 116,2 Da, im Vergleich zu den Sialinsäure Säure-Arten, die nicht gekennzeichnet sind mit dieser Farbstoff. In den Massenspektren, wenn das positive Masse/Ladung-Verhältnis der injizierten Proben zwischen 300 und 700 Anzeigen sind mehrere Peaks sichtbar. Dies liegt an Bildung der angesehenen DMB-markierten Sonde Addukt. Neben den protonierten Ion [M + H]+, das Natrium Addukte [M + Na]+ und [M + 2Na-H]+ erscheinen. Acetonitril (ACN) während der LC-Analyse vorliegt, kann es als ein Addukt in den Massenspektren gefunden werden (für DMB-Neu5Gc, Abbildung 4gezeigt: rechten oberen Bereich). Aufgrund der Zersplitterung durch Elektronenstruktur Dekompensation Aktivierungen erzeugt im Großraum Electronspray Transport zwischen den Kapillaren und den ersten Skimmer dehydriert Sialinsäure Säure Arten [M + H]+-H2O auch beobachtet werden können (für angezeigt DMB-Neu5Ac, Abbildung 4: oberen linken)23,27. Im LC-Setup elutes DMB-Neu5Gc kurz nach den nicht umgesetzten oder teilweise reagierten DMB-Arten. Daher kann die gesammelten DMB-Neu5Gc Sonde Verunreinigungen durch diese Reaktion Zwischenprodukte enthalten. Dies dient als Erklärung für das Auftreten der undefinierten Peaks im Massenspektrum von DMB-Neu5Gc (Abbildung 4: rechten oberen Bereich).

Behandlung von Kelly Neuroblastom-Zellen mit ManNProp oder ManNBut führt zu reduzierten Expression von Polysialic Säure auf NCAM, dargestellt durch Western-Blot Analyse der Zellmembran aus lysierten Zellen (Abbildung 5). Polysialic Säure wird normalerweise wie ein Abstrich tun, um die Heterogenität in Größe und Ladung der (≈ 200 kDa). Behandlung mit ManNAc Analoga führt zur Verringerung der Polysialic Säure auf der Oberfläche von Zellen: je länger der aliphatischen N-Acyl-Seitenkette, desto stärker die Reduktion28.

Figure 1
Abbildung 1: Der allgemeine Grundsatz der MGE mit N-Acyl geändert Mannosamines. Nach der Behandlung mit dem N-Acyl geändert Mannosamines, diese ManNAc-Analoga sind unidirektional metabolisiert (intrazellulären Stoffwechsel) zu den entsprechenden naturfremde Sialinsäure Säuren. Diese sind in den Golgi transportiert, überwiesenen Beträge zu den jeweiligen Oligosaccharid-Akzeptor Sialyltransferasen und auf der Zelloberfläche als Sialosides (hier: ein Glykoprotein) ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: repräsentative Chromatogramme DMB-Label Sialinsäure Säure Standards. DMB-Label Neu5Ac (obere Abdeckung) und Neu5Gc (untere Leiste) wurden mittels HPLC analysiert. Retention Zeiten (gestrichelte Linien) und Peakflächen der beiden Sialinsäure Säuren wurden ermittelt nach Injektion 10 ng der angesehenen DMB-markierten Arten in das HPLC-System. In der hier gezeigten repräsentative Chromatogramme, DMB-Neu5Gc eluiert nach ca. 8 min Verweilzeit und DMB-Neu5Ac bei 11 min, bzw.. Einige kleinere Gipfel in das Chromatogramm erscheinen in der Regel zwischen 2 und 6 min, repräsentieren nicht umgesetztes DMB und Reaktion Zwischenprodukte. Ein kleiner Bruchteil der DMB-Label Neu5Ac erscheint als eine kleine Verunreinigung im DMB-Neu5Gc Standard (untere Leiste). Diese Zahl wird vom Referenz22geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Charakterisierung der Membrane-springen Sialinsäure Säuren durch DMB-HPLC. Zellen wurden in Abwesenheit (unbehandelt, obere Platte) oder Präsenz mit 5 mM ManNAc kultiviert (zweite Panel von oben), ManNProp (dritte Panel von oben), oder ManNBut (untere Platte), jeweils für 7 Tage. Das Medium wurde alle 24 Std. geändert wurden die Zellen geerntet und Membran Fraktionen wurden vorbereitet, beschriftet mit DMB und mittels HPLC analysiert. Im Vergleich zu der Chromatogramme DMB-Label Sialinsäure Säure Standards (Abbildung 2) wurden Peaks bei der Retentionszeiten zwischen 8-9 min als DMB-Neu5Gc und Gipfel zwischen 10-11 min als DMB-Neu5Ac identifiziert. Im Vergleich zu den Gipfeln von DMB-Label Sialinsäure Säure Normen Injektion erhalten, zeigen Chromatogramme aus Zelle Lysates zusätzliche, undefinierte Gipfeln. Dies ist aufgrund der internen Unreinheit der Sonden sowie die Tatsache, dass DMB nicht nur mit Sialinsäure-Säure, die in der Zelle Lysates, sondern auch mit anderen α-Keto-Säuren in Zelle Lysates, einschließlich Pyruvat, Succinat und α-Ketoglutarate reagieren zu kann. Gipfeln, die erst in die Chromatogramme von Proben aus Zellen kultiviert in Gegenwart von N-Acyl geändert Mannosamine Analoga zeigen die entsprechenden DMB-Label naturfremde Sialinsäure Säuren. Diese Zahl wird vom Referenz22geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Masse Spektren von DMB-Label Sialinsäure Säure Arten in Zelle Lysates. HPLC Aufbewahrung Gipfeln von Interesse (siehe Abbildung 3) wurden gesammelt und anschließend analysiert von ESI-MS. 20 µL der gesammelten Selbstbehalte Gipfeln wurden in der LC-MSD-System injiziert. Reaktion mit DMB führt zu einem Anstieg der Molekülmasse von 116,2 Da im Vergleich zu den entsprechenden nicht umgesetztes Sialinsäure Säure-Arten. Die positive Masse/Ladung Verhältnis Spektrogramme aus verschiedenen Sialinsäure Säure Arten gewonnen werden dargestellt (DMB-Neu5Ac: oberen linken Feld, DMB-Neu5Gc: rechten oberen Bereich, DMB-Neu5Prop: unteren linken, DMB-Neu5But: unteren rechten Fensterbereich). Fällig zu Bildung Addukt sind mehrere Peaks sichtbar. Neben den protonierten Ion [M + H]+, Addukte Natrium [M + Na]+ und [M + 2Na-H]+ erscheinen. Acetonitril, der während der LC-Analyse vorhanden ist, finden Sie auch als ein Addukt (obere rechte Abbildung). Dehydrierte DMB-Neu5Ac, das erzeugt wird, durch eine Fragmentierung des Instruments [M + H]+-H2O kann (oben links) beobachtet werden. Die gesammelten DMB-Neu5Gc Sonde enthalten Verunreinigungen durch Reaktion nicht umgesetztes DMB sowie Zwischenprodukte als zusätzliche undefinierten Gipfel (obere rechte Abbildung). ACN, Acetonitril; H, Wasserstoff; Na, Natrium. Diese Zahl wird vom Referenz22geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Analyse der Polysialylation der NCAM. Kelly Neuroblastom-Zellen wurden im fehlen oder Vorhandensein von 5 mM ManNAc, ManNProp oder ManNBut für 7 Tage kultiviert. Zellen wurden geerntet und Proteine wurden getrennt auf 8 % SDS-Acrylamid Gele von Western-Blot mit monoklonalen Anti-PolySia Antikörper 735 analysiert. Hinweis: Diese PolySia als ein Abstrich wegen ihrer Heterogenität in Anzahl der Sia, was in verschiedenen Größen und Gebühren des PolySia angezeigt.

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Discussion

Wenn die chemisch synthetisierten ManNAc Derivate, ManNProp und ManNBut per Massenspektrometrie analysiert werden, sollten nur die richtigen Masse Gipfel für beide Proben ermittelt werden. Daher können die Produkte davon ausgegangen, dass eine Reinheit von über 99 %. Kleine Mengen von Neu5Gc, die normalerweise nicht in menschlichen Zellen29gefunden wird, werden in den Membran-Fraktionen der lysierten Zellen erkannt. Dies geschieht wahrscheinlich durch einen Unfall-Weg, der Neu5Gc vom fötalen Rinderserum Sialoglycoconjugates in den Medien30Rekruten. Behandlung mit der natürliche Vorläufer der Sialinsäure Säure Biosynthese, ManNAc, senkt drastisch die Expression von Neu5Gc Epitop auf der Zelloberfläche.

Anwendung der geänderten Mannosamines ist geringfügig giftig für alle Zellen, die bisher untersucht. Zellen nehmen erhöhte millimolaren Zucker-Konzentrationen innerhalb des Mediums, die notwendig ist, da gibt es keine spezifische Transporter für N- Acylmannosamines. Es wurde nachgewiesen, dass Signal Transduction Bahnen auf Antrag des N- Acylmannosamines aktiviert werden, die Zelle Wachstum oder Differenzierung31,32beeinträchtigen könnten. Ob dies ist aufgrund einer veränderten Sialylation Muster oder reflektiert direkte Auswirkungen auf die veränderten Sialylation ist bisher nicht bekannt. Wachstum von Zellen in Anwesenheit von C2-modifizierten ManNAc-Analoga, ManNProp oder ManNBut ergibt sich in der Ausprägung der naturfremde Sialinsäure Säure Arten tragen die entsprechenden N-Acyl-Substitution. Die Stoffwechseleffizienz der beiden getestet N-Acyl geändert Mannosamines variiert. Behandlung mit ManNProp führt in der Regel zum Ausdruck der entsprechenden Neu5Prop auf der Zelloberfläche und eine verminderte Expression von Neu5Ac sowie Neu5Gc. Andere N-Acyl geändert Mannosamine Analoga, wie N- Cyclopropylcarbamyl Mannosamine, sind in der Regel eine noch höhere Stoffwechseleffizienz22haben.

Frühere Studien zeigten, dass Polysialylation sialic Vorstufen stören. Polysialic Säuren werden fast ausschließlich auf die NCAM ausgedrückt. Interessanterweise kann NCAM Polysialylated durch zwei verschiedene Polysialyltransferases in den Golgi (ST8SiaII und ST8SiaIV) ausgedrückt werden. Es stellte sich heraus, dass ManNProp, ManNBut und andere N-Acyl-modifizierten Mannosamines mit Polysialylation stören und dass dies überwiegend durch die Wechselwirkung mit ST8SiaII14. Dieses Sialyltransferase drückt sich während der Entwicklung und ist wichtig für die Entwicklung des Gehirns. Interessant ist auch, viele Tumoren aus neuronalen Ursprungs neu express ST8SiaII erhöhen ihre Bösartigkeit und weiter so dass sie vom Immunsystem33nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu führt die Anwendung des ManNAc zu einer Erhöhung des PolySia, denn es zu einer Erhöhung der CMP-Neu5Ac führt, das ist das natürliche Substrat der beiden Polysialyltransferases.

MGE ist eine einzigartige Methode, neuartige Sialinsäure Säuren auf Proteine des Interesses (z.B. Erythropoietin) einzuführen und damit seine Funktion modulieren. Darüber hinaus kann zur Zelle Oberfläche Glykosylierung, modulieren die möglicherweise von Interesse bei vielen Krankheiten, wie Krebs, da viele Krebszellen versuchen, das Immunsystem zu entgehen, indem hohe Niveaus der Sialinsäure Säure zum Ausdruck zu bringen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht: Erstens Glykan mit Zellkulturen führen, und zweitens, um analysieren entwickelt Glykane, erfolgreiche Glykan zu beweisen. Die Methode ist sehr robust und bis jetzt sind keine Fallstricke berichtet; im Gegensatz dazu hat die Methode erweitert, um chemische aktive Gruppen zum Durchführen der Click-Chemie auf Zellen13einzuführen.

Hier präsentieren wir Ihnen zwei ManNAc Analoga mit aliphatischen N-Acyl-Seite-Kette-Modifikationen, die vergleichsweise einfach zu synthetisieren, sind sogar durch Labors mit weniger Ausstattung und weniger Erfahrung in der chemischen Synthese. Gruppen, die die organische Chemie besser auskennen könnte andere ManNAc-Analoga mit komplexeren Strukturen zu synthetisieren und verwenden diese für MGE, darunter der so genannte "Bioorthogonal"-Analoga, die beispielsweise genutzt werden, können Sialylated zu visualisieren Glykokonjugate. Es gibt Review-Artikel geben einen Überblick über die N-Acetyl-Mannosamine-Derivate, die bisher13,34synthetisiert. N- Azidoacetyl Mannosamine (ManNAz), eine Substanz, die häufig verwendet wird, um Sialylated handelt, zu visualisieren, ist im Handel erhältlich. Es kann wegen der geringen Membran Durchlässigkeit des ManNAc Analoga vorteilhaft, Derivate dieser Zucker mit geschützten Hydroxyl-Gruppen, z. B. Peracetylated ManNAc Analoga zu verwenden. Nach der Eingabe der Zytoplasma, sind die Schutzgruppen durch cytoplasmatische Esterasen abgespalten und Freigabe der aktiven Monosaccharide35,36,37. Peracetylated ManNAc Analoga setzen jedoch höhere Zytotoxizität im Vergleich zu den entsprechenden ungeschützten Derivate.

In diesem Manuskript entschieden wir uns für unsere Experimente mit MGE verewigt Neuroblastom-Zellen. Im Allgemeinen kann MGE (insbesondere mit ManNProp und ManNBut) angewendet werden, in einer Vielzahl von Zelllinien, einschließlich immortalisierte Zelllinien (siehe Wratil Et al. 13 für Beispiele) und Primärzellen38,39. Darüber hinaus wurde MGE erfolgreich eingesetzt, um Sialylation in Vivo in40 C. Elegans, Zebrafisch17,41, Maus19,20,42und Ratte zu verändern 43 , 44. die Behandlungszeit und die Konzentration der ManNAc Analoga in MGE Experimenten variiert werden, um die metabolische Effizienz dieser Methode zu beeinflussen. Aus unserer Erfahrung entsprechen längere Behandlung und höhere Konzentrationen besseren Ersatz der natürlich vorkommenden Sialinsäure Säure in Glykokonjugate durch veränderte Neu5R. Wenn sehr hohe Konzentrationen von ManNAc Derivaten verwendet werden, sollten die Zytotoxizität der Behandlung bewertet werden, z. B. durch die MTT-Assay oder Resazurin Reduktion Assay.

In diesem Manuskript empfehlen wir Ultra-Beschallung für Zelle Homogenisierung. Andere Zelle Lysis Methoden wurden getestet in unserem Labor, einschließlich Douncing auf Eis (ca. 250 Hübe) und Französisch Presse Störung (10.000 Psi, 4 Gänge), mit vergleichbaren Ergebnissen hinsichtlich der Höhe der Sialinsäure Säure in den Proben erkannt. Der Vorteil der Ultraschall Homogenisierung ist, dass es etwas Zeit benötigt und nicht das Hinzufügen von DNAase zu den Proben vor der Lyse erfordert.

Unsere Analyse konzentrieren wir auf die Membran Bruchteile von Zelle Lysates, denn wir wollten zeigen, dass Veränderungen in der Sialylation der Membran Glykokonjugate gebunden. Sialinsäure-Säure-Derivate und deren Konzentrationen können auch gemessen werden in das Zytosol der Zellen, nachdem die Membran Bruchteil durch High-Speed-Zentrifugation, mit der gleichen Methode wie oben beschrieben getrennt wurde. Allerdings sind die Konzentrationen der Sialinsäure Säure in das Zytosol bis zu 100 X niedriger im Vergleich zu Sialinsäure Säure Ausdruck auf der Zellmembran-7. Daher sind größere Mengen von Zellen erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse zu generieren. Der Pool der cytosolischen, aktivierte CMP-sialic Säure kann indirekt durch Vorbehandlung der cytosolischen Bruchteile von Zelle Lysates mit Natriumborohydrid vor Hydrolyse7,45gemessen werden. Um Sialinsäure Säure im Glykokonjugate und Sialinsäure Säure mit Hydroxyl-Änderungen Hydrolyseneigung, wurden die Zellen mit 1 M TFA inkubiert. Anderen sauren Lösungen können für die Hydrolyse, als auch, z. B. 2 M Propionsäure, Essigsäure 2 M oder 1 M HCl verwendet werden.

Ein mögliches aufgetretene Problem während der HPLC Analyse ist, dass Berge von Interesse mit undefinierten Spitzen überlappen. Dies ist besonders problematisch, wenn die Menge der Sialinsäure Säure in einer Probe durch die Fläche unter der Kurve eines bestimmten Peaks berechnet werden soll. Um einen Spitzenwert von Interesse von einem undefinierten Peak zu trennen, die Acetonitril-Konzentration in der HPLC-Lösungsmittel eingestellt werden könnte (± 3 %). Wir empfehlen stetige Lösungsmittel Konzentrationen für HPLC-Analytik, was den Vorteil der Vorbereitung Lösungsmittelgemisches vor Chromatographie. Daher ist unsere Methode erfordert nur ein HPLC-Pumpe und ist für eine Vielzahl von unterschiedlichen HPLC-Systemen möglich. Wenn mehr als eine Pumpe in das HPLC-System verfügbar ist, kann eine isokratische Gradienten mit steigenden Konzentrationen von Acetonitril angewendet werden, z. B. 4-9 % in 35 min45. Mithilfe dieser Technik werden die Retentionszeit des bestimmten HPLC-Gipfel deutlich verändert. Diese Strategie kann auch zur besseren Trennung von überlappenden Peaks zu erreichen. Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation, die Massenspektrometrie (MALDI-MS) erfolgreich hergestellt wurde, um zu überprüfen, die Expression von Sialinsäure Säure Spezies auf der Zelle Oberfläche45, und dient somit als Äquivalent zu der hier vorgestellte ESI-MS-Methode geändert .

Aufgrund der Hydrophilie der ManNAc Analoga und der Mangel an spezifischen Transporter für die Aufnahme von diesen Derivaten46werden hohe Konzentrationen in MGE Experimente mit diesen Verbindungen benötigt. Daher sind in oben skaliert Experimente und insbesondere in Vivo Studien große Mengen an die jeweiligen ManNAc Entsprechungen notwendig zeigt eine mögliche Einschränkung dieser Technik. Auf der anderen Seite muss eine bestimmte Mindestanzahl an behandelten Zellen je nach der verwendeten Zelllinien, zuverlässige Ergebnisse in der HPLC-Analyse zu erhalten. Aus unserer Erfahrung reicht ein Minimum von etwa 100.000 adhärente Zellen oder 150.000 Zellen in Suspension (1-2 Brunnen einer 96-Well-Platte mit konfluierende Zellen). Dies kann einen Engpass darstellen, wenn die Analyse werden, zum Beispiel in screening-Ansätze verkleinert soll.

Mit den Methoden in dieser Handschrift präsentiert können Sialinsäure Säure und seine Derivate in Zelle Lysates erkannt werden. Jedoch können die Struktur und Zusammensetzung der Glykokonjugate in Zellen mit ManNAc Derivate behandelt mit der hierin beschriebenen Technik beurteilt werden. Die Struktur der Glykokonjugate, e.g.,N- und O- Glykanen, zu lösen, erfordert in der Regel größere Erfahrung und ein Glykomik Anlage47. Unseres Wissens liegen bisher keine Daten auf die klare Struktur der Glykokonjugate aus Zellen, die mit ManNAc Analoga behandelt wurden.

Western-Blot Analyse der Polysialic Säure ist eine sehr schnelle und einfache Methode. Auf diese Weise gewonnenen Daten sind jedoch nicht quantitativ, da die Erkennung Antikörper und Chemilumineszenz verwendet. Daher ist die Verwendung von HPLC-Methoden einen Vorteil gegenüber westlichen beflecken. Dennoch empfehlen wir die Verwendung der Immunoblotting-Methode, da es einfach anzuwenden und sehr zuverlässig arbeiten bekannt ist.

Der Ausdruck der Sialinsäure Säure auf der Zelloberfläche kann auch durch andere Methoden als MGE verändert werden. Wie oben beschrieben, können Zellen mit einem Enzym Sialidase behandelt werden, die Sialinsäure Säure Rückstände von Glykokonjugate bindet sich in gewissem Sinne relativ unspezifisch. Sialidase Behandlung induziert folglich Hyposialylation in behandelten Zellen. Sialidase Behandlung ist leider eine eher begrenzte Technik, da es zytotoxische, für lange Zeit Behandlung nicht durchführbar und in in Vivo Experimente nicht anwendbar ist. Eine andere Technik induzieren Hyposialylation in den Zellen ist mit Inhibitoren der Sialinsäure Säure Biosynthese. Eine Vielzahl von Inhibitoren steht, dass entweder das Schlüsselenzym der Sialinsäure Säure Biosynthese, die UDP -N- Acetylglucosamin-2-Epimerase Zielgruppe /N- Acetylmannosamine-Kinase (Genentech/MNK) oder die Gruppe von Personen Sialyltransferasen6, 7,8,48. Eine dieser Verbindungen, eine C3-fluorierte Sialinsäure Säure analog, wurde gezeigt, die Expression von Sialinsäure Säure im Wohnzimmer zu senken Mäuse49. Tiere behandelt mit dieser Substanz jedoch zeigten Leber Beeinträchtigung, irreversiblen Nierenversagen und49Gedeihstörung. Diese Ergebnisse bestätigen die entscheidende Rolle der Neu5Ac in Leber und Nieren Funktion und weiter die Grenzen des Sialylation Inhibitoren für in Vivo Experimente. Eine dritte Methode, Zellen mit veränderten Zelle Oberfläche Sialylation zu generieren ist durch Eingriffe in die Expression von Enzymen, die für Sialinsäure Säure Biosynthese von entscheidender Bedeutung sind. Knock-down von Genentech/MNK in verewigt Zellen zeigte sich beispielsweise, diese Zellen Hyposialylated 9zu rendern. Die Möglichkeit, relativ einfach Knock-in und - Gene im Mobilfunk und in Vivo mit Roman und anerkannten CRISPR-Cas9-Technik könnte zu neuartigen Entdeckungen hinsichtlich Sialinsäure Säure Biosynthese führt und Zell-Oberfläche Sialylation.

Der Vorteil von MGE im Vergleich zu den hier beschriebenen Techniken ist, dass es einfach anzuwenden und anpassungsfähig für eine Vielzahl von verschiedenen Experimenten, von in-vitro- Studien zur Zell-basierte Testsysteme und in Vivo Experimente. Eine alternative Methode zur Messung der Ausdruck und die Konzentrationen der verschiedenen Sialinsäure Säure Arten in Zellproben wird durch Hochleistungs-Anion-Austausch-Chromatographie (HPAEC) mit gepulsten elektrochemische Detektion50. Durch Verwendung dieser Methode wird der Ausdruck der Sialinsäure Säure direkt gemessen wird und nicht nach dem beschriften mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es auch ausgenutzt werden kann, um Monosaccharide als Sialinsäure Säure und seine Derivate in Zelle und Proteinproben zu analysieren. Leider ist die Empfindlichkeit des HPAEC niedriger im Vergleich zu fluorometrisch Erkennung von DMB-sialic Acid. So ist HPAEC beschränkt sich auf Experimente mit der Verfügbarkeit von großen Stichprobe beträgt51.

Die hierin beschriebenen Methoden lässt sich unbekannte Eigenschaften der Glykokonjugate offenbaren. Eine Vielzahl von Beispielen für den Einsatz von MGE Sialinsäure Säure abhängige Interaktionen untersuchen bereits existiert13, zeigen die Machbarkeit dieser Technik im Zusammenhang mit einer breiten Palette von Versuchsaufbauten.

MGE mit N- Acetylmannosamines dient heute vor allem von Forschern auf dem Gebiet der Glykobiologie. Wir hoffen, dass diese Technik von einem breiteren Publikum als ein vielseitiges Werkzeug erkannt wird, Glykokonjugate zu ändern. Anderen Bereichen profitieren einschließlich Virologie, Immunologie, Neurologie oder Onkologie, durch diese Technik für ihre eigenen Zwecke anpassen. Diese Crossover-Forschung könnte ermöglichen die Entdeckung der noch unbekannte Bereiche, und daher ein besseres Verständnis von Gesundheit und Krankheit. In frühen Studien diente diese Technik beispielsweise Glykoproteine mit modifizierten Glykosylierung zu produzieren, die später für die in-Vivo -Impfung dienen. In bestimmten Fällen Behandlung mit solchen Glycoengineered Impfstoffe führen zur Produktion von Antikörpern, die erweiterte Gier und Toxizität für die jeweiligen Ziele52,53ausgesetzt. Erfolgreich verwendet andere MGE, um ein Modell für die gezielte Tumortherapie in Mäusen54zu entwickeln. Eine andere Studie zeigte, dass systemische in Vivo Injektion von ManNProp Nerv Regeneration55gefördert. Im Falle von PolySia zeigte sich, dass die Verminderung des Ausdrucks dieser Epitops in Neuroblastom-Zellen durch in dieser Handschrift, die vorgestellten Methoden erhöht die Empfindlichkeit dieser Tumor-Zellen, Bestrahlung oder Behandlung mit Krebsmedikamenten56.

Die Beträge der Sialinsäure Säure gemessen in Proben können abhängig von der Methode verwendet, um die behandelten Zellen trennen abweichen. In diesem Manuskript wurde Inkubation mit Trypsin verwendet, um Zellen zu lösen. Wenn andere Techniken verwendet werden, wie Schaben Zellen oder langjähriger Behandlung mit PBS + EDTA, abweichen der Mengen an Sialinsäure Säure in den Proben gemessen. Auch Anpassung der Inkubationszeit mit Trypsin kann auf die Sialinsäure Säure Konzentrationen später auswirken. Aus unserer Erfahrung die Auswirkungen der Zelle Ablösung Methode auf die Beträge der Sialinsäure Säure gemessen liegt unter 15 %, aber wenn Ergebnisse normalisiert und verglichen werden, könnte dies ein wichtiger Engpass geworden. Darüber hinaus kann die Methode zur Lyse der Zellen das Ergebnis der HPLC Analyse auswirken. Wir empfehlen daher, den Leser zu Zelle ablösen und lyse in ihren Experimenten zu standardisieren.

Zur Trennung der Membran Fraktion in Zelle Lysates zu erreichen, haben wir Zentrifugation für 2 h bei 20.000 x g und 4 ° C (Abschnitt 5.1). Zentrifugation können die Trennung und damit die Mengen an Sialinsäure Säure in den Proben erkannt Auswirkungen auf andere Protokolle. Eine kritische Verbindung innerhalb dieses Protokolls ist DMB, weil es sehr empfindlich auf Licht und nimmt im Laufe der Zeit. Hier haben wir aliquoten kleine Portionen der DMB-Lösung und speichern es als Bestände bei - 20 ° C, lichtgeschützt (Abschnitt 1.6.1) empfohlen. Auf diese Weise die DMB-Lösung kann für mehrere Wochen gespeichert werden. Wenn die Ergebnisse von DMB-HPLC Analyse Signale für Sialinsäure Säure Arten verringern oder erhöhen innerhalb der ersten 6 min von der HPLC-Messung signalisiert zeigen, sollten Vertretung DMB und die Reaktionsprodukte neue DMB-Lösung vorbereitet werden. Nicht wieder einfrieren und Wiederverwendung DMB-Lösung nach dem Auftauen es. Nach DMB Kennzeichnung sollten sofort alle Proben analysiert werden. Wenn größere Anzahl von Proben (> 10) analysiert werden sollen, sollten diese Proben aufgeteilt in kleinere Abzeichen und allmählich mit DMB gekennzeichnet werden. Sowohl die Kennzeichnung Reaktion Zeiten ebenso wie die DMB-markierten Sonden überhaupt vor Licht geschützt werden sollte. Nach der Elution sollten die DMB-Label Sialinsäure Säure-Arten sofort von ESI-MS. Direct analysiert werden Kopplung der HPLC mit dem ESI-MS-System (in einem LC-ESI-MS-Setup) ist nicht notwendig, aber kann vorteilhaft sein, höhere Qualität der Massenspektrometrie zu erreichen Analyse.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken L. D. Nguyen für das Manuskript Korrektur und für fruchtbare Diskussionen. Darüber hinaus danken wir J. Dernedde und H. G. Nguyen für uns bereitet dem Videodreh helfen. Die meisten Szenen des Videos wurden in den Labors von R. Tauber erschossen. Wir danken auch das Max-Planck-Institut für Kolloid- und Grenzflächenforschung, und uns freien Zugang zu ihren Massenspektrometrie-Anlage. RH wurde von der DFG (ProMoAge) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

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References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

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