Nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-Mannosamines を変更

Bioengineering

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Summary

シアル酸は、典型的な単糖単位の複合糖質は、です。分子と細胞の相互作用の茄多になっています。代謝独自のN- acetylmannosamine 誘導体を用いた細胞表面のシアル酸の発現を変更する方法をご紹介します。

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Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

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Abstract

シアル酸 (Sia) は、 N- O型糖鎖や糖脂質などの複合糖質の非常に重要な成分です。オリゴ糖類とユニークな化学特性の非還元テルミニで地位によるシアル酸は異なる受容体-リガンド相互作用の多数にかかわる。変更すると細胞表面のシアル酸の発現、シアル酸依存性相互作用は影響その結果。これはシアル酸依存性相互作用を調査する役に立つことができる、有益な方法である特定の病気に影響を与える可能性があります。代謝独自 (MGE)、を介して細胞表面のシアル酸の発現を調整できます。ここで、C2 変更誘導体のN- acetylmannosamine (ManNAc) 細胞、組織、または全体の動物が扱われます。これらのアミノ糖シアル酸前駆体分子として従って対応するシアル酸種に代謝され、複合糖質の表現。このメソッドを適用すると、様々 な生物学的プロセスに興味をそそられる効果が生成されます。たとえば、ポリシアル酸 (polySia) 処理の神経細胞での発現を大幅に削減することができ、こうして神経細胞の増殖と分化に影響を与えます。ここで、 N- butanoylmannosamine (ManNBut)、およびN- propionylmannosamine (ManNProp) 最も一般的な C2 変更N- アシルマンノサミン誘導体の 2 つの化学合成を紹介し、さらにどのようにこれらの非天然を表示アミノ糖は、細胞培養試験において適用できます。変更されたシアル酸種の式は高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による定量化、さらに質量分析器で分析されました。ポリシアル酸の発現に及ぼす影響は、市販ポリシアル酸抗体を用いたウエスタンブロットによって解明します。

Introduction

シアル酸は、 N- O型糖鎖や糖脂質などの複合糖質の非還元テルミニでは見つけることができる通常単糖類です。すべての単糖の中でシアル酸はいくつかのユニークな化学的特性を持っています。C-5 位置にラジカルアニオンの下でそれにより負荷電の生理的条件、C-1 位のカルボン酸基とアミノ機能 9 C 原子のバックボーンがあります。50 以上の自然発生するシアル酸の亜種が日1に特徴付けられる人間は、シアル酸の優勢な形態はNアセチルノイラミン酸 (Neu5Ac)。他の哺乳類はまた、 N‐ グリコリルノイラミン酸 (Neu5Gc)2,3の多量を表現します。

複合糖質の露出した場所にあるためシアル酸など4ホスト細胞にインフルエンザ ウイルスのヘマグルチニン依存結合受容体-リガンド相互作用の茄多が関係します。特に胚発生中や神経系の重要な生物学的機能を持つシアル酸エピトープはポリシアル酸です。ポリシアル酸は、最大 200 のアルファ 2, 8 リンク シアル酸の高分子です。ポリシアル酸の主要な蛋白質のキャリアは神経細胞接着分子 NCAM です。ポリシアル酸の発現はポリシアル酸式密着性を減少、増加する可塑性神経系5NCAM の接着性を調節します。

(ポリ) シアル酸の発現の変化は最終的に異なる生物間相互作用の多数に影響を与えます。これは、知られているシアル酸分子レベルで、新規複合糖質の相互作用を明らかにしたり、可能な治療上のアプローチを探るに依存するプロセスを研究に使用できます。ある異なる方法利用、細胞表面のシアル酸の発現を変調することができます、シアル酸特定グリコシダーゼ (シアリダーゼ)6 シアル酸生合成に関与する酵素の阻害による治療例 ,78、ノックダウンやシアル酸生合成9の鍵酵素の式を変更します。

シアル酸の発現を調節する別の汎用性の高い方法は、MGE (オリゴ糖とも呼ばれる代謝工学、萌え) です。ここで、細胞、組織、またはさらには動物は、C2 アミノ変更に耐える ManNAc の非天然誘導体と扱われます。細胞内取り込み後シアル酸の前駆体分子であること、これら ManNAc アナログ方向非自然代謝シアル酸、還元末端糖で表すことができます。ManNProp または ManNBut、 N- propionylneuraminic 酸 (Neu5Prop) や複合糖質10代でN- butanoylneuraminic 酸 (Neu5But) を組み込むかなど脂肪族 C2 の変更を運ぶ ManNAc 誘導体で処理した細胞,11ManNAc の C2 位置に導入された機能グループを使用して、発生する非天然型シアル酸が結合することができます、例えば、シュタウディンガー結紮またはアジ化 alkine 環、蛍光染料で、したがって。セルの表面12上で可視化します。

これらの非天然型シアル酸の発現は感染症病原体、密着性腫瘍細胞、一般的な細胞接着、血管新生、分化 (校閲用の移行など多くの生物学的プロセスに興味をそそられる効果参照してください: Wratil13) です。 nMGE 興味深いことに、-変更アシル mannosamines ポリシアル酸の発現に干渉する使えます。ポリシアル酸は、2 つの異なる polysialyltransferases (ST8SiaII ・ ST8SiaIV) によって生成されます。それは、その polysialyltransferase ST8SiaII、ManNProp または ManNBut14,15などの不自然なシアル酸前駆体によって抑制される実証されています。さらに、ManNProp または ManNBut のアプリケーションがシアル化による全15も減少させることにはひと神経芽腫細胞で実証されてそれ。

NMGE-アシル変更 mannosamines は簡単に使用されています、だけでなく哺乳類の種,線虫16などの全体の動物においても細菌細胞培養法を適用するにはゼブラフィッシュ17、またはマウス18,19,20,21。僅か細胞毒性、細胞培養液や血漿中 millimolar 濃度でも、特に ManNAc デリバティブ脂肪族の修正、ManNProp、ManNBut などの軸受です。さらに、彼らは比較的容易に合成です。

ここで、 nMGE を使用する方法の詳細を提供-アセチル変更 mannosamines。最初に、2 つの ManNProp と ManNBut、この分野で最も広く使用されている ManNAc 誘導体の化学合成を説明します。次に、生体内で実験の MGE の適用方法を示します。例として、神経芽細胞腫細胞株ケリー ポリシアル エピトープの発現の低下を実証する西によって選ばれた ManNAc 誘導体投与後のしみ。細胞表面に非天然型シアル酸は高速液体クロマトグラフィーによる定量化され、さらに質量分析器で分析されました。

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Protocol

1. バッファーおよび試薬の調製

  1. 3 mM ナトリウムメトキシド溶液の調製
    1. 攪拌棒 100 mL 瓶 50 mL のメタノール (3 mM) で 8.1 mg ナトリウムメトキシドを溶かしてください。数週間室温 (RT) で保存します。
  2. トリス塩酸バッファーの準備
    1. 攪拌棒と 8.766 g 塩化ナトリウム, 157 mg トリス-HCl, 146 mg 100 mL ガラス瓶の中の EDTA を組み合わせるし、80 mL の水に溶かします。
    2. PH メーターで pH を観察しながら攪拌溶液中に水酸化ナトリウム (水 1 M) または HCl (水の場合は 20%) を追加し、8.0 pH を調整します。
    3. 100 mL の最終的なボリュームを達成するために必要な水の量を追加します。0.22 μ m の滅菌フィルター システムを使用して、ソリューションをフィルター処理します。
      注: 150 mM の NaCl、トリス-HCl、10 mM と 5 mM EDTA (pH 8.0) 100 mL トリス塩酸バッファーが含まれます。ソリューションは、数週間の 4 ° C で保存できます。
  3. アプロチニン溶液の調製
    1. 水 (1.54 mM) 1 mL 中 10 mg アプロチニンを溶解します。因数 1.5 mL プラスチック チューブ (各 100 μ L) x 10 にアプロチニン ソリューション。数週間-20 ° C で保存します。
  4. Leupeptin 溶液の調製
    1. 水 2 mL (10 mM) で 10 mg leupeptin を溶解します。因数 leupeptin ソリューション 1.5 mL プラスチック チューブ × 10。数週間-20 ° C で保存します。
  5. 特異 (PMSF) フッ化物溶液の調製
    1. 34.8 mg PMSF 2 mL エタノール (100 mM) を解散します。因数 1.5 mL プラスチック チューブ × 10 で PMSF ソリューション。数週間-20 ° C で保存します。
  6. 1, 2-ジアミノ-4, 5-methyldioxybenzol-塩酸 (DMB) 溶液の調製
    1. 15.62 mg DMB、352 μ L β-メルカプトエタノール、および 48 μ L ナトリウム重亜硫酸塩溶液 (39%)、結合し、9.6 mL 水 (DMB 6.9 mM、500 mM β-メルカプトエタノール、0.19% ナトリウム重亜硫酸塩) を追加します。因数 1.5 mL プラスチック チューブ (各 250 μ L) x 40 で DMB ソリューション。数週間の-20 ° C で光から保護されたストア。
  7. 1 M トリフルオロ酢酸 (TFA) 酸溶液の調製
    1. 100% の 770.3 μ L を追加 9.23 mL 水 15 mL プラスチック チューブ (1 M) に TFA。数週間の 4 ° C で保存します。
  8. 120 mM TFA 溶液の調製
    1. 9.91 mL 水 (120 mM) 15 mL プラスチック チューブに 92.4 μ TFA (100%) を追加します。数週間の 4 ° C で保存します。
  9. 400 mM 水酸化ナトリウム (NaOH) 溶液の調製
    1. 160 mg 15 mL プラスチック チューブに 10 mL 水 (400 mM) で水酸化ナトリウムを溶解します。数週間の 4 ° C で保存します。
  10. 西部のしみの換散バッファーの準備
    1. 5.84 g, 塩化ナトリウム 0.1 g のトリス (ヒドロキシメチル) を溶解-aminomethan (Tris)、0.1 g CaCl2、0.95 g MgCl2、および 100 mL で 1 g トリトン X100 水し、7.8 に pH を合わせなさい。4 ° C でのストア換散バッファーを使用する前に各プロテアーゼ ・ インヒビター (アプロチニン、leupeptin、PMSF) の 100 μ L を追加します。
  11. ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) バッファーの準備
    1. 0.3 g のトリス、1.5 g のグリシン、0.1 g 水 100 mL に SDS を溶かし、7.3 に pH を調整します。室温ストア
  12. 西部のしみのバッファーの準備
    1. 0.3 g のトリス、1.1 g グリシン 90 mL の水で溶解し、10 mL のエタノールを追加します。室温ストア
  13. ソリューションをブロックの準備
    1. 25 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の無脂肪牛乳パワーの 1 g を溶解します。常に新鮮な準備します。

2. ManNProp と関連Nの合成-アシル-Mannosamines を変更

  1. 431.2 mg マンノサミン塩酸 10 mL 3 mM ナトリウムメトキシド溶液攪拌棒の 50 mL のガラス瓶の中で溶解します。
  2. 0 ° C の氷の混合物を冷却します。攪拌溶液中に徐々 に滴下 210 μ L プロピオニル塩化 (2.4 mmol)、または ManNProp または ManNBut、それぞれ合成する 248 μ L butanoyl 塩化 (2.4 mmol) を追加します。4 h の 0 の ° C で攪拌混合を孵化させなさい。
  3. 50 mL プラスチック チューブにソリューションを転送します。細い針とプラスチック製のチューブのふたに 4-8 穴を突きます。液体窒素を使用して、ソリューションを急速に凍結し、その後 (凍結乾燥) を凍結乾燥 48 時間またはそれが完全に乾燥しているまで。
  4. ミックス 350 g シリカゲル 60 750 mL エチル酢酸/メタノール/水 (15:2:1) (これは懸濁液)。シリカゲル 60 サスペンションからす柱 (直径 35 mm、長さ 70 cm) を記入し、使用する前に準備ができて、追加の 100 mL のエチル酢酸/メタノール/水 (15:2:1) を洗い流します。
  5. ステップ 2.3 から乾燥製品を溶解 (5 g の乾燥品) 10 mL のエチル ・酢酸/メタノール/水 (15:2:1) と負荷、シリカにピペットを使用してゲルの列。(ManNProp) のため、500 mL の後に 4 mL の一部分を収集します。注: ManNBut は、700 mL の後でおよそ列から溶出されます。
  6. 15 mL プラスチック チューブに溶出画分を転送します。細い針とプラスチック製のチューブのふたに 3-6 穴を突きます。急速凍結する液体窒素を使用して、ソリューションおよびその後、それが完全に乾燥するまでそれを凍結乾燥します。
    注意: 凍結乾燥製品が数ヶ月室温保存できます。
  7. 質量分析法 (セクション 9 を参照) による製品の純度を確認してください。
    注: また、純度も確認できます1H 核磁気共鳴 (NMR)。

3. 細胞培養

  1. ケリー神経芽細胞腫細胞 10% 牛胎児血清、100 U ペニシリン、ストレプトマイシン 100 mg、2 mM L-グルタミン含む 5 mM ManNAc、ManNProp、5 mM または 5 mM ManNBut、37 ° C、5% CO2培ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI)。
    注: ManNAc やその類縁体のない培地で培養された細胞は、コントロールとして使用されます。
  2. Mannosamines のアプリケーションの前にそれらをトリプシン/EDTA (0.25%、0.02%、PBS) で 10 分間インキュベートしケリー神経芽細胞腫細胞をデタッチしてノイバウアー商工会議所またはセルのカウンターを使用してカウントします。プレート/皿のサイズに基づいて定義された数字で細胞を播きます。
    1. シアル酸糖を測定するには、48 ウェル培養プレートに 500 μ L 中 1 x 10 の5セルをシードします。ポリシアル酸の分析、6 cm 径細胞培養ディッシュ上に 3 mL の培地で 1 x 10 の6セルをシードします。37 ° C と 5% CO2で孵化させなさい。メディアのすべての 24 h を交換してください。
      メモ: MGE の効果は治療の合計時間を増加します。高い代謝効率の 5-7 日のセルを扱います。
  3. 治療後、培地をデカントします。PBS でプレート/皿を洗います。それらをトリプシン/EDTA (0.25%、0.02%、PBS) で 10 分間インキュベートし、細胞をデタッチします。剥離細胞を細胞培養液の同じボリュームの追加によってトリプシンを中和します。15 mL プラスチック チューブに剥離細胞を転送します。500 x g で 3 分のサンプルを遠心し、上澄みを廃棄します。
    1. 5 mL の PBS と遠心載荷セル (ステップ 3.3 を参照) を追加します。さらに 2 回洗濯の手順を繰り返します。
      注: 清せず洗浄細胞ペレットは-20 ° C で数日間保存できます。ポリシアル酸の発現を解明する場合は 10 に進みます。

4. 高速液体クロマトグラフィー分析のためのセル換散

  1. 高速液体クロマトグラフィーの換散バッファーの準備
    1. 5 mL トリス塩酸バッファー、5 μ L アプロチニン ソリューション、20 μ L leupeptin ソリューション、および 50 μ L PMSF ソリューションを組み合わせます。
      注: 5 mL の HPLC の換散バッファーは 150 mM の NaCl、10 mM 5 mM EDTA、トリス-HCl 1.54 μ M アプロチニン、40 μ M、Leupeptin、1 mm PMSF (pH 8.0)。セル換散の前に新鮮なこのバッファーを準備する必要があります常に。
  2. 再 500 μ L 冷たい HPLC 換散バッファーに収集した細胞ペレット (ステップ 3.3) 各を中断し、超-超音波サンプル超音波プロセッサ針で 3 倍の 30 の期間中-高振幅で s。サイクルの間に、少なくとも 1 分の氷のサンプルを冷却します。

5. 膜分画の分離

  1. 遠心分離機の分離細胞サンプル 20,000 × g と 4 ° C で 2 時間1.5 mL プラスチック チューブでのゾル性細胞質蛋白質を表す上清 (約 480 μ L) で区切ります。これらの画分は、例えばブラッドフォードまたはビシンコニン酸 (BCA) 試金を使用してのタンパク質濃度を決定します。
    注: 細胞質画分のタンパク質濃度 (約 1 mg/mL) は、尊敬されるシアル酸種の測定量を後関連することができます。ペレットは、6.1 のステップで使用される膜画分を表します。

6. 酸性加水分解

注: オリゴ ・細胞膜多糖類は単糖類に加水分解します。さらに、可能な限りO-同様な糖に変更が加水分解します。膜画分におけるシアル酸の圧倒的多数は複合糖質に組み込まれている自然とOを負担する可能性があるかもしれないので、これは定量的な HPLC 分析に必要な-アセチルまたはO- lactolyl 変更。

  1. 150 μ L 1 M 追加分離膜の一部分 (セクション 5 からペレット) に TFA 溶液。200-600 rpm で振とうしながら 80 ° C で 4 時間サンプルをインキュベートします。
  2. 20,000 x g および上部の段階の容積はより小さい 20 μ L まで 3 kDa 除外膜 0.5 mL フィルター チューブを使用して 21 ° C で約 30 分のサンプルを遠心します。
    注: この手順は、高い分子破片を処分することが重要です。
  3. 小さい分子、2 mL プラスチック チューブにシアル酸種を含むを含む下の相を転送します。細い針とプラスチック製のチューブのキャップに 2-4 穴を突きます。急速凍結する液体窒素を使用してサンプルとそれらを一晩凍乾します。
    注: 長期保管のための RT。 置換の穴なしキャップで数日間乾燥のサンプルを格納できます。

7. 蛍光ラベリング

  1. 10 μ L 120 mM TFA 溶液の再乾燥のサンプルを中断し、50 μ L DMB ソリューションを追加します。紫外線からそれらを保護するために暗い 1.5 mL チューブにサンプルを転送します。
  2. 基準、1 μ L を解散 Neu5Ac (60 ng/mL、水で) または 1 μ L Neu5Gc (60 ng/mL、水) 暗い 1.5 mL チューブに 10 μ L 120 mM TFA 溶液中。50 μ L の DMB のソリューションを追加します。
  3. 細胞膜のサンプルをインキュベートし、56 ° C で 1.5 h の基準は、光から保護します。インキュベーション後、標識反応を停止するには、各サンプルに 4 μ L 400 mM NaOH 溶液を追加します。

8. HPLC 分析

注: ラベル サンプル RP C18 カラムと HPLC 装置の分析 (110 Å、3 μ m の粒子径、4.6 × 150 mm)、蛍光検出器とほんの一部のコレクター。使用される溶媒はメタノール、アセトニ トリル、水です。高速液体クロマトグラフィー システム内部脱がない場合、測定する前にすべての溶剤ガスを抜き確認します。

  1. 列の温度を 40 ° C に設定し、373 の蛍光検出器を構成する励起と 448 nm nm 発光、それぞれ。10 μ L の試料の注入、メタノール/アセトニ トリル/水 (6:8:86) 溶離液で 0.5 mL/分の流量で 50 分のプローブを区切ります。質量分析のための関心のピークを収集します。
    注: Neu5Gc は 6-8 分、9-12 分、17-23 分後 Neu5Prop、38-44 分後 Neu5But 後 Neu5Ac 後溶出する予定です。分別されたサンプルは、光から保護 4 ° C でいくつかの時間保存できます。
  2. 各サンプルを測定した後にメタノール/アセトニ トリル/水 (6:25:69) 1.0 mL/min の流量 (≈ 1.5 列ボリューム) に 7.5 分の列を洗って、メタノール/アセトニ トリル/水 (6:8:86) で 1.0 mL/分の流量で 7.5 分のシステムを再平衡します。
  3. 定量分析、それぞれの HPLC システム22のオペレーティング ソフトウェアを使用して興味のシアル酸のピークの曲線下の領域を計算します。
    注: Neu5Ac または Neu5Gc 標準および細胞質画分 (5.1 項を参照) で測定されたタンパク質の濃度は、得られたデータが関連付けることができます。

9. シアル酸糖の質量分析

注: 特定の HPLC 保持ピークさらに分析できます液体クロマトグラフィー (LC) エレクトロ スプレー イオン化質量分析法 (MS)、によって不自然なシアル酸種を確認するために。

  1. 質量分析用 LC/質量選択検出器 (MSD) システムに 79.9% メタノール、20% イソプロピル アルコール溶離液、0.5 mL/分の流量、4 kV キャピラリー電圧キャピラリー温度を 350 ° C と 0.1% ギ酸との採取試料の 20 μ L を注入する.22,23
  2. それぞれの LC/MSD システムの評価版ソフトウェア、総イオンのクロマト グラムの関心のピークを選択します。解決のピークの質量スペクトルを表示します。300 と 700 の間の正の質量/電荷比を表示します。
    注: DMB は、シアル酸のラベリング 116.2 g/mol の分子量の増加に します。シアル酸の DMB ラベル種次の分子固まりがある: DMB Neu5Ac = 424.2 g/mol、DMB Neu5Gc 441.8 g/mol、DMB Neu5Prop を = = 436.2 g/mol、DMB Neu5But 453.2 g = 付加体のモル共通/アセトニ トリル、ナトリウム、またはイソプロピル アルコール。

10 ケリー神経芽細胞腫細胞におけるポリシアル酸西部のしみの分析

  1. セル lysates の準備
    1. ステップ 3.3 と渦から細胞ペレットに 1 mL の西部のしみの換散バッファーを追加します。氷の上で 30 分間インキュベートします。渦 5 分ごと。遠心分離機の 20,000 × g と 4 ° C で 1.5 h のサンプル分離細胞からタンパク質を含む上清を収集します。
    2. 蛋白分画、例えば、ブラッドフォード、BCA アッセイのタンパク質濃度を決定します。タンパク質濃度は 1.5 μ g/μ L の換散バッファーのサンプルを希釈します。
    3. 90 μ L タンパク質画分 (1.5 μ g/μ L) を 10 μ L 塩化物イオン サンプル バッファーを追加して SDS ページのサンプルを準備し、沸騰 5 分24サンプルです。
  2. 免疫ブロット
    1. 20-30 μ L ポケットと 0.75 または 1 mm 厚 8 %sds アクリルアミドゲルを使用します。25 でゲルを実行室温 2 時間 mA
    2. ゲルからガラス ・ カバーを慎重に取り外します。カットし、読み込みポケットを含んでいるゲルの上の部分を破棄します。西部のしみバッファーに浸した (0.2 μ m)、ニトロセルロース膜にゲルを配置します。システム (例えば250 4 ° C で 1 時間の mA) の推薦によると硝酸セルロースに蛋白質を転送します。
    3. しみが付くシステムからニトロセルロース膜を削除します。Ponceau としみを汚れ蛋白質を視覚化する赤。プラスチック製チャンバーに硝酸セルロースの膜を転送し、解決を妨げる 10 mL を追加します。室温で 1 時間インキュベートまたは 4 ° C で一晩
    4. ブロッキング液をデカントし、PBS にモノクローナル抗 polySia 735 抗体 (1 μ g/mL) を追加します。RT で 1 h の膜を孵化させなさいまたは 4 ° C で一晩インキュベーション後、少なくとも 3 回 PBS で 5 分間膜を洗浄します。
    5. ポリクローナル抗マウス igg 抗体二次抗体 (1 μ g/mL) は、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) または PBS の蛍光ラベルに結合を追加します。室温 1 時間膜をインキュベートします。インキュベーション後、少なくとも 3 回 PBS で 5 分間膜を洗浄します。
    6. 適切な撮像素子のプレート上に膜を転送します。製造元の指示に従って信号を検出します。

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Representative Results

ラベル Neu5Ac Neu5Gc 規格蛍光灯の HPLC クロマト グラムを図 2で描かれています。ここに記述されたメソッドを使用すると、地上波 DMB ラベル Neu5Gc 通常た 7-9 分溶出時間と DMB Neu5Ac 10-12 分の間。クロマト グラムのいくつかのより小さいピークは通常 2-6 分間表示されます。これらのピークは、未反応の DMB を表し、反応中間体25

セル lysates の代表的なクロマト グラムを図 3に示します。地上波 DMB ラベル基準 (図 2) のクロマト グラムと比較してこれらのクロマト グラムでいくつかの未定義のピークが表示されます。これはセル lysates の DMB はシアル酸種も他の α-ケト酸、ピルビン酸、コハク酸、α-ケトグルタル酸26を含むのセル lysates の存在だけでなく反応する事実を内部の不純物が原因らしい。Oを軸受シアル酸の少量の存在-ない酢酸加水分解によって切断されているアセチル変更可能性がありますもこれら未定義ピーク23理由として議論されます。分離の未処理細胞からクロマト グラムは、以前 ManNAc やその類縁と扱われているセルからクロマト グラムと比較されます。下図のように、しばしば ManNAc 治療は細胞表面に Neu5Gc のほぼ全体の枯渇に します。Neu5Prop または Neu5But 分離細胞のクロマト グラムは、ピークが表示されます未処理細胞のクロマト グラムで表示されません。これらのピーク (ManNProp の約 19 分溶出時に細胞を扱われ、ManNBut の治療 42 分のセル) は、対応する非天然型シアル酸、Neu5Prop、Neu5Gc の外観を指定します。プロトコルのセクション 8.3 で説明、HPLC クロマト グラムはセル lysates の異なるシアル酸種の量を定量化するために分析できます。

明確な HPLC 保持ピークがシアル酸種に対応しているという事実は、質量分析器で確認されました。図 4に描かれている興味の収集した高速液体クロマトグラフィーのピークから代表 ESI MS データ: 上部左側のパネル、右上のパネルで 2 つの非天然型シアル酸種 DMB Neu5Gc で収集された地上波 DMB Neu5Ac 保持ピークのスペクトル地上波 DMB-Neu5Prop と下の左と右のパネルで地上波 DMB-Neu5But。DMB との反応は、この染料と分類されないシアル酸種と比較して 116.2 の Da の分子量の増加に します。質量スペクトル、300 と 700 の間注入された試料の質量/電荷比を表示するとき、いくつかのピークが表示されます。これは尊敬の DMB 標識プローブの形成を付加する予定です。プロトン化イオン [M + H]+、ほかのナトリウム付加体 [M+na]+ 、[M + 2Na-H]+が表示されます。質量スペクトルで抱合体の生成として見つけることが (ACN) アセトニ トリルが LC 分析中に存在する、(地上波 DMB-Neu5Gc、図 4に示されている: 右上のパネル)。キャピラリーと最初のスキマーの electronspray 輸送領域で生成された衝突の代償不全のアクティブ化によって発生、断片化によって脱水シアル酸 [M + H]+H2O の種を観察することも (DMB-Neu5Ac、図 4: 上部左側のパネル)23,27。LC セットアップで DMB Neu5Gc は未反応または部分的反応 DMB 種直後後た。したがって、収集された地上波 DMB-Neu5Gc プローブによるこれらの反応中間体の不純物を含めることができます。これを地上波 DMB Neu5Gc の質量スペクトルで未定義のピークの外観の説明として提供しています (図 4: 右上のパネル)。

分離細胞 (図 5) から細胞膜の西部のしみの分析が示すように、ManNProp または ManNBut ケリー神経芽細胞腫細胞の治療は NCAM、上ポリシアル酸の発現低下に します。ポリシアル酸は、塗抹標本サイズと (≈ 200 kDa) の料金でその不均質するように通常表示されます。ManNAc アナログ治療は細胞表面にポリシアル酸の削減につながる: 長くの脂肪族N-アシル基側鎖、強い削減28

Figure 1
図 1: nMGE の原則-アシル変更 mannosamines.Nと治療後-アシル変更 mannosamines、これら ManNAc 類縁体は、対応する非天然型シアル酸に代謝一方向 (細胞内の代謝)。これらはゴルジ体に運ばれるが、:pda-160、によってそれぞれオリゴ糖受容体に転送され、sialosides (ここでは、糖タンパクの一種) として細胞表面に発現します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: シアル酸の DMB ラベル基準の代表的なクロマト グラム。地上波 DMB ラベル Neu5Ac (上部パネル) と Neu5Gc (下段) 高速液体クロマトグラフィーにより分析しました。保存期間 (破線) と両方のシアル酸のピーク面積を求めた後注入 10 ng の HPLC システムに尊敬される地上波 DMB ラベル種。ここに示す代表的なクロマト DMB Neu5Gc 11 分でそれぞれ約 8 分保持時間と DMB Neu5Ac 後溶出にクロマト グラムのいくつかの小さなピークは、未反応の DMB と反応中間体を表す 2 6 分間通常表示されます。地上波 DMB ラベル Neu5Ac のごく一部は、DMB Neu5Gc 標準 (下段) でマイナーな不純物として表示されます。この図は、参照22から変更されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 地上波 DMB-高速液体クロマトグラフィーによる膜結合型シアル酸の特性。5 mm ManNAc 液体 (未処理、上部パネル) の有無で培養細胞 (上から 2 番目のパネル)、ManNProp (上から 3 番目のパネル)、または ManNBut (下段) をそれぞれ 7 日間。媒体ごとの 24 時間が変更されたセルが収穫された、膜画分を調製、DMB、ラベルの付いたし、hplc 分析します。シアル酸の DMB ラベル基準 (図 2) のクロマト グラムと比べて 8 ~ 9 分間保持時間のピークは地上波 DMB-Neu5Gc と DMB Neu5Ac として 10-11 分の間にピークとして識別されました。シアル酸の DMB ラベル基準を注入することから得られるピークと比較して、セル lysates からクロマト グラム表示追加、未定義のピークです。これは、DMB がシアル酸セル lysates の存在だけでなく、他の α-ケト酸、ピルビン酸、コハク酸、α-ケトグルタル酸などのセル lysates の存在に反応できるという事実だけでなく、プローブの内部の不純物が原因です。表示するだけNの存在下で培養した細胞から試料のクロマト グラムのピーク-アシル変更マンノサミン類似体は、対応する DMB ラベル非天然型シアル酸を示します。この図は、参照22から変更されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 大量のセル lysates のシアル酸の DMB ラベル種のスペクトル。興味の HPLC 保持ピーク収集された (図 3を参照) とその後収集した保持の ESI さん 20 μ L でピークを分析 LC MSD システムに注入しました。地上波 DMB と反応対応する未反応のシアル酸種に比べて 116.2 Da の分子量の増加に します。別のシアル酸種から得られる正の質量/電荷比スペクトロ グラムが描かれている (DMB Neu5Ac: 上部左側のパネル、DMB Neu5Gc: 右上のパネル、地上波 DMB-Neu5Prop: 左下パネル、地上波 DMB-Neu5But: 右下のパネル)。付加体を形成するために、いくつかのピークも表示されます。ナトリウム付加体 [M+na]+のプロトン化イオン [M + H]+のほか、[M + 2Na-H]+が表示されます。LC 分析時に現在であるアセトニ トリルは抱合体の生成 (右上のパネル) としてもあります。脱水 DMB Neu5Ac、楽器 [M + H]+H2O の断片化によって生成されるには、(上左) が観察できます。収集された地上波 DMB-Neu5Gc プローブは、未反応の DMB として反応によって引き起こされる不純物を含めることができます追加未定義ピーク (右上のパネル) として見られる中間体。ACN、アセトニ トリル;H は、水素;Na、ナトリウム。この図は、参照22から変更されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: NCAM の polysialylation の解析。ケリー神経芽細胞腫は、7 日間の不在または 5 mM ManNAc の存在、ManNProp、または ManNBut で培養しました。セルが収穫され、タンパク質分離した 8 %sds アクリルアミドゲル モノクローナル抗 polySia 735 抗体を用いたウエスタンブロット分析します。Sia は、異なるサイズや polySia の罪の結果の数でその不均質による塗抹標本としてその polySia が表示されます注意してください。

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Discussion

化学的に合成された ManNAc 誘導体、ManNProp と ManNBut は質量分析器で分析し、両方の標本の正しいの質量ピークのみが識別必要があります。したがって、製品は、99% 以上の純度をあると仮定することができます。Neu5Gc は、ひと細胞29が存在しない通常の少量は、分離細胞の膜画分に検出されます。これは最も可能性の高いメディア30のウシ胎児血清 sialoglycoconjugates から Neu5Gc は募集サルベージ経路を介して行われます。ManNAc、シアル酸生合成の自然な前駆体と治療は、細胞表面に Neu5Gc エピトープ発現を大幅に低減します。

変更された mannosamines の適用は僅かところすべて細胞に有毒であります。セルは、 Nacylmannosamines 特定のトランスポーターがないので、必要が媒体の内で増加した millimolar 糖濃度を受け入れます。シグナル伝達経路はN- acylmannosamines は、細胞の成長や分化31,32に影響を与える可能性のアプリケーションにアクティブ化されることが実証されています。変更されたシアル化によるパターンがこれのかに変更されたシアル化による直接的な影響を反映しているが今のところ知られていません。C2 変更 ManNAc 類縁体、ManNProp または ManNBut の存在下での細胞の増殖と、対応するNを運ぶ非天然型シアル酸種の式-アシル置換。2 つの代謝効率テストN-アシル変更 mannosamines 異なります。ManNProp による治療は通常 Neu5Ac として Neu5Gc の発現の低下と細胞表面に対応する Neu5Prop の発現に します。他のN-アシル変更マンノサミン類似体、 N- cyclopropylcarbamyl マンノサミンようが、さらに高い代謝効率22を持つ傾向があります。

以前の研究では、シアル前駆体が polysialylation と干渉することを明らかにしました。ポリシアル酸ほぼ独占的、NCAM 上で表現されます。興味深いことに、NCAM はゴルジ (ST8SiaII および ST8SiaIV) で表される 2 つの明瞭な polysialyltransferases によって polysialylated をすることができます。それが判明、ManNProp、ManNBut、および他のN-アシル-修正 mannosamines 干渉 polysialylation、これは主に ST8SiaII14との相互作用のため。このシアル酸転移酵素は、開発中には表現され、脳の発達のために重要です。興味深いことにも、多くの腫瘍再表現 ST8SiaII 増加する神経の起源からその悪性度とさらに免疫システム33から検出されないようにします。対照的に、それは両方の polysialyltransferases の自然な基質である CMP Neu5Ac の増加につながるので、ManNAc のアプリケーションは関与するの増加に します。

MGE は新規シアル酸 (例えばエリスロポエチン) 興味の蛋白質を紹介し、それによりその機能を調節するためのユニークな方法です。さらに、それは多くのがん細胞は、シアル酸の高いレベルを表現することにより免疫システムを脱出しようとするので、癌などの多くの病気に関心のあるかもしれない細胞表面糖鎖を調節するために使用できます。ここに示すメソッドを使用する: 最初に、独自培養細胞を使用してを実行し、2 番目を分析するには、独自の成功を証明するために糖鎖を設計。メソッドは非常に堅牢で、今まで、落とし穴は報告されません。対照的に、細胞13クリック化学を実行する化学のアクティブなグループを紹介するメソッドが拡張されています。

脂肪族N2 ManNAc 類縁体を紹介-合成、比較的単純なアシル基側鎖修飾も少ない機器と化学合成で経験の少ない所で。有機化学になじみのあるグループがより複雑な構造を持つ他の ManNAc 類縁体の合成し、MGE、いわゆる 'bioorthogonal' の類縁体は、還元末端を視覚化する、たとえば、利用することができますを含むためにこれらを使用して、複合糖質。Nの概要を与えるレビュー記事があります-アセチル-13,34これまで合成されているマンノサミン誘導体。N- azidoacetyl マンノサミン (マンナズ)、還元末端糖鎖を可視化によく使用される物質は市販されています。ManNAc 類縁体の膜透過性のため peracetylated ManNAc アナログなど保護された水酸基をもつこれらの糖の誘導体を使用して有利なことです。細胞質を入力した後保護のグループは、細胞内のエステラーゼによって切断されアクティブな単糖35,36,37を解放します。ただし、peracetylated ManNAc 類縁体は、対応する保護されていない誘導体と比較してより高い細胞毒性を公開します。

この原稿の MGE と私たちの実験の不死化神経芽細胞腫細胞を選んだ。一般に、(ManNProp と ManNBut)、特に MGE はさまざまな細胞は、不死化細胞株 (Wratilの参照を含むで適用できます。13例) と一次電池38,39。さらに、MGE は、シアル化による生体内c. の elegansラット、マウス19,20,42、ゼブラフィッシュ17,4140を変更する正常に利用されました。43,44。 このメソッドの代謝効率に影響を与えるに MGE 実験 ManNAc 類縁体の濃度と処理時間が変化します。経験から、長い治療と高濃度が変更された Neu5R による複合糖質で自然に発生するシアル酸種のより良い代替と対応しています。ManNAc 誘導体の非常に高濃度を使用する場合は、治療の細胞毒性を評価する必要があります、例えばMTT の試金またはレサズリンの還元の試金によって。

本稿では、超超音波を用いたセルの均質化をお勧めします。他のセル換散方法氷 (約 250 ストローク) に douncing を含む、私たちの研究室でテストされ、のサンプルで検出されたシアル酸の量に関する予後は同等とプレス停止 (10,000 psi、4 通路) をフランス語。超音の均質化の利点はそれが少し時間が必要、DNAase 溶解前にサンプルに添加を必要としません。

セル lysates の膜画分に我々 の分析を重点的には、シアル化による変化膜の連結複合糖質を見せてあげたかったので。シアル酸誘導体とその濃度膜画分は、上記のように同じメソッドを使用して、高速遠心分離によって分離されている後細胞の細胞質でも測定できます。ただし、細胞質におけるシアル酸の濃度は最大 100 倍低い7細胞膜のシアル酸式と比較してです。したがって、信頼性の高い結果を生成する細胞の大きな金額が必要です。ゾル性細胞質、アクティブ化された CMP シアル酸のプールは、前処理加水分解7,45前に水素化ホウ素ナトリウムとセル lysates の細胞質画分による直接測定できます。複合糖質にシアル酸と水酸基の変更とシアル酸を加水分解するためにセル 1 M TFA を添加されました。他の酸性溶液は、加水分解、2 M プロピオン酸など、2 M 酢酸、1 M HCl を使用できます。

高速液体クロマトグラフィー分析中に発生した問題の可能性は特定のピークが未定義のピークと重なっています。サンプルにおけるシアル酸の量はある特定のピークの曲線下面積で計算するとき、これは特に問題となります。未定義のピークからの関心のピークを分離、高速液体クロマトグラフィー溶媒中でアセトニ トリル濃度の調整可能性があります (± 3%)。前にクロマトグラフィー溶媒混合物の準備の優位性を与える高速液体クロマトグラフィー分析用溶剤濃度を安定したを使用してお勧めします。したがって、私たちのメソッド 1 つだけ HPLC ポンプ、幅広いさまざまな HPLC システムの実現が可能です。1 つ以上のポンプが高速液体クロマトグラフィー システムで利用可能な場合、アセトニ トリルの濃度の増加とイソクラティック グラデーションを適用できますが、35 分454-9%など。この手法を使用して、特定の高速液体クロマトグラフィーのピークの保持時間はかなり変更されます。この戦略は、ピークの重なりのよりよい分離を達成するためにも役立ちます。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (MALDI-MS) の式を確認するここで紹介 ESI MS 法と同等にシアル酸種細胞表面45、およびこうして機能を変更正常に確立されました.

ManNAc 類縁体の親水性と特定のトランスポーター46これらの誘導体の摂取量の不足、これらの化合物の MGE 実験高濃度が必要です。したがって、アップ スケールの実験と、生体内試験で特に、それぞれ ManNAc 類縁体の大量が必要この手法の限界を示します。その一方で、セルラインを使用によって扱われた細胞の特定の最低限の数は、HPLC 分析で信頼性の高い結果を得るため必要です。私たちの経験から最低約 100,000 の付着性のセルまたは 150,000 の懸濁細胞 (合流するセルと 96 ウェル プレートの 1-2 ウェルズ) で十分です。分析がスクリーニングのアプローチでたとえば、縮小する場合これがボトルネックになることができます。

本稿で提示されたメソッド、シアル酸およびその誘導体がセル lysates で検出されます。しかしながら、構造と ManNAc 誘導体細胞における複合糖質の組成は、ここに記述された技術と評価できません。一般的に複合糖質、 e.g.,N-、 O型糖鎖の構造を解決するより優れた経験とグライコミクス施設47を取る必要があります。我々 の知識にこれまでのところ、データがありません ManNAc アナログ処理されているセルから複合糖質の明瞭な構造に。

ポリシアル酸の西部のしみの分析は、非常に迅速かつ簡単な方法です。ただし、抗体と化学発光検出を使用するので、このメソッドによって取得されたデータは定量的、ありません。したがって、HPLC メソッドの使用は、ウェスタンブロット優位です。それにもかかわらず、それは簡単に適用して非常に確実に動作するように知られているので、免疫ブロット法を使用してお勧めします。

細胞表面のシアル酸の発現は MGE 以外の方法によっても変更できます。前述のように、シアリダーゼ、比較的非特異的な複合糖質からシアル酸残基を切断する酵素で細胞を扱うことができます。シアリダーゼ処理結果として扱われた細胞の hyposialylation を誘導します。残念ながら、シアリダーゼ処理、むしろ限られた手法だ細胞傷害性、長い時間治療のため不可能と生体内での実験では適用されません。セルの hyposialylation を誘導するために別の手法は、シアル酸生合成阻害剤を使用しています。様々 な阻害剤がいずれかが UDP-N- アセチルグルコサミン-2-エピメラーゼのシアル酸生合成の鍵酵素をターゲットできます/N- acetylmannosamine キナーゼ (GNE/MNK)、または、:pda-1606のグループ 7,8,48。これらの化合物は、アナログ、C3 フッ素化シアル酸のいずれかを示した生活におけるシアル酸の発現を下げるマウス49。動物はただし、この物質で治療49を繁栄する失敗、不可逆的な腎臓機能障害、肝臓機能障害を示した。これらの結果は、Neu5Ac の肝臓と腎臓の機能に重要な役割を確認し、さらに生体内で実験のためシアル化による阻害剤の限界を示します。変更された細胞表面シアル化による細胞を生成する 3 番目の方法は、シアル酸の生合成に不可欠な酵素の発現に干渉します。たとえば、不死化細胞で GNE/MNK のノックダウンは、これら細胞 hyposialylated 9をレンダリングする示されました。比較的簡単にノックイン ・遺伝子細胞とを生体内でを使用して小説とよく認識 CRISPR Cas9 技術シアル酸生合成に関する新しい発見につながるかもしれないし、細胞表面に可能性シアル化による。

MGE は、ここで説明する手法と比較しての利点は、簡単に適用して適応に無数の異なる実験細胞ベースのアッセイおよび生体内の実験への in vitro試験からです。パルス電気化学検出50高性能陰イオン交換クロマトグラフィー (HPAEC) 式と異なるシアル酸種細胞試料中の濃度を測定する方法です。このメソッドは、シアル酸の発現は直接計測を使用して、ない後蛍光色素をラベル付け。この方法の利点はシアル酸およびその誘導体の細胞やタンパク質サンプルの以外の単糖類の分析にも利用することができます。残念ながら、HPAEC の感度は DMB シアル酸の蛍光検出に比べて低い。したがって、HPAEC は、大規模なサンプル量51の可用性と実験に限定されます。

ここに記述されたメソッドは、複合糖質の未知の特性を明らかにするために使用できます。既にシアル酸依存相互作用を調査する MGE の使用のための例の多数存在13、実験的設定の広い範囲のコンテキストでこの手法の有効性を示します。

今日では、 Nacetylmannosamines と MGE は主に糖鎖生物学の分野の研究者によって使用されます。複合糖質を変更するのにはこの手法が汎用性の高いツールとして広範な視聴者によって認識されると思います。この手法、自分の目的のために適応させることによって、他の分野でお越しの免疫学、ウイルス学、神経学、または腫瘍を含みます。このような横断的研究がまだ未知の領域の探索を有効にしてしたがって、健康と病気のよりよい理解を与えます。たとえば、この手法は初期の研究で生体内でワクチン接種の後でなる変更された糖鎖、糖タンパク質を生成に使用されました。特定のケースでそのような glycoengineered のワクチンによる治療は高度な親和とそれぞれ目標52,53の毒性を公開されている抗体の生産に します。他の人は正常にマウス54ターゲット腫瘍治療のためのモデルを開発するのに MGE を使用しました。別の研究では、ManNProp の全身体内注入が神経再生55を促進されることを示した。PolySia、場合本稿で、提示法による神経芽細胞腫細胞におけるこのエピトープ発現を減少放射線や抗がん剤56治療にこれらの腫瘍の細胞の感受性が増加することが示されました。

サンプル内で測定したシアル酸の量は扱われた細胞のデタッチに使用方法によって異なる場合があります。本稿では, トリプシン培養細胞のデタッチに使用。他の手法は、細胞または PBS + EDTA、長年治療をこするなど、使用するをサンプルで測定されるシアル酸の量が異なる場合があります。トリプシン培養時間をも適応後に測定したシアル酸濃度に影響を持つことができます。我々 の経験から測定シアル酸量の細胞剥離法の影響は 15% 以下が、結果を正規化し、比較する場合は、これは重要なボトルネックになります。さらに、細胞の換散法 HPLC 分析の結果に影響します。したがって、我々 は細胞の剥離や溶解の実験で標準化するリーダーをお勧めします。

セル lysates の膜画分の分離を達成するためには、20,000 x g で 2 h と 4 ° C (セクション 5.1) に遠心分離を使用しました。その他の遠心分離のプロトコルは、分離とそのためのサンプルで検出されたシアル酸の量に影響があります。このプロトコルの中で重要な化合物である DMB、光に非常に敏感な時間の経過と共に低下するので。ここで DMB ソリューションとストアとしてそれは 20 ° C、光 (セクション 1.6.1) から保護-株式の因数の小さな部分をお勧めします。この方法で地上波 DMB-ソリューションは、数週間保存できます。DMB HPLC 分析の結果を示す HPLC 測定の最初の 6 分以内信号のシアル酸種の信号を減少または増加、DMB とその反応生成物を表す新しい DMB ソリューション必要があります準備されなさい。再冷凍はしないし、それを解凍後地上波 DMB ソリューションを再利用。DMB は、ラベリング後、すべてのサンプルをすぐに解析する必要があります。サンプル (> 10) の大きな数字を分析する場合は、これらのサンプルを小さいバッジに分かれて、DMB 付いて徐々 にする必要があります。ラベルの両方の反応だけでなく、地上波 DMB-分類されたプローブは、すべての光から保護されるべき回します。溶出後地上波 DMB ラベル シアル酸種を分析し、すぐに ESI さん直接、高速液体クロマトグラフィー (LC ESI MS セットアップ) で ESI MS システムの結合は必要ありませんが、質量分析法の高品質を達成するために有利であることができますで解析。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

原稿の校正と有意義な議論の l. d. グエンに感謝しますさらに、j. Dernedde、h. g. グエンは、ビデオ撮影を準備して私たちを助けるを感謝いたします。ビデオのほとんどのシーンは、r ・ タウバーの所で撮影されました。また、マックス ・ プランク コロイドおよびインターフェイスとの質量分析法の施設への無料アクセスをくださったことを感謝いたします。RH は、DFG (ProMoAge) によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

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