利用N酰基修饰 Mannosamines 对唾液酸的代谢 Glycoengineering

Bioengineering

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Summary

唾液酸是一种典型的单糖单位, 见于糖。它涉及过多的分子和细胞相互作用。在这里, 我们提出了一个方法来修改细胞表面唾液酸表达使用代谢 glycoengineering 与N-acetylmannosamine 衍生物。

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Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

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Abstract

唾液酸是糖的重要组成部分, 如NO-糖或脂。由于它的位置在还原总站的寡糖和多糖, 以及其独特的化学特性, 唾液酸参与了多种不同的受体配体相互作用。通过改变唾液酸在细胞表面的表达, 将影响唾液酸依赖性的相互作用。这有助于研究唾液酸依赖性的相互作用, 并有可能以有益的方式影响某些疾病。通过代谢 glycoengineering (MGE), 可以调节唾液酸在细胞表面的表达。在这里, 细胞, 组织, 甚至整个动物都是用 C2-modified 衍生物的N-acetylmannosamine (ManNAc) 来处理的。这些氨基糖充当唾液酸前体分子, 因此被代谢到相应的唾液酸种类和表达的糖。应用这种方法对各种生物过程产生了有趣的影响。例如, 它可以大大减少唾液酸 (polySia) 在处理神经元细胞中的表达, 从而影响神经元的生长和分化。在这里, 我们展示了两个最常见的 C2-modified n-acylmannosamine 衍生物的化学合成, n-propionylmannosamine (ManNProp) 以及n-butanoylmannosamine (ManNBut), 并进一步显示这些非氨基糖可用于细胞培养实验。用高效液相色谱 (HPLC) 对改性唾液酸的表达进行了定量分析, 并通过质谱法进行了进一步的分析。利用唾液酸抗体对唾液酸表达的影响进行了免疫印迹。

Introduction

唾液酸是一种单糖, 通常可以在糖的还原总站找到, 如N-和O-糖或脂。在所有单糖中, 唾液酸具有独特的化学特性。它有一个 9 C 原子骨干, 一个羧基在 C-1 位置, 是 deprotonated, 从而负电荷在生理条件下, 和一个氨基功能的 C-5 位置。虽然超过50自然发生的唾液酸变种已被描述为迄今1, 在人类中发现的主要形式的唾液酸是N-乙酰酸 (Neu5Ac)。其他哺乳动物也表达了更高的数量的N-glycolylneuraminic 酸 (Neu5Gc)23

由于其暴露在糖的位置, 唾液酸参与了过多的受体-配体相互作用,例如,流感病毒对宿主细胞的血依赖性绑定4。具有重要生物学功能的唾液酸表位, 尤其在胚胎发生和神经系统中, 是唾液酸。唾液酸是一种高达200α28连接的唾液酸的聚合物。唾液酸的主要蛋白载体是神经细胞黏附分子 (分子)。唾液酸的表达调节了分子的粘附特性, 即唾液酸的表达减少了粘连, 增加了与神经系统的可塑性5

(聚) 唾液酸的表达变化最终会影响多种不同的生物相互作用。这可以用来研究已知的唾液酸相关过程的分子水平, 以揭示新的糖相互作用, 或探索可能的治疗方法。有不同的方法可利用在细胞表面上唾液酸的表示可以被调整, 例如治疗与唾液酸具体糖苷 (sialidases), 抑制酵素参与在唾液酸生物合成中6 ,7,8, 或击倒或更改唾液酸生物合成的关键酶的表达式9

另一种用于调节唾液酸表达的方法是 MGE (也称为代谢性寡糖工程, 教育部)。在这里, 细胞, 组织, 甚至动物都是用非衍生物的 ManNAc 来进行 C2-amino 修饰。作为前体分子的唾液酸, 在细胞摄取后, 这些 ManNAc 类似物是单向代谢到非唾液酸和可以表达的 sialylated 糖。使用含有脂肪 C2-modifications 的 ManNAc 衍生物 (如 ManNProp 或 ManNBut) 处理的细胞, 在其 propionylneuraminic10中合并n-Neu5Prop 酸 (butanoylneuraminic) 或n-Neu5But 酸 (糖),11. 通过引入 ManNAc C2-position 的功能组, 非的唾液酸可以通过施陶丁格结扎或叠氮化 alkine 加与荧光染料相结合, 从而在单元格表面上可视化12

这些非唾液酸的表达对许多生物过程有着耐人寻味的影响, 包括病原体感染、肿瘤细胞黏附和迁移、一般细胞黏附以及血管化和分化 (供审查请参见: Wratil et al.13). 有趣的是, MGE 与N-酰基修饰的 mannosamines 也可以用来干扰唾液酸的表达。唾液酸是由两种不同的 polysialyltransferases (ST8SiaII 和 ST8SiaIV) 产生的。已经证明, polysialyltransferase ST8SiaII 是由非自然的唾液酸前体抑制的, 如 ManNProp 或 ManNBut14,15。此外, 它已经证明在人类神经母细胞瘤 ManNProp 或 ManNBut 应用也减少 sialylation 总15

MGE 与N-酰基修饰 mannosamines 是一种易于应用的方法, 已成功使用, 不仅在哺乳动物和细菌细胞培养, 而且在整个动物的不同物种, 如线虫线虫16,斑马鱼17, 或鼠标18,19,20,21。特别是含脂肪修饰的 ManNAc 衍生物, 包括 ManNProp 和 ManNBut, 都是地细胞毒, 即使在 millimolar 浓度的培养基或血浆中也是如此。此外, 它们相对容易合成。

在这里, 我们提供了如何使用 MGE 与N-乙酰修饰 mannosamines 的详细信息。首先, 解释了这一领域中最广泛使用的两种 ManNAc 衍生物的化学合成, ManNProp 和 ManNBut。接下来, 我们将展示如何在体内实验中应用 MGE。以 ManNAc 衍生物为例, 选择了神经母细胞线凯利在治疗后唾液表位的表达减少。采用 HPLC 法对细胞表面的非唾液酸进行定量分析, 并通过质谱法进一步分析。

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Protocol

1. 缓冲器和试剂的制备

  1. 3 mM 甲醇钠溶液的制备
    1. 在50毫升甲醇 (3 mM) 中, 在100毫升的玻璃瓶中溶解8.1 毫克钠醇, 搅拌棒。室温 (RT) 贮存数周。
  2. 三盐酸缓冲液的制备
    1. 结合8.766 克氯化钠, 157 毫克三盐酸, 146 毫克 EDTA 在100毫升玻璃瓶与搅拌棒和溶解在80毫升水。
    2. 将氢氧化钠 (1 米, 在水中) 或 HCl (20%, 在水中) 添加到搅拌液中, 同时观察 ph 值和 ph 值, 并将 ph 值调整到8.0。
    3. 增加需要的水量, 以达到100毫升的最终体积。使用0.22 µm 无菌过滤系统过滤解决方案。
      注: 100 毫升三盐酸缓冲将包含150毫米氯化钠, 10 毫米三盐酸, 和5毫米 EDTA (pH 8.0)。该溶液可贮存在4° c 以下几周。
  3. 抑肽酶溶液的制备
    1. 在1毫升水中溶解10毫克抑肽酶 (1.54 毫米)。分将抑肽酶溶液转化为 10 x 1.5 毫升塑料管 (每根100µL)。存放在-20 ° c 几个星期。
  4. leupeptin 溶液的制备
    1. 在2毫升水中溶解10毫克 leupeptin (10 毫米)。分 leupeptin 溶液 10 x 1.5 毫升塑料管。存放在-20 ° c 几个星期。
  5. 磺氟 (PMSF) 溶液的制备
    1. 在2毫升乙醇 (100 mM) 中溶解34.8 毫克 PMSF。分 10 x 1.5 mL 塑料管中的 PMSF 溶液。存放在-20 ° c 几个星期。
  6. 12二氨基-45-methyldioxybenzol 二盐酸盐 (DMB) 溶液的制备
    1. 结合15.62 毫克 DMB, 352 µL β-基, 和48µL 亚硫酸氢钠溶液 (39%), 并添加9.6 毫升水 (6.9 毫米 DMB, 500 毫米β-基, 和0.19% 亚硫酸氢钠)。分的 DMB 解决方案在 40 x 1.5 毫升塑料管 (每250µL)。商店在-20 ° c 保护了几个星期。
  7. 1 M 乙酸酸 (TFA) 溶液的制备
    1. 在15毫升塑料管 (1 米) 中加入770.3 µL 100% TFA 至9.23 毫升水。存放在4° c 几个星期。
  8. 120毫米 TFA 溶液的制备
    1. 在15毫升塑料管中加入92.4 µL TFA (100%) 至9.91 毫升水 (120 mM)。存放在4° c 几个星期。
  9. 400毫米氢氧化钠 (氢氧化钠) 溶液的制备
    1. 在15毫升的塑料管中溶解10毫升水 (400 毫米) 中的160毫克氢氧化钠。存放在4° c 几个星期。
  10. 西部印迹裂解液的制备
    1. 溶解 5.84 g 氯化钠, 0.1 g 三 (羟甲基)-aminomethan (三), 0.1 g CaCl2, 0.95 g 氯化镁2, 和 1 g Triton-X100 在100毫升水和调整 pH 值到7.8。贮存在4° c。在使用裂解缓冲液之前, 加入100µL 的蛋白酶抑制剂 (抑肽酶、leupeptin 和 PMSF)。
  11. 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-页) 缓冲剂的研制
    1. 在100毫升水中溶解0.3 克三, 1.5 克甘氨酸, 0.1 克 SDS, 并将 pH 值调整到7.3。存储在 RT。
  12. 免疫印迹缓冲液的制备
    1. 在90毫升水中溶解0.3 克三, 1.1 克甘氨酸, 加入10毫升乙醇。存储在 RT。
  13. 堵塞溶液的制备
    1. 在25毫升磷酸缓冲盐水 (PBS) 中溶解1克无脂牛奶的能量。总是准备新鲜。

2. ManNProp 的合成及相关的N-酰基修饰 Mannosamines

  1. 将431.2 毫克甘露盐酸盐溶于10毫升3毫米的甲醇钠溶液中, 在50毫升的玻璃瓶中加入搅拌棒。
  2. 在冰上冷却混合物到0° c。对搅拌溶液, 缓慢添加滴210µL 丙氯 (2.4 摩尔), 或248µL butanoyl 氯 (2.4 摩尔) 分别合成 ManNProp 或 ManNBut。孵育搅拌混合物在0° c 为 4 h。
  3. 将溶液转化为50毫升的塑料管。用薄针戳 4-8 孔到塑料管的盖子。使用液氮快速冷冻溶液, 随后 lyophilize (冷冻干燥) 48 小时或直至完全干燥。
  4. 混合350克硅凝胶60与750毫升乙酸乙酯/甲醇/水 (15:2: 1) (这是一个暂停)。在使用前, 用硅胶60悬浮液填充玻璃柱 (直径35毫米和70厘米), 再用100毫升的乙酸乙酯/甲醇/水 (15:2: 1) 洗涤准备好的柱子。
  5. 在10毫升乙酸乙酯/甲醇/水 (15:2: 1) 中溶解2.3 步 (5 克干制品) 中的干制品, 并将其用吸管放到硅胶柱上。收集500毫升后的4毫升分数 (ManNProp)。注: ManNBut 将在700毫升后大约洗。
  6. 将洗馏分转化为15毫升塑料管。用薄针戳 3-6 孔到塑料管的盖子。用液氮快速冷冻溶液, 随后 lyophilize, 直到完全干燥。
    注: 冻干产品可在室温下保存数月。
  7. 通过质谱法验证产品的纯度 (见9节)。
    注: 另外, 纯度也可以通过1H 核磁共振 (NMR) 进行验证。

3. 细胞培养

  1. 在罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基中含有10% 胎牛血清, 100 U 青霉素, 100 毫克链霉素, 2 毫米 l-谷氨酰胺, 含有5毫米 ManNAc, 5 毫米 ManNProp, 或5毫米 ManNBut, 在37° c 和 5% CO2
    注意: 以培养基培养的无 ManNAc 或类似物的细胞用作对照。
  2. 在应用 mannosamines 之前, 通过孵化10分钟的胰蛋白酶/EDTA (0.25%, 0.02%, PBS) 和计数使用 Neubauer 室或细胞计数器, 分离的凯利神经母细胞瘤。根据盘子/盘子的大小, 在定义的数字上播种细胞。
    1. 为了测定唾液酸单糖, 在500µL 培养基中, 种子 1 x 105细胞变成48井组织培养板。为分析唾液酸, 种子 1 x 106细胞在3毫升培养基上6厘米直径细胞培养皿。孵育在37° c 和 5% CO2。每24小时更换一次介质。
      注: MGE 的效果随着治疗总时间的增加而增大。为高新陈代谢的效率治疗细胞为 5-7 天。
  3. 治疗后, 醒酒培养基。用 PBS 洗盘子/盘子。分离的细胞, 孵化他们10分钟的胰蛋白酶/EDTA (0.25%, 0.02%, 在 PBS)。通过在分离细胞中加入相同体积的细胞培养基来中和胰蛋白酶。将分离的细胞转化为15毫升的塑料管。离心样品3分钟在 500 x g 和丢弃上清液。
    1. 添加5毫升 PBS 和离心细胞 (见步骤 3.3)。重复洗涤程序两次。
      注: 无上清的水洗细胞颗粒可在-20 ° c 贮存数天。如果唾液酸的表达将被阐明继续10节。

4. 高效液相色谱分析的细胞裂解

  1. HPLC 裂解液的制备
    1. 结合5毫升三盐酸缓冲液, 5 µL 抑肽酶溶液, 20 µL leupeptin 溶液, 50 µL PMSF 溶液。
      注: 5 毫升 HPLC 裂解缓冲液将含有150毫米氯化钠, 10 毫米三盐酸, 5 毫米 EDTA, 1.54 µM 抑肽酶, 40 µM Leupeptin, 1 毫米 PMSF (pH 8.0)。在细胞裂解之前, 这个缓冲液应该一直准备新鲜。
  2. 将所收集的细胞小球 (步骤 3.3) 重新悬浮在500µL ice-cold HPLC 裂解缓冲液中, 并在三十年代的中高振幅下用超声波处理器针三次 ultra-sonicate 样品。冰上的样品冷却至少1分钟之间的周期。

5. 膜馏分的分离

  1. 离心裂解细胞样品2小时在 2万 x g 和4° c。将上清液 (大约480µL) 分离, 代表胞浆蛋白, 在1.5 毫升塑料管中。确定这些分数的蛋白质浓度使用,例如, 布拉德福德或二辛可宁酸 (免疫分析) 化验。
    注: 蛋白质浓度 (约1毫克/毫升) 的胞浆组分后, 可与受测的唾液酸种类的数量有关。颗粒代表膜分数, 在步骤6.1 中使用。

6. 酸性水解

注意: 在细胞膜上的寡糖和多糖被水解成单糖。此外, 可能的O-在单糖中的修改也被水解。这是必要的定量 HPLC 分析, 因为绝大多数的唾液酸的膜分数是自然合并在糖, 可能会承担o-乙酰或o-lactolyl 修改。

  1. 添加150µL 1 M TFA-溶液的分离膜分数 (颗粒从5节)。在80° c 下以 200-600 rpm 的震动为样本孵育4小时。
  2. 离心样品大约30分钟在 2万 x g 和21° c 使用0.5 毫升滤管与 3 kDa 排除膜, 直到上部阶段容量小于20µL。
    注意: 这一步对处理更高的分子碎片很重要。
  3. 将包括唾液酸类在内的小分子的低相转化为2毫升塑料管。用薄针戳 2-4 孔到塑料管的盖子。快速冷冻样品使用液氮, 然后 lyophilize 他们过夜。
    注: 干燥后的样品可在 RT 中存放数天. 更换无孔盖, 以延长贮存时间。

7. 荧光标签

  1. 在10µL 120 mM TFA 溶液中重新挂干样品, 并加入50µL DMB 溶液。将样品转移到深色的1.5 毫升管子中, 以保护它们免受紫外线照射。
  2. 对于标准, 溶解1µL Neu5Ac (60 ng/毫升, 在水中) 或1µL Neu5Gc (60 ng/毫升, 在水中) 在10µL 120 毫米 TFA 解决方案在黑暗1.5 毫升管。添加50µL DMB 解决方案。
  3. 孵育细胞膜样品和标准为 1.5 h 在56° c 保护免受光。在孵化后, 加入4µL 400 毫米氢氧化钠溶液, 以停止对每个样品的标记反应。

8. HPLC 分析

注: 在 C18 RP 柱 (110 Å、3µm 粒度、4.6 x 150 mm)、荧光检测器和分数收集器的 HPLC 系统上对标签样品进行分析。所用溶剂为甲醇、乙腈和水。如果 HPLC 系统缺乏内部气, 请务必在测量前加气所有的溶剂。

  1. 将该柱的温度设置为40° c, 并分别配置 373 nm 激发和 448 nm 的荧光探测器。注入10µL 样品体积和分离探针为50分钟在0.5 毫升/分钟流速与甲醇/乙腈/水 (6:8:86) 作为淋洗。对于质谱分析, 收集感兴趣的峰值。
    注: Neu5Gc 洗后6-8 分钟, Neu5Ac 后 9-12 分钟, Neu5Prop 后 17-23 分钟, 和 Neu5But 38-44 分钟。分馏样品可以被存放为几个 h 在4° c 保护免受光。
  2. 在测量每样样品后, 用甲醇/乙腈/水 (6:25:69), 用甲醇/乙腈/水 (7.5: 1.0), 在1.0 毫升/分钟流速 (≈1.5 柱卷) 上, 将该柱洗净7.5 分钟, 并 re-equilibrate 系统为6:8 分钟。
  3. 对于定量分析, 使用各自的 HPLC 系统22的操作软件, 计算出感兴趣的唾液酸峰值曲线下的面积。
    注: 获得的数据可与 Neu5Ac 或 Neu5Gc 标准以及胞浆组分中测定的蛋白质浓度有关 (见5.1 节)。

9. 唾液酸单糖的质谱分析

注: 利用液相色谱 (LC) 电喷雾质谱 (ESI), 可进一步分析溶液中的活性峰, 以验证非自然唾液酸的含量。

  1. 在质谱分析中, 将采集到的20µL 样品注入到 LC/质量选择性检测系统中, 以79.9% 甲醇、20% 异丙醇和0.1% 甲酸为淋洗, 0.5 毫升/分钟流量, 4 kV 毛细管电压和350° c 毛细管温度22,23
  2. 在各自的 LC/调峰系统的评价软件中, 选择总离子色谱中的峰值。查看已解决峰值的质量频谱。显示300和700之间的正质量/电荷比。
    注: DMB 标记的唾液酸导致增加的分子质量116.2 克/摩尔。DMB 标记的唾液酸种类有以下分子质量: DMB-Neu5Ac = 424.2 克/摩尔, DMB-Neu5Gc = 441.8 克/摩尔, DMB-Neu5Prop = 436.2 克/摩尔, DMB-Neu5But = 453.2 克/摩尔. 普通加为乙腈、钠或异丙醇。

10. 唾液酸在凯利神经母细胞瘤中的免疫印迹分析

  1. 细胞裂解的制备
    1. 在步骤3.3 和旋涡中加入1毫升的西部印迹裂解缓冲液。在冰上孵育30分钟。漩涡每5分钟。离心样品1.5 小时在 2万 x g 和4° c。从裂解细胞中提取含有蛋白质的上清液。
    2. 测定蛋白质组分的蛋白质浓度,如: 如、布拉德福德或免疫分析。在裂解缓冲液中将样品稀释到1.5 µg/µL 的蛋白质浓度。
    3. 为 SDS 页准备样品, 将10µL Laemmli 样本缓冲器添加到90µL 蛋白分数 (1.5 µg/µL), 并将样品煮沸为 5 min24
  2. 免疫
    1. 使用 8% SDS-丙烯酰胺凝胶, 20-30 µL 袋和0.75 或1毫米厚度。在室温下运行25毫安的凝胶2小时。
    2. 小心地从凝胶中取下玻璃盖。切出并丢弃含有装载袋的凝胶的上部。将凝胶放在硝化棉膜上 (0.2 µm), 以前浸泡在西部印迹缓冲液中。根据系统的推荐将蛋白质转移到硝化纤维上 (例如,在4° c 时, 为 1 h 250 毫安)。
    3. 从印迹系统中除去硝化纤维素膜。染色的印迹与胭脂红红色, 以可视化的蛋白质。将硝化纤维素膜转移到塑料室中, 并加入10毫升堵塞溶液。在 RT 或夜间在4° c 孵育1小时。
    4. 醒酒在 PBS 中加入了阻断溶液并添加单克隆 anti-polySia 735 抗体 (1 µg/毫升)。在 RT 或隔夜在4° c 下孵育膜1小时。孵育后, 用 PBS 至少清洗三次膜5分钟。
    5. 添加多克隆 anti-mouse IgG 二级抗体 (1 µg/毫升), 再加上辣根过氧化物酶 (HRP) 或 PBS 中的荧光标签。在 RT 上孵育1小时的膜。孵育后, 用 PBS 至少清洗三次膜5分钟。
    6. 将膜转移到适当的成像仪的盘上。根据制造商的说明检测信号。

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Representative Results

图 2中描述了荧光标记 Neu5Ac 和 Neu5Gc 标准的 HPLC 谱。使用本文所描述的方法, DMB 标记的 Neu5Gc 通常 elutes 在 7-9 分钟洗脱时间之间, 和 DMB-Neu5Ac 之间 10-12 分钟。色谱中的几个小峰通常出现在 2-6 分钟之间。这些峰值代表未 DMB 和反应中间体25

图 3显示了单元格裂解的具有代表性的谱。与 DMB 标记的标准 (图 2) 的谱相比, 在这些谱中有一些未定义的峰值是可见的。这很可能是由于细胞裂解的内部杂质, 以及 DMB 不仅与唾液酸的物种反应, 而且还与细胞裂解中存在的其他α-酮酸, 包括丙酮酸、琥珀酸和α-二26。存在少量的唾液酸轴承的O-乙酰基改性没有被醋酸水解, 也可能讨论这些未定义的峰值23的原因。谱从裂解未经处理的细胞是与谱的细胞, 以前已被治疗的 ManNAc 或其类似物。如图所示, ManNAc 治疗常导致细胞表面 Neu5Gc 几乎全部耗尽。在谱裂解细胞治疗 Neu5Prop 或 Neu5But, 峰值是可见的, 没有出现在谱的未经处理的细胞。这些峰值 (用于 ManNProp 处理的细胞在大约19分钟洗脱时间和为 ManNBut 处理的细胞在 42 min) 表明相应的非唾液酸, Neu5Prop 和 Neu5Gc 的出现。如《议定书》8.3 节所述, 可以对 HPLC 谱进行分析, 以便对细胞裂解中不同唾液酸的数量进行量化。

通过质谱法验证了不同的液相色谱保留峰对应于某些唾液酸的事实。在图 4中, 从收集的高效液相色谱峰中描述了典型的电喷雾-MS 数据: 所收集的 DMB-Neu5Ac 保留峰在左上面板的频谱, 右上面板 DMB-Neu5Gc, 和两个非唾液酸种类,DMB-Neu5Prop 和 DMB-Neu5But 在左下和右面板。与 DMB 的反应导致了 116.2 Da 的分子质量的增加, 而唾液酸的种类与没有标记的这种染料。在质量谱中, 当显示注入样本的正质量/电荷比在300和700之间时, 几个峰值是可见的。这是由于受尊敬的 DMB 标记的探针加合物形成。除质子离子 [m + H]+外, 还会出现钠加 [m + Na]+和 [M+2Na-H]+ 。由于乙腈 (ACN) 是存在于 LC 分析期间, 它可以被认为是在质谱的加合物 (显示为 DMB-Neu5Gc,图 4: 右上面板)。由于在毛细管和第一个撇渣之间的 electronspray 传输区域产生碰撞失代偿活化引起的碎裂, 因此也可以观察到脱水的唾液酸 (M + h)+h2O 的种类 (如DMB-Neu5Ac,图 4: 左上面板)23,27。在 LC 设置, DMB-Neu5Gc elutes 后不久未或部分反应 DMB 物种。因此, 收集的 DMB-Neu5Gc 探针可能含有这些反应中间体引起的杂质。这就解释了 DMB-Neu5Gc 的质量谱 (图 4: 右上面板) 中未定义的峰值的外观。

ManNProp 或 ManNBut 治疗凯利神经母细胞瘤导致唾液酸在分子的表达减少, 如从裂解细胞中的细胞膜的印迹分析 (图 5) 所示。唾液酸通常表现为涂片对其大小和电荷的异质性 (≈ 200 kDa)。治疗与 ManNAc 类似物导致唾液酸的减少在细胞表面: 更长的脂肪族N-酰基侧链, 更强的减少28

Figure 1
图 1: MGE 与N-酰基修饰 mannosamines 的一般原理.治疗后与N-酰基修饰 mannosamines, 这些 ManNAc 类似物是单向代谢 (细胞内代谢) 到相应的非唾液酸。这些被运输对高尔基体, 转移到各自的寡糖接受者由 sialyltransferases 和表达在细胞表面作为 sialosides (这里, 一个糖蛋白)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 代表谱 DMB 标记的唾液酸标准.用 HPLC 法对 DMB 标 Neu5Ac (上面板) 和 Neu5Gc (下面板) 进行了分析。在将受尊敬的 DMB 标记的 10 ng 注入 HPLC 系统后, 测定了两种唾液酸的保留时间 (虚线) 和峰值面积。在这里显示代表谱, DMB-Neu5Gc 洗在大约8分钟保留时间以后和 DMB-Neu5Ac 在 11 min, 分别。色谱中的几个小峰通常出现在 2-6 分钟之间, 代表未 DMB 和反应中间体。在 DMB-Neu5Gc 标准 (下面板) 中, 一小部分 DMB 标记的 Neu5Ac 显示为次要杂质。此图是从引用22中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: DMB-高效液相色谱法测定膜结合唾液酸的特性.细胞被培养在缺席 (未处理, 上部板) 或存在与5毫米 ManNAc (第二个小组从上部), ManNProp (第三个小组从上部), 或者 ManNBut (下面板), 分别为7天。对培养基进行了每24小时的 DMB, 制备了膜, 用 HPLC 对其进行了标记。通过与 DMB 标记的唾液酸标准的谱比较 (图 2), 在保留时间8-9 分钟之间的峰值被确定为 DMB-Neu5Gc, 峰值介于 10-11 min 为 DMB-Neu5Ac。与注射 DMB 标记的唾液酸标准所获得的峰值相比, 细胞裂解的谱显示额外的、未定义的峰值。这是由于探针的内部杂质, 并且对事实 DMB 能起反应不仅与唾液酸存在于细胞裂解, 而且与其他α-酮酸存在于细胞裂解, 包括丙酮酸、琥珀酸和α-二。只有出现在谱的细胞样本的峰值, 在存在的N-酰基修饰的甘露类似物表明相应的 DMB 标记非唾液酸。此图是从引用22中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 在细胞裂解中发现的 DMB 标记的唾液酸种类的质谱.采用 HPLC 法 (参见图 3) 收集并随后分析了收集的保留峰的20µL, 并将其注入到 LC 系统中。与相应的未唾液酸相比, 与 DMB 的反应导致 116.2 Da 分子质量的增加。描述了从不同唾液酸种中获得的正质量/电荷比图 (DMB-Neu5Ac: 左上面板, DMB-Neu5Gc: 右上面板, DMB-Neu5Prop: 左下面板, DMB-Neu5But: 右下面板)。由于加成物形成几个峰是可见的。除质子离子 [m + H]+外, 还会出现加钠 [m + Na]+和 [M+2Na-H]+ 。乙腈, 这是目前在 LC 分析, 也可以发现作为加成物 (右上面板)。脱水 DMB-Neu5Ac, 这是由仪器中的碎片产生的 [M + h]+h2O 可以观察 (左上面板)。收集的 DMB-Neu5Gc 探针可能含有由未 DMB 引起的杂质, 以及被视为附加未定义峰值的反应中间体 (右上面板)。ACN, 乙腈;H, 氢;Na, 钠。此图是从引用22中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 分析分子的 polysialylation.在5毫米 ManNAc、ManNProp 或 ManNBut 的缺席或存在下7天内培养了凯利神经母细胞瘤。采用单克隆 anti-polySia 抗体 735, 在 8% SDS-丙烯酰胺凝胶上分离细胞, 用印迹法分析蛋白质。请注意, polySia 出现作为一个涂片由于它的数量在新加坡航空的异质性, 导致不同的大小和收费的 polySia。

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Discussion

如果化学合成的 ManNAc 衍生物, ManNProp 和 ManNBut 通过质谱分析, 只有正确的质量峰值的两个标本应确定。因此, 可以假定产品的纯度超过99%。在裂解细胞的膜片段中检测到少量的 Neu5Gc, 通常不存在于人类细胞29。这最有可能发生通过一个打捞途径, 招募 Neu5Gc 从胎儿牛血清 sialoglycoconjugates 在媒体30。用唾液酸的天然前驱物进行生物合成, ManNAc, 大大降低了 Neu5Gc 表位在细胞表面的表达。

改性 mannosamines 的应用对目前所研究的所有细胞都地毒性。细胞接受增加的 millimolar 糖集中在媒介, 是必要的, 因为没有具体运输者为N-acylmannosamines。已经证明, 信号转导通路被激活时, 应用的N-acylmannosamines, 这可能会影响细胞生长或分化31,32。这是否是由于改变的 sialylation 模式或反映了对修改的 sialylation 的直接影响目前还不知道。在 C2-modified ManNAc 类似物、ManNProp 或 ManNBut 的存在下, 细胞的生长会导致非唾液酸的表达, 这是携带相应的N-酰基代换。两种经试验的N-酰基修饰 mannosamines 的代谢效率各不相同。治疗与 ManNProp 通常导致在细胞表面对应的 Neu5Prop 的表示和到减少的表示 Neu5Ac 并且 Neu5Gc。其他n-酰基修饰的甘露类似物, 如n-cyclopropylcarbamyl 甘露, 往往有更高的新陈代谢效率22

先前的研究表明, 唾液前体干扰 polysialylation。唾液酸几乎完全被表达在分子。有趣的是, 分子可以神经细胞两个不同的 polysialyltransferases 表达的高尔基 (ST8SiaII 和 ST8SiaIV)。结果表明, ManNProp、ManNBut 和其他N-酰基修饰的 mannosamines 干扰 polysialylation, 这主要是由于与 ST8SiaII14的交互。这 sialyltransferase 在发展期间被表达并且是重要为脑子的发展。有趣的是, 许多肿瘤从神经元来源表达 ST8SiaII 增加他们的恶性肿瘤, 并进一步使他们无法从免疫系统33。相反, ManNAc 的应用导致 polySia 的增加, 因为它导致 CMP-Neu5Ac 的增量, 是两个 polysialyltransferases 的自然基体。

MGE 是一种独特的方法, 引入新的唾液酸对蛋白质的兴趣 (例如,促红细胞生成素) 和调节从而其功能。此外, 它可以用来调节细胞表面糖基化, 这可能是对许多疾病, 如癌症的兴趣, 因为许多癌细胞试图通过表达高水平的唾液酸来逃避免疫系统。这里提出的方法允许: 首先, 使用细胞培养执行 glycoengineering, 其次, 分析工程糖, 以证明成功的 glycoengineering。该方法是非常稳健的, 到目前为止, 没有任何陷阱报告;相比之下, 该方法已被扩展, 以引入化学活性基团, 在单元格上执行单击-化学13

在这里, 我们提出两个 ManNAc 类似物的脂肪族N-酰基侧链的修改, 可比较简单的合成, 即使是实验室的设备较少, 在化学合成经验较少。对有机化学较为熟悉的群体可以合成其他 ManNAc 类似物与更复杂的结构, 并使用这些为 MGE, 包括 so-called ' bioorthogonal ' 类似, 可以利用, 例如, 可视化 sialylated糖.有综述文章概述了N-乙酰基甘露衍生物, 已合成到日期13,34N-azidoacetyl 甘露 (ManNAz), 一种经常使用的物质, 用于可视化 sialylated 糖, 是商业上可用的。由于 ManNAc 类似物的低膜渗透性, 它可以是有利使用这些糖的衍生物与被保护的羟基小组,例如, peracetylated ManNAc 类似物。进入细胞质后, 保护基团被细胞质酯, 从而释放出活性单糖35,36,37。然而, 与相应的无保护衍生物相比, peracetylated ManNAc 类似物暴露出更高的细胞毒性。

在这篇手稿中, 我们选择了永生化的神经母细胞瘤 MGE。通常, MGE (特别是 ManNProp 和 ManNBut) 可以应用于多种细胞系, 包括永生细胞系 (请参见 Wratil et al.13示例) 和主单元格38,39。此外, MGE 在C. 线虫40、斑马鱼1741、鼠标192042和大鼠中被成功地用于改变 sialylation的体内43,44. ManNAc 类似物在 MGE 实验中的处理时间和浓度可以变化, 从而影响该方法的代谢效率。根据我们的经验, 更长的处理和更高的浓度对应与更好地替换自然发生的唾液酸种类在糖由改性的 Neu5R。如果使用极高浓度的 ManNAc 衍生物, 则应通过 MTT 法或天青还原法对治疗的细胞毒性进行评估,例如

在这篇手稿中, 我们建议使用 ultra-sonication 细胞均匀化。其他细胞裂解方法在我们的实验室进行了测试, 包括冰 douncing (大约250中风) 和法国的新闻中断 (1万 psi, 4 通道), 与在样品中检测到的唾液酸的数量相当的结果。超声均匀化的优点是, 它需要很少的时间, 不需要在裂解之前添加 DNAase 样品。

我们着重分析了细胞裂解的膜组分, 因为我们想在膜界糖的 sialylation 中显示变化。唾液酸衍生物和它们的浓度也可以测量在细胞的胞, 后膜分数已被高速离心分离, 使用相同的方法如上所述。然而, 与细胞膜上的唾液酸的表达相比, 胞中的唾液酸的浓度可达 100x.7。因此, 需要更大量的细胞来产生可靠的结果。在水解745之前, 可以通过预处理细胞裂解与硼氢化钠的胞浆组分间接测量胞浆、活化的 CMP 唾液酸的池。为了水解糖和唾液酸中的羟基修饰的唾液酸, 细胞培养1米 TFA。其他酸性溶液也可用于水解,例如, 2 米丙酸, 2 米醋酸, 或 1 m HCl。

在 HPLC 分析中可能遇到的问题是, 兴趣峰与未定义的峰值重叠。当样品中的唾液酸量要由某一峰值曲线下的面积计算时, 这是特别成问题的。为了将感兴趣的峰值与未定义的峰值分离, 可以调整 HPLC 溶剂中的乙腈浓度 (± 3%)。我们建议使用稳定的溶剂浓度进行 HPLC 分析, 给出了在色谱前制备溶剂混合物的优点。因此, 我们的方法只需要一个高效液相色谱泵, 对多种不同的 hplc 系统是可行的。如果在高效液相色谱系统中有多个泵可用, 则可以应用等梯度增加乙腈的浓度,例如, 4-9% 在 35 min45中。利用这一技术, 可以大大改变某些 HPLC 峰的保留时间。该策略还有助于更好地分离重叠峰值。成功地建立了基质辅助激光解吸电离质谱 (MALDI), 以验证修饰的唾液酸在细胞表面的表达45, 从而相当于这里提出的 ESI-ms 方法.

由于 ManNAc 类似物的亲水性和缺乏具体运输者为吸收这些衍生物46, 高浓度是需要的 MGE 实验与这些化合物。因此, 在上规模的实验中, 特别是在体内试验中, 大量的 ManNAc 类似物是必要的, 显示了这种技术可能的局限性。另一方面, 根据所使用的细胞线, 一定数量的处理细胞是必要的, 以获得可靠的结果 HPLC 分析。根据我们的经验, 至少有10万个附着细胞或15万个悬浮细胞 (1-2 口井的 96-井板与汇合细胞) 是足够的。这可能成为一个瓶颈, 如果分析是缩小, 例如在筛选方法。

采用本论文所提出的方法, 可以在细胞裂解中检测到唾液酸及其衍生物。然而, 在 ManNAc 衍生物处理的细胞中, 糖的结构和组成不能用本文所描述的技术来评估。解析糖的结构,例如, N-和O-糖, 通常需要更大的经验和学设施47。据我们所知, 到目前为止, 没有任何数据可在糖的独特结构的细胞, 已处理与 ManNAc 类似物。

唾液酸的印迹分析是一种快速、简便的方法。然而, 这种方法获得的数据不是定量的, 因为检测使用的是抗体和化学发光。因此, 使用 HPLC 法是比西方印迹的优势。不过, 我们建议使用免疫方法, 因为它很容易应用和已知的工作非常可靠。

唾液酸在细胞表面的表达也可以通过非 MGE 的方法来改变。如上所述, 细胞可以用唾液, 一种酶, 克里夫斯唾液酸残留糖以相对不的方式。唾液治疗结果诱导 hyposialylation 在治疗细胞。不幸的是, 唾液治疗是一个相当有限的技术, 因为它是细胞毒, 不可行的长时间的治疗, 而不是适用于体内实验。另一种诱导细胞 hyposialylation 的方法是利用唾液酸生物合成抑制剂。各种抑制剂是可用的, 要么目标的关键酶的唾液酸生物合成, UDP-n-acetylglucosamine-2-epimerase/n-acetylmannosamine 激酶 (GNE/入侵), 或组 sialyltransferases6, 7848。这些化合物之一, 一个 C3-fluorinated 唾液酸模拟, 被证明, 以降低唾液酸的表达在活老鼠49。然而, 用这种物质治疗的动物, 显示肝脏受损, 不可逆转的肾脏功能障碍, 并未能茁壮成长49。这些结果证实了 Neu5Ac 在肝脏和肾脏功能中的关键作用, 并进一步表明了 sialylation 抑制剂对体内实验的限制。第三种生成细胞表面 sialylation 的方法是干扰对唾液酸生物合成至关重要的酶的表达。例如, 在永生化细胞中, GNE/入侵的击倒被显示为使这些细胞 hyposialylated 9。使用新的和公认的 CRISPR-Cas9 技术, 在细胞中相对容易基因的进出基因的可能性和在体内可能导致关于唾液酸生物合成和细胞表面的新发现sialylation

与这里所描述的技术相比, MGE 的优势在于, 它很容易应用和适应各种不同的实验, 从体外试验到细胞基检测和体内实验。采用高性能的阴离子交换色谱 (HPAEC) 和脉冲电化学检测方法50测定细胞样品中不同唾液酸的表达和浓度。利用这种方法, 直接测量唾液酸的表达, 而不是用荧光染料进行标记。这种方法的优点是, 它也可以用来分析除唾液酸及其衍生物在细胞和蛋白质样品中的单糖。不幸的是, 与 DMB-唾液酸的荧光检测相比, HPAEC 的灵敏度较低。因此, HPAEC 仅限于对大量样本量51的可用性进行的实验。

本文所描述的方法可用于揭示糖的未知特征。大量的例子, 使用 MGE 研究唾液酸相关的相互作用已经存在13, 显示了该技术的可行性, 在范围广泛的实验设置。

目前, MGE 与N-acetylmannosamines 主要用于生物学领域的研究。我们希望这项技术将被更广泛的受众所认可, 作为一个多用途的工具来修改糖。其他领域, 包括免疫学, 病毒学, 神经病学, 或肿瘤学将受益于适应这种技术为自己的目的。这种交叉研究可能有助于发现未知的领域, 从而更好地了解健康和疾病。例如, 在早期的研究中, 这种技术被用于产生修饰糖蛋白, 后者后来用于体内疫苗接种。在某些情况下, 这种 glycoengineered 疫苗的治疗会导致抗体的产生, 从而暴露出高级的亲和力和毒性, 并对各自的目标52,53。其他人成功地使用 MGE 开发一个模型为靶向肿瘤治疗小鼠54。另一项研究显示, 全身性体内注射 ManNProp 促进神经再生55。在 polySia 的情况下, 它表明, 减少这个表位的表达在神经母细胞瘤的方法, 在本手稿中提出, 增加了这些肿瘤细胞的敏感性, 以放疗或治疗的抗癌药物56

在样品内测定的唾液酸的数量可能会因分离被处理细胞的方法而不同。在这份手稿中, 用胰蛋白酶孵化是用来分离细胞。如果使用其他技术, 如用 PBS + EDTA 刮取细胞或长期处理, 样品中的唾液酸含量可能会有所不同。即使用胰蛋白酶来适应潜伏期, 也会对以后测定的唾液酸浓度产生影响。根据我们的经验, 细胞剥离法对唾液酸测定量的影响在15% 以下, 但如果结果要正常化和比较, 这可能成为一个重要的瓶颈。此外, 细胞裂解的方法也会影响 HPLC 分析的结果。因此, 我们建议读者在实验中规范细胞剥离和裂解。

为了实现细胞裂解膜部分的分离, 我们在 2万 x g 和4° c (5.1 节) 上采用离心法进行 2 h。其他的离心协议可能会影响分离, 因此在样品中检测到唾液酸的数量。这一协议中的一个关键化合物是 DMB, 因为它是非常敏感的光和退化随着时间的推移。在这里, 我们建议分小部分的 DMB-解决方案, 并存储在-20 ° c 的股票, 从光保护 (部分 1.6.1)。这样, DMB 解决方案可以存储几个星期。DMB-hplc 分析结果表明, 在 hplc 测定的前6分钟内, 唾液酸类或增加信号的衰减信号, 代表 DMB 及其反应产物, 应制备新的 DMB 溶液。解冻后不要 re-freeze 和再利用 DMB 溶液。DMB 贴标后, 应立即对所有样品进行分析。如果要分析较大数量的样品 (> 10), 则应将这些样本分为较小的徽章, 并逐渐用 DMB 标记。无论是标记反应还是 DMB 标记的探针都应该在任何时候都不受光照的保护。洗脱后, DMB 标记的唾液酸的种类应立即由 esi-质谱联用喷雾-ms 系统直接耦合 (在 LC-电喷雾-ms 设置) 是不必要的, 但可以有利于实现质谱的更高质量分析.

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢阮先生校对手稿和进行富有成效的讨论。此外, 我们感谢 j. Dernedde 和阮先生帮助我们准备视频拍摄。大多数视频镜头都是在 r. 罗腾堡实验室拍摄的。我们还感谢马克斯普朗克研究所的胶体和接口, 并为我们提供免费进入他们的质谱仪设施。RH 得到了 DFG (ProMoAge) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

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