Sialic अम्ल का चयापचय Glycoengineering उपयोग N-acyl-संशोधित Mannosamines

Bioengineering

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Summary

Sialic एसिड एक ठेठ monosaccharide-glycoconjugates में पाया इकाई है । यह आणविक और सेलुलर बातचीत के एक बहुतायत में शामिल है । यहां हम एक विधि के लिए सेल सतह sialic एसिड N-acetylmannosamine डेरिवेटिव के साथ चयापचय glycoengineering का उपयोग कर अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए वर्तमान ।

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Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

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Abstract

Sialic अम्ल (सिया) glycoconjugates का एक अति महत्वपूर्ण घटक है, जैसे कि एन-एण्ड -glycans या glycolipids. गैर में अपनी स्थिति के कारण-oligo के टर्मिनी को कम करने-और polysaccharides, साथ ही साथ अपनी अनूठी रासायनिक विशेषताओं, sialic एसिड अलग रिसेप्टर-ligand बातचीत की एक भीड़ में शामिल है. कोशिका सतह पर sialic एसिड की अभिव्यक्ति को संशोधित करके, sialic एसिड पर निर्भर बातचीत के फलस्वरूप प्रभावित हो जाएगा । यह sialic एसिड पर निर्भर बातचीत की जांच करने के लिए उपयोगी हो सकता है और एक लाभदायक तरीके से कुछ रोगों को प्रभावित करने की क्षमता है । चयापचय glycoengineering (MGE) के माध्यम से, कोशिका की सतह पर sialic एसिड की अभिव्यक्ति संग्राहक किया जा सकता है । साथ ही, कोशिकाओं, ऊतकों, या यहां तक कि पूरे जानवरों के C2 संशोधित डेरिवेटिव के साथ इलाज कर रहे हैं N-acetylmannosamine (ManNAc). ये अमीनो शर्करा sialic अम्ल प्रणेता अणुओं के रूप में कार्य करते हैं और इसलिए इसी sialic अम्ल प्रजातियों को metabolized जाता है और glycoconjugates पर व्यक्त किया जाता है. इस विधि लागू विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं पर पेचीदा प्रभाव पैदा करता है । उदाहरण के लिए, यह तेजी से इलाज न्यूरॉन कोशिकाओं में polysialic एसिड (polySia) की अभिव्यक्ति को कम कर सकते हैं और इस तरह के न्यूरॉन विकास और भेदभाव को प्रभावित करता है. यहाँ, हम दो सबसे आम C2-संशोधित N-acylmannosamine डेरिवेटिव, n-propionylmannosamine (ManNProp) और साथ ही एन-butanoylmannosamine (ManNBut) के रासायनिक संश्लेषण दिखाने, और आगे दिखाने के लिए कैसे इन गैर-प्राकृतिक एमिनो शर्करा सेल संस्कृति प्रयोगों में लागू किया जा सकता है । संशोधित sialic अम्ल प्रजातियों की अभिव्यक्ति उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा मात्रा है और आगे जन स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण किया । polysialic अम्ल अभिव्यक्ति पर प्रभाव एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polysialic एसिड एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी दाग के माध्यम से आविर्भाव कर रहे हैं ।

Introduction

Sialic एसिड एक monosaccharide है जो आम तौर पर glycoconjugates के गैर-कम टर्मिनी पर पाया जा सकता है, जैसे कि N-और O-glycans या glycolipids । सभी monosaccharides के बीच, sialic एसिड कुछ अद्वितीय रासायनिक विशेषताओं है । यह एक 9 सी-एटम रीढ़, सी-1 स्थिति में एक carboxylic समूह है, कि deprotonated है और इस तरह नकारात्मक शारीरिक स्थितियों के तहत आरोप लगाया है, और सी में एक एमिनो समारोह-5 स्थिति । हालांकि ५० से अधिक sialic एसिड की स्वाभाविक रूप से होने वाली वेरिएंट की तारीख1के लिए विशेषता है, मानव में पाया sialic एसिड के प्रमुख रूप एन-acetylneuraminic एसिड (Neu5Ac) है । अन्य स्तनधारी भी एन-glycolylneuraminic एसिड (Neu5Gc)2,3की अधिक मात्रा व्यक्तकरतेहैं ।

glycoconjugates में अपनी उजागर स्थिति के कारण, sialic एसिड रिसेप्टर की एक बहुतायत में शामिल ligand बातचीत, उदा, इंफ्लूएंजा वायरस के hemagglutinin निर्भर बंधन कोशिकाओं को होस्ट करने के लिए4। एक sialic एसिड epitope महत्वपूर्ण जैविक कार्यों के साथ, विशेष रूप से embryogenesis के दौरान और तंत्रिका तंत्र में, polysialic एसिड है । Polysialic एसिड अप करने के लिए २०० अल्फा 2, 8 से जुड़े sialic एसिड की एक बहुलक है । polysialic एसिड का प्रमुख प्रोटीन वाहक तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (NCAM) है. Polysialic एसिड अभिव्यक्ति में NCAM के चिपकने वाला गुण है कि Polysialic एसिड अभिव्यक्ति आसंजन कम हो जाती है और तंत्रिका तंत्र के साथ बढ़ जाती है प्लास्टिक5

(पाली) sialic एसिड की अभिव्यक्ति में परिवर्तन अंततः अलग जैविक बातचीत की एक भीड़ को प्रभावित करेगा । यह एक आणविक स्तर पर ज्ञात sialic एसिड निर्भर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, उपंयास glycoconjugate बातचीत को उजागर करने के लिए, या संभव चिकित्सकीय दृष्टिकोण का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वहाँ विभिन्न तरीकों जो सेल सतह पर sialic एसिड की अभिव्यक्ति संग्राहक जा सकता है उपलब्ध हैं, sialic एसिड विशिष्ट glycosidases (sialidases) के साथ उदाहरण के उपचार के लिए, sialic एसिड में शामिल एंजाइमों के निषेध6 ,7,8, या नीचे दस्तक या sialic एसिड के प्रमुख एंजाइम की अभिव्यक्ति को बदलने9

sialic एसिड अभिव्यक्ति मिलाना करने के लिए एक और बहुमुखी विधि MGE (भी चयापचय oligosaccharide इंजीनियरिंग, मो के रूप में जाना जाता है) है । इस के साथ साथ, कोशिकाओं, ऊतकों, या यहां तक कि जानवरों गैर ManNAc के प्राकृतिक डेरिवेटिव है कि C2-अमीनो संशोधनों भालू के साथ इलाज कर रहे हैं । sialic एसिड के लिए अग्रदूत अणुओं होने के नाते, सेलुलर के बाद, इन ManNAc अनुरूप गैर प्राकृतिक sialic एसिड के लिए एकतरफ़ा metabolized कर रहे हैं और sialylated glycoconjugates पर व्यक्त किया जा सकता है. कोशिकाओं ManNAc डेरिवेटिव aliphatic C2-संशोधन, जैसे ManNProp या ManNBut ले जाने के साथ इलाज किया, एनशामिल करते हैं-propionylneuraminic एसिड (Neu5Prop) या एन-butanoylneuraminic एसिड (Neu5But) उनके glycoconjugates में10 , 11. C2-ManNAc की स्थिति के लिए शुरू की कार्यात्मक समूहों का उपयोग करके, होने वाली गैर प्राकृतिक sialic एसिड युग्मित किया जा सकता है, जैसे, Staudinger बंधाव या azide alkine cycloaddition के माध्यम से, फ्लोरोसेंट रंगों के साथ और इसलिए कक्ष सरफ़ेस12पर विज़ुअलाइज़ की गई ।

इन गैर प्राकृतिक sialic एसिड की अभिव्यक्ति कई जैविक प्रक्रियाओं पर पेचीदा प्रभाव है, रोगज़नक़ संक्रमण सहित, आसंजन और ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास, सामान्य सेल आसंजन, साथ ही vascularization और भेदभाव (समीक्षा के लिए देखें: Wratil एट अल. 13). दिलचस्प है कि एन-acyl संशोधित mannosamines के साथ MGE को भी polysialic एसिड की अभिव्यक्ति में दखल देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Polysialic अम्ल दो भिन्न polysialyltransferases (ST8SiaII और ST8SiaIV) द्वारा उत्पन्न होता है. यह प्रदर्शन किया गया है, कि polysialyltransferase ST8SiaII अप्राकृतिक sialic एसिड पुरोगामी, जैसे ManNProp या ManNBut14,15से हिचकती है । इसके अलावा, मानव neuroblastoma कोशिकाओं में यह प्रदर्शन किया गया है कि ManNProp या ManNBut आवेदन भी कुल15में sialylation कम कर देता है ।

MGE के साथ N-acyl संशोधित mannosamines एक आसान तरीका है कि सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, न केवल स्तनधारी और बैक्टीरिया सेल संस्कृति में भी विभिंन प्रजातियों के पूरे पशुओं में, इस तरह के Caenorhabditis एलिगेंस16के रूप में लागू करने के लिए, zebrafish17, या चूहों18,19,20,21. विशेष रूप से ManNAc डेरिवेटिव असर aliphatic संशोधनों, ManNProp और ManNBut सहित, negligibly साइटोटोक्सिक, यहां तक कि सेल संस्कृति मध्यम या रक्त प्लाज्मा में millimolar सांद्रता पर कर रहे हैं । इसके अलावा, वे अपेक्षाकृत संश्लेषित करने के लिए आसान कर रहे हैं ।

यहां, हम N-एसिटाइल संशोधित mannosamines के साथ MGE का उपयोग करने के बारे में विवरण प्रदान करते हैं । पहले, इस क्षेत्र में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया ManNAc डेरिवेटिव के दो के रासायनिक संश्लेषण, ManNProp और ManNBut, समझाया गया है । अगले, हम बताएंगे कि कैसे MGE में एक vivo प्रयोग में लागू किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, neuroblastoma सेल लाइन केली को ManNAc डेरिवेटिव के साथ उपचार के बाद पश्चिमी दाग द्वारा polysialic epitope की कमी अभिव्यक्ति का प्रदर्शन चुना गया था । कोशिका की सतह पर गैर-प्राकृतिक sialic एसिड HPLC द्वारा मात्रा गया और आगे जन स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण किया गया.

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Protocol

1. बफ़र्स और रिएजेंट्स की तैयारी

  1. 3 एमएम सोडियम methoxide सॉल्यूशन की तैयारी
    1. भंग ८.१ मिलीग्राम सोडियम methoxide में ५० मिलीलीटर मेथनॉल (3 मिमी) एक बार हलचल के साथ एक १०० मिलीलीटर कांच की बोतल में । कमरे के तापमान पर स्टोर (आरटी) कई हफ्तों के लिए ।
  2. Tris-एचसीएल बफर की तैयारी
    1. गठबंधन ८.७६६ जी NaCl, १५७ मिलीग्राम Tris-एचसीएल, और १४६ मिलीग्राम EDTA एक बार हलचल के साथ एक १०० मिलीलीटर कांच की बोतल में और ८० मिलीलीटर पानी में भंग ।
    2. एक पीएच-मीटर के साथ पीएच देख, और ८.० करने के लिए पीएच को समायोजित जबकि सोडियम हीड्राकसीड (पानी में 1 मीटर,) या एचसीएल (20%, पानी में) को उभारने के समाधान के लिए जोड़ें ।
    3. १०० मिलीलीटर के अंतिम खंड को प्राप्त करने के लिए आवश्यक पानी की मात्रा जोड़ें । एक ०.२२ µm बाँझ फ़िल्टर प्रणाली का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर.
      नोट: १०० एमएल Tris-एचसीएल बफर में १५० एमएम NaCl, 10 एमएम Tris-एचसीएल, और 5 एमएम EDTA (पीएच ८.०) शामिल होंगे । समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. aprotinin समाधान की तैयारी
    1. 1 मिलीलीटर पानी में 10 मिलीग्राम aprotinin भंग (१.५४ मिमी) । Aliquot में aprotinin समाधान 10 x १.५ मिलीलीटर-प्लास्टिक ट्यूबों (१०० µ एल प्रत्येक) । कई हफ्तों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  4. leupeptin समाधान की तैयारी
    1. भंग 10 मिलीग्राम leupeptin में 2 मिलीलीटर पानी (10 मिमी). Aliquot leupeptin समाधान 10 x १.५ मिलीलीटर-प्लास्टिक ट्यूबों । कई हफ्तों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  5. phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) समाधान की तैयारी
    1. भंग ३४.८ मिलीग्राम PMSF में 2 मिलीलीटर इथेनॉल (१०० मिमी). Aliquot में PMSF समाधान 10 x १.५ मिलीलीटर-प्लास्टिक ट्यूबों । कई हफ्तों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  6. तैयारी 1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB) समाधान
    1. गठबंधन १५.६२ मिलीग्राम DMB, ३५२ µ l β-mercaptoethanol, और ४८ µ एल सोडियम bisulfite-समाधान (३९%), और जोड़ें ९.६ मिलीलीटर पानी (६.९ मिमी DMB, ५०० मिमी β-mercaptoethanol, और ०.१९% सोडियम bisulfite). Aliquot में DMB समाधान ४० x १.५ मिलीलीटर-प्लास्टिक ट्यूबों (२५० µ एल प्रत्येक) । कई हफ्तों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित स्टोर ।
  7. 1 M trifluoroacetic अम्ल (TFA) समाधान की तैयारी
    1. एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब (1 एम) में ९.२३ मिलीलीटर पानी के लिए १००% TFA के ७७०.३ µ एल जोड़ें । कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  8. १२० एमएम TFA समाधान की तैयारी
    1. जोड़ें ९२.४ µ एल TFA (१००%) एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में ९.९१ मिलीलीटर पानी (१२० मिमी) । कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  9. ४०० mM सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) सॉल्यूशन की तैयारी
    1. एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में 10 मिलीलीटर पानी (४०० मिमी) में १६० मिलीग्राम NaOH भंग । कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  10. वेस्टर्न ब्लाटर lysis बफर की तैयारी
    1. भंग ५.८४ g NaCl, ०.१ g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), ०.१ g CaCl2, ०.९५ g MgCl2, और 1 ग्राम ट्राइटन-X100 १०० मिलीलीटर पानी में और पीएच को ७.८ से समायोजित करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । lysis बफ़र का उपयोग करने से पहले प्रत्येक चिढ़ाना अवरोध करनेवाला (aprotinin, leupeptin, और PMSF) के १०० µ l जोड़ें ।
  11. सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) बफर की तैयारी
    1. भंग ०.३ g Tris, १.५ g glycine, और ०.१ ग्राम एसडीएस १०० मिलीलीटर पानी में और पीएच को ७.३ से समायोजित करें । RT पर स्टोर.
  12. पश्चिमी ब्लाटर बफर की तैयारी
    1. भंग ०.३ ग्राम Tris, १.१ ग्राम ९० मिलीलीटर पानी में glycine और 10 मिलीलीटर इथेनॉल जोड़ें । RT पर स्टोर.
  13. समाधान रोकने की तैयारी
    1. 25 मिलीलीटर फॉस्फेट में वसा मुक्त दूध बिजली की 1 जी भंग (पंजाब) । हमेशा फ्रेश तैयार करें ।

2. ManNProp का संश्लेषण और संबंधित N-acyl-संशोधित Mannosamines

  1. भंग ४३१.२ मिलीग्राम mannosamine हाइडरोक्लॉराइड में 10 मिलीलीटर 3 मिमी सोडियम methoxide समाधान में एक ५० मिलीलीटर कांच की बोतल के साथ एक बार हलचल ।
  2. 0 ° c के लिए बर्फ पर मिश्रण ठंडा । सरगर्मी समाधान करने के लिए, धीरे dropwise २१० µ एल propionyl क्लोराइड (२.४ mmol), या २४८ µ एल butanoyl क्लोराइड (२.४ mmol) ManNProp या ManNBut, क्रमशः संश्लेषित करने के लिए जोड़ें । 4 एच के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर चमचे मिश्रण की मशीन ।
  3. एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में समाधान स्थानांतरण । एक पतली सुई के साथ प्लास्टिक ट्यूब के ढक्कन में 4-8 छेद प्रहार । तेजी से तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर समाधान फ्रीज और बाद में lyophilize (फ्रीज सूखी) यह ४८ के लिए ज या जब तक यह पूरी तरह से सूख गया है ।
  4. मिश्रण ३५० जी सिलिका जेल ६० के साथ ७५० मिलीलीटर एथिल-एसीटेट/मेथनॉल/पानी (15:2:1) (यह एक निलंबन है) । सिलिका जेल ६० निलंबन के साथ एक गिलास कॉलम (३५ मिमी व्यास और ७० सेमी लंबाई) भरें और उपयोग करने से पहले एक अतिरिक्त १०० मिलीलीटर एथिल-एसीटेट/मेथनॉल/पानी (15:2:1) के साथ तैयार कॉलम धो लें ।
  5. 10 मिलीलीटर एथिल-एसीटेट/मेथनॉल/पानी (15:2:1) में कदम २.३ (5 जी सूखे उत्पाद) से सूखे उत्पादों को भंग और सिलिका जेल कॉलम पर एक पिपेट का उपयोग कर उन्हें लोड । ५०० एमएल (ManNProp के लिए) के बाद 4 एमएल अंश लीजिए । नोट: ManNBut ७०० एमएल के बाद लगभग कॉलम से elute होगा ।
  6. 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में eluted भागों स्थानांतरण । एक पतली सुई के साथ प्लास्टिक ट्यूब के ढक्कन में 3-6 छेद प्रहार । तेजी से तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर समाधान फ्रीज और बाद में इसे पूरी तरह से सूख गया है जब तक lyophilize ।
    नोट: lyophilized उत्पादों RT पर कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  7. मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उत्पादों की शुद्धता सत्यापित करें (अनुभाग 9 देखें).
    नोट: वैकल्पिक रूप से, पवित्रता भी 1एच परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) द्वारा सत्यापित किया जा सकता है ।

3. सेल संस्कृति

  1. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) में संस्कृति केली neuroblastoma कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, १०० यू पेनिसिलिन, १०० मिलीग्राम streptomycin, 2 मिमी एल-glutamine युक्त 5 मिमी ManNAc, 5 मिमी ManNProp, या 5 मिमी ManNBut, ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर से युक्त2.
    नोट: ManNAc या इसके एनालॉग के बिना मध्यम में कल्चरित कक्षों को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है ।
  2. mannosamines के आवेदन करने से पहले, trypsin/EDTA (०.२५%, ०.०२%, पंजाबियों में) और गिनती के साथ 10 मिनट के लिए उंहें मशीन द्वारा केली neuroblastoma कोशिकाओं अलग और एक Neubauer-चैंबर या सेल काउंटर का उपयोग कर गणना । बीज थाली के आकार के आधार पर निर्धारित संख्या में कोशिकाओं/
    1. को मापने के लिए sialic एसिड monosaccharides, बीज 1 x 105 कोशिकाओं में ५०० µ l मध्यम में एक ४८-well टिशू कल्चर प्लेट. polysialic एसिड के विश्लेषण के लिए, बीज 1 x 106 कोशिकाओं 3 मिलीलीटर मध्यम में एक 6 सेमी व्यास सेल संस्कृति पकवान पर । ३७ ° c और 5% कं2पर मशीन । मीडियम को हर 24 ज से बदलें ।
      नोट: MGE का प्रभाव उपचार के कुल समय के साथ बढ़ जाता है । उच्च चयापचय दक्षता के लिए 5-7 दिनों के लिए कोशिकाओं का इलाज ।
  3. उपचार के बाद, मध्यम खिचड़ी भाषा । पंजाबियों के साथ प्लेटें धोकर बर्तन/ trypsin/EDTA (०.२५%, ०.०२%, पंजाबियों में) के साथ 10 मिनट के लिए उंहें मशीन द्वारा अलग कोशिकाओं । सेल संस्कृति माध्यम की एक ही मात्रा अलग कोशिकाओं को जोड़कर trypsin बेअसर । 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में अलग कोशिकाओं स्थानांतरण । ५०० x जी पर 3 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    1. 5 मिलीलीटर पंजाबियों जोड़ें और कोशिकाओं केंद्रापसारक (३.३ कदम देखें) । धुलाई प्रक्रिया को दो बार दोहराएं ।
      नोट: supernatant बिना धोया सेल गोली कई दिनों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । यदि polysialic अम्ल की अभिव्यक्ति का आविर्भाव होना है तो धारा १० को जारी रखें.

4. HPLC विश्लेषण के लिए सेल Lysis

  1. HPLC lysis बफर की तैयारी
    1. जुडा 5 एमएल Tris-एचसीएल बफर, 5 µ l aprotinin हल, 20 µ l leupeptin हल, और ५० µ l PMSF हल ।
      नोट: 5 मिलीलीटर HPLC Lysis बफर १५० mm NaCl, 10 मिमी Tris-एचसीएल, 5 मिमी EDTA, १.५४ µ एम aprotinin, ४० µ एम Leupeptin, और 1 मिमी PMSF (पीएच ८.०) शामिल होंगे । इस बफर हमेशा ताजा सेल lysis से पहले तैयार किया जाना चाहिए ।
  2. पुन: निलंबित सेल छर्रों (चरण ३.३) प्रत्येक में ५०० µ एल बर्फ-शीत HPLC lysis-बफर, और अल्ट्रा-sonicate नमूने एक अल्ट्रा सोनिक प्रोसेसर सुई के साथ तीन बार मध्यम उच्च आयाम पर 30 एस की अवधि के लिए. बर्फ पर चक्रों के बीच में न्यूनतम 1 मिनट के लिए नमूने शांत ।

5. झिल्ली अंश का पृथक्करण

  1. २०,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए लीजड सेल नमूने केंद्रापसारक । supernatant (लगभग ४८० µ एल) अलग, cytosolic प्रोटीन का प्रतिनिधित्व, १.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में । इन भागों का उपयोग कर के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण, जैसे, ब्रैडफोर्ड या bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख ।
    नोट: प्रोटीन एकाग्रता (लगभग 1 मिलीग्राम/एमएल) cytosolic अंश बाद में संमानित sialic एसिड प्रजातियों की मापा मात्रा से संबंधित हो सकता है । गोली झिल्ली अंश है, जो चरण ६.१ में प्रयोग किया जाता है का प्रतिनिधित्व करता है ।

6. अम्लीय Hydrolysis

नोट: Oligo-और कोशिका झिल्ली में polysaccharides hydrolyzed को monosaccharides हैं. इसके अलावा, monosaccharides में संभव -संशोधन hydrolyzed हैं, के रूप में अच्छी तरह से । यह मात्रात्मक HPLC विश्लेषण के लिए आवश्यक है, क्योंकि झिल्ली भागों में sialic एसिड के भारी बहुमत स्वाभाविक रूप से glycoconjugates में शामिल कर रहे है और संभवतः सहन o-एसिटाइल या o-lactolyl संशोधन हो सकता है ।

  1. जोड़ें १५० µ एल 1 एम TFA-अलग झिल्ली भिंन (खंड 5 से गोली) के लिए समाधान । २००-६०० rpm पर मिलाते के साथ ८० डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए नमूनों की मशीन ।
  2. २०,००० पर लगभग 30 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक x g और 21 ° c 3 केडीए अपवर्जन झिल्ली के साथ ०.५ मिलीलीटर फिल्टर ट्यूबों का उपयोग कर, ऊपरी चरण की मात्रा से कम 20 µ एल जब तक
    नोट: इस कदम के लिए उच्च आणविक मलबे निपटान महत्वपूर्ण है ।
  3. 2 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में sialic एसिड प्रजातियों सहित छोटे अणुओं, युक्त निचले चरण हस्तांतरण । एक पतली सुई के साथ प्लास्टिक ट्यूबों की टोपियां में 2-4 छेद प्रहार । तेजी से तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर नमूने फ्रीज और फिर उंहें रात भर lyophilize ।
    नोट: सूखे नमूने आरटी पर कई दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है अब भंडारण के लिए छेद के बिना एक टोपी की जगह ।

7. फ्लोरोसेंट लेबलिंग

  1. सूखे नमूनों को पुन: निलंबित कर 10 µ l १२० mM TFA समाधान और add ५० µ l DMB समाधान । उन्हें पराबैंगनी प्रकाश से बचाने के लिए अंधेरे १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में नमूनों हस्तांतरण ।
  2. मानकों के लिए, 1 µ l Neu5Ac भंग (६० एनजी/एमएल, पानी में) या 1 µ l Neu5Gc (६० एनजी/एमएल, पानी में) 10 µ एल १२० mM TFA समाधान में अंधेरे १.५ मिलीलीटर ट्यूबों । जोड ५० µ l DMB हल ।
  3. सेल झिल्ली के नमूने और ५६ ° c प्रकाश से सुरक्षित पर १.५ ज के लिए मानकों की मशीन । मशीन के बाद, लेबलिंग प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए 4 µ एल ४०० mM NaOH समाधान जोड़ें ।

8. HPLC विश्लेषण

नोट: लेबल नमूने एक HPLC एक C18 आरपी कॉलम (११० Å, 3 µm कण आकार, ४.६ x १५० mm), एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर, और एक अंश कलेक्टर के साथ सुसज्जित प्रणाली पर विश्लेषण कर रहे हैं । इस्तेमाल किया सॉल्वैंट्स मेथनॉल, acetonitrile, और पानी कर रहे हैं । HPLC प्रणाली एक आंतरिक degasser का अभाव है, तो माप करने से पहले सभी सॉल्वैंट्स degas करने के लिए सुनिश्चित करें ।

  1. ४० डिग्री सेल्सियस के लिए कॉलम के तापमान सेट और उत्तेजना के लिए ३७३ एनएम और उत्सर्जन के लिए ४४८ एनएम के साथ प्रतिदीप्ति डिटेक्टर कॉंफ़िगर, क्रमशः । 10 µ एल नमूना मात्रा सुई और eluent के रूप में मेथनॉल/acetonitrile/पानी (6:8:86) के साथ ०.५ मिलीलीटर/न्यूनतम प्रवाह दर पर ५० मिनट के लिए जांच अलग । मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए, ब्याज की चोटियों इकट्ठा ।
    नोट: Neu5Gc 6-8 मिनट के बाद eluate करने के लिए उम्मीद है, 9-12 मिनट के बाद Neu5Ac, Neu5Prop 17-23 मिनट के बाद, और Neu5But के बाद ३८-४४ मिनट. fractionated नमूने प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर कई एच के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  2. प्रत्येक नमूने को मापने के बाद, मेथनॉल/acetonitrile/पानी (6:25:69) के साथ १.० मिलीलीटर/न्यूनतम प्रवाह दर (≈ १.५ स्तंभ वॉल्यूम) पर ७.५ मिनट के लिए स्तंभ को धो दें और मेथनॉल/acetonitrile/पानी (७.५) के साथ १.० मिलीलीटर/ंयूनतम प्रवाह दर पर 6:8:86 मिनट के लिए सिस्टम को पुन: equilibrate ।
  3. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, संबंधित HPLC-प्रणाली22के ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ब्याज की sialic एसिड चोटियों के वक्र के तहत क्षेत्र की गणना ।
    नोट: प्राप्त डेटा Neu5Ac या Neu5Gc मानक से संबंधित हो सकते है और cytosolic भागों में मापा प्रोटीन सांद्रता के लिए (५.१ अनुभाग देखें) ।

9. Sialic अम्ल Monosaccharides के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

नोट: HPLC प्रतिधारण पीक ब्याज की आगे तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा) electrospray-ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-MS) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, ताकि अप्राकृतिक sialic एसिड प्रजातियों को सत्यापित करने के लिए ।

  1. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए, एक नियंत्रण रेखा/जन चयनात्मक डिटेक्टर (एमएसडी) प्रणाली में ७९.९% मेथनॉल, 20% isopropyl शराब, और ०.१% eluent, ०.५ मिलीलीटर/ंयूनतम प्रवाह दर, 4 केवी केशिका वोल्टेज, और ३५० ° c केशिका तापमान के रूप में एसिड के साथ एकत्र नमूना के 20 µ एल इंजेक्षन 22 , 23.
  2. संबंधित नियंत्रण रेखा/एमएसडी प्रणाली के मूल्यांकन सॉफ्टवेयर में, कुल आयन वर्णलेख में ब्याज की चोटी का चयन करें । हल चोटी के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम देखें । सकारात्मक द्रव्यमान/३०० और ७०० के बीच चार्ज अनुपात प्रदर्शित करें ।
    नोट: sialic एसिड के DMB लेबलिंग ११६.२ ग्राम के आणविक द्रव्यमान में वृद्धि की ओर जाता है/ DMB-sialic एसिड प्रजातियों लेबल निंनलिखित आणविक जनता है: DMB-Neu5Ac = ४२४.२ g/मोल, DMB-Neu5Gc = ४४१.८ g/मोल, DMB-Neu5Prop = ४३६.२ g/मोल, DMB-Neu5But = ४५३.२ g/मोल । आम adducts acetonitrile, सोडियम, या isopropyl शराब हैं ।

10. केली Neuroblastoma कोशिकाओं में Polysialic एसिड का पश्चिमी दाग विश्लेषण

  1. सेल lysates की तैयारी
    1. कदम ३.३ और भंवर से सेल छर्रों के लिए 1 मिलीलीटर पश्चिमी दाग lysis बफर जोड़ें । बर्फ पर 30 मिनट के लिए मशीन । भंवर हर 5 मिनट । २०,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर १.५ ज के लिए नमूने केंद्रापसारक । लीजड कोशिकाओं से प्रोटीन युक्त supernatant लीजिए.
    2. प्रोटीन अंशों के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण, जैसे, ब्रैडफोर्ड या बीसीए परख । lysis बफर में १.५ µ जी/µ एल के एक प्रोटीन एकाग्रता के लिए नमूनों को पतला ।
    3. एसडीएस-पृष्ठ के लिए नमूने तैयार 10 µ l Laemmli नमूना बफ़र को जोड़कर ९० µ l प्रोटीन अंश (१.५ µ g/µ l) और 5 मिनट24के लिए नमूना फोड़ा ।
  2. immunoblotting
    1. 20-30 µ l जेबें और ०.७५ या 1 मिमी मोटाई के साथ 8% एसडीएस-acrylamide जैल का उपयोग करें । आरटी पर 2 ज के लिए 25 mA में जेल चलाते हैं ।
    2. सावधानी से ग्लास कवर जेल से हटा दें । बाहर कट और लोडिंग जेब युक्त जेल के ऊपरी भाग को त्यागें । एक nitrocellulose झिल्ली पर जेल प्लेस (०.२ µm), पहले पश्चिमी दाग बफर में लथपथ । प्रणाली की सिफारिश के अनुसार nitrocellulose करने के लिए प्रोटीन स्थानांतरण (उदा, 1 के लिए २५० mA h 4 डिग्री सेल्सियस पर) ।
    3. सोख्ता सिस्टम से nitrocellulose झिल्ली को हटा दें । Ponceau रेड के साथ दाग को प्रोटीन की कल्पना । एक प्लास्टिक चैंबर में nitrocellulose झिल्ली स्थानांतरण और 10 मिलीलीटर अवरुद्ध समाधान जोड़ें । आरटी में 1 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात के लिए मशीन ।
    4. ब्लॉकिंग समाधान नहीं कर सकते और मोनोक्लोनल एंटी-polySia ७३५ एंटीबॉडी (1 µ g/ आरटी में 1 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए झिल्ली की मशीन । मशीनीकरण के बाद, सबसे कम तीन बार पंजाबियों के साथ 5 मिनट के लिए झिल्ली धो लो ।
    5. polyclonal एंटी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी (1 µ g/एमएल) सहिजन peroxidase (एचआरपी) या पंजाबियों में एक फ्लोरोसेंट लेबल करने के लिए युग्मित जोड़ें । आरटी पर 1 ज के लिए झिल्ली की मशीन । मशीनीकरण के बाद, सबसे कम तीन बार पंजाबियों के साथ 5 मिनट के लिए झिल्ली धो लो ।
    6. एक उपयुक्त imager की एक थाली पर झिल्ली स्थानांतरण । निर्माता के निर्देशों के अनुसार संकेत का पता लगाएं ।

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Representative Results

HPLC chromatograms फ्लोरोसेंट लेबल Neu5Ac और Neu5Gc मानकों में चित्रित कर रहे है चित्रा 2। इस के साथ साथ वर्णित विधि का प्रयोग, DMB-लेबल Neu5Gc आम तौर पर elutes के बीच 7-9 मिनट रेफरेंस समय, और DMB-Neu5Ac के बीच 10-12 मिनट । वर्णलेख में कई छोटे चोटियों आमतौर पर 2-6 मिनट के बीच दिखाई देते हैं । इन चोटियों पर प्रतिक्रिया व्यक्त की DMB और प्रतिक्रिया मध्यवर्ती25प्रतिनिधित्व करते हैं ।

चित्रा 3 सेल lysates के प्रतिनिधि chromatograms से पता चलता है. DMB-लेबल मानकों के chromatograms की तुलना में (चित्रा 2), इन chromatograms में कई अपरिभाषित चोटियों दिखाई दे रहे हैं । यह सबसे अधिक होने की संभावना कोशिका lysates के आंतरिक नापाक और इस तथ्य के कारण है कि DMB न केवल sialic एसिड प्रजातियों के साथ प्रतिक्रिया करता है, लेकिन यह भी lysates, पाइरूवेट, और succinate-α सहित सेल ketoglutarate में मौजूद अन्य α-कीटो एसिड के साथ26। sialic एसिड की छोटी मात्रा की उपस्थिति का असर -एसिटाइल संशोधनों कि एसिटिक hydrolysis द्वारा नहीं किया गया है भी इन अपरिभाषित चोटियों के लिए एक कारण के रूप में चर्चा की जा सकती है23। लीजड अनुपचारित कोशिकाओं से Chromatograms पहले ManNAc या उसके सादृश्य के साथ इलाज किया गया है कि कोशिकाओं से Chromatograms के साथ तुलना कर रहे हैं । यहां के रूप में दिखाया गया है, ManNAc के साथ उपचार अक्सर सेल सतह पर Neu5Gc के लगभग पूरे घट की ओर जाता है । लीजड कोशिकाओं के chromatograms में Neu5Prop या Neu5But के साथ इलाज किया, चोटियों दिखाई है कि अनुपचारित कोशिकाओं के chromatograms में दिखाई नहीं देते हैं । इन चोटियों (ManNProp के लिए लगभग 19 मिनट के रेफरेंस समय पर कोशिकाओं का इलाज और ४२ मिनट में ManNBut इलाज कोशिकाओं के लिए) इसी गैर प्राकृतिक sialic एसिड, Neu5Prop और Neu5Gc की उपस्थिति का संकेत मिलता है । के रूप में प्रोटोकॉल की धारा ८.३ में वर्णित है, HPLC chromatograms विश्लेषण किया जा सकता है क्रम में सेल lysates में विभिंन sialic एसिड प्रजातियों की मात्रा यों तो ।

तथ्य यह है कि विशिष्ट HPLC प्रतिधारण चोटियों कुछ sialic एसिड प्रजातियों के अनुरूप जन स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से सत्यापित किया गया था । प्रतिनिधि ईएसआई-एमएस डेटा ब्याज की एकत्र HPLC चोटियों से चित्रा 4में चित्रित कर रहे हैं: ऊपरी बाएँ पैनल में एकत्र DMB-Neu5Ac प्रतिधारण चोटी के स्पेक्ट्रम, ऊपरी दाएँ फलक में DMB-Neu5Gc, और दो गैर प्राकृतिक sialic एसिड प्रजातियों, निचले बाएँ और दाएँ पैनलों में DMB-Neu5Prop और DMB-Neu5But. DMB के साथ प्रतिक्रिया ११६.२ दा के आणविक द्रव्यमान में वृद्धि की ओर जाता है, sialic एसिड प्रजातियों कि इस डाई के साथ लेबल नहीं कर रहे हैं की तुलना में. मास स्पेक्ट्रा में, ३०० और ७०० के बीच इंजेक्शन नमूनों के सकारात्मक द्रव्यमान/चार्ज अनुपात प्रदर्शित करते समय, कई चोटियों दिखाई दे रहे हैं. यह सममान DMB-त्यसपछि जांच के adduct गठन के कारण है । इसके अलावा protonated आयन [एम + एच]+, सोडियम adducts [m + Na]+ और [m + 2Na-h]+ दिखाई देते हैं । के रूप में acetonitrile (ACN) नियंत्रण रेखा विश्लेषण के दौरान मौजूद है, यह मास स्पेक्ट्रा में एक adduct के रूप में पाया जा सकता है (DMB-Neu5Gc के लिए दिखाया गया है, चित्रा 4: ऊपरी दाएं फलक) । electronspray परिवहन क्षेत्र में उत्पन्न टकराव के कारण विखंडन के कारण केशिका और पहले स्किमर, निर्जलित sialic एसिड प्रजातियों [एम + एच]+-एच2ओ भी मनाया जा सकता है (के लिए दिखाया गया है DMB-Neu5Ac, चित्रा 4: ऊपरी बायां पैनल)23,27. नियंत्रण रेखा सेटअप में, DMB-Neu5Gc elutes के बाद शीघ्र ही या आंशिक रूप से प्रतिक्रिया व्यक्त की DMB-प्रजातियों । इसलिए, एकत्रित DMB-Neu5Gc जांच इन प्रतिक्रिया मध्यवर्ती के कारण दोष हो सकता है । यह DMB के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम में अपरिभाषित चोटियों की उपस्थिति के लिए एक विवरण के रूप में कार्य करता है-Neu5Gc (चित्रा 4: ऊपरी दाएँ पैनल).

ManNProp या ManNBut के साथ केली neuroblastoma कोशिकाओं के उपचार NCAM पर polysialic एसिड की कम अभिव्यक्ति की ओर जाता है, के रूप में लीजड कोशिकाओं से कोशिका झिल्ली के पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा दिखाया गया है (चित्रा 5) । Polysialic एसिड आम तौर पर एक धब्बा के रूप में प्रकट होता है आकार और के प्रभारी (≈ २०० केडीए) में अपनी विविधता के लिए करते हैं । ManNAc के अनुरूप उपचार कोशिकाओं की सतह पर polysialic एसिड की कमी की ओर जाता है: अब aliphatic एन-acyl पक्ष श्रृंखला, मजबूत कटौती28.

Figure 1
चित्रा 1: MGE के सामांय सिद्धांत के साथ N-acyl संशोधित mannosamines । N-acyl संशोधित mannosamines के साथ उपचार के बाद, इन ManNAc अनुरूप गैर प्राकृतिक metabolized एसिड के लिए unidirectionally intracellular (sialic चयापचय) कर रहे हैं । ये Golgi के लिए ले जाया, sialyltransferases द्वारा संबंधित oligosaccharide स्वीकारकर्ता को हस्तांतरित कर रहे हैं, और sialosides के रूप में सेल की सतह पर व्यक्त (यहां, एक ग्लाइकोप्रोटीन) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: DMB-लेबल sialic एसिड मानकों के प्रतिनिधि chromatograms । DMB-लेबल Neu5Ac (ऊपरी पैनल) और Neu5Gc (निचले पैनल) HPLC द्वारा विश्लेषण किया गया । अवधारण समय (डैश्ड लाइनें) और दोनों sialic एसिड की चोटी क्षेत्रों HPLC प्रणाली में संमानित DMB-लेबल प्रजातियों में से 10 एनजी इंजेक्शन के बाद निर्धारित किया गया । इस स्पेसिफिकेशंस दिखाया प्रतिनिधि chromatograms में, DMB-Neu5Gc eluted के बाद लगभग एक 8 मिनट प्रतिधारण समय और DMB-Neu5Ac पर 11 मिनट, क्रमशः । वर्णलेख में कई छोटे चोटियों आमतौर पर 2-6 मिनट के बीच दिखाई देते हैं, unactioned DMB और प्रतिक्रिया मध्यवर्ती का प्रतिनिधित्व । DMB-त्यसपछि Neu5Ac का एक छोटा-सा अंश DMB-Neu5Gc मानक (निचला फलक) में गौण शुचिता के रूप में प्रकट होता है. यह आंकड़ा संदर्भ22से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: DMB-HPLC द्वारा झिल्ली बंधे sialic एसिड के लक्षण वर्णन । कोशिकाओं के अभाव (अनुपचारित, ऊपरी पैनल) या 5 मिमी ManNAc (ऊपर से दूसरे पैनल), ManNProp (ऊपर से तीसरे पैनल), या ManNBut (निचले पैनल), क्रमशः 7 दिनों के लिए के साथ उपस्थिति में संस्कृति थे । माध्यम बदल गया था हर 24 ज. कोशिकाओं को काटा गया और झिल्ली भागों तैयार किया गया था, DMB के साथ लेबल, और HPLC द्वारा विश्लेषण किया । DMB के chromatograms के साथ तुलना करके-sialic एसिड मानक लेबल (चित्रा 2), 8-9 मिनट के बीच प्रतिधारण समय पर चोटियों DMB-Neu5Gc के रूप में पहचान की, और DMB-Neu5Ac के रूप में 10-11 मिनट के बीच चोटियों थे । DMB-लेबल sialic एसिड मानकों के इंजेक्शन से प्राप्त चोटियों की तुलना में, सेल lysates से chromatograms अतिरिक्त, अपरिभाषित चोटियों दिखाओ । यह जांच की आंतरिक शुचिता के कारण है, साथ ही तथ्य यह है कि DMB न केवल कोशिका lysates में मौजूद sialic एसिड के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, लेकिन यह भी सेल lysates में मौजूद अन्य α-कीटो एसिड के साथ, पाइरूवेट, succinate, और α-ketoglutarate सहित. चोटियों कि केवल N-acyl संशोधित mannosamine अनुरूप की उपस्थिति में प्रसंस्कृत कोशिकाओं से नमूनों की chromatograms में दिखाई देते हैं इसी DMB-लेबल गैर प्राकृतिक sialic एसिड संकेत मिलता है. यह आंकड़ा संदर्भ22से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: DMB के मास स्पेक्ट्रा-लेबल sialic एसिड प्रजातियों के सेल lysates में पाया. ब्याज की HPLC प्रतिधारण चोटियों (देखें चित्रा 3) एकत्र किए गए थे और बाद में ईएसआई द्वारा विश्लेषण-सुश्री 20 एकत्र अवधारण चोटियों के µ एल नियंत्रण रेखा में इंजेक्शन थे-एमएसडी प्रणाली. DMB के साथ प्रतिक्रिया ११६.२ की आणविक जन में वृद्धि की ओर जाता है दा इसी प्रतिक्रिया sialic एसिड प्रजातियों की तुलना में । विभिंन sialic एसिड प्रजातियों से प्राप्त सकारात्मक मास/चार्ज अनुपात spectrograms (DMB-Neu5Ac: ऊपरी बायां पैनल, DMB-Neu5Gc: ऊपरी दायां पैनल, DMB-Neu5Prop: निचला बायां पैनल, DMB-Neu5But: निचला दायां फलक) दर्शाया गया है । adduct गठन के कारण कई चोटियों पर असर दिखाई दे रहा है । इसके अलावा protonated आयन [m + H]+, सोडियम adducts [m + Na]+ और [m + 2Na-h]+ दिखाई देते हैं । Acetonitrile, जो नियंत्रण रेखा के विश्लेषण के दौरान मौजूद है, भी एक adduct (ऊपरी दाहिने पैनल) के रूप में पाया जा सकता है । निर्जलित DMB-Neu5Ac, जो साधन में विखंडन द्वारा उत्पन्न होता है [M + h]+-h2O देखा जा सकता है (ऊपरी बायां फलक) । एकत्र DMB-Neu5Gc जांच अस्पष्ट DMB की वजह से अशुद्धियों को शामिल कर सकते हैं, साथ ही प्रतिक्रिया मध्यवर्ती अतिरिक्त अपरिभाषित चोटियों (ऊपरी दाएँ पैनल) के रूप में देखा । ACN, acetonitrile; एच, हाइड्रोजन; ना, सोडियम. यह आंकड़ा संदर्भ22से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: NCAM के polysialylation का विश्लेषण. केली neuroblastoma कोशिकाओं के अभाव या 7 दिनों के लिए 5 मिमी ManNAc, ManNProp, या ManNBut की उपस्थिति में संस्कृति थे । कोशिकाओं को काटा गया और प्रोटीन 8% एसडीएस-acrylamide जैल और मोनोक्लोनल विरोधी polySia एंटीबॉडी ७३५ का उपयोग कर पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण पर अलग किया गया । ध्यान दें कि polySia सिया की संख्या में अपनी विविधता के कारण एक धब्बा के रूप में प्रकट होता है, polySia के विभिंन आकारों और आरोपों में जिसके परिणामस्वरूप ।

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Discussion

यदि रासायनिक संश्लेषित ManNAc डेरिवेटिव, ManNProp और ManNBut मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं, दोनों नमूनों के लिए केवल सही जन चोटी की पहचान की जानी चाहिए । इसलिए, उत्पादों के लिए ९९% से अधिक की पवित्रता है ग्रहण किया जा सकता है । Neu5Gc की छोटी मात्रा है, जो सामांय रूप से मानव कोशिकाओं में नहीं मिला है29, लीजड कोशिकाओं के झिल्ली भागों में पाया जाता है । यह सबसे अधिक संभावना एक उबार मार्ग है कि मीडिया में भ्रूण गोजातीय सीरम sialoglycoconjugates से Neu5Gc रंगरूटों के माध्यम से होता है30। sialic एसिड के प्राकृतिक अग्रदूत के साथ उपचार, ManNAc, तेजी से कोशिका की सतह पर Neu5Gc epitope की अभिव्यक्ति को कम करती है ।

संशोधित mannosamines के आवेदन अब तक की जांच की सभी कोशिकाओं को विषाक्त negligibly है । कोशिकाएं मध्यम के भीतर बढ़ी हुई millimolar शर्करा सांद्रता स्वीकार करती हैं, जो आवश्यक है, क्योंकि N-acylmannosamines के लिए कोई विशिष्ट ट्रांसपोर्टर नहीं हैं । यह दिखा दिया गया है कि संकेत transduction रास्ते एन-acylmannosamines, जो सेल विकास या भेदभाव31,३२को प्रभावित कर सकता है के आवेदन पर सक्रिय कर रहे हैं । क्या यह एक परिवर्तित sialylation पैटर्न के कारण है या संशोधित sialylation पर प्रत्यक्ष प्रभाव को दर्शाता है अब तक ज्ञात नहीं है । C2-संशोधित ManNAc एनालॉग की उपस्थिति में कोशिकाओं की वृद्धि, ManNProp या ManNBut परिणाम गैर-प्राकृतिक sialic अम्ल प्रजातियों की अभिव्यक्ति में इसी N-acyl प्रतिस्थापन ले जा । दो परीक्षण N-acyl संशोधित mannosamines के चयापचय दक्षता बदलता है । ManNProp के साथ उपचार आमतौर पर सेल की सतह पर इसी Neu5Prop की अभिव्यक्ति की ओर जाता है और Neu5Ac की एक कम अभिव्यक्ति के रूप में अच्छी तरह के रूप में Neu5Gc । अंय n-acyl संशोधित mannosamine अनुरूप, N-cyclopropylcarbamyl mannosamine की तरह, एक भी उच्च चयापचय दक्षता22है करते हैं ।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि sialic पुरोगामी polysialylation के साथ हस्तक्षेप । Polysialic एसिड लगभग विशेष रूप से NCAM पर व्यक्त कर रहे हैं । दिलचस्प है, NCAM दो अलग Golgi (ST8SiaII और ST8SiaIV) में व्यक्त polysialyltransferases द्वारा polysialylated जा सकता है । यह पता चला कि ManNProp, ManNBut, और अंय N-acyl संशोधित mannosamines polysialylation के साथ हस्तक्षेप और है कि यह मुख्य रूप से ST8SiaII14के साथ बातचीत की वजह से है । यह sialyltransferase विकास के दौरान व्यक्त किया जाता है और मस्तिष्क के विकास के लिए महत्वपूर्ण है । दिलचस्प भी, कई ट्यूमर से ंयूरॉन मूल पुनः व्यक्त ST8SiaII उनके द्रोह बढ़ रही है और आगे उंहें प्रतिरक्षा प्रणाली से undetectable बनाने३३। इसके विपरीत, ManNAc के आवेदन polySia की वृद्धि की ओर जाता है, क्योंकि यह सीएमपी-Neu5Ac की वृद्धि की ओर जाता है, जो दोनों polysialyltransferases के प्राकृतिक सब्सट्रेट है.

MGE ब्याज (जैसे, erythropoietin) के प्रोटीन पर उपंयास sialic एसिड परिचय और इस प्रकार अपने कार्य को मिलाना करने के लिए एक अनूठी विधि है । इसके अलावा, यह सेल सतह ग्लाइकोसिलेशन, जो इस तरह के कैंसर के रूप में कई रोगों में ब्याज की हो सकती है, के बाद से कई कैंसर की कोशिकाओं को sialic एसिड के उच्च स्तर को व्यक्त करने से प्रतिरक्षा प्रणाली से बचने की कोशिश का नियमन किया जा सकता है । विधि यहां प्रस्तुत की अनुमति देता है: पहले, सेल संस्कृतियों का उपयोग कर glycoengineering प्रदर्शन करने के लिए, और दूसरा, इंजीनियर glycans का विश्लेषण करने के लिए सफल glycoengineering साबित । विधि बहुत मजबूत है और अब तक, कोई नुकसान की सूचना है; इसके विपरीत, विधि को13कक्षों पर क्लिक-रसायन प्रदर्शन करने के लिए रासायनिक सक्रिय समूहों को लागू करने के लिए विस्तारित किया गया है ।

यहाँ हम aliphatic N-acyl पक्ष श्रृंखला संशोधनों के साथ दो ManNAc अनुरूप पेश करते हैं जो कि कम उपकरणों और रासायनिक संश्लेषण में कम अनुभव के साथ प्रयोगशालाओं द्वारा भी तुलना में सरल हैं । समूहों है कि कार्बनिक रसायन विज्ञान के लिए अधिक परिचित है और अधिक जटिल संरचनाओं के साथ अंय ManNAc सादृश्य संश्लेषित सकता है और तथाकथित ' bioorthogonal ' अनुरूप है, जो उपयोग किया जा सकता सहित MGE के लिए इन का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, sialylated कल्पना glycoconjugates । समीक्षा लेख है कि एन-एसिटाइल-mannosamine डेरिवेटिव है कि13दिनांक,३४को संश्लेषित किया गया है की एक सिंहावलोकन दे रहे हैं । N-azidoacetyl mannosamine (ManNAz), एक पदार्थ है कि अक्सर इस्तेमाल किया जाता है, sialylated glycans कल्पना करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है । ManNAc सादृश्य की कम झिल्ली पारगम्यता के कारण, यह सुरक्षित हाइड्रॉक्सिल समूहों के साथ इन शर्करा के डेरिवेटिव का उपयोग करने के लिए लाभप्रद हो सकता है, जैसे, peracetylated ManNAc अनुरूप. कोशिका में प्रवेश करने के बाद, रक्षा समूहों cytoplasmic esterases द्वारा सट रहे हैं, जिससे सक्रिय monosaccharides३५,३६,३७जारी । हालांकि, peracetylated ManNAc अनुरूप उच्च cytotoxicity इसी असुरक्षित डेरिवेटिव की तुलना में बेनकाब ।

इस पांडुलिपि में, हम MGE के साथ हमारे प्रयोगों के लिए अमर neuroblastoma कोशिकाओं को चुना । आम तौर पर, MGE (विशेष रूप से ManNProp और ManNBut के साथ) सेल लाइनों की एक विस्तृत विविधता में लागू किया जा सकता, अमर सेल लाइनों सहित (Wratil एट अल देखें. 13 उदाहरण के लिए) और प्राथमिक कक्ष३८,३९। इसके अलावा, MGE सफलतापूर्वक सी. एलिगेंस४०, zebrafish17,४१, माउस19,20,४२, और चूहे में vivo में sialylation को बदलने के लिए उपयोग किया गया ४३ , ४४. उपचार के समय और MGE प्रयोगों में ManNAc सादृश्यों की एकाग्रता इस पद्धति की चयापचय क्षमता को प्रभावित करने के लिए अलग किया जा सकता है । हमारे अनुभव से, अब उपचार और उच्च सांद्रता संशोधित Neu5R द्वारा glycoconjugates में स्वाभाविक रूप से होने वाली sialic अम्ल प्रजातियों के बेहतर प्रतिस्थापन के साथ अनुरूप है । यदि ManNAc डेरिवेटिव के बहुत उच्च सांद्रता के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं, उपचार के cytotoxicity का मूल्यांकन किया जाना चाहिए, जैसे, MTT परख या resazurin कमी परख द्वारा ।

इस पांडुलिपि में, हम सेल homogenization के लिए अल्ट्रा sonication का उपयोग करने का सुझाव । अंय सेल lysis तरीकों हमारी प्रयोगशाला में परीक्षण किया गया, बर्फ पर douncing सहित (लगभग २५० स्ट्रोक) और फ्रेंच प्रेस व्यवधान (१०,००० साई, 4 मार्ग), तुलनीय परिणामों के साथ sialic एसिड की मात्रा के बारे में नमूनों में पता चला । अल्ट्रा ध्वनि homogenization का लाभ यह है कि यह कम समय की जरूरत है और lysis करने से पहले नमूनों को DNAase के अलावा की आवश्यकता नहीं है ।

हम कोशिका lysates के झिल्ली अंशों पर हमारे विश्लेषण ध्यान केंद्रित है, क्योंकि हम झिल्ली बंधे glycoconjugates के sialylation में परिवर्तन दिखाना चाहता था । Sialic एसिड डेरिवेटिव और उनकी सांद्रता भी कोशिकाओं के cytosol में मापा जा सकता है, के बाद झिल्ली अंश उच्च गति केंद्रापसारक द्वारा अलग किया गया है, ऊपर वर्णित के रूप में एक ही विधि का उपयोग कर । हालांकि, cytosol में sialic एसिड की सांद्रता कोशिका झिल्ली पर sialic एसिड अभिव्यक्ति की तुलना में 100x कम करने के लिए कर रहे हैं7. इस प्रकार, कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में विश्वसनीय परिणाम उत्पंन करने की जरूरत है । cytosolic के पूल, सक्रिय सीएमपी-sialic एसिड पूर्व से मापा जा सकता है अप्रत्यक्ष रूप से borohydride7,४५से पहले सोडियम hydrolysis के साथ सेल lysates के cytosolic भागों इलाज । आदेश में हाइड्रॉक्सिल संशोधनों के साथ glycoconjugates और sialic एसिड में sialic एसिड hydrolyze करने के लिए, कोशिकाओं 1 मीटर TFA के साथ मशीन थे । अंय अंलीय समाधान hydrolysis के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से, जैसे, 2 एम propionic एसिड, 2 एम एसिटिक एसिड, या 1 एम एचसीएल ।

HPLC विश्लेषण के दौरान एक संभव सामना करना पड़ा मुद्दा यह है कि ब्याज की चोटियों अपरिभाषित चोटियों के साथ ओवरलैपिंग कर रहे हैं । यह विशेष रूप से समस्याग्रस्त है जब एक नमूने में sialic एसिड की मात्रा एक निश्चित चोटी के वक्र के तहत क्षेत्र द्वारा गणना की जानी है । एक अपरिभाषित चोटी से ब्याज की एक चोटी को अलग करने के लिए, HPLC विलायक में acetonitrile एकाग्रता समायोजित किया जा सकता है (± 3%) । हम HPLC विश्लेषण के लिए स्थिर विलायक सांद्रता का उपयोग सुझाव है, क्रोमैटोग्राफी से पहले विलायक मिश्रण तैयार करने का लाभ दे रही है । इसलिए, हमारे विधि केवल एक HPLC पंप की आवश्यकता है और विभिंन HPLC प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए व्यवहार्य है । यदि एक से अधिक पंप HPLC प्रणाली में उपलब्ध है, acetonitrile की सांद्रता में वृद्धि के साथ एक isocratic ढाल लागू किया जा सकता है, जैसे, ३५ मिनट४५में 4-9% । इस तकनीक का उपयोग करके, कुछ HPLC चोटियों के प्रतिधारण समय काफी बदल जाएगा । यह रणनीति भी अतिव्यापी चोटियों की बेहतर जुदाई को प्राप्त करने में मदद कर सकते हैं । मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर desorption ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मालदी-ms) सफलतापूर्वक सेल सतह पर संशोधित sialic एसिड प्रजातियों की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए स्थापित किया गया था४५, और इस प्रकार ईएसआई-एमएस विधि यहां प्रस्तुत करने के लिए एक समकक्ष के रूप में कार्य करता है .

ManNAc अनुरूप और इन derivates के hydrophilicity के लिए विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों की कमी के कारण४६, इन यौगिकों के साथ MGE प्रयोगों में उच्च सांद्रता की जरूरत है । इसलिए, अप में पैमाने पर प्रयोगों और, विशेष रूप से vivo में परीक्षणों में, संबंधित ManNAc अनुरूप की बड़ी मात्रा में इस तकनीक की एक संभव सीमा दिखा आवश्यक हैं. दूसरी ओर, सेल लाइनों के आधार पर इस्तेमाल किया, इलाज कोशिकाओं की एक निश्चित ंयूनतम संख्या HPLC विश्लेषण में विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । हमारे अनुभव से, के बारे में न्यूनतम १००,००० अनुयाई कोशिकाओं या १५०,००० निलंबन कोशिकाओं (एक ९६-धाराप्रवाह कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से प्लेट के 1-2 कुओं) के लिए पर्याप्त है । यह एक अड़चन बन सकता है, यदि विश्लेषण के लिए है स्वतः, स्क्रीनिंग के दृष्टिकोण में उदाहरण के लिए ।

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत तरीकों के साथ sialic एसिड और उसके डेरिवेटिव सेल lysates में इसका पता लगाया जा सकता है । हालांकि, संरचना और ManNAc डेरिवेटिव के साथ इलाज कोशिकाओं में glycoconjugates के संयोजन के साथ इस बारे में वर्णित तकनीक का आकलन नहीं किया जा सकता । glycoconjugates की संरचना का समाधान, जैसे, एनऔर -glycans, आम तौर पर अधिक से अधिक अनुभव और एक glycomics सुविधा४७की आवश्यकता है । हमारे ज्ञान के लिए, अभी तक, कोई डेटा कोशिकाओं है कि ManNAc अनुरूप के साथ इलाज किया गया है से glycoconjugates की अलग संरचना पर उपलब्ध हैं ।

polysialic एसिड का पश्चिमी दाग विश्लेषण एक बहुत तेजी से और आसान तरीका है । हालांकि, इस पद्धति द्वारा प्राप्त डेटा मात्रात्मक नहीं हैं, क्योंकि पता लगाने एंटीबॉडी और chemiluminescence का उपयोग करता है. इसलिए, HPLC तरीकों का उपयोग पश्चिमी सोख्ता पर एक फायदा है । फिर भी, हम immunoblotting विधि का उपयोग सुझाव है, क्योंकि यह आसान है लागू करने के लिए और बहुत मज़बूती से काम करने के लिए जाना जाता है ।

कोशिका की सतह पर sialic अम्ल की अभिव्यक्ति को MGE के अलावा अन्य विधियों द्वारा भी बदला जा सकता है. जैसा कि ऊपर वर्णित है, कोशिकाओं sialidase, एक एंजाइम है कि एक अपेक्षाकृत विशिष्ट तरीके से glycoconjugates से sialic एसिड अवशेषों से सट के साथ इलाज किया जा सकता है । Sialidase उपचार फलस्वरूप इलाज कोशिकाओं में hyposialylation लाती है । दुर्भाग्य से, sialidase उपचार एक बल्कि सीमित तकनीक है, क्योंकि यह साइटोटोक्सिक है, लंबे समय तक इलाज के लिए व्यवहार्य नहीं है, और vivo प्रयोगों में लागू नहीं है । कोशिकाओं में hyposialylation प्रेरित करने के लिए एक और तकनीक sialic एसिड के अवरोधकों का उपयोग करके है । अवरोधकों की एक किस्म उपलब्ध है कि या तो sialic एसिड के प्रमुख एंजाइम को लक्षित संश्लेषण, UDP-n-acetylglucosamine-2-epimerase/n-acetylmannosamine-कळेनासे (्ेने/MNK), या sialyltransferases6के समूह, 7,8,४८. इन यौगिकों में से एक, एक C3-fluorinated sialic एसिड अनुरूप, sialic एसिड की अभिव्यक्ति में रहने वाले चूहों को कम करने के लिए दिखाया गया था४९. पशु इस पदार्थ के साथ इलाज किया, तथापि, जिगर ख़राबी दिखाया, अपरिवर्तनीय गुर्दे रोग, और४९कामयाब करने के लिए विफलता. इन परिणामों जिगर और गुर्दे समारोह में Neu5Ac की महत्वपूर्ण भूमिका की पुष्टि करें और आगे vivo प्रयोगों में के लिए sialylation अवरोधकों की सीमा का संकेत है । बदल कोशिका सतह sialylation के साथ कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक तीसरी विधि एंजाइमों कि sialic एसिड के लिए महत्वपूर्ण हैं की अभिव्यक्ति के साथ हस्तक्षेप द्वारा है. उदाहरण के लिए, ्ेने/MNK का एक नॉक-डाउन, hyposialylated 9इन कक्षों को रेंडर करने के लिए दिखाया गया था । संभावना अपेक्षाकृत आसानी से दस्तक में और बाहर सेलुलर में जीन और उपंयास का उपयोग कर vivo में और अच्छी तरह से मांयता प्राप्त CRISPR-Cas9 तकनीक उपंयास sialic एसिड के संबंध में खोजों के लिए नेतृत्व कर सकते है संश्लेषण और कोशिका की सतह sialylation ।

MGE का लाभ यहां वर्णित तकनीकों की तुलना में, यह है कि इसे लागू करने के लिए आसान है और एक अलग प्रयोगों के असंख्य करने के लिए अनुकूलनीय से, इन विट्रो परीक्षणों से सेल पर आधारित परख और vivo में प्रयोगों । सेल नमूनों में भिन्न sialic अम्ल प्रजातियों की अभिव्यक्ति और सांद्रता को मापने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति उच्च प्रदर्शन आयनों-exchange क्रोमैटोग्राफी (HPAEC) के साथ स्पंदित विद्युत डिटेक्शन५०द्वारा किया जाता है । इस विधि का उपयोग करके, sialic एसिड की अभिव्यक्ति सीधे मापा जाता है और एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल करने के बाद नहीं. इस विधि का लाभ यह है कि यह भी sialic एसिड और सेल में अपने डेरिवेटिव और प्रोटीन के नमूनों के अलावा अंय monosaccharides का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । दुर्भाग्य से, DMB-sialic एसिड की fluorometric डिटेक्शन की तुलना में HPAEC की संवेदनशीलता कम है । इस प्रकार, HPAEC बड़े नमूना मात्रा५१की उपलब्धता के साथ प्रयोगों तक सीमित है ।

इस स्पेसिफिकेशंस बताए गए तरीके glycoconjugates की अज्ञात विशेषताओं को प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । MGE के उपयोग के लिए उदाहरण के एक भीड़ sialic एसिड निर्भर बातचीत की जांच करने के लिए पहले से ही13मौजूद है, प्रयोगात्मक setups की एक विस्तृत श्रृंखला के संदर्भ में इस तकनीक की व्यवहार्यता दिखा ।

आजकल, MGE के साथ N-acetylmannosamines मुख्य रूप से glycobiology के क्षेत्र में शोधकर्ताओं द्वारा प्रयोग किया जाता है । हमें उंमीद है कि इस तकनीक को glycoconjugates संशोधित करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में एक व्यापक दर्शकों द्वारा मांयता प्राप्त हो जाएगा । इम्यूनोलॉजी, वायरोलॉजी, न्यूरोलॉजी, या कैंसर विज्ञान सहित अन्य क्षेत्रों, अपने स्वयं के प्रयोजनों के लिए इस तकनीक के अनुकूल द्वारा लाभ होगा । इस तरह के पार अनुसंधान अभी तक अज्ञात क्षेत्रों की खोज में सक्षम हो सकता है, और इसलिए स्वास्थ्य और रोग की एक बेहतर समझ दे । प्रारंभिक अध्ययन में, उदाहरण के लिए, इस तकनीक संशोधित ग्लाइकोसिलेशन, जो बाद में vivo टीकाकरण में के लिए सेवा के साथ नच का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । कुछ मामलों में, इस तरह के glycoengineered टीके के साथ उपचार एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए सीसा कि संबंधित लक्ष्यों को उन्नत avid और विषाक्तता उजागर५२,५३. दूसरों को सफलतापूर्वक चूहों५४में लक्षित ट्यूमर थेरेपी के लिए एक मॉडल विकसित करने के लिए MGE इस्तेमाल किया । एक अंय अध्ययन से पता चला है कि ManNProp के vivo इंजेक्शन में प्रणालीगत तंत्रिका पुनर्जनन५५पदोंनत । polySia के मामले में यह दर्शाया गया कि इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधियों द्वारा neuroblastoma कोशिकाओं में इस epitope की अभिव्यक्ति को कम करने, विरोधी औषधियों के साथ विकिरण या उपचार करने के लिए इन ट्यूमर कोशिकाओं की संवेदनशीलता को बढ़ाता है५६.

नमूनों के भीतर मापा sialic एसिड की मात्रा इलाज कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया विधि के आधार पर अलग हो सकता है. इस पांडुलिपि में, trypsin के साथ गर्मी कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । अन्य तकनीकों का इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे हैं, जैसे कि पंजाबियों + EDTA के साथ कोशिकाओं या लंबे समय से इलाज स्क्रैप, नमूनों में मापा sialic एसिड की मात्रा अलग हो सकता है. यहां तक कि trypsin के साथ मशीन समय अनुकूली sialic एसिड सांद्रता पर बाद में मापा पर एक प्रभाव हो सकता है । हमारे अनुभव से, sialic एसिड मापा की मात्रा पर सेल टुकड़ी विधि का प्रभाव 15% से नीचे है, लेकिन अगर परिणाम के लिए सामान्यीकृत और तुलना कर रहे हैं, यह एक महत्वपूर्ण अड़चन बन सकता है । साथ ही, lysis कक्षों के लिए विधि HPLC विश्लेषण के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रकार, हम पाठक को अपने प्रयोगों में कोशिका टुकड़ी और lysis का मानकीकरण करने की सलाह देते हैं.

कोशिका lysates में झिल्ली अंश की जुदाई को प्राप्त करने के लिए, हम २०,००० x g और 4 ° c (धारा ५.१) में 2 घंटे के लिए केंद्रापसारक का इस्तेमाल किया । अंय केंद्रापसारक प्रोटोकॉल जुदाई को प्रभावित और इसलिए sialic एसिड की मात्रा के नमूनों में पता चला सकता है । इस प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण यौगिक DMB है, क्योंकि यह बहुत प्रकाश और समय के साथ नीचा के प्रति संवेदनशील है । यहां हम DMB-समाधान के छोटे भागों aliquot की सिफारिश की है और स्टॉक के रूप में यह स्टोर-20 ° c, प्रकाश से सुरक्षित (धारा 1.6.1) । इस तरह DMB-समाधान कई हफ्तों के लिए संग्रहित किया जा सकता है । यदि DMB-HPLC विश्लेषण से परिणाम sialic अम्ल प्रजातियों के लिए कम संकेतों दिखाने या HPLC माप के पहले 6 मिनट के भीतर संकेतों में वृद्धि, DMB और इसकी प्रतिक्रिया उत्पादों का प्रतिनिधित्व, नई DMB-समाधान तैयार किया जाना चाहिए । फिर से फ्रीज न करें और इसे गल जाने के बाद फिर से DMB-सॉल्यूशन का इस्तेमाल करें । DMB लेबलिंग के बाद, सभी नमूनों का तुरंत विश्लेषण किया जाना चाहिए । नमूनों की बड़ी संख्या (> 10) का विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, इन नमूनों छोटे बैज में विभाजित किया जाना चाहिए और धीरे-DMB के साथ लेबल. दोनों लेबलिंग प्रतिक्रिया के साथ ही DMB-लेबल जांच हर समय प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए । रेफरेंस के बाद DMB-लेबल्ड sialic एसिड प्रजाति का तुरंत विश्लेषण किया जाना चाहिए ईएसआई-एमएस के साथ HPLC के डायरेक्ट युग्मन ईएसआई-एमएस सिस्टम (एक नियंत्रण रेखा-ईएसआई-एमएस सेटअप में) आवश्यक नहीं है, लेकिन उच्च गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए लाभप्रद हो सकता है जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

पांडुलिपि को ठीक करने और फलदायक चर्चाओं के लिए हम एल. डी. गुयेन को धन्यवाद देते हैं । इसके अलावा, हम हमें वीडियो शूट की तैयारी में मदद करने के लिए जे Dernedde और एच. जी. गुयेन धन्यवाद । वीडियो के ज्यादातर सीन्स आर टाउबर की प्रयोगशालाओं में फिल्माए गए थे । हम भी colloids और इंटरफेस के लिए मैक्स प्लैंक संस्थान धंयवाद, और हमें उनके जन स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा के लिए स्वतंत्र पहुंच देने के लिए । आरएच DFG (प्रोमो) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

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