Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sialik asit (SIA) glycoconjugates, N- ve O- glukanlardir veya glikolipitler gibi son derece önemli bir kurucu olduğunu. Sigara azaltarak termini adlı oligo - ve polisakkaritler, aynı zamanda benzersiz kimyasal özellikleri onun konumunu nedeniyle çok sayıda farklı Reseptör-ligand etkileşimleri sialik asit ilgilenmektedir. Sialik asit hücre yüzeyinde ifade değiştirerek, sialik asit bağımlı etkileşimleri sonuç olarak etkilenir. Bu sialik asit bağımlı etkileşimleri araştırmak yararlı olabilir ve bazı hastalıklara yararlı bir şekilde etkilemek için bir potansiyele sahiptir. (MGE) metabolik glycoengineering sialik asit hücre yüzeyinde ifade modülasyonlu. Burada, hücre, doku veya hatta tüm hayvanlar N- acetylmannosamine (ManNAc) C2-modified türevleri ile tedavi edilir. Bu amino şeker sialik asit öncül molekül olarak hareket ve bu nedenle ilgili sialik asit tür metabolize edilir ve glycoconjugates üzerinde dile getirdi. Bu yöntemi uygulayarak çeşitli biyolojik süreçleri ilginç etkiler üretir. Örneğin, bu ifade polysialic asit (polySia) tedavi nöronal hücre önemli ölçüde azaltır ve böylece nöronal büyüme ve farklılaşma etkiler. İşte, N- butanoylmannosamine (ManNBut), yanı sıra iki en yaygın C2-modified N- acylmannosamine türevleri, N- propionylmannosamine (ManNProp) kimyasal sentez göstermektedir ve daha fazla nasıl bu doğal olmayan göster amino şeker hücre kültür deneylerde uygulanabilir. Ifade değiştirilmiş sialik asit türlerin yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) sayılabilir ve kütle spektrometresi ile daha fazla analiz. Polysialic asit ifade üzerinde etkileri bir piyasada bulunan polysialic asit antikor kullanarak Western blot yolu ile aydınlatılmamıştır.

Introduction

Sialik asit glycoconjugates, N- ve O- glukanlardir veya glikolipitler gibi sigara azaltarak termini genellikle bulunabilir bir yaşam var. Tüm bol arasında sialik asit bazı benzersiz kimyasal özelliklere sahiptir. C-5 bulunduğu bir 9 C-atom omurga, karboksilik grubu deprotonated ve böylece olumsuz altında ücret fizyolojik şartlarda C-1 pozisyonda ve amino bir işlevi vardır. Sialik asit türevleri doğal olarak meydana gelen 50'in üzerinde tarihi1olarak nitelendirmiştir rağmen en baskın sialik asit insanlarda bulunan N- asetilnöraminik asit (Neu5Ac) biçimidir. Diğer memeliler de N- glycolylneuraminic asit (Neu5Gc)2,3daha yüksek miktarda hızlı.

Glycoconjugates nedeniyle maruz konumunu, sialik asit reseptör-ligand etkileşimleri, Örneğin, ana bilgisayar hücreleri4grip virüsü hemagglutinin bağımlı bağlantısını bir bolluk ilgilenmektedir. Sialik asit epitope önemli biyolojik fonksiyonları, özellikle sırasında embriyo ve sinir sisteminde polysialic asittir. Polysialic asit 200 alfa 2,8 bağlı sialik asit bir polimerdir. Polysialic asit büyük protein taşıyıcı sinir hücre adezyon molekülü (NCAM) olduğunu. Polysialic asit ifade yapışma azalır ve plastisite sinir sistemi5ile artar Polysialic asit ifade NCAM yapışkanlı mülkiyeti modüle.

Değişiklikler (poli) sialik asit ifadesi sonuçta bir çok farklı biyolojik etkileşimlerin etkiler. Bu bilinen sialik asit bağımlı işlemler roman glycoconjugate etkileşimleri ortaya çıkarmak veya olası tedavi edici yaklaşımlar keşfetmek için moleküler düzeyde eğitim için kullanılabilir. Farklı yöntem kullanılabilir örneğin sialik asit belirli glycosidases (sialidases), enzimler sialik asit biyosentezi6 dahil inhibisyonu ile tedavi hangi sialik asit hücre yüzeyinde ifade modülasyonlu, vardır ,7,8, ya da vurma veya anahtar enzim sialik asit biyosentezi9ifade değiştirme.

Sialik asit ifade modüle için başka bir çok yönlü MGE (olarak da bilinen metabolik oligosakkarit mühendislik, MOE) yöntemidir. Burada, hücre, doku veya hayvanlar için bile C2-amino değişiklikleri taşıyan doğal olmayan türevleri ManNAc ile tedavi edilir. Habercisi moleküller sialik asit, sonra hücresel alımını olmak, bu ManNAc analogları tek yönlü doğal olmayan metabolize sialik asit vardır ve sialylated glycoconjugates ifade edilebilir. ManNProp veya ManNBut, dahil N- propionylneuraminic asit (Neu5Prop) veya N- butanoylneuraminic asit (Neu5But) onların glycoconjugates10 olarak hücreleri Alifatik C2-değişiklikler, taşıma ManNAc türevleri ile kabul edilir , 11. fonksiyonel ManNAc C2-pozisyon tanıttı gruplarını kullanarak, meydana gelen doğal olmayan sialik asit birleştiğinde olabilir, mesela Staudinger ligasyonu veya floresan boyalar ile azid alkine cycloaddition üzerinden ve bu nedenle hücre yüzey12görüntülenir.

Bu doğal olmayan sialik asit ifade patojen enfeksiyonlar, yapışma ve göç tümör hücreleri, genel hücre adezyon, yanı sıra vaskülarizasyon ve farklılaşma (gözden geçirme için de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçleri üzerinde ilginç etkileri vardır bkz: Wratil vd. 13). İlginçtir, MGE ile N-modifiye asil mannosamines polysialic asit ifade ile müdahale için de kullanılabilir. Polysialic asit tarafından iki farklı polysialyltransferases (ST8SiaII ve ST8SiaIV) oluşturulur. Bu göstermiştir, bu polysialyltransferase ST8SiaII ManNProp veya ManNBut14,15gibi doğal olmayan sialik asit öncüleri tarafından engellenir. Buna ek olarak, bu insan Nöroblastom hücrelerde ManNProp veya ManNBut uygulaması da toplam15sialylation azalttığı gösterilmiştir.

MGE ile N-modifiye asil mannosamines başarılı bir şekilde, sadece memeli ve bakteri hücre kültürü Caenorhabditis elegans16gibi farklı türlerin tüm hayvanlarda aynı zamanda kullanılmıştır yöntemi uygulamak kolay bir şey Zebra balığı17, ya da fareler18,19,20,21. Özellikle ManNProp ve ManNBut, dahil olmak üzere Alifatik değişiklik taşıyan ManNAc türevleri negligibly sitotoksik hücre kültür orta veya kan plazması millimolar konsantrasyonlarda bile. Ayrıca, onlar sentez nispeten kolaydır.

Burada, MGE Nile kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak-asetil değiştiren mannosamines. İlk olarak, iki ManNProp ve ManNBut, bu alanda en yaygın olarak kullanılan ManNAc türevlerinin kimyasal sentez açıkladı. Daha sonra biz MGE vivo içinde deney uygulanabilir nasıl gösterir. Örnek olarak, Nöroblastom hücre kültürünü Kelly seçildi polysialic epitope azalmış ifade göstermek için tarafından Western blot tedavi ManNAc türevleri ile sonra. Doğal olmayan sialik asit hücre yüzeyinde HPLC tarafından sayısal ve daha fazla kütle spektrometresi ile analiz edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlanması arabellekleri ve Kimyasalları

  1. 3 mM sodyum methoxide çözüm hazırlanması
    1. 8.1 mg sodyum methoxide 50 mL metanol (3 mM) içinde bir heyecan çizgiyle 100 mL cam şişede geçiyoruz. Oda sıcaklığında (RT) birkaç hafta için saklayın.
  2. Tris-HCl tampon hazırlanması
    1. 8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl ve 146 mg 100 mL cam şişe içinde EDTA bir heyecan bar ile birleştirin ve 80 mL suda çözülür.
    2. Sodyum hidroksit (suda 1 M) veya HCl (suda %20) karıştırma, pH metre ile pH kesilmediğini gözleyerek ekleyin ve 8,0 pH ayarlayın.
    3. 100 mL son hacmi elde etmek için gereken su hacmi ekleyin. 0,22 µm steril filtre sistemi kullanarak çözüm filtre.
      Not: 100 mL Tris-HCl tampon 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl ve 5 mM EDTA (pH 8.0) içerir. Çözüm 4 ° C'de birkaç hafta saklanır.
  3. Aprotinin çözüm hazırlanması
    1. 10 mg aprotinin (1.54 mM) 1 mL suda çözülür. Aliquot 10 x 1,5 mL-plastik tüpler (100 µL her) aprotinin çözümde. -20 ° C'de birkaç hafta için saklayın.
  4. Leupeptin çözüm hazırlanması
    1. 10 mg leupeptin (10 mM) 2 mL suda çözülür. Aliquot leupeptin çözüm 10 x 1,5 mL-plastik tüpler. -20 ° C'de birkaç hafta için saklayın.
  5. Phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) çözüm hazırlanması
    1. 34.8 mg PMSF 2 mL etanol (100 mM) geçiyoruz. Aliquot PMSF çözüm 10 x 1,5 mL-plastik tüpler içinde. -20 ° C'de birkaç hafta için saklayın.
  6. 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB) çözüm hazırlanması
    1. 15.62 mg DMB, 352 µL β-mercaptoethanol ve 48 µL Sodyum bisülfit-çözüm (% 39) birleştirin ve 9,6 mL su (6,9 mM DMB, 500 mM β-mercaptoethanol ve %0.19 Sodyum bisülfit) ekleyin. Aliquot 40 x 1,5 mL-plastik tüpler (250 her µL) DMB çözümde. Mağaza için birkaç hafta ışık-20 ° C'de korunuyorsunuz.
  7. 1 M trifluoroacetic asit (TFA) çözüm hazırlanması
    1. % 100 770.3 µL eklemek TFA bir 15 mL plastik tüp (1 M) 9,23 mL su için. Birkaç hafta için 4 ° C'de depolayın.
  8. 120 mM TFA çözüm hazırlanması
    1. 92,4 µL TFA (% 100) 9.91 mL suda 15 mL plastik tüp (120 mM) ekleyin. Birkaç hafta için 4 ° C'de depolayın.
  9. 400 mM sodyum hidroksit (NaOH) çözüm hazırlanması
    1. 160 mg 15 mL plastik tüp 10 mL su (400 mM) NaOH geçiyoruz. Birkaç hafta için 4 ° C'de depolayın.
  10. Western blot lizis arabellek hazırlanması
    1. Dağıtılması 5,84 g NaCl, 0.1 g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 0.1 g CaCl2, 0.95 g MgCl2ve 1 g Triton-X100 100 ml su ve pH 7.8 için ayarlayın. 4 ° C'de mağaza Her proteaz inhibitörü (aprotinin, leupeptin ve PMSF) 100 µL lizis arabellek kullanmadan önce ekleyin.
  11. Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) arabellek hazırlanması
    1. 0.3 g Tris, 1.5 g glisin ve 0.1 g SDS 100 mL suda çözülür ve pH 7,3 için ayarlayın. Mağazada RT.
  12. Western blot arabellek hazırlanması
    1. 0.3 g Tris, 1.1 g glisin 90 mL suda çözülür ve 10 mL etanol ekleyin. Mağazada RT.
  13. Hazırlık çözüm engelleme
    1. Yağlı ücretsiz süt güç 25 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 g geçiyoruz. Her zaman taze hazırlayın.

2. ManNProp ve ilgili Nsentezi-asil-Mannosamines modifiye

  1. 431.2 mg mannosamine hidroklorid çözümde 10 mL 3 mM sodyum methoxide 50 mL cam şişe bir heyecan çizgiyle geçiyoruz.
  2. Buz 0 ° c üzerinde karışımı serin Karıştırma, yavaş yavaş dropwise 210 µL propionyl klorür (2.4 mmol) veya ManNProp veya ManNBut, sırasıyla sentez 248 µL butanoyl klorür (2.4 mmol) ekleyin. 0 ° C 4 h için karıştırma karisimin kuluçkaya.
  3. Çözüm 50 mL plastik tüpün içine aktarın. 4-8 delik plastik tüp kapağı ince bir iğne ile poke. Hızla sıvı nitrojen kullanarak çözüm donma ve daha sonra lyophilize (dondurma kuru) bu 48 h veya kadar tamamen kurudu.
  4. 350 g silikon jel 60 750 mL Etil-asetat/metanol / (Bu bir süspansiyon) mix su ile (15:2:1). Bir cam sütun (35 mm çap ve 70 cm uzunluk) silika jel 60 süspansiyon ile doldurun ve bir ek 100 mL Etil asetat/metanol/su (15:2:1) ile hazırlanmış sütun kullanmadan önce yıkayın.
  5. Adım 2.3 kurutulmuş Urun dağıtılması (5 g kurutulmuş ürün) 10 mL Etil asetat/metanol/su (15:2:1) ve yük bir pipet silis üzerine kullanarak sütun jel. 4 mL kesirler sonra 500 mL (ManNProp için) toplamak. Not: ManNBut sütundan sonra yaklaşık 700 mL elute.
  6. Eluted kesirler 15 mL plastik tüpler içine aktarın. 3-6 delik plastik tüp kapağı ince bir iğne ile poke. Hızlı sıvı nitrojen kullanarak çözüm donma ve daha sonra tamamen kurudu kadar lyophilize.
    Not: Lyophilized ürünleri RT. birkaç ay depolanabilir
  7. Saflık Ürünler Kütle spektrometresi (bakınız Bölüm 9) doğrulayın.
    Not: Alternatif olarak, saflık da 1tarafından H Nükleer manyetik rezonans (NMR) doğrulanabilir.

3. hücre kültürü

  1. Kültür Kelly Nöroblastom Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta % 10 fetal sığır serum, 100 U penisilin, 100 mg streptomisin, 2 mM L-glutamin içeren 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp veya 5 mM ManNBut, 37 ° C ve % 5 CO2içeren hücrelerde.
    Not: Orta ManNAc veya kendi analogları olmadan kültürlü hücreler bir denetim olarak kullanılır.
  2. Mannosamines uygulanması önce onları tripsin/EDTA (% 0.25, %0.02, PBS) ile 10 min için kuluçka Kelly Nöroblastom hücre bağlantısını kesin ve Neubauer-odası veya hücre sayaç saymak. Tohum hücreleri tanımlanmış numaralarından plaka/çanak boyutuna bağlı.
    1. Sialik asit bol ölçmek için 1 x 105 500 µL orta hücrelerde bir 48-iyi doku kültürü tabak tohum. Polysialic asitler analiz için 1 x 106 6 cm çapında hücre kültür çanak 3 mL ortamına hücrelerde tohum. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya. Her 24 h orta yerine.
      Not: Tedavi toplam süresi ile MGE etkisini artırır. Yüksek metabolik verimlilik için 5-7 gün için hücreleri tedavi.
  3. Kullanımdan sonra orta dikkatle boşaltmak. PBS ile plakalar/bulaşıkları yıkamak. Hücreleri onları tripsin/EDTA (% 0.25, %0.02, PBS) ile 10 min için kuluçka bağlantısını kesin. Tripsin müstakil hücrelere hücre kültür orta aynı hacmi ekleyerek etkisiz hale getirin. Müstakil hücreleri 15 mL plastik tüpler içine aktarın. Örnekleri için 500 x g de 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    1. (Bkz. Adım 3.3) 5 mL PBS ve santrifüj hücreleri ekleyin. Yıkama işlemi iki kez daha tekrarlayın.
      Not: Yıkanmış hücre Pelet süpernatant olmadan birkaç gün için-20 ° C'de muhafaza edilebilir. Polysialic asit ifade aydınlatılmamıştır için ise 10 bölümüne gidin.

4. hücre lizis HPLC analiz için

  1. HPLC lizis arabellek hazırlanması
    1. 5 mL Tris-HCl tampon, 5 µL aprotinin çözüm, 20 µL leupeptin çözüm ve 50 µL PMSF çözüm birleştirir.
      Not: 5 mL HPLC lizis arabellek 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1.54 µM aprotinin, 40 µM içerecektir Leupeptin ve 1 mM PMSF (pH 8.0). Bu arabellek her zaman taze hücre lizis önce hazırlanmalıdır.
  2. Toplanan hücre granül (Adım 3.3) her 500 µL buz gibi HPLC lizis-arabellekte yeniden askıya alma ve ultra-örnekleri bir ultra sonik işlemci iğne ile üç kez bir süre 30 için solüsyon içeren temizleyicide orta-yüksek genlikleri s. Örnekleri için en az 1 dk döngüleri arasında buzda ne yapıyorsun?

5. membran kesir ayrılması

  1. 20.000 x g ve 4 ° c 2 h lysed hücre örnekleri santrifüj kapasitesi 1.5 mL plastik tüpler sitozolik protein temsil eden süpernatant (yaklaşık 480 µL), ayırın. Kullanarak, örneğin, Bradford veya bicinchoninic asit (BCA) tahlil bu kesirler protein konsantrasyonu belirlemek.
    Not: Sitozolik kesirler protein konsantrasyonu (yaklaşık 1 mg/mL) daha sonra saygın sialik asit türü ölçülen miktarlarda ilgili olabilir. Pelet 6.1 adımda kullanılan membran kesir temsil eder.

6. asidik hidroliz

Not: Oligo - ve hücre zarlarında polisakkaritler için bol hidrolize. Ayrıca, olası O-bol olarak değişiklikleri hidrolize, de. Sialik asit membran kesirler ezici çoğunluğu doğal olarak glycoconjugates içinde dahil edilmiştir ve muhtemelen Oayı olabilir kantitatif HPLC analiz için gerekli olmasıdır-asetil ya da O- lactolyl değişiklikler.

  1. 150 µL 1 M eklemek TFA-çözüm için ayrılmış membran kesirler (Pelet bölümünden 5). Örnekleri 200-600 devir / dakikada sallayarak ile 80 ° C 4 h için kuluçkaya.
  2. Yaklaşık 30 dakika 20.000 x g ve üst aşama birim daha az 20 µL olana 3 kDa dışlama membranlar ile 0.5 mL filtre tüpler kullanarak 21 ° C için örnekler santrifüj kapasitesi.
    Not: Bu adım daha yüksek moleküler enkaz imha etmek önemlidir.
  3. 2 mL plastik tüpler içine sialik asit türler de dahil olmak üzere daha küçük moleküller içeren alt aşaması aktarın. 2-4 delik plastik tüpler kapaklar ince bir iğne ile poke. Hızlı sıvı nitrojen kullanarak örnekleri donma ve sonra onları bir gecede lyophilize.
    Not: Kurutulmuş örnekleri RT. Değiştir bir kap delik olmadan, birkaç gün daha uzun depolama için saklanır.

7. floresan etiketleme

  1. Kurutulmuş örnekleri 10 µL 120 mM TFA çözümde yeniden askıya alma ve 50 µL DMB çözüm ekleyin. Örnekleri ultraviyole ışık onları korumak için karanlık 1,5 mL tüpler içine aktarın.
  2. Standartları için 1 µL çözülür Neu5Ac (60 ng/mL, su) veya 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, su) 10 µL 120 mM TFA çözüm karanlık 1,5 mL tüpler içinde. 50 µL DMB çözüm ekleyin.
  3. Hücre zarının örnekleri kuluçkaya ve 1,5 saat 56 ° c standartları ışıktan korunan. Kuluçka sonra etiketleme reaksiyonu durdurmak için her bir örneği için 4 µL 400 mM NaOH çözüm ekleyin.

8. HPLC analiz

Not: Etiketli örnekleri C18 RP sütun ile donatılmış bir HPLC sistemi analiz edilir (110 Å, 3 µm partikül büyüklüğü 4.6 x 150 mm), Floresans dedektörü ve kesir toplayıcı. Kullanılan çözücüler metanol, Asetonitril ve su vardır. HPLC sistemi dahili bir degasser yoksa ölçümler önce tüm çözücüler degas emin olun.

  1. Sütun sıcaklık 40 ° C ila ayarlayın ve floresan dedektörü ile 373 yapılandırmak için uyarma ve 448 nm nm için emisyon, sırasıyla. 10 µL numune hacmi enjekte ve metanol/Asetonitril/su (6:8:86) olarak eluent ile 50 dk az 0.5 mL/dk akış hızı probları ayrı. Kütle spektrometresi analiz için faiz doruklarına toplamak.
    Not: Neu5Gc 6-8 min, 9-12 dakika, 17-23 dk sonra Neu5Prop ve 38-44 dakika sonra Neu5But sonra Neu5Ac sonra eluate için bekleniyor. Fraksiyonlara örnekleri için birkaç h ışıktan korunan 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
  2. Her örnek ölçme sonra sütun için 7.5 dak 1.0 mL/dk akış hızı (≈ 1.5 sütun birimler) metanol/Asetonitril/su (6:25:69) ile yıkama ve 1.0 mL/dk akış hızı metanol/Asetonitril/su (6:8:86) ile 7.5 dakika için sistemi yeniden equilibrate.
  3. Kantitatif analiz için ilgili HPLC sistemi22işletim yazılımı kullanarak faiz sialik asit doruklarına eğri altındaki alan hesaplamak.
    Not: Elde edilen veri Neu5Ac veya Neu5Gc standart ve ölçülen protein konsantrasyonları sitozolik kesirler (bakınız Bölüm 5.1) ilgili olabilir.

9. sialik asit bol kütle spektrometresi analizleri

Not: HPLC saklama doruklarına ilgi daha fazla sıvı Kromatografi (LC) electrospray-iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS), tarafından doğal olmayan sialik asit türler doğrulamak için analiz edilebilir.

  1. Kütle spektrometresi analiz için toplanan örnek 20 µL %79.9 metanol, % 20 izopropil alkol ve %0,1 formik asit eluent, 0.5 mL/dk akış hızı, 4 kV kapiller gerilim ve kapiller 350 ° C sıcaklık ile bir LC/kütle seçici dedektörü (MSD) sistemi içine enjekte 22 , 23.
  2. Değerlendirme yazılım ilgili LC/MSD sistem, toplam iyon Kromatografik ilgi zirvesine seçin. Çözümlenmiş tepe kütle spektrumu görüntüleyin. 300 ve 700 arasındaki olumlu kütle/şarj oranı görüntüler.
    Not: DMB sialik asit etiketleme 116.2 g/mol moleküler kütlesi bir artışa yol açar. DMB etiketli sialik asit türü aşağıdaki moleküler kütlesi var: DMB-Neu5Ac 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g = / moleküler ortak adducts Asetonitril, sodyum veya izopropil alkol vardır.

10. Western Blot analizi Kelly Neuroblastoma hücre Polysialic asit

  1. Hücre lysates hazırlanması
    1. 1 mL Western blot lizis arabellek hücre topakları adım 3.3 girdap ekleyebilir. Buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya. Girdap her 5 dak. 20.000 g ve 4 ° c x 1,5 saat için örnekler santrifüj kapasitesi Lysed hücrelerden protein içeren süpernatant toplamak.
    2. Protein kesirler, örneğin, Bradford veya BCA tahlil protein konsantrasyonu belirlemek. Örnekleri için 1,5 µg/µL lizis arabellekte bir protein konsantrasyonu sulandırmak.
    3. Örnekleri 10 µL Laemmli örnek arabellek 90 µL protein Fraksiyonu (1,5 µg/µL) ekleyerek SDS-sayfa için hazırlamak ve örnek 5 min24için kaynatın.
  2. Immunoblotting
    1. % 8 SDS-Akrilamid jelleri 20-30 µL cepler ve 0,75 veya 1 mm kalınlığı ile kullanın. Jel 25, koş mA RT 2 h için
    2. Dikkatli bir şekilde cam kapak jel çıkarın. Kes şunu ve yükleme cepler içeren jel üst kısmını atın. Daha önce Western blot arabellekte batırılmış jel nitroselüloz membran (0.2 µm), üzerinde yerleştirin. Proteinler nitroselüloz öneri sistemi (Örneğin, 250 mA için 1 h 4 ° C'de) göre aktarın.
    3. Nitroselüloz membran blotting sisteminizden kaldırın. Leke Ponceau olan proteinleri görselleştirmek için kırmızı leke. Plastik bir odaya nitroselüloz membran aktarmak ve 10 mL çözüm engelleme ekleyin. RT, 1 h için kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de
    4. Engelleme çözüm dikkatle boşaltmak ve PBS içinde monoklonal anti-polySia 735 antikor (1 µg/mL) ekleyin. Membran RT, 1 h için kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de Kuluçka sonra PBS ile 5 min için en az üç kez membran yıkayın.
    5. Poliklonal Anti-fare IgG ikincil antikor (1 µg/mL) horseradish peroksidaz (HRP) veya floresan bir etiket PBS ile birleştiğinde ekleyin. Membran RT. 1 h için kuluçkaya Kuluçka sonra PBS ile 5 min için en az üç kez membran yıkayın.
    6. Membran uygun bir Imager bir tabak üzerine aktarın. Üreticinin yönergelerine uygun sinyal tespit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HPLC chromatograms Neu5Ac ve Neu5Gc standartları etiketli Floresan, Şekil 2' de tasvir edilmektedir. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, DMB etiketli Neu5Gc genellikle 7-9 dk elüsyon süresi ile DMB-Neu5Ac arasında 10-12 dk arasında elutes. Kromatografik birkaç daha küçük tepeler genellikle 2-6 dk arasında görünür. Bu tepeler unreacted DMB temsil ve reaksiyon25ara ürün.

Şekil 3 hücre lysates temsilcisi chromatograms gösterir. DMB etiketli standartları (Resim 2), chromatograms için karşılaştırıldığında bu chromatograms birkaç tanımsız doruklarına görülebilir. Bunun iç Dünyamıza bozukluk hücre lysates ve gerçeği DMB sadece sialik asit türleri ile aynı zamanda pyruvate, süksinat ve α-ketoglutarate26da dahil olmak üzere hücre lysates içinde diğer α-keto asitler tepki nedeniyle olabilir. Sialik asit Otaşıyan küçük miktarlarda varlığı-asetik hidroliz tarafından i ciddi değil asetil değişiklikler de ele bu tanımsız doruklarına23için bir sebep olarak. Chromatograms lysed tedavi edilmezse hücrelerden daha önce ManNAc veya kendi analogları ile tedavi etmiş hücrelerden chromatograms ile karşılaştırılır. Burada gösterildiği gibi sık sık ManNAc tedaviyle hücre yüzeyinde Neu5Gc neredeyse tüm bir tükenmesi yol açar. İçinde chromatograms lysed hücre Neu5Prop veya Neu5But ile tedavi doruklarına görülebilir içinde tedavi edilmezse hücre chromatograms görünmez. Bu tepeler (ManNProp için hücreleri yaklaşık 19 dk elüsyon zamanda tedavi ve hücreleri 42 dk ManNBut için tedavi) karşılık gelen doğal olmayan sialik asit, Neu5Prop ve Neu5Gc görünümünü gösterir. Protokol 8.3 bölümünde açıklandığı gibi HPLC chromatograms hücre lysates farklı sialik asit türler miktarda ölçmek için analiz edilebilir.

Gerçeği farklı HPLC saklama doruklarına belirli sialik asit türlere karşılık kütle spektrometresi ile doğrulandı. Faiz toplanan HPLC doruklarına temsilcisi ESI-MS verileri şekil 4' te tasvir: toplanan DMB-Neu5Ac saklama tepe üst sol panelinde, DMB-Neu5Gc doğru üst kapı aynası ve iki doğal olmayan sialik asit türler, spektrum DMB-Neu5Prop ve DMB-Neu5But alt sol ve sağ panelleri. DMB ile reaksiyonu 116.2 Da değil etiketlenir sialik asit türler bu boya ile karşılaştırıldığında, molekül ağırlığı bir artışa yol açar. Enjekte örnekleri 300 ve 700 arasında pozitif kütle/şarj oranı görüntülerken kitle spectra içinde, birkaç tepeler görülebilir. Bu saygın DMB etiketli sonda oluşumu adduct kaynaklanmaktadır. Protonated iyon [M + H]+yanı sıra, sodyum [M + Na]+ adducts ve [M + 2Na-H]+ görünür. Asetonitril (ACN) LC Çözümleme sırasında mevcut olduğu gibi bu bir adduct kitle spectra bulunabilir (gösterilen DMB-Neu5Gc için şekil 4: üst doğru kapı aynası). Sialik asit tür [M + H]+-H2O da görülebilir (için gösterilen electronspray ulaşım bölgesi kılcal ve ilk Kepçe arasında oluşturulan collisional düzensizlikten activations neden parçalanma nedeniyle susuz DMB-Neu5Ac, şekil 4: üst sol kapı)23,27. LC Kurulumu'nda, DMB-Neu5Gc kısa bir süre unreacted veya kısmen tepki DMB türler-sonra elutes. Bu nedenle, toplanan DMB-Neu5Gc sonda bu reaksiyon intermediates tarafından neden yabancı maddeleri içerebilir. Bu DMB-Neu5Gc kütle spektrumu tanımsız Peaks'e görünümü için bir açıklama olarak hizmet vermektedir (şekil 4: üst doğru kapı aynası).

Kelly Nöroblastom hücre ManNProp veya ManNBut ile tedavi polysialic asit düşük ifade için hücre zarının lysed hücrelerden (şekil 5) Western blot analizi tarafından gösterildiği gibi NCAM üzerinde yol açar. Onun heterojenite boyutu ve ücret (≈ 200 kDa) için bir smear yapmak gibi Polysialic asit normalde görünür. ManNAc analogları ile tedavi polysialic asit azaltılması için hücre yüzeyinde yol açar: uzun Alifatik N-asil yan zinciri, güçlü azaltma28.

Figure 1
Resim 1: Nile MGE genel prensibi-asil modifiye mannosamines. Sonra tedavi ile N-asil değiştiren mannosamines, bu ManNAc analogları karşılık gelen doğal olmayan sialik asit karakter metabolize (hücre içi metabolizma) vardır. Bu, ilgili oligosakkarit alıcısı tarafından sialyltransferases transfer, Golgi için taşınan ve hücre yüzeyinde sialosides (burada, bir glikoprotein) ifade. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: DMB etiketli sialik asit standartların temsilcisi chromatograms. DMB etiketli Neu5Ac (üst paneli) ve Neu5Gc (alt paneli) tarafından HPLC analiz edildi. Saklama süreleri (kesikli çizgiler) ve pik alanları her iki sialik asit tespit sonra 10 enjekte ng türlerin saygın DMB etiketli HPLC sistemi içine. Burada gösterilen temsilcisi chromatograms içinde DMB-Neu5Gc 11 dk sırasıyla yaklaşık bir 8 dk saklama süresi ve DMB-Neu5Ac sonra eluted. Kromatografik birkaç daha küçük tepeler genellikle 2-6 dk arasında unreacted DMB ve tepki ara ürün temsil eden, görünür. DMB etiketli Neu5Ac küçük bir kısmını küçük bir kirlilik DMB-Neu5Gc standart (alt paneli) olarak görünür. Bu rakam başvuru22değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: membran bağlı sialik asit DMB-HPLC tarafından karakterizasyonu. Hücreleri devamsızlık (tedavi edilmemiş, üst paneli) veya 5 mM ManNAc varlığıyla kültürlü (üstten ikinci paneli), ManNProp (üstten üçüncü paneli), veya ManNBut (alt paneli), sırasıyla 7 gün için. Orta her 24 h değiştirildi ve membran kesirler, DMB ile etiketli, kurumlara ve HPLC tarafından analiz hücre hasat. DMB etiketli sialik asit standartları (Şekil 2) chromatograms yasland tepeler arasında 8-9 dk saklama zamanlarda DMB-Neu5Gc ve tepeler arasında 10-11 dk DMB-Neu5Ac olarak tespit edilmiştir. DMB etiketli sialik asit standartları enjekte elde doruklarına karşılaştırıldığında, chromatograms hücre lysates üzerinden ek, tanımsız doruklarına göster. Bu iç Dünyamıza bozukluk sondalar, yanı sıra gerçeği DMB sialik asit hücre lysates mevcut değil sadece, aynı zamanda pyruvate, süksinat ve α-ketoglutarate de dahil olmak üzere hücre lysates içinde diğer α-keto asitler ile tepki verebilir kaynaklanmaktadır. Sadece örnekleri Nhuzurunda kültürlü hücrelerden chromatograms görünür tepeler-modifiye asil mannosamine analogları belirtmek karşılık gelen DMB etiketli doğal olmayan sialik asit. Bu rakam başvuru22değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: kitle spectra DMB etiketli sialik asit türlerin hücre lysates bulundu. HPLC saklama doruklarına faiz (bkz. şekil 3) toplanan ve daha sonra toplanan retentions ESI-Bayan 20 µL tarafından doruklarına analiz LC-MSD sisteme enjekte edildi. DMB ile reaksiyonu 116.2 Da karşılık gelen unreacted sialik asit türlere göre molekül ağırlığı bir artışa yol açar. Farklı sialik asit türlerden elde edilen olumlu kütle/şarj oranı spectrograms tasvir edilmektedir (DMB-Neu5Ac: üst sol kapı aynası, DMB-Neu5Gc: üst doğru kapı aynası, DMB-Neu5Prop: alt sol kapı aynası, DMB-Neu5But: alt doğru kapı aynası). Nedeniyle oluşumu adduct için birkaç tepeler görülebilir. Protonated iyon [M + H]+yanı sıra, sodyum [M + Na]+ adducts ve [M + 2Na-H]+ görünür. Asetonitril LC Çözümleme sırasında mevcut olan bir adduct (üst doğru kapı aynası) da bulunabilir. Susuz DMB-Neu5Ac, parçalanma alet [M + H]+-H2O tarafından oluşturulan (üst sol kapı) görülebilir. Toplanan DMB-Neu5Gc sonda unreacted DMB tarafından yanı sıra tepki neden yabancı maddeleri içerebilir ek tanımsız tepeler (üst doğru kapı aynası) görülen ara ürün. ACN, Asetonitril; H, hidrojen; Na, sodyum. Bu rakam başvuru22değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: NCAM polysialylation analizini. Kelly Nöroblastom hücreleri yokluğu veya 5 mM ManNAc varlığı, ManNProp veya ManNBut 7 gün boyunca kültürlü. Hücre hasat edildi ve proteinlerin % 8 SDS-Akrilamid jeller üzerinde ayrılmış ve Western blot tarafından monoklonal anti-polySia antikor 735 kullanarak analiz. Not Bu polySia onun heterojenite SIA, farklı boyutlarda ve polySia suçlamalardan sonuçlanan dizi nedeniyle bir smear olarak görünür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kimyasal sentez ManNAc türevleri, ManNProp ve ManNBut kütle spektrometresi ile analiz edilir, sadece doğru kitle tepe her iki örnekleri için tespit edilmelidir. Bu nedenle, ürünler üzerinde % 99 saflık için kabul edilebilir. İnsan hücreleri29normalde bulunmazsa, Neu5Gc az miktarda lysed hücre membran kesirler tespit edilir. Bu en olası fetal sığır serum sialoglycoconjugates medya30' dan Neu5Gc acemi bir kurtarma yol boyunca oluşur. Sialik asit biyosentezi, ManNAc, doğal habercisi ile tedavi Neu5Gc epitope hücre yüzeyinde ifade büyük ölçüde düşürür.

Değiştirilmiş mannosamines uygulanması negligibly defa soruşturma tüm hücrelere toksiktir. Hücreleri artan millimolar şekeri konsantrasyonları belirli hiçbir taşıyıcılar için N- acylmannosamines olduğundan gereklidir, orta içinde kabul. N- acylmannosamines, hücre büyüme veya farklılaşma31,32etkileyebilecek dilekçe üzerine sinyal iletim yollarının aktif hale gelir kanıtlanmıştır. Olup bu değiştirilen sialylation deseni nedeniyle veya değiştirilmiş sialylation üzerinde doğrudan etkileri yansıtır defa bilinmemektedir. C2-modified ManNAc analogları, ManNProp veya ManNBut huzurunda hücrelerinin büyümesini sonuç karşılık gelen Ntaşıyan doğal olmayan sialik asit tür ifadede-asil yerine koyma. İki metabolik etkinliğini test N-asil modifiye mannosamines değişir. ManNProp ile tedavi genellikle ilgili Neu5Prop hücre yüzeyinde ifade ve azalan bir ifade Neu5Ac hem de Neu5Gc yol açar. Diğer N-modifiye asil mannosamine analogları, N- cyclopropylcarbamyl mannosamine gibi daha yüksek bir metabolizma verimliliği22sahip olma eğilimi.

Önceki çalışmalarda sialik öncüleri polysialylation ile müdahale saptandı. Polysialic asitler neredeyse sadece NCAM ifade edilir. İlginçtir, NCAM polysialylated tarafından iki ayrı polysialyltransferases Golgi (ST8SiaII ve ST8SiaIV) ifade olabilir. O ManNProp, ManNBut ve diğer Ndöndü-asil-modifiye mannosamines müdahale ile polysialylation ve bu ağırlıklı olarak ST8SiaII14ile etkileşim kaynaklanmaktadır. Bu sialyltransferase geliştirme sırasında ifade edilir ve beyin gelişimi için önemlidir. Nöronal kökenli yeniden hızlı artan ST8SiaII ilginç bir şekilde de, birçok tümör onların malignite ve daha fazla yapım onları bağışıklık sistemi33üzerinden tespit edilemez. Buna ek olarak, her iki polysialyltransferases doğal yüzey olduğu için Cumhuriyetçi Millet Partisi-Neu5Ac, bir artış yol açar bu yana ManNAc uygulanması için polySia, bir artış yol açar.

MGE roman sialik asit proteinlerin ilginç (e.g., Eritropoetin) üzerinde tanıtmak ve böylece modüle işlevi için benzersiz bir yöntemdir. Ayrıca, hangi kanser gibi birçok hastalığın ilginç olabilecek birçok kanser hücrelerinin sialik asit yüksek düzeyde ifade ederek bağışıklık sistemi kaçmaya beri hücre yüzey glikozilasyon modüle için kullanılabilir. Burada sunulan yöntem sağlar: ilk olarak, hücre kültürlerinde kullanarak glycoengineering gerçekleştirmek ve ikinci, analiz etmek için glukanlardir başarılı glycoengineering kanıtlamak için tasarlanmış. Çok sağlam bir yöntemdir ve şimdiye kadar hiçbir tuzaklar bildirilir; Buna ek olarak, yöntemi tıklatın-kimya hücreleri13tarihinde gerçekleştirmek için kimyasal etkin gruplar tanıtmak için genişletilmiş oldu.

Burada iki ManNAc analogları Alifatik Nile mevcut-sentez nispeten basit asil yan zinciri değişiklikler bile laboratuvarları ve daha az kimyasal sentez deneyim daha az ekipman ile tarafından. Organik Kimya için daha tanıdık grupların daha karmaşık yapılar ile diğer ManNAc analogları sentez ve bunlar MGE, örneğin, sialylated görselleştirmek için kullanılması gereken sözde 'bioorthogonal' analogları da dahil olmak üzere için kullanın GLYCOCONJUGATES. Nbir bakış veren derlemeler vardır-asetil-13,34bugüne kadar sentez mannosamine türevleri. N- azidoacetyl mannosamine (ManNAz), sık sık, sialylated glukanlardir, görselleştirmek için kullanılan bir madde ticari olarak kullanılabilir. ManNAc analogları düşük membran geçirgenliği nedeniyle bu şeker türevleri korumalı hidroksil grupları, Örneğin, peracetylated ManNAc analogları ile kullanmak yararlı olabilir. Sitoplazma girdikten sonra koruma grupları tarafından sitoplazmik esterazlar, böylece etkin bol35,36,37serbest i ciddi. Ancak, peracetylated ManNAc analogları daha yüksek sitotoksisite karşılık gelen korunmasız türevleri için karşılaştırıldığında ortaya çıkarmak.

Bu makale, MGE ile bizim deneyler için ölümsüzleştirdi Nöroblastom hücre seçtik. Genel olarak, MGE (özellikle ile ManNProp ve ManNBut) hücre hatları, (bkz: Wratil ve ark. ölümsüzleştirdi hücre hatları dahil olmak üzere çok çeşitli olarak uygulanabilir 13 örnekler için) ve Primer hücre38,39. Ayrıca, MGE başarıyla sialylation in vivo C. elegans40, Zebra balığı17,41, fare19,20,42ve fare değiştirmek için kullanılmıştır 43 , 44. tedavi süresi ve ManNAc analogları MGE deneylerde konsantrasyon bu yöntem metabolik verimliliğini etkiler için değiştirilebilir. Bizim deneyim, uzun tedavi ve daha yüksek konsantrasyonlarda glycoconjugates tarihinde Neu5R tarafından doğal olarak meydana gelen sialik asit türlerin daha iyi değiştirilmesi ile karşılık gelir. ManNAc türevleri çok yüksek konsantrasyonda kullanılacak ise, tedavi sitotoksisite değerlendirilmesi gerekir, Örneğin, ÇMT tahlil veya resazurin azaltma tahlil.

Bu makale, ultra-sonication için hücre homojenizasyon kullanmanızı öneririz. Diğer hücre lizis yöntemleri douncing buz (yaklaşık 250 kontur) dahil olmak üzere bizim laboratuvar test edildi ve sialik asit örnekleri tespit miktar ile ilgili benzer sonuçlar ile basın bozulma (10.000 PSI, 4 pasajlar), Fransız. Ultra ses homojenizasyon küçük zamana ihtiyacı ve does değil istemek DNAase lizis önce örnekleri için ek avantajdır.

Glycoconjugates membran sialylation içinde değişikliklere bağlı göstermek istedik çünkü bizim analiz hücre lysates, membran kesirler üzerinde duruldu. Sonra membran kesir yukarıda açıklandığı gibi aynı yöntemi kullanarak yüksek hızlı Santrifüjü tarafından ayrılmış sialik asit türevleri ve onların konsantrasyonları da hücreleri, sitozol ölçülebilir. Ancak, sitozol içindeki sialik asit konsantrasyonları 100 x daha düşük sialik asit ifade hücre zarı7karşılaştırıldığında vardır. Böylece, hücreleri daha büyük miktarlarda güvenilir sonuçlar üretmek için ihtiyaç vardır. Sitozolik, aktif CMP sialik asit havuzu hücre lysates ile sodyum borhidrür hidroliz7,45önce sitozolik kesirler önceden davranarak dolaylı olarak ölçülebilir. Glycoconjugates içindeki sialik asit ve sialik asit hidroksil değişiklikler ile hidrolize için hücreleri 1 M TFA ile inkübe. Asidik diğer çözümler hidroliz, de, Örneğin, 2 M propiyonik asit, 2 M Asetik asit veya 1 M HCl için kullanılabilir.

Olası karşılaşılan HPLC analiz sırasında faiz doruklarına tanımsız zirveleri ile örtüşmez meselesi. Bu özellikle sorunlu olduğunda bir örnek içindeki sialik asit miktarı belirli bir tepe eğri altındaki alan tarafından hesaplanacak olan. Tanımsız bir ayında en yüksek bir tepe ilgi ayırmak için HPLC solvent Asetonitril konsantrasyon ayarlanması (± % 3). Biz daha önce Kromatografi solvent karışımı hazırlama avantaj vermek sürekli çözelti konsantrasyonları HPLC analiz için kullanmanızı öneririz. Bu nedenle, bizim yöntem tek bir HPLC pompa gerektirir ve farklı HPLC sistemleri geniş bir yelpazesi için mümkün olabilir. Birden fazla pompa HPLC sistemi kullanılabilir durumdaysa, Asetonitril konsantrasyonları artan bir isocratic degrade uygulanabilir, Örneğin, 4-%9 35 dk.45içinde. Bu tekniği kullanarak, belirli HPLC zirvesinin tutma zamanı önemli ölçüde değişmiş. Bu strateji aynı zamanda tepeler çakışan daha iyi ayırma elde etmek için yardımcı olabilir. Matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonlaşma kütle spektrometresi (maldı-MS) başarılı bir şekilde ifade doğrulamak için sialik asit tür hücre yüzey45ve böylece hizmet burada sunulan ESI-MS yöntemine eşdeğer olarak değiştiren kuruldu .

ManNAc analogları hydrophilicity ve bu ortamlarda46alımını için belirli taşıyıcılar eksikliği nedeniyle yüksek konsantrasyonları MGE deneylerde bu bileşikler ile ihtiyaç vardır. Bu nedenle, yukarı ölçekli deneyler ve, in vivo çalışmalarda özellikle, ilgili ManNAc analogları büyük miktarda bu tekniğin olası bir sınırlama gösterilen gereklidir. Öte yandan, kullanılan hücre hatları bağlı olarak, işlem görmüş hücreleri belirli olabildiğince az sayıda HPLC analiz güvenilir sonuçlar elde etmek gereklidir. Bizim deneyim, yaklaşık 100.000 yapışık hücreleri veya 150.000 süspansiyon hücreleri (1-2 kuyu Konfluent hücreleri ile 96-şey plaka yapımı) en az yeterli olur. Analiz, örneğin yaklaşımlar eleme küçültüleceğini için ise bu bir darboğaz haline gelebilir.

Bu el yazması sunulan yöntemleri ile hücre lysates sialik asit ve türevleri tespit edilebilir. Ancak, yapısı ve kompozisyonu glycoconjugates hücrelerdeki ManNAc türevleri ile tedavi burada açıklanan tekniği ile tespit edemez. Glycoconjugates, e.g.,N- ve O- glukanlardir, yapısını çözme genellikle daha fazla deneyim ve glycomics tesis47gerektirir. Bilgimizi, şimdiye kadar hiçbir veri glycoconjugates ManNAc analogları ile tedavi hücrelerden farklı yapısı kullanılabilir.

Polysialic asit Western blot analizi çok hızlı ve kolay bir yöntemdir. Ancak, algılama antikorlar ve Kemiluminesan kullandığından bu yöntemle elde edilen verilerin nicel, değildir. Bu nedenle, HPLC yöntemlerin kullanımı Western blot bir avantaj. Yine de, ondan beri onun uygulamak kolay ve çok güvenilir bir şekilde çalışmak için bilinen immunoblotting yöntemi kullanmanızı öneririz.

Sialik asit hücre yüzeyinde ifade MGE dışındaki yöntemleri tarafından da değiştirilebilir. Yukarıda açıklandığı gibi hücre sialidase, sialik asit kalıntıları glycoconjugates nispeten belirsiz bir şekilde cleaves bir enzim ile tedavi edilebilir. Sialidase tedavi sonuç olarak tedavi hücrelerde hyposialylation neden olmaktadır. Ne yazık ki, sitotoksik, uzun süre tedavi için mümkün değil ve in vivo deneyler geçerli değil gibi sialidase tedavi oldukça sınırlı bir tekniği kullanıyor. Hücrelerdeki hyposialylation ikna etmek için başka bir teknik sialik asit biyosentezi inhibitörleri kullanmaktır. İnhibitörleri çeşitli ya sialik asit biyosentezi, UDP -N- peptidoglikan-2-epimerase anahtar enzimi hedef kullanılabilir /N- acetylmannosamine-kinaz (GNE/MNK) veya sialyltransferases6, Grup 7,8,48. Bu bileşikler, analog, C3-flüorlu sialik asit biri gösterildi yaşam içindeki sialik asit ifade düşürmek için fareler49. Hayvanlar bu madde ile ancak, karaciğer bozukluğu, geri dönüşü olmayan böbrek fonksiyon bozukluğu ve49gelişmek için hata gösterdi kabul edilir. Bu sonuçlar Neu5Ac önemli rol karaciğer ve böbrek fonksiyonu onaylamak ve daha fazla sialylation inhibitörleri in vivo deneyler için sınırlarını gösterir. Değişmiş hücre yüzey sialylation içeren hücreleri oluşturmak için üçüncü ifade sialik asit biyosentezi için çok önemli enzim engel tarafından yöntemidir. Knock aşağı GNE/MNK ölümsüzleştirdi hücrelerde, örneğin, bu hücreleri hyposialylated 9işlemek için gösterildi. Nispeten kolayca çakma ve genler cep içinde ve in vivo kullanarak roman ve iyi tanınan CRISPR-Cas9 teknik sialik asit biyosentezi konusunda yeni keşifler neden ve hücre yüzey - imkanı sialylation.

Burada açıklanan teknikleri ile karşılaştırıldığında MGE avantajdır bu farklı deneyler, sayısız için hücre tabanlı deneyleri ve in vivo deneyler için vitro çalışma kolay uygulama ve adapte olduğunu. Darbeli elektrokimyasal algılama50ile yüksek performanslı anyon-Satım Kromatografi (HPAEC) tarafından ifade ve hücre örnekleri farklı sialik asit türler konsantrasyonları ölçmek için alternatif bir yöntem olduğunu. Bu yöntem, sialik asit ifade doğrudan ölçülür kullanarak ve sonra değil floresan bir boya ile etiketleme. Bu yöntemin avantajı bu da bol sialik asit ve türevleri hücrenin protein örnekleri içinde başka analiz etmek yararlı olabilir ki var. Ne yazık ki, HPAEC duyarlılığını DMB sialik asit Fluorometrik tespiti kıyasla daha düşük. Böylece, HPAEC deneyleri büyük örnek tutarlarını51durumu ile sınırlıdır.

Burada açıklanan yöntemleri glycoconjugates bilinmeyen özellikleri ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu teknik fizibilite deneysel kurulumları geniş bir bağlamda gösterilen13, zaten sialik asit bağımlı etkileşimleri araştırmaya MGE kullanımına ilişkin örnekler çok sayıda bulunmaktadır.

Günümüzde, MGE ile N- acetylmannosamines esas olarak glycobiology alanındaki araştırmacılar tarafından kullanılır. Umarız bu teknik daha geniş bir izleyici tarafından çok yönlü bir araç glycoconjugates değiştirmek için tanınması. Diğer alanlar, İmmünoloji, Viroloji, Nöroloji veya Onkoloji gibi kendi amaçları için bu tekniği adapte tarafından yararlanacaktır. Bu dörtlü araştırma henüz keşfedilmemiş alanları bulmayı etkinleştirmek ve bu nedenle daha iyi anlamak sağlık ve hastalık vermek. Erken çalışmalarda, örneğin, daha sonra hizmet için in vivo aşı glikoproteinlerin ile değiştirilmiş glikozilasyon, üretmek için bu tekniği kullanılmıştır. Belirli durumlarda, bu tür glycoengineered aşı ile tedavi gelişmiş hırs ve toksisite ilgili hedefler52,53maruz antikor üretimine neden. Diğerleri başarıyla MGE fareler54yılında hedeflenen tümör tedavisi için bir model geliştirmek için kullanılır. Başka bir çalışma ManNProp sistemik vivo içinde enjeksiyon sinir rejenerasyon55terfi gösterdi. PolySia söz konusu olduğunda, bu el yazması sunulan yöntemler tarafından bu epitope Nöroblastom hücrelerdeki ifade azalan Bu tümör hücreleri radyasyon veya antikanser ilaçlar56ile tedavi duyarlılığını artırır gösterildi.

Sialik asit örnekleri içinde ölçülen miktarlarda işlem görmüş hücreleri ayırmak için kullanılan yönteme bağlı olarak farklılık gösterebilir. Bu makale, kuluçka tripsin ile hücreleri ayırmak için kullanıldı. Eğer diğer teknikleri hücreleri veya PBS + EDTA, uzun süredir tedavi kazıma gibi kullanılacak sialik asit örneklerinde ölçülen miktarlarda farklılık gösterebilir. Hatta tripsin kuluçka zamanla uyum daha sonra ölçülen sialik asit konsantrasyonu etkisi olabilir. Bizim deneyim hücre dekolmanı yöntemi sialik asit ölçülen miktarlarda üzerinde etkisi altında % 15 olduğunu ama eğer sonuçları normalleştirilmiş ve karşılaştırıldığında için bu önemli bir performans sorunu hale gelebilir. Ayrıca, hücre lizis için yöntem, HPLC analiz sonucunu etkileyebilir. Böylece, hücre dekolmanı ve onların deneylerde lizis standartlaştırmak için okuyucu öneririz.

Hücre lysates membran kesir ayrılması elde etmek için biz aralıklarla 20.000 x g 2 h 4 ° C (Bölüm 5.1) için kullandık. Diğer Santrifüjü protokolleri ayrılması ve bu nedenle sialik asit örnekleri tespit miktarda etkileyebilir. Işığa çok duyarlı ve zaman içinde alçaltır bu iletişim kuralına kritik bir bileşik DMB, çünkü. Burada aliquot küçük porsiyonlar DMB-çözüm ve mağaza olarak, - 20 ° C, ışık (Bölüm 1.6.1) korumalı stokları için tavsiye. Bu şekilde DMB-çözüm için birkaç hafta saklanır. DMB-HPLC analiz sonuçlarından sinyalleri sialik asit türler için azalan veya artan HPLC ölçüm ilk 6 dk içinde sinyalleri gösterirsen, DMB ve reaksiyon ürünlerini temsil eden yeni DMB-çözüm hazırlanmalıdır. Yeniden donma ve DMB-çözüm çözdürme sonra yeniden kullanın. Etiketleme DMB sonra tüm örneklerini hemen analiz edilmelidir. Eğer daha büyük sayıda örnekleri (> 10) analiz edilecek, bu örnekler daha küçük rozetleri bölünmüş ve yavaş yavaş DMB ile etiketli gerekir. Her iki etiketleme tepki DMB etiketli probları hiç ışıktan korunmalıdır yanı sıra kez. Elüsyon sonra DMB etiketli sialik asit tür hemen ESI-Bayan HPLC (LC-ESI-Bayan kurulumunda) ESI-MS sistemiyle bağlantı gerekli değildir ancak kütle spektrometresi daha yüksek kalitesini elde etmek için yararlı olabilir doğrudan tarafından analiz edilmelidir analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz L. ö Nguyen için el yazması yazım denetleme ve verimli tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca, biz J. Dernedde ve H. G. Nguyen video çekimi hazırlanıyor bize yardımcı olduğunuz için teşekkür ederiz. Çoğu sahneleri video R. Tauber laboratuvarlarda çekildi. Ayrıca Max Planck Enstitüsü Kolloidler ve arabirimleri ile ilgili ve bize kütle spektrometresi tesislerini ücretsiz erişim verdiğiniz için teşekkür ederiz. RH DFG (ProMoAge) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics