Análisis de la transferencia dependiente de la unión Gap de miARN con 3D-FRAP Microscopía

Biology

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Summary

Aquí, describimos la aplicación de la recuperación de fluorescencia tridimensional después de fotoblanqueo (3D-FRAP) para el análisis de la separación gap dependiente de la transferencia de miARN. En contraste con los métodos comúnmente aplicados, 3D-FRAP permite la cuantificación de la transferencia intercelular de ARN pequeños en tiempo real, con alta resolución espacio-temporal.

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Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55870, doi:10.3791/55870 (2017).

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Abstract

Pequeños ARNs antisentido, como el miARN y el siRNA, juegan un papel importante en la fisiología y patología celular y, además, pueden ser utilizados como agentes terapéuticos en el tratamiento de varias enfermedades. El desarrollo de nuevas e innovadoras estrategias para miARN / siRNA terapia se basa en un amplio conocimiento de los mecanismos subyacentes. Los datos recientes sugieren que los ARN pequeños se intercambian entre las células en una forma dependiente de la unión de vacíos, induciendo así los efectos reguladores de los genes en la célula receptora. Las técnicas biológicas moleculares y el análisis de citometría de flujo se usan comúnmente para estudiar el intercambio intercelular de miARN. Sin embargo, estos métodos no proporcionan una alta resolución temporal, que es necesaria cuando se estudia el flujo de juntura de las moléculas. Por lo tanto, para investigar el impacto de miARN / siRNA como moléculas de señalización intercelular, se necesitan nuevas herramientas que permitan el análisis de estos ARN pequeños a nivel celular. El presente protocolo describe el apPlication de la recuperación tridimensional de la fluorescencia después de la microscopía del photobleaching (3D-FRAP) para aclarar el intercambio dependiente de la conexión de la separación de moléculas del miRNA entre las células cardíacas. Es importante destacar que este enfoque directo y no invasivo de imágenes de células vivas permite la visualización y cuantificación de la separación gapcaling de pequeños RNA marcados fluorescentemente en tiempo real, con alta resolución espacio-temporal. Los datos obtenidos por 3D-FRAP confirman una nueva vía de regulación de genes intercelulares, donde los ARN pequeños actúan como moléculas de señalización dentro de la red intercelular.

Introduction

Los pequeños ARN no codificantes son actores importantes en la regulación de genes celulares. Estas moléculas están compuestas de 20-25 nucleótidos que se unen a un ARNm diana específico, lo que conduce al bloqueo de la traducción oa la degradación del mRNA 1 , 2 . El proceso de regulación de genes llevado a cabo por pequeños ARNs, como miARN y siRNA, es un mecanismo altamente conservado que se ha encontrado en muchas especies diferentes [ 3] . En particular, las moléculas de miARN son de crucial importancia para una variedad de procesos fisiológicos, incluyendo la proliferación, diferenciación y regeneración 4 , 5 . Además, la desregulación de la expresión de miARN se atribuye a muchos trastornos patológicos. Correspondientemente, miRNAs han demostrado ser adecuados como biomarcadores para el diagnóstico y como agentes terapéuticos para la terapia génica 6 , 7

Las uniones Gap (GJs) son estructuras proteicas especializadas en la membrana plasmática de dos células adyacentes que permiten el intercambio difusional de moléculas con un peso molecular de hasta 1 kD. Se ha demostrado que son importantes para el desarrollo de tejidos, la diferenciación, la muerte celular y trastornos patológicos como el cáncer o las enfermedades cardiovasculares [ 8 , 9 , 10] . Varias moléculas han sido descritas como capaces de atravesar canales GJ, incluyendo iones, metabolitos y nucleótidos. Curiosamente, GJs también se encontró a proporcionar una vía para el movimiento intercelular de pequeños ARNs [ 11 , 12] . Por lo tanto, miRNAs puede actuar no sólo dentro de la célula en la que se producen, sino también dentro de las células receptoras. Esto pone de relieve el papel de los miARN en el sistema de transducción de señales intercelulares. Al mismo tiempo, los datosQue la comunicación intercelular de unión gap está estrechamente vinculada a la función miARN. Debido al impacto significativo de miARN y GJs en la homeostasis, la patología y el diagnóstico de los tejidos, una comprensión integral de la función de los GJs y la dinámica intercelular relacionada del miRNA ayudará a aclarar los mecanismos de las enfermedades basadas en miARN y desarrollar nuevas estrategias para MiARN.

Dependiendo de la extensión del acoplamiento de la separación de la abertura, la transferencia de moléculas del miARN entre las células puede ser un proceso muy rápido. Por lo tanto, se requiere una metodología que permita la visualización y cuantificación del movimiento intercelular rápido de estas moléculas de señalización reguladora. Comúnmente, citometría de flujo y técnicas de biología molecular se han aplicado para demostrar el shuttling de pequeños ARNs 11 , 12 , 13 , 14 . Sin embargo, a diferencia de FRAP microsCopiar, estos enfoques carecen de alta resolución temporal, lo que es obligatorio al analizar el intercambio de miRNA a través de GJs. Por otra parte, la microscopía FRAP es menos invasiva y por lo tanto representa una poderosa y novedosa técnica de imágenes de células vivas para evaluar el intercambio GJ-dependiente de moléculas en varios tipos de células 15 , 16 , 17 .

Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe la aplicación de 3D-FRAP para evaluar miRNA shuttling entre cardiomiocitos. Para este propósito, se transfectaron cardiomiocitos con miARN marcado fluorescentemente. Una celda marcada con este miARN fue fotoblanqueada, y el gap de unión de miRNA re-afluencia de células adyacentes se registró en un tiempo dependiente de la forma. La alta resolución temporal de los experimentos FRAP ofrece la posibilidad de realizar estudios cinéticos para la evaluación precisa de la transferencia intercelular de miRNA y siRNA entre células vivas. MoreoVer, como ARN pequeños pueden ser intercambiados a través de diferentes mecanismos con cinética muy diferente, la microscopía FRAP puede ayudar a aclarar la medida en que GJs están involucrados en los procesos de shuttling respectivos [ 18] . Además, 3D-FRAP puede ser utilizado para investigar las alteraciones fisiológicas y patológicas en la permeabilidad GJ y su impacto en la transferencia de ARN pequeños [ 15 , 19] .

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Protocol

Todos los pasos en este protocolo que implican ratones neonatal fueron realizados por las pautas éticas para el cuidado animal del centro médico de la universidad de Rostock.

1. Preparación de platos de cultivo celular y el medio para cultivo de cardiomiocitos

  1. Recubrir una placa de cultivo celular con 0,1% de gelatina en PBS e incubar a 37 ° C durante 4 h oa 4 ° C durante la noche. Retire la gelatina y deje que se seque bajo flujo de aire laminar estéril.
  2. Preparar el medio de cultivo celular compuesto de 50 ml de DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). Precalentar a 37 ° C.

2. Aislamiento de Cardiomiocitos Neonatales

  1. Sacrificar a ratones neonatales (1-2 días de edad) por decapitación con tijeras estériles y abrir el pecho a lo largo del esternón. Retire el corazón con una pinza mientras presiona ligeramente el tórax y transfiere el corazón a una placa de 24 pocillos que contenga HBSS helado(Sin Ca 2+ y Mg 2+ ).
  2. Elimine el tejido no cardíaco y los vasos más grandes usando fórceps estériles. Transferir los corazones limpios a un tubo de 1,5 ml que contenga HBSS helado. Utilice un máximo de 5 corazones por tubo para la digestión enzimática.
  3. Picar los corazones con tijeras pequeñas en piezas de <0,5 a 1 mm³.
  4. Lave los corazones picados con HBSS dos veces por aspiración / adición de HBSS usando una pipeta de microlitro de 1 ml. Eliminar el HBSS completamente antes de agregar las enzimas.
  5. Para la digestión enzimática de corazones neonatales, utilice un kit disponible comercialmente y siga el protocolo del fabricante (vea la Tabla de Materiales ). Agitar el tubo que contiene los corazones picados cada 5 min mientras se incuba con enzimas a 37 ° C durante 35 min.
  6. Sembrar las células en suspensión en placas de cultivo celular no recubiertas que contienen medio de cultivo celular durante 1,5-2 h para permitir la adherencia de la fracción no cardiomiocitaria. Repita este paso si una alta purezaDe cardiomiocitos. Si se desea, se cultiva adicionalmente la fracción no cardiomiocítica.
    NOTA: Para una suspensión celular de 15 corazones, la etapa de pre-recubrimiento se puede realizar en matraces de cultivo celular de 75 cm $ ² $. Normalmente, se obtienen ~ 5 x 105 células de un corazón neonatal.
  7. Recoger el sobrenadante en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar durante 10 min a 300 x g. Resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo celular.
  8. Contar las células con un hemocitómetro de cámara Neubauer, o utilizar un método equivalente.
  9. Los cardiomiocitos aislados en placa en placas de 6 pocillos con una densidad de 3 x 105 células / cm $ ² $. Incubar las células durante la noche a 37 ° C y 5% de CO 2 .
    NOTA: Opcionalmente, las células también pueden ser transfectadas en este punto. Sin embargo, se observó una mayor viabilidad cuando las células se cultivaron durante un día antes de ser sometidas a electroporación.

3. Transfección con miRNA marcado fluorescentemente

  1. Pre-(Véase el paso 1.2) a 37 ° C en un baño de agua o un dispositivo equivalente.
  2. Preparar una solución madre de 20 μM de miARN fluorescente en agua estéril libre de RNasa.
  3. Preparar un tampón de electroporación que contiene Na _ { 2 } HPO _ { 4 } 90 mM, NaH _ { 2 } PO _ { 4 } 90 mM, KCl 5 mM, MgCl _ { 2 } 10 mM y succinato de sodio 10 mM y ajustar el pH a 7,2; El tampón de electroporación puede almacenarse a -20 ° C durante varios meses.
  4. Se separan las células del plato de cultivo usando tripsina al 0,05% durante 5 min. Inactivar la tripsina añadiendo medio de cultivo celular.
  5. Contar las células con un hemocitómetro de cámara Neubauer, o utilizar un método equivalente. Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min.
  6. Resuspender las células en tampón de electroporación para obtener una concentración de 4 x 105 células por 100 μl.
  7. Mezclar 100 μL de suspensión celular con miARN fluorescente (concentración final: 0,25 μM) en un tubo yCargar la mezcla en una cubeta de electroporación.
    1. Determinar empíricamente la cantidad apropiada de miARN, dependiendo del tipo de célula.
  8. Realizar la electroporación utilizando un dispositivo de electroporación (véase la tabla de materiales ), utilizando el programa "G-009".
  9. Añadir 500 μl de medio de cultivo celular precalentado y transferir la suspensión de células completas (4 x 105 células) en un pocillo de un portaobjetos de 4 pocillos de fondo de vidrio. Cultivo de las células durante 1 día a 37 ° C en una atmósfera de CO 2 al 5%.
    NOTA: Para el análisis FRAP, una densidad celular de ~ 80% es óptima. La transfección de miARN marcado debe realizarse exclusivamente mediante electroporación. Puesto que la distribución homogénea de las moléculas de miARN marcadas es beneficiosa para la medición de FRAP, no se recomienda la transfección basada en reactivos.

4. Aplicación de la 3D-FRAP Microscopía (Día 3)

  1. Calentar la incubadora del microscopio a 37 °; C y encienda el microscopio confocal al menos 2 h antes de la medición FRAP para establecer un equilibrio térmico y disminuir la posibilidad de deriva. Si es posible, mantenga una atmósfera de CO2 al 5%.
  2. Inserte la corredera de la cámara en el soporte de muestras de la etapa.
  3. Encuentre un grupo de cardiomiocitos transfectados utilizando un objetivo de aceite 1.4 NA (aumento de 400X) y una luz de excitación láser de 561 nm con baja potencia láser, con un rango de detección de 570-680 nm.
    NOTA: La definición de los ajustes de FRAP, la adquisición de la imagen y el análisis se realizaron utilizando software específico del microscopio (ver Tabla de Materiales ).
  4. Active los botones "z-Stack", "Series temporales", "Blanqueo" y "Regiones" en el "Administrador de configuración".
  5. Defina los parámetros FRAP.
    1. Defina los ajustes de adquisición de imagen en el menú "Modo de adquisición" ajustando el "tamaño del marco4; A 512 x 512, el "paso de línea" a 1, y el "tiempo de exploración" a <1 s.
    2. En el menú "Canales", ajuste los ajustes de potencia, offset y ganancia del láser para obtener la máxima fluorescencia a partir de la mínima excitación del láser ( por ejemplo, potencia del láser: 1-5%); Ajustar para evitar la saturación de intensidad. Coloque el "tamaño del agujero de alfiler" en 2 μm.
    3. A continuación, en el menú "Regiones", seleccione la "herramienta de dibujo ROI" y utilice el cursor para marcar la celda de destino, la celda de referencia y el área de fondo. Si es necesario, seleccione varias celdas de destino para el fotoblanqueo.
    4. Ajuste la configuración de fotoblanqueo en el menú "Blanqueado" ( p. Ej., Iteraciones: 9-14, potencia láser para fotoblanqueo: 100%, intervalo de adquisición de imagen: 60 s, ciclos: 15). Definir el inicio del blanqueo después de 3 exploraciones iniciales.
    5. En el menú "z-Stack", defina los límites para la adquisición de la pila z, dependiendo del grosor de las celdas. Ajuste el "número oF z-capas "a 12 - 15.
    6. Iniciar el experimento FRAP y registrar la recuperación de fluorescencia.
      NOTA: Dado que los ajustes de un experimento FRAP dependen del tipo de célula, el colorante fluorescente y el sistema de microscopio, es mejor realizar experimentos piloto para determinar los parámetros óptimos para FRAP. El blanqueo debe ser suficiente para reducir la intensidad inicial de fluorescencia en al menos el 50%. Típicamente, la recuperación de fluorescencia debe ser registrada cada 30-60 s hasta que se alcance la fase de meseta.

5. Análisis de datos

  1. Crear proyecciones máximas de las pilas z adquiridas y obtener valores de intensidad de fluorescencia de las células diana blanqueadas, la celda de referencia y el fondo. Utilizando el software específico del microscopio, haga clic en "Procesamiento" → "Proyección de intensidad máxima" → seleccione archivo → "Aplicar".
    1. Alternativamente, utilice una herramienta de análisis de imagen equivalente (
  2. Copie los datos de intensidad de fluorescencia en todos los puntos de tiempo de la celda de destino, el fondo y la celda de referencia en una hoja de cálculo.
    1. Restar la intensidad de fondo y la intensidad de la celda de referencia de los valores de intensidad de la celda objetivo para corregir el fotoblanqueo causado durante el proceso de adquisición. Realice las correcciones de fondo y de celda de referencia para cada punto de tiempo.
    2. Normalizar los datos FRAP corregidos a la intensidad de fluorescencia inicial antes del blanqueo dividiendo cada valor por la fluorescencia inicial.
    3. Para obtener curvas FRAP, ajuste la línea base a la intensidad de fluorescencia inmediatamente después del blanqueo restando de los valores de intensidad de cada punto de tiempo.

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Representative Results

Aquí, presentamos la microscopía 3D-FRAP como una técnica no invasiva para estudiar la separación gapcaling de miRNA fluorescente dentro de los cardiomiocitos neonatales. Los cardiomiocitos aislados revelaron el típico patrón estriado de α-actinina y contenían grandes placas de Cx43 a lo largo de los bordes celulares ( Figura 1A , puntas de flecha blancas), lo que permitía el alto flujo intercelular de moléculas. La pureza de los cardiomiocitos aislados se evaluó mediante la cuantificación microscópica de células positivas a α-actinina. Aunque algunos no cardiomiocitos (α-actinina negativos) estaban presentes en el cultivo, los cardiomiocitos neonatales representaron el mayor tipo de células después del aislamiento (79,62 ± 3,68%, Figura 1B ).

Para investigar la brecha intercambio de unión de miARN, las células fueron transfectadas con fluorescently etiquetados miARN. EleLa ctroporación es el método de elección para administrar moléculas de miARN a las células, ya que asegura una alta eficiencia de transfección y la distribución homogénea de los compuestos transfectados, lo que es obligatorio para el análisis de FRAP. En nuestra configuración experimental, se logró una eficiencia de transfección de ~ 45%, según lo determinado por citometría de flujo ( Figura 2A ]. La preparación de cardiomiocitos para FRAP incluye el desprendimiento de la placa de cultivo, la electroporación y el reenlace en los portaobjetos de la cámara. Un ensayo de citometría de flujo vivo / muerto reveló que la mayoría de las células demostró una alta viabilidad, lo que es importante al analizar la comunicación de la separación de la abertura ( Figura 2B ). Además, la densidad celular es un parámetro crucial que afecta a los resultados del FRAP. Para las mediciones óptimas de FRAP, las células deben ser sembradas con una densidad de ~ 80% para permitir la formación de grupos de células y el establecimiento de uniones funcionales gap entre las células ( Figura2C).

Para el análisis FRAP, las células diana se seleccionan dentro de un grupo de células y se fotoblanquean con potencia láser al 100%, lo que conduce a la reducción de la fluorescencia de miARN en las células seleccionadas ( Figura 3A , blanqueador). Posteriormente, se registra la recuperación de fluorescencia para visualizar la transferencia de miARN de células adyacentes al área blanqueada. Dado que la fase de meseta de la recuperación de fluorescencia se alcanzó después de 13 min, este lapso de tiempo se utilizó para la adquisición de imágenes en los experimentos FRAP. El análisis cuantitativo y la normalización de los datos adquiridos mostraron una recuperación media del 20%. Los datos también demostraron que la microscopía FRAP permite el registro rápido de miRNA shuttling con alta resolución temporal. Dependiendo de las propiedades del tinte, los parámetros de adquisición se pueden cambiar para aumentar aún más la resolución temporal.

El uso de 3D-FRAP permiteLa comparación de la permeabilidad GJ a miARN bajo diferentes condiciones. Para demostrar esto, hemos inducido un knockdown mediado por siRNA de Cx43, lo que conduce a la expresión de proteína reducida ( Figura 3C ] y la inhibición de la comunicación de la separación gap. Como resultado, la recuperación de la fluorescencia se redujo en más del 50%, lo que indica que la eficiencia de la transferencia de miARN es fuertemente dependiente de la extensión del acoplamiento de separación gap entre las células ( Figura 3B , Cx43 knockdown). Para confirmar que la recuperación de la fluorescencia refleja el paso de la miRNA marcado fluorescentemente, en lugar de la etiqueta Dy547 desprendida, también adquirimos datos de FRAP para el colorante de calceína ( Figura 3D ). La calceína tiene un peso molecular comparable al de Dy547 y, por tanto, posee una dinámica de transferencia similar. En contraste con la recuperación de la fluorescencia de DY547 marcado miARN, calcein demostrado aumento de la brecha de intercambio de lazo, lo que indica que el Dy547 etiqueta iS no separado de la molécula de miARN ( Figura 3D ).

Las condiciones de enfoque estable son obligatorias a lo largo de un experimento FRAP, especialmente cuando se realizan mediciones a largo plazo. En comparación con las aplicaciones 2D, 3D-FRAP puede compensar la posible desviación del enfoque. Como se muestra en la Figura 4 , incluso ligeros cambios de enfoque afectan a la detección adecuada de la señal de fluorescencia de miARN cuando sólo una sola capa 2D se utiliza para el experimento FRAP ( Figura 4B ). En cambio, para 3D-FRAP, se registra una pila z completa de la célula diana y se someten las proyecciones máximas al análisis de datos ( Figura 4A ). El impacto de la desviación del foco en una curva de intensidad de fluorescencia normalizada se representa en la Figura 4C . Mientras que la recuperación de fluorescencia aumenta de manera constante con el tiempo en 3D-FRAP, la adquisición de 2D-FRAPF la señal de fluorescencia.

Además de la compensación de los cambios de enfoque, 3D-FRAP también proporciona datos espaciales de la brecha de intercambio de unión de miARN. La Figura 5 muestra una representación superficial 3D de un experimento FRAP. En comparación con las proyecciones máximas, la adquisición de z-pilas se puede utilizar para crear reconstrucciones 3D para investigar la localización y la movilidad de miARN dentro de las células ( Figura 5 ]. El co-etiquetado con organelos permitirá investigar la participación de otros componentes celulares en la transferencia de miARN.

Figura 1
Figura 1: Imágenes microscópicas representativas de cardiomiocitos neonatales aislados. ( A ) microscopía de iluminación estructurada muestra la alta expresión de Cx43, que se acumula en grandes pLaques en las fronteras celulares (puntas de flecha). La pronunciada formación de GJs con células adyacentes permite un amplio intercambio de pequeñas moléculas, incluyendo miARN. Barra de escala = 20 μm ( B ) Pureza de los cardiomiocitos aislados. El etiquetado de α-actinina demuestra que los cardiomiocitos representan el tipo de célula principal después del aislamiento. Barra de escala = 50 μm. Las células se tiñeron con anticuerpos anti-Cx43 (verde) y anti-α-actinina (rojo). Los núcleos se visualizaron usando DAPI (azul). Una descripción de microscopía de iluminación estructurada y etiquetado inmunológico se proporciona en una publicación previa [ 20] . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Eficiencia de Transfección, Viabilidad , Y densidad celular del cultivo de cardiomiocitos neonatales. ( A ) La citometría de flujo reveló que la electroporación miR547 dio como resultado una eficiencia de transfección de ~ 45%. ( B ) Viabilidad celular de cardiomiocitos usados ​​para FRAP. Tras el aislamiento, la electroporación y la reinserción, los cardiomiocitos se sometieron a tinción celular viva y muerta y demostraron alta viabilidad celular. ( C ) Imagen microscópica de cardiomiocitos transfectados con mir547 preparados para la microscopía FRAP. Una densidad celular del 80-90% asegura la formación pronunciada de los contactos de célula-célula de separación gap. Barra de escala = 50 μm. En las publicaciones anteriores 20 , 21 se menciona un método para el análisis de citometría de flujo de la eficacia de transfección y la tinción de viabilidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Intercambio dependiente de GJ de miARN en cardiomiocitos neonatales. ( A ) Imágenes representativas de un experimento FRAP. Después de la transfección con miARN marcado, las células diana dentro de un grupo de células son fotoblanqueadas por un pulso de láser fuerte (pre-blanqueo versus blanqueador). Dependiendo de la extensión del acoplamiento de la unión de la separación, el flujo de unión de los miARN de las células adyacentes produce una mayor intensidad de fluorescencia en las células diana blanqueadas (post-blanqueo t = 3, 6, 9 y 13 min). Barra de escala = 20 μm ( B ) El análisis cuantitativo de los datos de FRAP adquiridos muestra una recuperación de fluorescencia del 20% después de 13 min. Para confirmar la participación de GJs en la transferencia intercelular de miARN, se realizó un knockdown cx43, lo que condujo a una fuerte disminución de la recuperación de fluorescencia (50%). ( C ) Immunostaining con anti-Cx43Anticuerpo y microscopía confocal posterior demuestran la eficacia de la destrucción de Cx43 a nivel de proteína. Barra de escala = 50 μm. ( D ) La comparación de los datos de FRAP de miR547 y el colorante de calceína muestran las diferentes dinámicas de transferencia. El menor peso molecular de la calceína dio lugar a una mayor recuperación de fluorescencia en comparación con el dy547 marcado miARN moléculas. Las curvas FRAP resumen los datos de n ≥56 células, mostradas como la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA bidireccional seguido por la prueba post hoc de Bonferroni (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Compensación de la desviación de enfoque utilizando 3D-FRAP Microscopía. ( B ) Imágenes representativas de una célula fotoblanqueada (línea roja) demuestran el impacto de la desviación del foco en la intensidad de fluorescencia durante los experimentos 3D y 2D-FRAP. ( A ) En 3D-FRAP, las pilas z se registran para cada punto de tiempo, y las proyecciones máximas se utilizan para el análisis de datos, que corrige la deriva del foco. Barra de escala = 20 μm. ( B ) En contraste, para 2D-FRAP, sólo una sola capa 2D se somete a análisis de datos. Por lo tanto, la intensidad de fluorescencia global se reduce profundamente por cambios en el enfoque. Barra de escala = 20 μm. ( C ) Las curvas de intensidad de fluorescencia normalizadas representativas de los experimentos 3D y 2D-FRAP indican el fuerte efecto de la desviación del foco en la recuperación de fluorescencia y muestran los beneficios de la adquisición 3D al estudiar el transporte intercelular de miARN. Haga clic aquí para ver una versión más grande deEs la cifra.

Figura 5
Figura 5: Representación de superficies 3D de un experimento 3D-FRAP. (Izquierda) Proyecciones máximas de una medición FRAP. La célula fotoblanqueada (marco rojo) demuestra un aumento en la intensidad de fluorescencia debido a la transferencia de miARN de células adyacentes. (Derecha) Las pilas z adquiridas de la misma célula fotoblanqueada (roja) se sometieron a renderización superficial 3D para visualizar la distribución espacial del miARN. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

MiRNAs son actores clave en la fisiología celular y se demostró que actúan como moléculas de señalización utilizando-entre otros-GJs como una vía para el intercambio intercelular [ 11 , 12 , 22] . El protocolo actual presenta una técnica de imágenes de células vivas in vitro para caracterizar este desplazamiento dependiente de GJ utilizando miRNAs fluorescentes dentro de grupos de células.

El protocolo se desarrolló sobre cardiomiocitos como un sistema de modelo celular. Sin embargo, este enfoque puede aplicarse a varios tipos de células si la electroporación es un método adecuado para la transfección de miARN. Además de la célula a la célula de intercambio, la técnica presentada también es adecuado para investigar la movilidad intracelular de miRNA moléculas ( por ejemplo, para la identificación de los posibles mecanismos de transporte dentro de la célula) , [ 23 , 24] .

La investigación de la transferencia de miARN mediante la microscopía FRAP requiere moléculas miRNA marcadas con fluorescencia ( Figura 2 ) .Como el etiquetado de los miRNAs celulares específicos no es factible, sólo se puede utilizar miARN etiquetado exógeno, introducido para 3D-FRAP para analizar su movilidad intercelular En nuestros experimentos, las células fueron transfectadas con miRNA 250 nM.Esta concentración fue mucho mayor en comparación con condiciones fisiológicas, donde el nivel de miARN varía de 10 a 50.000 moléculas por célula 27 , 28. Tales bajas concentraciones no se puede utilizar en los experimentos FRAP, Ya que se requiere cierto nivel de moléculas de miARN fluorescentes para obtener una señal de fluorescencia suficiente y asegurar la discriminación apropiada entre la fluorescencia de fondo y el miARN marcado fluorescentemente. Sin embargo, dependiendo del sistema de formación de imágenes confocal y las propiedades del colorante, el uso de concentraciones de miARN a niveles bajos -nM debe ser factible para los ensayos FRAP. <Pabellón

Diferentes técnicas se aplican comúnmente para estudiar la transferencia de miARN intercelular, incluidos la citometría de flujo, PCR, y luciferase reportero ensayos [ 12 , 13] . Estos métodos detectan miRNA shuttling con baja resolución temporal ( es decir, horas a días). Por el contrario, 3D-FRAP microscopía permite la visualización y cuantificación de miARN transferencia y movilidad en tiempo real. Además de la brecha de células de contacto de células de contacto, la interconexión shuttring de miRNA también está mediada por otros mecanismos, como los exosomas [ 18 , 29 , 30] . Solamente el 3D-FRAP proporciona una resolución temporal suficientemente alta para discriminar entre la transferencia exosomal y la transferencia de unión gap. Por lo tanto, permite una investigación específica sobre el efecto directo de la permeabilidad GJ en la señalización miARN en diferentes condiciones patológicas o fisiológicas ( FiguRe 2).

Recomendamos el uso de 3D-FRAP, que es superior al convencional 2D-FRAP, ya que proporciona datos más precisos sobre la transferencia de miARN dependiente de GJ. Las mediciones 3D-FRAP incluyen el volumen de la célula entera, lo cual es importante cuando se usan tipos de células de gran volumen. Además, puede compensar los cambios de enfoque o los movimientos celulares, que se demostró que perjudican significativamente la recuperación de fluorescencia en 2D-FRAP ( Figura 3 ]. Por último, la grabación de z-pilas en 3D-FRAP experimentos proporciona la posibilidad de obtener información espacial, lo que no es factible cuando sólo una sola capa 2D se utiliza para el análisis de las intensidades de fluorescencia ( Figura 3B ].

Dado que la recuperación de fluorescencia depende de la afluencia de miARN de células adyacentes, el número de células conectadas a la célula blanqueada es crítica y debe ser similar a través de diferentes mediciones para obtener datos confiables. Por lo tanto, se requiere una alta densidad celularD para asegurar la formación de clusters celulares más adecuados para el análisis FRAP. Además, se deben realizar experimentos preliminares para seleccionar condiciones de blanqueo moderadas ( es decir, potencia del láser, tiempo de blanqueo y ajustes de exploración) para evitar efectos fototóxicos causados ​​por una intensidad láser alta 25 , 26 . Esto también ayudará a reducir el fotoblanqueo que se produce durante el proceso de adquisición.

A pesar de las limitaciones, nuestros datos muestran que 3D-FRAP es una poderosa herramienta para evaluar el papel de los miRNAs como moléculas de señalización dentro de una red celular. El impacto de la composición de conexinas en miRNA shuttling o la permeabilidad selectiva de GJs para miRNAs específicos se pueden abordar con la cuantificación directa de la eficiencia del transporte. 3D-FRAP puede proporcionar información importante para mejorar el desarrollo de nuevas terapias que incluyen miRNA y siRNA, tales como la definición de condiciones adecuadas que facilitan la distributioN de ARN pequeños a través de la red GJ 31 , 32 .

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Disclosures

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo contó con el apoyo del Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania (FKZ 0312138A y FKZ 316159), del Estado de Mecklemburgo-Pomerania Occidental con los Fondos Estructurales de la UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 y FSE / IVBM-B35-0010 / 12), el DFG (DA1296-1) y la Fundación Alemana del Corazón (F / 01/12). Además, RD cuenta con el apoyo del Programa FORUN del Centro Médico de la Universidad de Rostock (889001), la Fundación DAMP y el BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
neonatal NMRI mice Charles River
Gelatin Sigma Aldrich G7041 0.1% solution in PBS, sterilized
PBS Pan Biotech P04-53500
Dulbecco´s modified medium Pan Biotech P04-03550
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serum Pan Biotech P30-3306
Cell culture plastic TPP
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit Thermo Fisher Scientific 88281
HBSS Thermo Fisher Scientific 88281 included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blue Thermo Fisher Scientific 15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic Dharmacon CP-004500-01-05 dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
Sodium phosphate dibasic Carl Roth T877.2
Potassium chloride Sigma P9333
Magnesium chloride Serva 28305.01
Sodium succinate Carl Roth 3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solution Merck L2153
4-well- Glass bottom chamber slides IBIDI 80827 coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector II Lonza program G-009 was used for Electroporation 
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Excel software Microsoft
α-actinin antibody Abcam ab9465 dilution 1:200
Connexin43 antibody Santa Cruz sc-9059 dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibody Thermo Fisher Scientific A-11005 dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Thermo Fisher Scientific A-11034 dilution 1:300
Connexin43 siRNA Thermo Fisher Scientific AM16708 ID158724 final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306

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References

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