Protocole pour HER2 pêcher avec un fixateur de tissu Non-cross-linking, formol à combiner les avantages de Cryo-préservation et Fixation au formol

Cancer Research
 

Summary

L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est souvent le cas en combinaison avec l’histopathologie et diagnostics moléculaires pour la sélection de la thérapie en médecine personnalisée. Un fixateur de nouveaux tissus non-cross-linking, formol qui permet la qualité morphologique, moléculaire et des analyses de poissons du même spécimen par ajout d’une étape après fixation avant poisson est présenté.

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Loibner, M., Oberauner-Wappis, L., Viertler, C., Groelz, D., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation. J. Vis. Exp. (130), e55885, doi:10.3791/55885 (2017).

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Abstract

Évaluation morphologique des échantillons de tissus fixés au formol, paraffine (FFIP) l’étalon-or pour le diagnostic du cancer depuis des décennies en raison de son excellente conservation de la morphologie. Médecine personnalisée fournit plus en plus thérapies individuellement adaptées et ciblées pour les maladies individuelles caractérisés activés par des technologies combinées d’analyses morphologiques et moléculaires et le diagnostic. Performance des analyses morphologiques et moléculaires du même spécimen FFPE est difficile en raison de l’impact négatif du formol en raison de la modification chimique et réticulation des acides nucléiques et des protéines. Un fixateur de tissu non-cross-linking, formol a été récemment développé pour remplir deux conditions, c'est-à-dire, pour préserver la morphologie comme FFIP et biomolécules comme cryo-préservation. Étant donné que le poisson est souvent le cas en combinaison avec l’histopathologie et diagnostic moléculaire, nous avons testé l’applicabilité des protocoles de poissons sur les tissus traités avec ce nouveau fixateur. Nous avons constaté qu’après fixation de formol de coupes histologiques de la non-cross-linking, formol et paraffine (NCFPE) du sein cancer tissu généré des résultats équivalents à ceux avec tissu FFPE au récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) de 2 Analyse des poissons. Ce protocole décrit comment un essai FISH initialement développé et validé pour tissu FFPE peut être utilisé pour les tissus NCFPE par une simple étape après fixation des coupes histologiques.

Introduction

Médecine personnalisée s’appuie plus sur multiparamétriques tests impliquant des analyses morphologiques et moléculaires des tissus. Fixation au formol des tissus comme le gold standard fournit excellente qualité morphologique1,2. Cependant, modification chimique induite par le formol et la réticulation des protéines et des acides nucléiques3,4,5 négativement interfère avec l’analyse moléculaire6. Ces modifications moléculaires limitent la qualité des acides nucléiques et des protéines et peut résulter en séquence de gène artefacts7 ou sensibilité réduite de la réaction en chaîne par polymérase (PCR)-fondée essais8. Bien que des efforts considérables ont été prises afin d’optimiser les tests moléculaires pour tissu FFPE, cryo-préservation des tissus est supérieur général pour la fixation au formol, rendant nécessaire de diviser les échantillons de tissus pour les procédures de conservation différents. Pour éviter la nécessité pour la cryoconservation des analyses moléculaires, un non-cross-linking, formol fixateur, les tissus de PAXgene a été développé. Ce système disponible dans le commerce comprend une fixation et une solution de stabilisation contenant divers alcools, acide acétique et un composé organique soluble. Une bonne conservation des acides nucléiques, protéines (phospo) et la morphologie a été montrée dans plusieurs études6,9,10,11,12,13.

Une demande particulière au diagnostic du cancer est poisson détecter une gamme complète d’altérations chromosomiques, telles que les translocations, destructions submicroscopiques et amplifications 14. Par exemple, vingt pour cent des tumeurs cancéreuses du sein envahissant montrent l’amplification du récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) de 2 gènes15,16,17, qui est associée à un pronostic sombre18 ,,19. Détermination de l’état d’amplification et la surexpression de HER2 dans le cancer du sein par les poissons est nécessaire pour sélectionner les patients pour la thérapie anti-HER2-réalisé et est un compagnon diagnostique énuméré par la Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. Afin de permettre une large application du diagnostic compagnon à base de poisson dans les soins de santé, des essais ont été élaborés et approuvés pour tissus FFIP.

Dans une étude précédente, nous avons montré que les tissus NCFPE ne peuvent servir pour des analyses de poissons qui ont été approuvés pour tissu FFPE. Cependant, les tests de temps série de poste différent des procédures de fixation des tissus NCFPE avec 4 % tamponnée de formaldéhyde ont montré que poste des temps de fixation de 18 h ou plus NCFPE des sections de tissu atteint des résultats équivalents à ceux avec FFIP tissus14.

Dans cette étude, nous fournir un protocole détaillé et démontrer que l’impact du tissu non-cross-linking, formol fixation et 24h 4 % mis en mémoire tampon après fixation de formaldéhyde sur les sections utilisées pour la qualité de poisson HER2 et l’ARN du même spécimen tissu primaire.

Figure 1
Figure 1 : Schéma montrant les étapes pour l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et analyse de RNA de formol fixé paraffine incorporé (FFIP) et non-cross-linking, formol fixe paraffine encastré tissus (NCFPE). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Université médicale de Graz (référence numéro 20-066), Autriche. Des échantillons de tissus ont été prélevés de deux cas de cancers du sein invasif primaire réséqués chirurgicalement après que les patients avaient donné consentement éclairé.

1. fixation du tissu

Nota : Tissus fixation est effectuée soit avec une solution standard de formol tamponné (RAOUDHA), définie comme solution de 10 % de formol contenant une fraction massique de 3,7 % (correspondant à une fraction volumique de 4 %) de formaldéhyde tamponnée à pH 6,8 à pH 7,2 selon CEN/TS 16827-1:2015 ou le système de fixation de tissu non-cross-linking, formol (aussi dénommé la solution de rechange fixation ci-dessous) consistant en un fixateur et une solution de stabilisateur à température ambiante (RT).

  1. Couper la poitrine avec un scalpel stérile des échantillons de tissus de cancer en deux moitiés chaque 4 mm d’épaisseur pour assurer la quantité suffisante de tissu. Utilisez une taille maximale de 4 x 15 x 15 mm pour la fixation du tissu NCFPE ou RAOUDHA.
  2. Placez chaque moitié de l’échantillon de la tumeur dans une cassette de tissu standard et il immergez-la dans RAOUDHA ou la solution de fixation alternative pendant 24 h avec un volume par rapport de volume (v/v) de fixateur de 4 pièces et une partie des tissus (4 mL/1 g de tissu (idéalement 1 g/10 mL)).
  3. Transférer les échantillons d’alternativement-fixé dans la solution de stabilisateur pendant 2-72 h par ouvrir le conteneur, en tournant la cassette de tissu de 180° et submergeant.
  4. Placer les cassettes de tissu avec les échantillons de RAOUDHA-correction dans 250 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 min à ta supprimer RAOUDHA résiduelle.
    Remarque : Cette étape est importante pour éviter la contamination de RAOUDHA de non-cross-linking des échantillons traités fixateur dans le processeur de tissus automatisés, qui détruirait les propriétés bénéfiques de non-cross-linking fixatifs pour la préservation des biomolécules.
    ATTENTION : RAOUDHA est une solution dangereuse, provoque des irritations de la peau, des lésions oculaires graves, peut-être causer une réaction allergique cutanée, est susceptible de provoquer des anomalies génétiques, peut causer le cancer, irritation des voies respiratoires, somnolence et causes des dommages aux organes. L’autre fixateur est toxique par inhalation, par contact avec la peau et en cas d’ingestion, irritant pour les yeux et la peau, danger d’effets irréversibles très graves par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Inhalation et le contact physique doivent être évités pour les deux solutions de fixation. Porter un vêtement de protection approprié, des gants et protection oculaire et faciale. Travailler sous une hotte.
  5. Procéder au traitement de tissus, enrobage et découpe de tissus (sections 2 et 3).

2. traitement tissus et incorporation

  1. Effectuer une déshydratation progressive des cassettes de tissu avec les échantillons de tissu fixe à 70 % (2 x 15 min), 80 % (30 min), 90 % (60 min), et l’éthanol à 99 % (2 x 60 min), suivie de xylène (2 x 60 min). Puis infiltrer avec de la paraffine dans un processeur de tissus automatisés (4 x 45 min).
  2. À l’aide de pinces, placer les échantillons déshydratés et s’est infiltré dans la paraffine (alternativement et RAOUDHA-fixe) dans des moules métalliques.
  3. Incorporer les échantillons en paraffine fondue 5-10 mL (point de solidification 56-58 ° C) en utilisant un enrobage de paraffine instrument.
  4. Placer les moules sur une plaque de refroidissement à-5 ° C pendant 30 min.
  5. Récupérer les blocs de paraffine tissus de moules.
  6. Stocker les blocs qui en résulte (alternativement-fixe, paraffine (NCFPE) et la paraffine RAOUDHA-fixe (FFIP)) dans l’obscurité à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.

3. tissu sectionnement et diapositive préparation de poisson

NOTE : FFIP sections sont directement utilisées pour le poisson, tandis que diapositives avec des sections NCFPE post résolus dans RAOUDHA pendant 24 h avant la procédure de poissons.

  1. Insérez une lame à usage unique dans le microtome et réglez le microtome à 10 µm.
  2. Prenez le premier bloc de la plaque de refroidissement et insérez-le dans l’instrument.
  3. Couper le bloc jusqu'à l’obtention d’une surface plane. Nettoyer le microtome à l’aide d’un pinceau et ajustez-la à 3 µm. jeter les premières sections 2-3.
  4. Coupes de 3 µm de blocs NCFPE et FFIP et placez-les dans un bain d’eau froide (l’eau ultrapure).
    Remarque : Pour obtenir les meilleures photographies sans noyaux qui se chevauchent, ici, image de 2 sections de µm au lieu de 3-5 µm tel que recommandé dans la notice de manufacturer´s sont affichées.
  5. Ramasser chaque section flottante avec un pinceau fin et une aiguille sur une lame de microscope couché pour l’adherence des coupes de tissus.
  6. Plonger cette diapositive dans une tiède (40 ° C) bain d’eau et laisser la section étirer complètement.
  7. Replacez la section sur la diapositive en tirant délicatement la lame hors de l’eau et éviter les faux plis.
  8. Laissez que toutes les sections sécher à température ambiante pendant 1 h.
  9. Faire chauffer les diapositives à 70 ° C pendant 30 min dans un incubateur pour faire fondre de la paraffine.
  10. Posez les lames horizontale dans un verre pot de coloration.
  11. Réhydrater les sections par étapes à la droite dans les cuves de coloration remplies de 250 mL chacun des liquides suivants : 100 % xylène 2 x 15 min, éthanol à 96 % 2 x 15 min, 90 % éthanol 2 min, 80 % éthanol 2 min, éthanol à 70 % 2 min, 50 % d’éthanol 2 min et distillée 2 x 10 min de l’eau.
    ATTENTION : Effectuez des opérations déparaffinage et réhydratation dans une hotte de laboratoire, ne pas inhaler des solvants toxiques volatilisés.
    Remarque : Selon les sections et les tissus, il peut être nécessaire tester le temps de différentes d’incubation à l’avance.

4. après fixation des spécimens NCFPE

  1. Effectuer après fixation des lames NCFPE en les plaçant dans un pot de coloration nouveau rempli de RAOUDHA pendant 24 h à RT. Place le bocal dans une hotte de laboratoire au cours de l’étape d’après fixation 24h.
  2. RAOUDHA excès enlever par lavage avec phosphate buffered saline (3 x 10 min) et (2 x 10 min) d’eau distillée.

5. hybridation in situ fluorescence (poisson)

NOTE : Ici le poisson est réalisée en utilisant la sonde disponible dans le commerce du bicolore HER2/CEN17 Kit selon les instructions du fabricant. Ne laissez pas les sections de tissu à sécher pendant l’hybridation et étapes de lavage. Ne pas laisser la sonde ADN et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ADN contre-colorant solutions pour être exposé à la lumière pendant une longue période. Effectuez ces opérations dans l’obscurité à l’aide de conteneurs opaque. Selon l’âge et l’étape de la fixation de l’échantillon, augmenter ou diminuer la dénaturation et températures pour obtenir les meilleurs résultats d’hybridation de lavage.

  1. Placer un pot de coloration contenant 250 mL de solution de prétraitement thermique citrique dans un bain d’eau de 98 ° C.
  2. Placez la FFPE réhydraté et NCFPE post fixe se glisse dans le bocal et incuber pendant 15 min.
N’utilisez pas plus de six diapositives par pot de coloration.
  • Laver les lames dans l’eau distillée pendant 3 min à ta dans un nouveau pot de coloration.
  • Pour protéolyse, placer les lames dans un système d’hybridation de régulation de température à 37 ° C.
    1. Appliquer immédiatement, le-prêt-à-utiliser solution de pepsine (2mg/ml) goutte à goutte (~ 30 µl par goutte d’eau) pour les sections de tissu jusqu'à ce qu’elle soit complètement recouverte. Incuber pendant 9 min à 37 ° C dans le système d’hybridation.
      Remarque : Un temps d’incubation de 5 à 15 min est recommandé. Le moment optimal pour la protéolyse devrait être déterminé à l’avance.
    2. Les diapositives dans un bocal contenant du tampon de lavage SSC et incuber pendant 5 min.
    3. Rincer les lames dans l’eau distillée pendant 1 min à température ambiante.
    4. Effectuer la déshydratation des sections dans les alcools graduées suivantes : 50 %, 70 %, 90 % et 100 % chacun pour 1 min. Air sec les sections.
    5. Pour l’hybridation, prélever 10 µL de sonde HER2/CEN17 sur les coupes de tissus secs, couvrir chaque échantillon avec un lamelle couvre-objet et sceller avec du ciment de caoutchouc.
      Remarque : 10 µL de sonde est recommandé par zone de tissu de 22 x 22 mm. Un léger réchauffement de la sonde facilite le processus de pipetage. Éviter les bulles et longue exposition de la sonde à la lumière.
    6. Co-dénaturer sonde et échantillon d’ADN dans le système d’hybridation à 75 ° C pendant 10 min.
    7. Définir le système d’hybridation à 37 ° C et s’hybrident du jour au lendemain.
    8. Retirer délicatement la colle de caoutchouc avec une pince de poteau-hybridation et de détection.
    9. Incuber les lames dans une coloration jar contenant 37 ° C préchauffé 1 x lavage tampons A pendant 5 min. Retirez le couvre-objet.
    10. Laver les diapositives à l’aide de préchauffé 1 x lavage tampon A deux fois pendant 5 min à 37 ° C.
    11. Déshydrater les diapositives dans l’éthanol à 70 %, 90 % et 100 %, 1 min chaque.
    12. Sécher les échantillons dans l’air et protéger de la lumière.
    13. Pour la coloration, appliquez 30 µL DAPI-solution pour la zone hybridée en évitant les bulles. Couvrir les sections avec une lamelle.
    14. Incuber pendant 15 min, abri de la lumière.
    15. Retirez soigneusement les excès DAPI-solution en appuyant doucement sur la diapositive entre papiers filtres.
    16. Stocker les lames à 2-8 ° C dans l’obscurité pendant 2 semaines jusqu'à évaluation par microscopie confocale.
  • 6. confocal d’imagerie et de numérisation de diapositives de poisson

    1. Effectuer d’imagerie confocale et la numérisation des diapositives sur un scanner numérique confocal équipé d’un 40 x / 1.2 objectif de NA, quadri-bande filtres (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) et un 5.5Mpx, 16bits, refroidi caméra scientifique oxyde de métal complémentaire à semi-conducteurs (CMOS).
    2. Acquérir les images avec des filtres pour vert (excitation : 503 nm ; émission : 528 nm) et orange (excitation : 547 nm ; émission : 572 nm) canaux.

    7. l’interprétation

    Remarque : La sonde HER2/CEN17 est un mélange d’une rouge marqué au fluorochrome CEN17 sonde spécifique pour la région centromérique alpha satellite du chromosome 17 (D17Z1) et une vert marqué au fluorochrome HER2 sonde spécifique du gène HER2 (sonde emplacement 17q12). Les échantillons de tumeur avec une ≤2. 0 du ratio de HER2:CEN17 par noyau sont marqués comme d’habitude, tandis que ceux avec un ratio de HER2:CEN17 ≥2. 0 sont marqués comme amplifié17.

    1. Effectuer une analyse de la qualité des images avec l’open source CaseViewer 2.120.
      1. Évaluer au moins 20 cellules qui sont trouvent dans deux régions différentes de la composante invasive de la carcinome tel que défini par un pathologiste. Inclure les noyaux bien réparties clairement distingués dans l’aire de comptage. Exclure du comptage des regions tissulaires à la frontière et les zones rétractées ou pressés.

    8. ARN qualité

    1. Extraction de l’ARN
      1. S’assurer que tous les instruments et les outils sont RNAse librement. Utilisez une solution de RNAse-élimination.
      2. Couper des sections de 10 à 20 (5 µm d’épaisseur) de NCFPE ou FFIP échantillons à l’aide d’un microtome suivant le protocole jusqu'à l’étape 3,8.
      3. Extrait RNA NCFPE échantillons utilisant l’isolement nécessaire (voir la Table des matières). Extrait RNA échantillons FFPE en utilisant un kit d’isolation FFIP RNA.
        Remarque : L’Extraction d’ARN à partir de fixateurs non-cross-linking nécessite une méthode d’isolement adaptée à la méthode de fixation. Ne pas utiliser toute autre méthode d’isolement RNA (Trizol, RNeasy FFPE, etc. pour le spécimen de NCFPE).
      4. Déterminer la concentration d’ARN et de la pureté à l’aide d’un spectrophotomètre. Le rapport de la densité optique à 260 nm et 280 nm (A260/280) devrait être ~ 2.0.
      5. Conserver l’ARN isolé à-70 ° C jusqu'à l’analyse plus poussée.
    2. Effectuer une glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) en temps réel la transcription inverse PCR en utilisant des amorces pour générer des amplicons de différentes longueurs8,9.
      1. Utiliser un kit de transcription inverse ARNC conformément aux instructions de manufacturer´s pour la synthèse de cDNA. Utilisez 500 ng ARN de chaque échantillon. Conserver ADNc à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
      2. Préparer le mélange maître PCR conformément aux instructions manufacturer´s.
      3. Déposer le mélange maître PCR en géométrie dans une plaque 384 puits de réaction. Ajouter 4 µL de 01:16 dilué cDNA (modèle PCR). Effectuer l’ACP conformément aux instructions manufacturer´s.
        Remarque : Pour GAPDH humaine, les amorces suivantes ont été utilisées : GAPDH vers l’avant : 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´ ; GAPDH inverse : bp 71 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, bp 153 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, bp 200 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, bp 277 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, bp 323 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ et 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´.
      4. Analyser les résultats à l’aide d’un logiciel applicable à la machine PCR. Produits non spécifiques doivent être exclues à l’issu de la fusion de courbe analyse21.

    Representative Results

    Détermination de poissons de HER2 :

    Les intensités de signal de HER2-poissons du FFIP et NCFPE sont semblables (Figure 2). Les deux cas dans la plupart des cellules montrent un excès évident du signal vert (l’indicatif du verbe le locus du gène HER2 amplifié) par rapport au signal rouge (gène de référence CEN17). Par conséquent, l’affaire montre un gène HER2 amplifié, ce qui signifie que cette patiente est prévue pour répondre au trastuzumab, une thérapie anti-HER2 ciblées. L’échantillon FFPE servait de témoin positif. Les signaux observés dans les cellules non néoplasiques (tant au FFIP et NCFPE) servent de référence interne et le contrôle négatif pour l’amplification du gène HER2. Pour chaque série d’analyse, au moins une section ayant le statut d’amplification des gènes connus devrait être utilisée comme témoin positif pour la réaction d’hybridation.

    Qualité de l’ARN :

    FFIP correspondante et NCFPE échantillons provenant de deux cas différents montrent des différences dans la qualité de RNA en employant la transcription inverse PCR en temps réel. Résultats obtenus montrent l’efficacité de l’amplification différents amplicon différentes longueurs (c.-à-d., 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) de l’ARNm GAPDH. Toutes les valeurs de Ct (cycle seuil) obtenus à partir des échantillons FFPE étaient supérieures à celles de NCFPE. Cette différence illustre la basse amplificability PCR d’ARNm isolés des tissus FFIP, suggérant une modification chimique plus prononcée. En outre, les valeurs plus élevées de la Ct pour longtemps par rapport à des amplicons courts constituent un indicateur pour la fragmentation de l’ARNm. En comparaison, les pentes de valeur de Ct des longueurs différentes amplicon montre plus prononcée de fragmentation d’ADN messagère dans FFIP que les tissus NCFPE (Figure 3).

    Figure 2
    Figure 2 : résultats représentatifs de HER2 poissons pour correspondant au formol fixé paraffine incorporé (FFIP) et non-cross-linking, formol paraffine fixe encastré des sections de tissu (NCFPE). Des échantillons correspondants dans les mêmes tissus FFIP (A) et NCFPE (B) sont indiquées. Contrairement aux cellules en interphase normal (C), où deux vert (HER2) et deux signaux (CEN17) rouges sont attendus, les cellules avec le locus du gène HER2 amplifié représentent des copies multiples de signaux verts (HER2) (D). Statut d’amplification HER2 était identique en FFIP et les sections post fixes de NCFPE (A, B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3 : résultats d’un test PCR en temps réel de la transcription inverse utilisé pour le contrôle de qualité de RNA. Axe y : Les valeurs de Ct (cycle seuil) du gène GAPDH sont indiqués pour longueurs différentes amplicon (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) sur l’axe des abscisses. l’ARNm est isolé du FFIP et NCFPE de deux échantillons de tissus de cancer de sein différents transformées en parallèle et transcrites à l’ARNC pour la PCR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Discussion

    Les résultats démontrent deux principales constatations. Tout d’abord, une étape d’après fixation RAOUDHA simple 24h des sections coupées provenant de tissus NCFPE est suffisante pour obtenir des résultats équivalents à ceux avec FFIP dans les analyses de poissons à l’aide de dosages de poisson approuvés pour tissus FFIP (voir aussi la référence14). Ce protocole a l’avantage d’utiliser des dosages de poisson initialement élaboré et approuvé pour FFIP sans la nécessité pour la revalidation complète (par exemple, en optimisant les conditions préalables de l’hybridation pour tissus non réticulé). Le protocole de poissons peut être utilisé exactement comme décrit dans les instructions du fabricant.

    Modifications mineures de manufacturer´s consignes décrites dans ce protocole (par ex. tissu section diamètre incubation périodes et les étapes de déparaffinage) résultent des adaptations précédentes, qui est explicitement recommandé par le fabricant en raison de l’utilisation des types de tissus différents et des méthodes de fixation.

    L’étape d’après fixation est essentielle car il nécessite un temps de réaction chimique de 18 à 24 heures, ce qui prolonge la durée de l’analyse d’un jour, mais permet le même flux de travail quotidien que développées pour tissus FFIP (Figure 1). RAOUDHA est signalé à pénétrer les tissus au rythme moyen de 1 mm par heure22 à 5 mm à 2 h selon le tissu type23,24. L’observation que seulement après fixation prolongée de plus de 18 h pourrait modifier les propriétés de NCFPE aux sections FFIP, indique que pas la pénétration du fixateur, mais le temps de réaction chimique est essentielle pour atteindre les résultats escomptés1 ,,14.

    En second lieu, le tissu NCFPE restant qui ne sert pas pour après fixation peut être utilisé pour approfondir les analyses moléculaires comme les biomolécules sont bien conservés. Cela a été démontré par transcription inverse en temps réel PCR (Figure 3). L’essai est plus sensible et plus spécifique que la valeur RIN électrophorégramme dérivés (RNA intégrité nombre) quant à la qualité de la RNA (modification chimique et fragmentation) d’ARNm isolés des tissus inclus en paraffine,8. Contrôle de la qualité se limitait dans cette étude de PCR en temps réel, puisque des groupes indépendants ont montré que, en plus de l’ARN, la qualité de l’ADN et de protéines isolées de NCFPE est meilleure que celle du FFIP tissus 8,9, 13.

    Le protocole présenté ci-dessous, le cas échéant (p. ex., recette RAOUDHA, conditions de fixation, RNA contrôle de la qualité, validation), les exigences des spécifications techniques CEN pré-analytique procédures pour diagnostic in vitro (IVD), qui ont été récemment libérés par le Comité européen de normalisation (CEN) (p. ex. CEN/TS 16827-1:2015 pour ARN de tissus FFPE qui se réfère à la norme ISO 15189).

    La méthode est limitée à ce fixateur spécifique. Bien que la bonne conservation des biomolécules et de morphologie à l’aide du fixateur non-cross-linking, formol a été présentée dans plusieurs études, il est principalement utilisé dans la recherche, mais pas dans des applications médicales courantes. Une des raisons est que remplacer l’étalon-or RAOUDHA fixation par un autre fixateur nécessiterait une variété d’études de validation que pas tous les protocoles optimisés pour matériel FFIP peuvent être utilisés pour les matériaux fixés avec non-cross-linking fixateurs. Autres méthodes de fixation des tissus pour ce protocole de poissons n’ont pas été testés.

    L’étape d’après fixation simple décrite dans ce manuscrit a l’avantage d’utiliser les essais de l’IVD a approuvé les deux pour tissus FFPE et NCFPE.

    Disclosures

    D.G. est employé par Qiagen et détient stock options ou bond en régime de retraite de la société. Les données présentées dans ce manuscrit se réfèrent au système des tissus PAXgene, qui a été développé en collaboration par Qiagen et PreAnalytiX. QIAGEN est partenaire industriel du laboratoire Christian Doppler subventionnée par l’état des recherches biologiques et des Technologies de biobanques. Tous les auteurs ont aucun conflit d’intérêts et aucun intérêts financiers concurrents.

    Acknowledgments

    Nous remercions l’équipe du laboratoire de pathologie moléculaire à l’Institut de pathologie de l’Université de Graz médical pour leur expertise et soutien. En outre, nous remercions Iris Kufferath et Daniela Pabst d’assistance technique, Bernadette Rieger et Sylvia Eidenhammer pour traiter les cas de HER2 ainsi que Kinga Szurian (pathologiste) et Tamas Regényi (3DHISTEC). Nous remercions Kungl Penelope pour la relecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu financièrement par le Fonds de recherche Doppler chrétien, ministère fédéral autrichien de la Science, recherche et Economie et la Fondation nationale pour la recherche, de technologie et de développement.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany www.sav-lp.de FN-200L-4-1 Tissue fixative
    Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada www.simport.com M-498 Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 765112 For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 813150 Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
    Merck Millipore, Munich, Germany www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html MC1009834000 Dehydration of tissue samples
    VWR Chemicals, Darmstadt, Germany https://at.vwr.com 10293EP Dehydration of tissue samples
    ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria www.herba-chemosan.at 2549662 32 Paraffin used in a tissue processing device
    Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria www.LeicaBiosystems.com 39602004 Paraffin embedding medium
    Sanova Diagnostik, Vienna, Austria www.sanova.at 5229 Paraffin embedding instrument for tissues for histology
    Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria www.histocom.info M 910010 This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
    Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark www.chem.agilent.com K802021-2 Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 73504 For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 765134 For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
    ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany www.zytovision.com Z-2015-200 For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
    3DHISTEC, Budapest, Hungary www.3dhistech.com Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 4368814 The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 4367659 PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
    ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE www.thermofisher.com Ser. Nr. F239 Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
    QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System www.thermofisher.com 4485701 PCR machine,
    Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.

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    References

    1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33, (8), 845-853 (1985).
    2. Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3, (1), 73-77 (2003).
    3. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27, (22), 4436-4443 (1999).
    4. Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279, (8), 6235-6243 (2003).
    5. Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13, (3), 282-288 (2011).
    6. Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94, (1), 188-194 (2013).
    7. Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
    8. Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8, (7), e70714 (2013).
    9. Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14, (5), 458-466 (2012).
    10. Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465, (5), 509-519 (2014).
    11. Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9, (10), 5188-5196 (2010).
    12. Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6, (11), e27704 (2011).
    13. Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
    14. Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97, (2), 202-206 (2016).
    15. Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13, (1), 63-72 (1996).
    16. Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5, (1), 63-69 (2004).
    17. Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131, (1), 18-43 (2007).
    18. Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15, (8), 2894-2904 (1997).
    19. Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19, (8), 2334-2356 (2001).
    20. Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. (2017).
    21. Applied Biosystems. QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. Publication Number 4489822 (2013).
    22. NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry. Wayne. (1999).
    23. Baker, J. R. Principles of Biological Microtechnique. London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).
    24. Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132, (12), 1929-1935 (2008).

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