Metoder och Tips för intravenös administrering av Adeno-associerade Virus till råttor och utvärdering av centrala nervsystemet transduktion

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Metoder för en omfattande centrala nervsystemet gen leverans hos råtta omfattas. I det här exemplet är syftet att efterlikna en sjukdom som påverkar hela ryggmärgen. Den utbredda transduktion kan användas för att leverera ett terapeutiskt protein till CNS från en engångsavgift, perifer administrering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Adeno-associerade virusvektorer (AAV) är en nyckel reagens i neurovetenskaperna för klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR), optogenetik, cre-lox inriktning, etc. Syftet med detta manuskript är att hjälpa utredaren försöker expansiva centrala nervsystemet (CNS) genöverföring i råtta via svans ven injektion av AAV. Omfattande uttryck är relevanta för villkor med utbredd patologi, och en råtta modell är betydande på grund av sin större storlek och fysiologiska likheter till människor jämfört med möss. I detta exempel ansökan används en omfattande neuronala transduktion att efterlikna en neurodegenerativ sjukdom som drabbar hela ryggmärgen, amyotrofisk lateralskleros (ALS). Den effektiva omfattande CNS transduktion kan också användas för att leverera terapeutiska proteinet faktorer i prekliniska studier. Efter en efter injektion uttryck intervall på flera veckor utvärderas effekterna av transduktion. För ett grönt fluorescerande protein (GFP) kontroll vektor beräknas beloppet av GFP i lillhjärnan snabbt och tillförlitligt av en grundläggande bildprogrammet. För motorisk sjukdom fenotyper som induceras av ALS relaterade protein transactive svar DNA-bindande protein av 43 kDa (TDP-43), poängsätts underskotten av fly reflex och rotarod. Bortom sjukdomen modellering och genterapi finns det olika potentiella tillämpningar för den omfattande gen inriktning beskrivs här. Utökad användning av denna metod kommer stödet att påskynda hypotesprövning i neurovetenskap och Neurogenetik.

Introduction

Rekombinant adeno-associerade (AAV) virusvektorer är oumbärliga verktyg för CNS forskning eftersom de är så effektiv för transducing nervceller invivo. AAV vektorer är mycket mångsidig för att studera olika transgener och protein isoformer, olika vävnader, olika värdart och olika administreringsvägar. Exempelvis kan AAV ges till möss av en perifer, relativt icke-invasiv, intravenös injektion till transduce nervceller i hela CNS som först beskrivs i Foust et al. och Duque o.a. (se JOVE papper av Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 denna gen leverans metod används i råttor effektivt uttrycka antingen grönt fluorescerande protein (GFP) eller ALS med protein, transactive svar DNA-bindande protein av 43 kDa (TDP-43) i CNS. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 arbetar i råttor är betydande eftersom råttans fysiologiska och metabola parametrar är närmare människor jämfört med möss och det finns beteendemässiga och toxikologiska analyser som utformats speciellt för råttor. Dessutom fler transgena råtta linjer blir tillgängliga som kan utnyttjas i AAV gen överföring studier.

Metoderna beskrivs för expansiva CNS genöverföring i råtta och snabb, tillförlitlig kvantifiering av resultaten. Omfattande CNS transduktion används för att efterlikna symptomatologyen av ALS hos råttor genom att uttrycka TDP-43 hela ryggmärgen. Metoden är svansen ven injektioner av TDP-43 vektorn till unga vuxna råttor som används i Jackson et al. 6 , 8 , 9 efter flera veckor, poängsätts TDP-43-inducerad motor underskott av två metoder: fly reflex och rotarod som används i Dayton et al. och Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 för kontroll GFP vektorns i postmortala analys beräknas området fluorescerande i lillhjärnan som ett index över transduktion effektivitet som används i Jackson et al. 6 , 8 analys av lillhjärnan har visat sig vara en snabb och tillförlitlig index av graden av CNS transduktion efter perifer gen leverans och bör tillämpas på en mängd metoder försöker perifera-till-central genöverföring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alla förfaranden följde lämpliga NIH riktlinjerna. Alla förfaranden följde djurens protokoll som godkänts av djur vård och användning kommittén på LSU Health Sciences Center i Shreveport. Kvinnliga Sprague-Dawley-råttor vid 6 veckors ålder användes för proceduren.

1. fastställa vilka doser/volymer av vektor behövs

  1. väga råttorna att injiceras och fastställa beloppet för virala vektorn behövs för varje djur baserat på titern (koncentration) av vektor preparatet. Använda vektor doser som har varit framgångsrika för effektiv uttryck i råtta CNS tidigare (se Jackson et al. 6).
    Anmärkning: för AAV9 TDP-43 eller AAV9 GFP, en typisk dos är mellan 3 x 10 13 - 1 x 10 14 vektor genomen/kg. De unga vuxna råttorna vid 6 veckors ålder väger ca 150 g.
  2. Gör motsvarande doser per kg i alla djur för systematiska jämförelser. Kontrollera volymen inte överstiger standard rekommenderas injektionsvolymer (250-500 µL för en 250 g råtta). En typisk injektionsvolym är 200 μl till en ung vuxen råtta.

2. Förbereda arbetsstationen

  1. samla alla nödvändiga leveranser: ett paraffin filma fyrkantig (ca 5 x 5 cm) per djur, en spritsudd för beredning per djur, Flor Madrassera (2-3 per djur), Pipettera tips och en mikropipett.
  2. Förbereda arbetsytor genom att rengöra ytan med 70% etanol. Placera en värmedyna med den temperatur som anges till låg (~ 37 ° C). Placera en bänk pad ovanpå värmedyna.
  3. Förbered gasen anestesi (isofluran). Säkerställa tillräcklig syre och gas anestesi för förfarandet. Rengör den induktiv kammare och anestesi masken med 70% etanol och placera anestesi masken på bänken pad.

3. Förbereda vektorn

  1. Tina vektorn i rumstemperatur och etikett för ett sterilt mikrocentrifug rör för varje djur.
  2. Pipettera volymen av AAV bestäms i Stig 1.1 i lämpliga röret och med volym upp till önskad injektionsvolymen (här, 200 μl) med ringer Ringer ' s lösning eller saltlösning.
  3. Puls vortex provet för 1-2 s och sedan pulsera Centrifugera i 5 s att få provet till botten av röret.
  4. Pipettera totala injektionsvolymen för råttan ut ur röret och på torget i paraffin filma.
  5. Placera en 30 gauge nål på en 1 mL injektionsspruta.
  6. Placera nålen med den fasade kanten nedåt i vektorn på paraffin filma. Dra tillbaka sprutkolven tills alla virus är i kanylen och sprutan. Var noga med att undvika ritning luftbubblor i nålen, som blir enklare med lite övning.

4. Förbereda råtta

  1. slå syret upp till 1 L/min och Ställ in den isofluran anestesi till 5%. Se till att den gas anestesi flödar till induktion kammaren genom att kontrollera alla anslutningsslangar och Avstängningskranen orienteringar.
  2. Placera råtta i gaskammaren för anestesi induktion ca 3 min, tills råttan inte svarar.
  3. Säkerställa tillräcklig djup anestesi genom att nypa tån. Det bör ingen rörelse i den foten eller benet efter att tå nypa.
  4. Minska de isofluran anestesi till 2% för underhåll av anestesi och justera Avstängningskranen så att anestesi flödar till anestesi masken.
  5. Placera råtta ' s näsa i anestesi masken och justera råtta så att det ligger på dess sida.
  6. Identifiera laterala svans ven.
    Obs: Laterala svans venerna ligga på ungefär 10 och 2 o ' klocka med ryggens överkant svansen som 12 o ' klocka. Med råtta liggande på sidan, laterala svans ven ska vara vänd upp
  7. Torka injektionsstället med alkohol förberedelse pad. Injektionsstället är två tredjedelar ner längden på svansen.

5. Injicera vektorn

  1. håll stadigt svansen något ovanför injektionsstället med ett finger direkt över laterala svans ven; detta kommer att vidgas venen.
  2. Uppåt, justera nålen med synliga svans ven i samma riktning med fasningen.
  3. Genomborrar huden över svansen venen medan tar stor omsorg att undvika den andra handen hålla svansen och trycka på på svansen venen.
  4. Släppa trycket från svans venen att möjliggöra normalt blodflöde.
  5. Flytta nålen in i venen. För att säkerställa att nålen har punkterat svans venen, dra tillbaka lite på kolven. Om nålen är i venen, kommer blodet att flöda in nålen.
    1. Flytta nålen som behövs. Då, för att stabilisera nålen, flytta handen ovanför injektionsstället till nedanför injektionsstället och håll i slutet av sprutan mot svansen.
  6. Långsamt injicera vektorn i svansen (ungefärligt 20 µL/s).
    Obs: Venen kan förlora färg som vektor flödena igenom den. Tecken att lösningen injicerades utanför venen inkluderar blebbing, blanchering av huden, eller motstånd när du injicerar vektorn. Med övning, extra vaskulär exponering kan minimeras.
  7. När vektorn har administrerats, ta bort nålen från råtta och tryck en kompress mot injektionsstället för att hejda blödningen för 30-60 s.

6. Städa upp

  1. Stäng av isofluran anestesi och syre. Övervaka råtta tills det återfår medvetandet och sedan returnera den till sin bur.
  2. Noggrant placera alla nålar i behållaren för vassa föremål. Kassera alla andra disponibla material som är potentiellt förorenat med AAV i lämpliga biohazard behållare. Rengöra arbetande stationer med 70% etanol.

7. Utvärdera bakbenet fly reflex

Obs: bakbenet underskott uppstår vanligtvis 2-6 veckor efter TDP-43 genöverföring, beroende på vilken vektor dos.

  1. På en plan yta klar skräp, med två fingrar fånga råtta ' s svans ca 2 cm från kroppen. Lyft råtta försiktigt tills frambenen hänger medan du visar den ventrala undersidan av råtta.
    1. Utför proceduren varje vecka under hela experimentell tid-efter genöverföring (t.ex. upp till 12 veckor efter genöverföring).
      Obs: Också Poäng forelimb underskott på detta sätt, men bakbenet underskott är mer sannolikt att uppstå i denna modell, beroende på vilken vektor dos används.
  2. Observera bakbenen för 10 s. OBS om en eller båda bakbenen bita mot mittlinjen under 10 s.
  3. Upprepa detta test för totalt tre gånger med 30 s mellan prövningar. Om en eller båda bakbenen är knöt för var och en av tre studier, visar råtta motorisk dysfunktion. Spela in data (manuellt i anteckningar) som antingen ensidig eller bilateral bakbenet underskott närvarande om det finns konsekvent knyta över alla tre prövningar.

8. Utvärdera motorisk funktion på rotarod

  1. att ställa in rotarod, placera en bänk pad under rotarod och ställa acceleration till 4-40 varv per minut (rpm) över 2 min (frekvensen ökar med ~0.3 rpm/s). För en 12 veckors tid-kurs, kör ämnen vid 2, 4, 8 och 12 veckor efter genen överföra.
  2. Tillåter råttan att acklimatisera till testning rum för 20 min.
  3. Att träna råttan att använda rotarod för första gången, först starta rotarod på en inställd hastighet av 4 rpm och sedan placera råtta på rotarod. Låt råttan att gå för en fullständig revolution vid 4 rpm, sedan starta acceleration och låt råttan att gå på rotarod tills det faller av. Fortsätter utbildning tills råttan kan konsekvent gå för minst 40 s. En frisk, ung vuxen råtta blir lätt tränad på detta sätt.
    1. Vid en råtta med en märkbar försämring av motor, kan som hindrar råttan från att uppnå en baslinje latens för att falla av 40 s, ge råttan 3-5 utbildning försök innan du börjar rotarod scoring.
  4. För att börja rotarod testning, placera råtta på rotarod och börja acceleration av rotarod. Notera den tid vid vilken råtta faller från rotarod; Detta är latens falla. Om råttan är på rotarod efter 120 s, cap sessionen på denna punkt, ta bort råttan från rotarod och spela in en höst latens 120 s.
  5. Upprepa test två gånger för totalt tre studier. För att minimera effekten av trötthet, utrymme de prövningar minst 5 min apart. Genomsnittliga värderingar för tre prövningar. En unimpaired vuxen råtta har vanligtvis en genomsnittliga svarstid till nedgången av > 40 s.
  6. Råtta tillbaka i buren och rengör rotarod och omgivande områden med 70% etanol.

9. Kvantifiering av GFP uttryck i lillhjärnan

  1. söva råttorna och BEGJUTA med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sedan 4% PARAFORMALDEHYD. Dissekera hjärnan och ryggmärgen och Blötlägg vävnader i fixeringsvätskan över natten och sedan flytta dem till en 30% sackaroslösning. Efter Jämviktstiden, skär 50 μm koronalt avsnitt på en slädmikrotom med frysning etapp 4 , 5 , 6.
  2. Välja 3-6 delar av lillhjärnan som är jämnt fördelade i vermis, den centrala loben av lillhjärnan. Fluorescently etikett i GFP att maximera signalen. Använd primära antikroppen för god Jordbrukarsed på 1: 500 och Alexa-488 konjugerade sekundära antikroppen vid en spädning av 1:300 4 , 5 , 6.
    Obs: Se referenser 4 , 5 , 6 för mer information om provtagning, snittning och färgning förfaranden.
  3. Photomicrograph varje avsnitt i regionen definierad av intresse med en låg förstoring lins med Mikroskop. Använd ett 2,5 X-objektiv (N.A. 0.12) och filtret inställda 10, 450-490/515-565 excitation/utsläpp). Hålla kamerainställningar (exponering gånger, t.ex., 2 s) samma över prov som ska analyseras. Spara som en. TIF fil.
  4. Öppna photomicrograph i allmänt tillgängliga Scion image program; två fönster öppnas. Stäng fönstret anges som " indexerad färg ".
  5. Välj " alternativ ", sedan " densitet SliceŔ en rad nyanser kommer att anges i rött på fönstret Look-Up Table (LUT). I fönstret använda markören för att fylla i specifika GFP märkning endast och stoppa när icke-specifik bakgrunden börjar plockas upp i bilden.
    Obs: Detta kommer att belysa det fluorescerande området på photomicrograph att kvantifieras. Inställningarna bör optimeras för att specifikt fånga alla synligt fluorescerande celler. Med praxis, kan denna metod just framhäva specifika fluorescensen.
  6. Innan du mäter fluorescerande område, först se till att de mätningar som görs i de rätta enheterna (pixlar). För att göra detta, klicka på " analysera ", sedan " ställa ScaleŔ den fjärde raden ska säga " enheter ". Från den nedrullningsbara listan, Välj pixlar att mäta i pixlar, klicka " OK ". Växla mellan alternativen analys att " omfatta inre hål " att säkerställa införandet av hela cellkroppen i analysen.
  7. Att mäta fluorescerande området, klicka " analysera " och klicka sedan på " åtgärd ". Detta värde, klicka " analysera " Klicka på " Visa ResultsŔ ett resultatfönster visas. Fluorescerande området mätning blir under rubriken märkt " område ".
  8. För att säkerställa standardisering över mätningarna, ändrar inte markerade värdena i fönstret LUT.
  9. När alla mätningar har registrerats, genomsnittliga värden för varje djur (från 3-6 sektioner per djur). Använda en lämpliga statistiska test för att jämföra transduced områden mellan grupperna. 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TDP-43 inducerad motoriska funktionsnedsättningar skulle uppstå inom 2-6 veckor beroende på vilken dos av AAV TDP-43 används (figur 1). Misslyckade svans ven injektioner kommer att resultera i partiell eller inga nedskrivningar; AAV måste nå blodomloppet för att producera effekten. En framgångsrik injektion av AAV GFP kommer att resultera i GFP uttryck i hela hjärnan och ryggmärgen på en vektor-dosberoende sätt. När du använder starka rekombinant arrangören bilresa uttrycket, cytomegalovirus kyckling beta aktin hybrid arrangören, även känd som CAG arrangören, finns det effektiv uttryck i CNS samt flera andra vävnader såsom lever och hjärta. 4 , 5 , 10 inom råtta CNS, när du använder AAV9 eller AAV PHP. B vektorer, mönstret är huvudsakligen neuronala transduktion och bara glesa, sporadiska gliaceller transduktion. 4 , 8 eftersom ingen könsskillnad i transduktion effektivitet observerades hos råttor med metoden omfattande, honor används vanligtvis för intravenös genöverföring på grund av deras lägre vikter. 6

Den semikvantitativa bildgivande metod som beskrivs är snabb och tillförlitlig eftersom det finns en utmärkt signal-brus-förhållande. En icke-sensorik provet jämförs med ett transduced prov i figur 2 med både prover som färgas med GFP antikroppen. Värden som samlats in från dessa prover visar 0,3% buller (från de värden som anges i figur 2B, D) i icke-sensorik provet, som kan anses försumbar. Med tanke på det utmärkta signal-brus-förhållandet, är denna metod giltig för snabba jämförelser experimentella betingelser såsom vektor typer, vektor dos, kön, ålder, etc.

Figure 1
Figur 1. Storskalig AAV9 TDP-43 genöverföring till råttor orsakar progressiv motor njurfunktion. Rotarod prestanda 1-3 veckor efter genen överföra kontrollen GFP eller ALS-relaterade genen TDP-43. Försökspersonerna testades innan genöverföring och de efterföljande mätningarna var uttryckt som ett förhållande till baslinjen tidpunkten. En normal obehandlad råtta kommer att bo på rotarod från 60-90 s under dessa förhållanden. Denna siffra har ändrats från6.

Figure 2
Figur 2. Snabb kvantifiering av området GFP-positiv fluorescerande i lillhjärnan efter intravenös AAV administrering till råtta. A, B) icke-sensorik prov som var fläckade av GFP antikroppen. C, D) prov från en råtta som fick AAV9 GFP. B, D) The densitet skiva alternativ på Scion Image används för att selektivt belysa området fluorescerande rött och sedan de röda pixlarna räknas av programmet. Alternativet densitet skiva bör belysa alla synliga fluorescerande celler som kan ses i C. Det röda området uttryckt i fyrkantiga pixlar som beräknas av programmet visas i B, D. Tidpunkten var 4 veckor efter en svans ven injektion av AAV9 GFP till en ung vuxen råtta på en vector 1 x 1014 vektor genomen/kg. Skalstapeln i A är 536 µm; samma förstoring i A-D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En mängd leveransvägar har testats för AAV vektorer: intra-parenkymal, intra-cerebroventricular, intra-thecal, intravenös, intranasalt, intramuskulär, etc. Varje rutt kan ha särskilda fördelar samt nackdelar. Svans ven administrering av AAV till vuxna råttor är en tillförlitlig metod för att uppnå konsekvent transduktion i CNS. Den perifera injektion metoden undviker införandet av en injektion kanyl i CNS vävnader och är därför minimalt invasiv. Det effektiva CNS-uttryck som kan uppnås genom denna metod är den största fördelen med tekniken. Andra praktiska fördelar är att den injektion metoden är mycket snabb (ca 10 min per djur från början till slut) och att svansen ven injektionerna inte är mycket tekniska och därför kan bemästras snabbt. Visst, en stor nackdel är att en massa hög titer vektor behövs, som kommer att vara ett genomförbarhet fråga om de AAV preps är under 1 x 1013 vektor genomen/ml. Med ytterligare förfining av vektor inriktning funktioner, kan detta tillvägagångssätt vara fördelaktigt för kliniska genterapi i framtiden, givet att genen leveransen är av en perifer rutt och därmed relativt icke-invasiv. Däremot, mer direkt inom ryggmärgsvätskan vätska injektioner kan vara gynnsamt i prekliniska och kliniska metoder av två skäl: mer begränsade spridningen av vektorn och användning av lägre vektor doser.

Råttor med mörkare pigmentering, kan svans venen vara svårare att identifiera. Så, alternativa administrationssätt som retro-orbital injektioner eller intravenösa injektioner till ytlig ven kan användas. Retro-orbital injektionerna rikta en tät kapillär säng och liknar således en intravenös injektion. För möss och kanske råttor också metoden retro-orbital kan vara lättare än svans ven injektioner, men tre studier har visat stor konsekvens av svans ven injektionerna hos vuxna råttor. 6 , 8 , 9 de flesta detta arbete används en stark rekombinant arrangören att köra transgenens uttryck, cytomegalovirus kyckling beta aktin hybrid arrangören. 10 om försöksledaren vill avgränsa uttryck till nervceller i CNS, en cell typ-specifika promotorn kan prövas, till exempel synapsin arrangören. 8 , 11

När det gäller metoden imaging är det en snabb, semikvantitativ metod för att uppskatta transduktion effektivitet. Om genomfördes korrekt, sedan ger analysen en tillförlitlig uppskattning av det transduced området. Stereology anropas metoden guldmyntfoten för räkna objekt i CNS-vävnaden. Det tar ca 75 min per djur att genomföra en beteendetester sond i en region av intresse i hjärnan medan den beskrivna metoden är snabbare på 20 min per djur eller ännu mindre när skalas upp. Om alla villkor hålls lika och samma region samplas ordentligt, konsekvens av data närmar sig stor konsekvens av stereology och stora grupper av prov kan analyseras snabbt massor.

Det finns ett antal ytterligare tekniska anteckningar som motiverar ytterligare diskussion. För avsnitt 1 angående vektor doser, vektor doserna som krävs för effektiv transgenens uttryck hos råttor bestämdes av trial-and-error och dos-respons i Wang et al., Dayton et al.och Jackson et al., samt tidigare doser som används i möss (Foust et al. och Duque et al). 1 , 2 , 4 , 5 , 6 säkert en kritisk, och potentiellt hastighetsbegränsande steget producerar hög-titer AAV preps för att uppnå effektiva doserna.

För avsnitt 3 bör om lastning vektorn i nålen, luftbubblor i injektionslösningen undvikas så gott som möjligt. En liten mängd luft bör inte vara problematiskt eftersom detta kan filtreras bort av lungorna, men överdrivna mängder luft sprutas in i venen kan orsaka en venös luftemboli som potentiellt som ledde till döden. 12 om bubblor i sprutan, viruset bör utvisas från sprutan och en ny spruta ska läsas. För att undvika skapandet av bubblor, se till att placera nålen nära släpp av vektor på parafilm med fasningen nedåt. När majoriteten av vektorn har tagits upp i nålen, mycket långsamt dra upp den överblivna lösningen. En liten luftficka bildar på baksidan av sprutan. Detta är döda utrymme och inte kommer att injiceras. För att säkerställa att det förblir mot bakre delen av sprutan, håll sprutan horisontellt eller spetsiga nedåt och inte svep sprutan.

För avsnitt 5 angående injektionerna, för att säkerställa att injektionen går in i venen och inte vävnaden som omger venen, när nålen har infogats, dra lite kolven för att skapa undertryck på nålspetsen. Som nämnts, om nålen är i venen, blod ska strömma tillbaka in nålen och kommer att synas vid basen av nålen. Medan du injicerar in i venen, bör lite motstånd kännas när nålen placeras på lämpligt sätt. Om betydande motstånd påträffas, är det troligt att injektionen kommer in i vävnaden av svansen som beskrivs ovan. Det är också möjligt att punktera genom venen, orsakar en ”blåst ven”, när vinkeln att nålen sitter är för brant, när mätaren av nålen är för stor för venen eller när den injektion-hastigheten är alltför snabba att sätta för mycket press på venen. En blåst ven kan uppstå under första punkteringen av venen eller under injektionen. För att undvika punktera venen under injektionen eller ha nålen bli lossnar från venen, bör sprutan stabiliseras genom att hålla i slutet av sprutan mot svansen som nämnts. Om nålen blir rubbas eller en andra injektion behövs för en annan anledning, kan den andra injektionen göras antingen till laterala svans ven på motsatt sida eller upp närmare kroppen på samma sida.

Avsnitt 8 drivs rotarod analysen med 4 veckors mellanrum under experimentet. Normal, obehandlad råttor har bättre resultat när de är yngre (4-6 veckor gamla) än i äldre åldrar. Underskotten i den fly-reflexen är ritade som överlevnad av lem funktion över tid. Överlevnadskurvor analyseras av ett log-rank test på Prism programvara.

För avsnitt 9 angående signaltransduktion analysen, med praktik, blir tillvägagångssättet relativt snabb, tar ca 20 min per djur eller mindre. Denna analys är också mycket tillförlitlig eftersom icke-sensorik vävnader som är bearbetade med den GFP färgning förfarande en i princip försumbar läsning ((Se figur 2B), och eftersom det finns ett stort dynamiskt omfång för att avläsningen. De flesta av GFP fluorescensen härrör från sensorik Purkinje celler, och deras stora antal ger därmed ett stort dynamiskt omfång. Hittills har genen spruttryck uppnåtts inte har orsakat avläsningarna att mätta över hela fältet (dvs 100% transduktion Purkinje celler), åtminstone när genöverföring administreras till vuxna råttor. Om mättnad av hela fältet fanns ett problem, kunde sedan signalen sänkas genom att tillämpa en lägre vektor dos i separata djur eller genom att mäta endast den svagare, infödda GFP fluorescens, avstå från färgningsproceduren. Transduktion andra celltyper i lillhjärnan kan säkerligen också bidra till signalen, men de flesta av vad är lätt synlig och räknas av programmet klart cell organ i de Purkinje cell-lagrarna och deras dendritiska träd i den molekylära lager i hela lillhjärnan, baserat på deras kända position och morfologi. En betydande utmaning för metoden är att luftbubblor eller fluorescerande skräp kunde räknas, som således kommer att kontaminera avläsningarna. Avsnitt och fält med detta buller används inte; ren gratisprover av icke-specifika buller krävs. Eftersom GFP är en främmande protein, finns det ingen bakgrundsljud i vävnaden, så den specifika fluorescensen kan just fångas och beräknad. I dessa studier de GFP mikrofotografier tillfångatogs i färg och sedan omvandlas till gråskala med en bildprogrammet än Scion Image. Dock vore det enklare att fånga GFP i svart och vitt i första hand för efterföljande analys i Scion Image. Tidigare studier analyseras transduktion av ryggmärgen lägre rörelse neuronerna på procentuell basis, dvs andelen motoneurons uttrycker GFP. 4 , 6 dock analysen av lillhjärnan är mer snabb, kräver färre sektioner och verkar också vara mer konsekvent och tillförlitlig för (till exempel över enskilda observatörer att göra bedömningarna). Metoden för snabb cerebellär imaging är således en bra snabb index för framgången av perifera-till-central genöverföring. Analyser av ryggmärgen transduktion och exempel på transduktion av andra platser i råtta nervsystemet har rapporterats i Wang et al., Dayton et al.och Jackson et al. 4 , 5 , 6

Sammanfattningsvis är den intravenösa administreringsvägen minimalt invasiva; CNS kan riktas av en perifer administration utan att placera en nål in i hjärnan eller ryggmärgen. Tillsammans med ytterligare förfining av inriktning, kommer att relevanta prekliniska och kliniska genterapi fortsätta att använda intravenös leverans, medan många välbevarade framtida typer av grundläggande funktionella studier på råttor kan dra nytta av den expansiva transduktion i strävan att påskynda hypotesprövning av geners funktion invivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

Detta arbete finansierades av the ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx och en välgörenhetsorganisation donation för ALS-forskning från Thomas Lawson, vilket vi är tacksamma. Vi tackar Elysse Orchard och Donna Burney för råd och utbildning. JAS stöddes av stiftelsen ljög och National Institutes of Health bevilja GM103418.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17, (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18, (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21, (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22, (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17, (1), 69 (2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12, (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20, (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23, (5), 237-246 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics