Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Neuroscience

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Summary

Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l'intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un'amministrazione periferica, una tantum.

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Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

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Abstract

Vettori di virus adeno-associato (AAV) sono un reagente chiave nelle neuroscienze per cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR), optogenetica, cre-lox targeting, ecc. Lo scopo di questo manoscritto è di aiutare l'investigatore tentativo di trasferimento del gene espansiva del sistema nervoso centrale (SNC) nel ratto tramite iniezione della vena della coda di AAV. Espressione su vasta scala è rilevante per le condizioni con patologia diffusa, e un modello del ratto è significativo a causa della sua maggiore dimensione e fisiologiche somiglianze agli esseri umani rispetto ai topi. In questa applicazione di esempio, una trasduzione neuronale su vasta scala è usato per simulare una malattia neurodegenerativa che colpisce l'intero midollo spinale, sclerosi laterale amiotrofica (ALS). La trasduzione di CNS su vasta scala efficiente consente anche di fornire fattori di proteine terapeutiche in studi pre-clinici. Dopo un intervallo di espressione post-iniezione di parecchie settimane, vengono valutati gli effetti di trasduzione. Per un vettore di controllo della proteina fluorescente verde (GFP), l'importo di GFP nel cervelletto è stimato rapidamente e in modo affidabile da un programma di formazione immagine base. Per fenotipi di malattia motore che sono indotte da ALS relativi transactive risposta della proteina del DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43), i deficit sono segnati da rotarod e riflesso di fuga. Oltre alla modellazione di malattia e terapia genica, ci sono diverse applicazioni potenziali per la larga scala gene-targeting descritto qui. L'uso esteso di questo metodo sarà di aiuto nel velocizzare in neuroscienze e Neurogenetica di verifica delle ipotesi.

Introduction

Vettori ricombinanti virus adeno-associato (AAV) sono strumenti indispensabili per la ricerca di CNS perché sono così efficienti per trasdurre i neuroni in vivo. I vettori AAV sono molto versatili per studiare diversi transgeni e isoforme della proteina, diversi tessuti, ospitano diverse specie e diverse vie di somministrazione. Per esempio, AAV può essere somministrato a topi di una periferica, relativamente non-invasiva, l'iniezione endovenosa di trasdurre neuroni in tutto il sistema nervoso centrale come in primo luogo descritto in Foust et al e Duque et al. (vedere Giove carta da Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 questo approccio di consegna del gene viene utilizzato nei ratti per esprimere in modo efficiente una proteina fluorescente verde (GFP) o l'ALS ha collegato la proteina, transactive risposta DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43) nel SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 lavorando in ratti è significativo perché i parametri fisiologici e metabolici del ratto sono più vicini agli esseri umani rispetto ai topi e ci sono le analisi tossicologiche e comportamentali progettate specificamente per i ratti. Inoltre, altre linee di ratto transgenico stanno diventando disponibili che possono essere utilizzati in studi di trasferimento del gene AAV.

Metodi sono dettagliate per il trasferimento del gene CNS espansiva nel ratto e quantificazione rapida, affidabile dei risultati. Trasduzione CNS su vasta scala è usato per imitare la sintomatologia di ALS in ratti esprimendo TDP-43 in tutto il midollo spinale. Il metodo è coda vena iniezioni di TDP-43 vector per giovani ratti adulti come usato in Jackson et al. 6 , 8 , 9 dopo diverse settimane, i deficit del motore indotta da TDP-43 sono segnati con due metodi: fuga reflex e rotarod come usato in Dayton et al e Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 per il vettore GFP di controllo, nelle analisi post-mortem, zona fluorescente del cervelletto è calcolata come un indice di efficienza di trasduzione come usato in Jackson et al. 6 , 8 l'analisi del cervelletto ha dimostrato di essere un indice rapido e affidabile del grado di trasduzione CNS dopo la consegna del gene periferico e dovrebbe essere applicabile a una varietà di approcci di tentare di trasferimento genico centro-periferico.

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Protocol

tutte le procedure seguite le opportune linee guida NIH. Tutte le procedure di seguito protocolli degli animali che sono stati approvati dal comitato di utilizzo LSU Health Sciences Center a Shreveport e cura degli animali. Ratti Sprague-Dawley femminili a 6 settimane dell'età sono stati utilizzati per questa procedura.

1. determinare le dosi/volumi del vettore necessaria

  1. pesare i ratti per essere iniettato e determinare la quantità di vettore virale necessari per ogni animale basati sul titolo (concentrazione) della preparazione vettoriale. Utilizzare dosi di vettore che hanno avuto successo per efficiente espressione nel ratto CNS in precedenza (vedere Jackson et al. 6).
    Nota: per AAV9 TDP-43 o AAV9 GFP, una dose tipica è tra 3 x 10 13 - 1x10 14 vettoriale genomi/kg. I giovani ratti adulti a 6 settimane dell'età pesano circa 150 g.
  2. Fare dosi equivalenti / kg in tutti gli animali per sistematici raffronti. Assicurarsi che il volume non superi volumi di iniezione standard consigliato (250-500 µ l per un ratto di 250 g). Un volume di iniezione tipica è 200 μl di un ratto adulto giovane.

2. Preparare la postazione di lavoro

  1. raccogliere tutte le necessarie forniture: un film di paraffina quadrato (circa 5 x 5 cm) per animale, un batuffolo di preparazione per animale, compresse di garza (2-3 per animale), dispensare consigli e una micropipetta.
  2. Preparare la superficie di lavoro di pulizia della superficie con etanolo al 70%. Posizionare un rilievo di riscaldamento verso il basso con la temperatura impostata su bassa (~ 37 ° C). Posizionare un cuscinetto di banco sopra il termocuscino.
  3. Preparare l'anestesia di gas (isoflurano). Garantire sufficiente ossigeno e gas anestesia per la procedura. Pulire la maschera di anestesia e camera di induzione con etanolo al 70% e collocare la maschera di anestesia sul tappetino di panca.

3. Preparare il vettore

  1. scongelare il vettore a temperatura ambiente ed etichettare una microcentrifuga sterile per ciascun animale.
  2. Dispensare il volume di AAV determinato nel passaggio 1.1 nel tubo appropriato e portare il volume a volume iniezione desiderato (qui, 200 μl) con Ringer lattato ' s soluzione o soluzione fisiologica.
  3. Impulsi Vortexare il campione per 1-2 s e quindi di impulso Centrifugare per 5 s per portare il campione alla parte inferiore del tubo.
  4. Dispensare il volume totale iniettato per il ratto fuori dal tubo e sulla Piazza della pellicola di paraffina.
  5. Inserire un ago da 30 gauge su una siringa da 1 mL.
  6. Inserire l'ago con lo smusso rivolto verso il basso nel vettore sulla pellicola di paraffina. Tirare indietro lo stantuffo della siringa fino a quando tutti i virus è nell'ago e la siringa. Fare attenzione a evitare bolle d'aria di disegno nell'ago, che diventa più facile con pratica.

4. Preparare il ratto

  1. girare l'ossigeno fino a 1 L/min e impostare l'anestesia di isoflurane al 5%. Garantire che l'anestesia di gas fluisce nella camera di induzione di controllando tutti i tubi di collegamento e rubinetto orientamenti.
  2. Mettere il ratto nella camera a gas anestesia induzione circa 3 min, fino a quando il ratto è insensibile.
  3. Garantire adeguata profondità dell'anestesia pizzicando la punta. Non ci dovrebbe essere alcun movimento del piede o la gamba dopo il pizzico di toe.
  4. Ridurre l'anestesia di isoflurane al 2% per il mantenimento dell'anestesia e regolare il rubinetto in modo che l'anestesia sta fluendo alla maschera anestesia.
  5. Posto il ratto ' s naso nella maschera di anestesia e regolare il ratto, in modo che è sdraiato su un lato.
  6. Identificare la vena caudale laterale.
    Nota: Le vene di coda laterale si trovano a circa 10 e 2 o ' orologio con parte superiore dorsale della coda come 12 o ' orologio. Con il topo sdraiato su un lato, la vena caudale laterale deve essere rivolto verso up.
  7. Pulire la zona di iniezione con il rilievo della preparazione dell'alcool. Il sito di iniezione è due terzi giù la lunghezza della coda.

5. Iniettare il vettore

  1. fermamente tenere la coda leggermente sopra l'area di iniezione con un dito direttamente sopra la vena caudale laterale; questo sarà dilatare la vena.
  2. Con lo smusso rivolto verso l'alto, allineare l'ago con la vena di coda visibile nella stessa direzione.
  3. Bucare la pelle sopra la vena della coda mentre facendo grande attenzione a evitare l'altra mano tenendo la coda e premendo sulla vena caudale.
  4. Scaricare la pressione dalla vena caudale per consentire il flusso sanguigno normale.
  5. Spostare l'ago nella vena. Per assicurarsi che l'ago ha perforato la vena caudale, tirare leggermente indietro lo stantuffo. Se l'ago è in vena, il sangue scorrerà nell'ago.
    1. Riposizionare l'ago come necessario. Quindi, per stabilizzare l'ago, spostare la mano sopra il sito di iniezione per sotto il sito di iniezione e tenere l'estremità della siringa contro la coda.
  6. Iniettare lentamente il vettore nella coda (circa 20 µ l/s).
    Nota: La vena può perdere il colore come il vettore scorre attraverso di essa. I segni che la soluzione è stata iniettata di fuori della vena includono blebbing, sbiancamento della pelle, o resistenza quando si inietta il vettore. Con la pratica, può essere minimizzato l'esposizione extravascolare.
  7. Dopo che il vettore è stato somministrato, rimuovere l'ago dal ratto e premere un tampone di garza contro il sito di iniezione per contribuire ad arginare l'emorragia per 30-60 s.

6. Pulizia

  1. spegnere l'isoflurano anestesia e ossigeno. Monitorare il ratto fino a quando riprende conoscenza e poi restituirlo alla sua gabbia.
  2. Posto con attenzione tutti gli aghi nell'apposito contenitore. Smaltire tutti i altri materiali usa e getta che sono potenzialmente contaminati con AAV in un contenitore appropriato biohazard. Pulire le stazioni di lavoro con etanolo al 70%.

7. Valutare il riflesso di fuga del hindlimb

Nota: i deficit Hindlimb presentano solitamente 2-6 settimane dopo il trasferimento del gene di TDP-43, a seconda della dose di vettore.

  1. Su una superficie piana libera da detriti, con due dita afferra il ratto ' s coda di circa 2 cm dal corpo. Sollevare delicatamente il ratto fino a quando gli arti anteriori sono appesi durante la visualizzazione lato ventrale del ratto.
    1. Eseguire la procedura settimanale durante tutto il tempo-corso sperimentale dopo trasferimento genico (ad es., fino a 12 settimane dopo il trasferimento del gene).
      Nota: Punteggio ottenuto anche i deficit degli arti anteriori in questo modo, ma i deficit hindlimb sono più probabile che si verificano in questo modello, a seconda della dose di vettore utilizzato.
  2. Osservare le zampe posteriori per 10 s. Nota Se uno o entrambi posteriori stringono verso la linea mediana durante il 10 s.
  3. Ripetere questo test per un totale di tre volte con 30 s tra le prove. Se uno o entrambi posteriori sono serrati per ciascuna delle tre prove, il ratto sta mostrando la disfunzione del motore. Registrare i dati (manualmente nelle note) come entrambi deficit unilaterale o bilaterale hindlimb presenti se c'è coerente stringendo attraverso tutte le tre prove.

8. Valutare la funzione motoria sul rotarod

  1. per impostare il rotarod, posizionare un cuscinetto di banco sotto il rotarod e impostare accelerazione su 4-40 giri al minuto (rpm) in 2 minuti (il tasso aumenta di ~0.3 giri/s). Per un tempo-corso di 12 settimane, eseguire i soggetti a 2, 4, 8 e 12 settimane dopo gene transfer.
  2. Consentire il ratto di acclimatare per la sala di collaudo per 20 min.
  3. Addestrare il topo a utilizzare il rotarod per la prima volta, prima di avviare il rotarod ad una velocità impostata di 4 giri/min, poi appoggiate il ratto il rotarod. Consentono il topo a camminare per un giro completo a 4 giri, poi avviare l'accelerazione e consentono il topo a calpestare il rotarod finché non cade fuori. Continuare la formazione fino a quando il ratto può camminare costantemente per almeno 40 s. Un ratto adulto sano, giovane sarà prontamente addestrato in questo modo.
    1. Nel caso di un topo con un evidente danno del motore, che può impedire il ratto dal raggiungimento di una latenza di linea di base alla caduta di 40 s, fornire il ratto 3-5 tentativi di formazione prima di iniziare a segnare rotarod.
  4. Per iniziare il rotarod test, appoggiate il ratto il rotarod e avviare accelerazione del rotarod. Nota la data in cui il ratto cade dal rotarod; Questa è la latenza a cadere. Se il topo rimane il rotarod dopo 120 s, cap la sessione a questo punto, rimuovere il ratto dal rotarod e registrare una latenza di caduta di 120 s.
  5. Ripetere il test due volte per un totale di tre prove. Per ridurre al minimo l'effetto di affaticamento, spazio le prove almeno 5 min apart. Media i punteggi delle tre prove. Un ratto adulto unimpaired in genere ha una latenza media di cadere di > 40 s.
  6. Inserire il topo nella gabbia e pulire il rotarod e zone circostanti con etanolo al 70%.

9. Quantificazione dell'espressione di GFP nel cervelletto

  1. anestetizzare i ratti e irrorare con tampone fosfato salino (PBS) e poi con paraformaldeide al 4%. Sezionare il cervello e il midollo spinale e immergere i tessuti nel fissativo durante la notte e quindi spostarli in una soluzione di saccarosio 30%. Dopo l'equilibratura, tagliare 50 μm sezioni coronali su un microtomo scorrevole con congelamento fase 4 , 5 , 6.
  2. Scegliere le sezioni di 3-6 del cervelletto che sono distribuiti uniformemente nei vermis, il lobo centrale del cervelletto. Etichetta fluorescente GFP per massimizzare il segnale. Utilizzare l'anticorpo primario per GFP a 1: 500 e utilizzare l'anticorpo secondario coniugato di Alexa-488 a una diluizione di 1: 300 4 , 5 , 6.
    Nota: Vedi riferimenti 4 , 5 , 6 per maggiori dettagli sul campionamento, sezionamento e le procedure di colorazione.
  3. Photomicrograph ogni sezione della regione definiti di interesse con una lente di ingrandimento basso usando un microscopio. Uso un obiettivo X 2.5 (N.A. 0.12) e filtro impostato 10, eccitazione 450-490/515-565/emissione). Mantenere le impostazioni della fotocamera (i tempi di esposizione, per esempio, 2 s) lo stesso attraverso campioni da analizzare. Salvare come un. File TIF.
  4. Aprire la microfotografia nel programma di immagine Scion ampiamente disponibile; due finestre si apriranno. Chiudi la finestra indicata come " scala di colore ".
  5. Scegli " opzioni ", poi " densità SliceŔ una gamma di tonalità sarà indicata in rosso sulla finestra di look-up Table (LUT). Nella finestra, utilizzare il cursore per riempire la GFP un'etichettatura specifica solo e fermarsi quando il fondo comincia a essere prelevati nell'immagine.
    Nota: Questo metterà in evidenza l'area fluorescente sul Fotomicrografo da quantificare. Le impostazioni dovrebbero essere ottimizzate per acquisire specificamente tutte le cellule visibilmente fluorescente. Con la pratica, questo metodo può proprio evidenziare la fluorescenza specifica.
  6. Prima fluorescente area di misurazione, prima assicurarsi che le misurazioni effettuate sono espressi nelle unità corrette (pixel). Per effettuare questa operazione, fare clic su " Analyze ", poi " Set ScaleŔ la quarta riga dovrebbe dire " unità ". Dall'elenco a discesa, scegliere pixel misura in pixel, quindi fare clic su " OK ". Attivare o disattivare le opzioni di analisi di " includono fori interni " per garantire l'inclusione di tutto il corpo delle cellule nell'analisi.
  7. Fare clic
  8. di misurare l'area fluorescente, " analizza " e quindi fare clic su " misura ". Per visualizzare questo valore, fare clic " Analyze " quindi fare clic su " ResultsŔ Show verrà visualizzata una finestra di risultati. La misura di superficie fluorescente sarà sotto l'intestazione con l'etichetta " zona ".
  9. Per garantire la standardizzazione attraverso le misurazioni, non modificare i valori evidenziati nella finestra LUT.
  10. Una volta che tutte le misurazioni sono state registrate, media dei valori per ciascun animale (da 3-6 sezioni per animale). Utilizzare un appropriato test statistico per confrontare le aree trasdotte fra i gruppi. 6

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Representative Results

TDP-43 motorie indotte dovrebbero sorgere entro 2-6 settimane a seconda della dose dell'AAV TDP-43 utilizzato (Figura 1). Iniezioni di vena infruttuoso coda si tradurrà in parziale o nessuna disabilità; l'AAV deve raggiungere il flusso sanguigno per produrre l'effetto. Un'iniezione di successo di AAV GFP si tradurrà nell'espressione di GFP in tutto il cervello e il midollo spinale in modo vettoriale-dose dipendente. Quando si utilizza il promotore ricombinante forte espressione di unità, promotore del citomegalovirus pollo beta actina ibrido, noto anche come il promotore CAG, c'è efficiente espressione nel SNC, nonché diversi altri tessuti quali fegato e cuore. 4 , 5 , 10 entro il ratto CNS, quando si utilizza AAV9 o AAV PHP. Vettori di B, il modello è principalmente un neurone trasduzione e trasduzione glial solo sparse, sporadici. 4 , 8 poiché nessuna differenza di genere in efficienza di trasduzione è stata osservata in ratti con il metodo su vasta scala, le femmine sono tipicamente utilizzate per il trasferimento genico per via endovenosa a causa del loro peso inferiore. 6

Il metodo di imaging semi-quantitativo descritto è rapida ed affidabile perché c'è un eccellente rapporto segnale-rumore. Un campione non trasdotte viene confrontato con un campione trasdotte nella Figura 2 con entrambi i campioni macchiato con l'anticorpo GFP. I valori raccolti da questi esempi indicano rumore 0,3% (dai valori elencati nella Figura 2B, D) nel campione non trasdotte, che può essere considerato trascurabile. Dato l'ottimo rapporto segnale-rumore, questo metodo è valido per i confronti rapidi delle condizioni sperimentali quali tipi di vettore, vettore dose, genere, età, ecc.

Figure 1
Figura 1. Trasferimento del gene AAV9 TDP-43 su larga scala ai ratti provoca disabilità motoria progressiva. Prestazioni di rotarod a 1-3 settimane dopo gene di trasferimento del controllo GFP o il gene ALS-correlati TDP-43. I soggetti sono stati testati prima del trasferimento del gene e le misure successive sono state espresse come rapporto al punto di tempo linea di base. Un topo normale non trattato rimarrà acceso il rotarod da 60-90 s in queste condizioni. Questa figura è stata modificata da6.

Figure 2
Figura 2. Quantificazione rapida della zona fluorescente GFP-positive nel cervelletto dopo somministrazione endovenosa di AAV al ratto. Un, B) Non trasdotte campione che è stato macchiato con l'anticorpo GFP. C, D) campione da un ratto che ricevono AAV9 GFP. B, D) la densità fetta opzione su Scion Image consente di evidenziare selettivamente l'area fluorescente in rosso, e quindi i pixel rossi vengono conteggiati dal programma. L'opzione di densità fetta deve evidenziare tutte le celle visibili fluorescente come visto in C. La zona rossa, espressa in pixel quadrati come calcolato dal programma è mostrata in B, D. Il punto di tempo era 4 settimane dopo un'iniezione di vena di coda di GFP AAV9 a un giovane ratto adulto ad una dose di vettore di 1 x 1014 vettoriale genomi/kg. Barra della scala nel A è 536 µm; stesso ingrandimento in A-D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Una varietà di percorsi di consegna sono stati testati per i vettori di AAV: intra-parenchimali, intra-intracerebroventricolare, intra-tecale, endovenosa, intranasale, intra-muscolare, ecc. Ogni itinerario può avere vantaggi specifici, così come gli svantaggi. Amministrazione di coda vena di AAV ai ratti adulti è un metodo affidabile per la realizzazione coerente trasduzione dello SNC. Il metodo di iniezione periferica evita l'introduzione di una cannula di iniezione nei tessuti CNS e pertanto è come minimo dilagante. L'espressione di CNS efficiente che può essere realizzato con questo metodo è il più grande vantaggio della tecnica. Altri vantaggi pratici sono che il metodo di iniezione è molto veloce (circa 10 min per animale dall'inizio alla fine) e che le iniezioni di vena della coda non sono altamente tecniche e pertanto possono essere masterizzate rapidamente. Certamente, un grave inconveniente è che è necessario un sacco di vettore di alto titolo, che sarà un problema di fattibilità se il preps AAV sono di sotto di 1 x 1013 vettoriale genomi/ml. Con ulteriore perfezionamento delle funzionalità di targeting vettoriale, questo approccio potrebbe essere vantaggioso per la terapia genica clinici in futuro, dato che la consegna del gene è di un percorso periferico e quindi relativamente non-invasiva. D'altra parte, altri diretti intra-cerebrospinale fluide iniezioni potrebbero essere vantaggiose in approcci preclinici e clinici per due motivi: più limitata diffusione del vettore e l'uso delle dosi più basse di vettore.

In ratti con pigmentazione più scura, vena caudale può essere più difficile da identificare. Così, possono essere utilizzati percorsi alternativi di amministrazione come iniezioni retro-orbitale o iniezioni endovenose alla vena safena. Le iniezioni di retro-orbitale un letto capillare denso di destinazione e sono così simili ad un'iniezione endovenosa. Per topi e forse per ratti troppo, il metodo di retro-orbitale può essere più facile che le iniezioni di vena di coda, ma tre studi hanno mostrato grande coerenza delle iniezioni della vena della coda in ratti adulti. 6 , 8 , La maggior parte di questo lavoro utilizzato 9 un forte promotore ricombinante per l'espressione del transgene in auto, il promotore di ibrido di citomegalovirus pollo beta actina. 10 se lo sperimentatore vuole delimitare l'espressione dei neuroni del SNC, un promotore di tipo-specific di cella può essere tentato, per esempio il promotore della sinapsina. 8 , 11

Per quanto riguarda il metodo di imaging, è un metodo veloce e semiquantitativo per stimare l'efficienza di trasduzione. Se condotta correttamente, l'analisi produce quindi una stima attendibile della zona trasdotte. Il metodo gold standard per il conteggio di oggetti in tessuto dello SNC è chiamato stereology. Si impiegano circa 75 minuti per animale per condurre una sonda stereologiche in una regione di interesse nel cervello, considerando che il metodo descritto è più veloce a 20 min per animale o anche meno, quando scalati. Se tutte le condizioni sono mantenute uguali e la stessa regione è correttamente campionata, la coerenza dei dati si avvicina il grande coerenza di stereology e grandi gruppi di campioni possono essere analizzati rapidamente in massa.

Ci sono una serie di ulteriori note tecniche che autorizzano ulteriore discussione. Per la sezione 1 per quanto riguarda le dosi di vettore, le dosi di vettore necessarie per l'espressione del transgene efficiente nei ratti sono state determinate da trial-and-error e dose-risposta in di Wang et al., Dayton et ale Jackson et al., così come precedenti dosi utilizzate in topi (Foust et al e Duque et al.). 1 , 2 , 4 , 5 , 6 certamente un passo critico e potenzialmente limitante sta producendo alto-titolo AAV preps per ottenere le dosi efficaci.

Per la sezione 3 per quanto riguarda il vettore di carico nell'ago, bolle d'aria nella soluzione iniezione dovrebbe essere evitato nel miglior modo possibile. Una piccola quantità di aria non dovrebbe essere problematica come questo possa essere filtrato dai polmoni, ma eccessivi volumi d'aria iniettato nella vena possono causare un'embolia gassosa venosa, potenzialmente con conseguente morte. 12 se le bolle sono presenti nella siringa, il virus deve essere espulsa dalla siringa, e una nuova siringa deve essere caricata. Per evitare la creazione di bolle, assicurarsi di posizionare l'ago vicino alla goccia di vettore sul parafilm con lo smusso rivolto verso il basso. Quando la maggior parte del vettore è stato ripreso nell'ago, molto lentamente, aspirare la soluzione rimanente. Una piccola tasca d'aria si forma sul retro la siringa. Questo è lo spazio morto e non deve essere iniettato. Per garantire che rimanga verso il retro della siringa, tenere la siringa orizzontale o punta verso il basso e non flick la siringa.

Per la sezione 5 per quanto riguarda le iniezioni, per garantire che l'iniezione va in vena e non il tessuto che circonda la vena, una volta che l'ago è stato inserito, tirare leggermente indietro lo stantuffo per creare pressione negativa sulla punta dell'ago. Come accennato, se l'ago è in vena, sangue dovrebbe fluire nuovamente dentro l'ago e sarà visibile alla base dell'ago. Durante l'iniezione nella vena, poca resistenza dovrebbe essere sentito quando l'ago è opportunamente collocato. Se si incontra una resistenza significativa, quindi è probabile che l'iniezione sta nel tessuto della coda come descritto sopra. È anche possibile perforare attraverso la vena, causando una "vena soffiata", quando l'angolo che l'ago è inserito è troppo ripida, quando il calibro dell'ago è troppo grande per la vena, o quando la velocità di iniezione è troppo veloce mettere troppa pressione sulla vena. Una vena soffiata può verificarsi durante la puntura iniziale della vena o durante l'iniezione. Per evitare di pungere la vena durante l'iniezione o con l'ago a diventare sloggiato dalla vena, la siringa deve essere stabilizzata da tenendo l'estremità della siringa contro la coda come accennato. Se l'ago diventa sloggiato o una seconda iniezione è necessaria per un altro motivo, la seconda iniezione può essere effettuata sia a vena caudale laterale sul lato opposto o avvicinarsi al corpo sullo stesso lato.

Per la sezione 8, il rotarod test viene eseguito a intervalli di 4 settimane durante l'esperimento. Normale, ratti non trattati hanno punteggi migliori quando sono più giovani (4-6 settimane) che in età più. I deficit nel riflesso di fuga vengono tracciati come sopravvivenza della funzione dell'arto nel corso del tempo. Le curve di sopravvivenza sono analizzate da un test log-rank il software Prism.

Per la sezione 9 per quanto riguarda l'analisi di trasduzione, con la pratica, la procedura diventa relativamente veloce, prendendo circa 20 min per animale o meno. Questo test è anche altamente affidabile perché non trasdotte tessuti che sono trattati con la procedura di colorazione di GFP una lettura sostanzialmente trascurabile (Figura 2B), e perché c'è una vasta gamma dinamica alla lettura. La maggior parte della fluorescenza della GFP deriva da cellule di Purkinje trasdotte e così loro grandi numeri forniscono un ampio range dinamico. Finora, l'efficienza di trasferimento del gene raggiunto non ha causato le letture di saturare attraverso l'intero campo (cioè, 100% di trasduzione delle cellule di Purkinje), almeno quando il trasferimento del gene è amministrato ai ratti adulti. Se la saturazione dell'intero campo era un problema, il segnale potrebbe essere abbassato applicando una dose più bassa di vettore in animali separati o misurando solo il più debole, nativa fluorescenza GFP, rinunciando la procedura di colorazione. Certamente la trasduzione di altri tipi di cellule nel cervelletto potrebbe anche contribuire per il segnale, ma la maggior parte di ciò che è facilmente visibile e contato dal programma è chiaramente i corpi delle cellule negli strati delle cellule di Purkinje e loro alberi dendritiche in molecolare strati tutto il cervelletto, basato sulla loro posizione conosciuta e la morfologia. Una sfida significativa al metodo è che le bolle d'aria o detriti fluorescenti potevano essere conteggiato, così che possono contaminare le letture. Sezioni e campi con questo rumore non vengono utilizzati; pulito campioni gratuiti di rumore non specifici sono necessari. Poiché la GFP è una proteina estranea, non c'è nessun rumore di fondo all'interno del tessuto, quindi la fluorescenza specifica può essere precisamente catturata e stimata. In questi studi, le microfotografie GFP furono catturati nel colore e poi convertite in scala di grigi utilizzando un programma di grafica diverso da Scion Image. Tuttavia, sarebbe più semplice per catturare la GFP in bianco e nero in primo luogo per la successiva analisi in Scion Image. Precedenti studi analizzati trasduzione dei motoneuroni del midollo spinale su base percentuale, cioè, la percentuale dei motoneuroni che esprimono GFP. 4 , 6 tuttavia, l'analisi del cervelletto è più rapida, che richiedono meno sezioni e inoltre sembra essere più coerente e affidabile troppo (per esempio, attraverso singoli osservatori facendo delle valutazioni). Il metodo rapido di imaging cerebellare è dunque un buon indice rapido del successo di trasferimento genico centro-periferico. Analisi della trasduzione del midollo spinale ed esempi di trasduzione di altri siti nel sistema nervoso del ratto sono stati segnalati in Wang et al., Dayton et ale Jackson et al. 4 , 5 , 6

In sintesi, la via di somministrazione endovenosa è minimamente invasiva; il sistema nervoso centrale possa essere mirato da un'amministrazione periferica senza inserire un ago nel cervello o nel midollo spinale. Con ulteriore affinamento di targeting, terapie geniche pre-clinici e clinici pertinenti continueranno a utilizzare consegna endovenosa, mentre molti alla miriade di futura tipi di studi funzionali di base nei ratti possono trarre vantaggio la trasduzione espansiva nella ricerca per accelerare i test di ipotesi di funzione genica in vivo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato da ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx e una donazione di beneficenza per la ricerca sulla SLA da Thomas Lawson, per cui siamo grati. Ringraziamo Elysse Orchard e Donna Burney per consulenza e formazione. JAS è stata sostenuta dalla Fondazione ha mentito e National Institutes of Health concedere GM103418.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

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References

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