Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Neuroscience

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Summary

Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.

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Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

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Abstract

Vetores de vírus adeno-associado (AAV) são um reagente chave nas Neurociências para cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR), optogenetics, cre-lox segmentação, etc. O objetivo deste manuscrito é ajudar o investigador a tentativa de transferência de genes de extenso sistema de nervoso central (SNC) em ratos através da injeção de veia de cauda de AAV. Expressão de larga escala é relevante para as condições com patologia generalizada, e um modelo do rato é significativo devido ao seu tamanho maior e fisiológicas semelhanças com os seres humanos em comparação com ratos. Neste aplicativo de exemplo, uma transdução neuronal em larga escala é usada para imitar uma doença neurodegenerativa que afeta toda medula espinhal, esclerose lateral amiotrófica (ela). A transdução de CNS eficiente em grande escala também pode ser usada para entregar fatores de proteínas terapêuticas em estudos pré-clínicos. Após um intervalo de expressão pós-injeção de várias semanas, são avaliados os efeitos da transdução. Para um vetor de controle de proteína verde fluorescente (GFP), a quantidade de GFP no cerebelo é estimada rapidamente e confiantemente por um programa básico da imagem latente. Para fenótipos motor doença que são induzidos pelo ALS relacionados resposta transacional de proteínas DNA-proteína obrigatória de 43 kDa (TDP-43), os défices são marcados por rotarod e reflexo de fuga. Além da modelagem de doença e terapia genética, existem diversas aplicações potenciais para o gene em larga escala como alvo descrito aqui. Expandido o uso deste método irá ajuda em acelerar testes nas neurociências e neurogenética de hipóteses.

Introduction

Vectores recombinantes vírus adeno-associado (AAV) são ferramentas indispensáveis para a investigação do CNS, porque eles são tão eficientes para transducing neurônios em vivo. Vetores AAV são muito versáteis para estudar diferentes transgenes e isoformas de proteínas, tecidos diferentes, espécies hospedeiras diferentes e diferentes vias de administração. Por exemplo, AAV pode ser administrado a ratos por um periférico, relativamente não-invasivo, injeção intravenosa para transduce neurônios em todo o CNS como o primeiro descrito em Foust et al e Duque et al (veja papel de Júpiter por Gombash et al (2014)). 1 , 2 , 3 abordagem de entrega este gene é usada em ratos eficientemente expressar qualquer proteína verde fluorescente (GFP) ou o ALS relacionados a proteína, a resposta transacional ADN-proteína obrigatória de 43 kDa (TDP-43) no SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 trabalhando em ratos é significativa porque o rato está fisiológica e metabólica parâmetros estão mais próximos aos seres humanos em comparação com ratos e há ensaios toxicológicos e comportamentais projetados especificamente para ratos. Além disso, mais linhas de ratos transgénicos estão se tornando disponíveis que podem ser utilizados em estudos de transferência de gene AAV.

Métodos são detalhados para transferência de genes de CNS expansiva no rato e rápida e confiável de quantificação dos resultados. Transdução de CNS em larga escala é usada para imitar a sintomatologia de ALS em ratos expressando TDP-43 ao longo da medula espinhal. O método é cauda veia injeções do vetor de ratos adultos jovens como usado em Jackson et al TDP-43 6 , 8 , 9 depois de várias semanas, TDP-43-induzido motor défices são marcados por dois métodos: escapar de reflexo e rotarod como usado em Dayton et al e Jackson et al 5 , 6 , 7 , 9 para o vetor de controle GFP, em análise post-mortem, a área fluorescente do cerebelo é calculada como um índice de eficiência de transdução como usado em Jackson et al . 6 , 8 a análise do cerebelo tem provado para ser um índice rápido e confiável do grau de transdução CNS após a entrega do gene periférica e deve ser aplicável a uma variedade de abordagens, a tentativa de transferência de genes de periféricos-para-central.

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Protocol

todos os procedimentos seguiram as orientações adequadas de NIH. Todos os procedimentos seguiram protocolos de animais que foram aprovados pelo Comitê de uso no centro de Ciências de saúde de LSU em Shreveport e cuidado Animal. Ratas Sprague-Dawley com 6 semanas de idade foram utilizadas para este procedimento.

1. determinar os doses/volumes de vetor necessário

  1. pesar ratos injetados e determinar a quantidade de vetor viral necessária para cada animal com base do título (concentração), da preparação do vetor. Usar doses de vetor que foram bem sucedidos para expressão eficiente no rato CNS anteriormente (ver Jackson et al. 6).
    Nota: para AAV9 TDP-43 ou AAV9 GFP, uma dose típica é entre 3 x 10 13 - 1 x 10 14 vector genomas/kg. Os ratos adultos jovens com 6 semanas de idade pesam cerca 150 g.
  2. Fazer doses equivalentes por kg em todos os animais para comparações sistemáticas. Certifique-se que o volume não exceda volumes de injeção aconselhados padrão (250-500 µ l para um rato de 250 g). Um volume de injeção típico é 200 μl de um jovem rato adulto.

2. Preparar a estação de trabalho

  1. pegar os materiais necessários: um filme de parafina quadrada (cerca de 5 x 5 cm) por animal, almofada de preparação de um álcool por animal, gaze (2-3 por animal), pontas de pipeta e uma micropipeta.
  2. Preparar a superfície de trabalho, limpando a superfície com etanol a 70%. Coloque uma almofada de aquecimento para baixo com a temperatura definida como baixa (~ 37 ° C). Coloque uma almofada do banco em cima da almofada de aquecimento.
  3. Preparar a anestesia de gás (isoflurano). Certifique-se de oxigênio adequado e anestesia de gás para o procedimento. Limpar a máscara de anestesia e câmara de indução com etanol a 70% e coloque a máscara de anestesia na almofada banco.

3. Preparar o vetor

  1. descongelar o vetor à temperatura ambiente e rotular um tubo estéril microcentrifuga para cada animal.
  2. Pipeta o volume de AAV determinado no passo 1.1 para o tubo apropriado e trazer o volume o volume de injeção desejado (aqui, 200 μl) com Ringer lactato ' solução salina ou solução de s.
  3. Pulso vórtice a amostra para 1-2 s e então pulse centrífuga para 5 s para levar a amostra para o fundo do tubo.
  4. Pipeta o volume total de injeção para o rato fora do tubo e para a Praça da película de parafina.
  5. Colocar uma agulha de 30 calibre em uma seringa de 1 mL.
  6. Coloque a agulha com o bisel virado para baixo na vetor do filme de parafina. Puxe o êmbolo da seringa até que todo o vírus está na agulha e seringa. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar para a agulha, que se torna mais fácil com a prática de desenho.

4. Preparar o rato

  1. aumentar o oxigênio até 1 L/min e defina a anestesia de isoflurano para 5%. Certifique-se de que a anestesia de gás está fluindo para a câmara de indução, verificando todas as mangueiras de ligação e orientações torneira.
  2. Colocar o rato na câmara de indução de anestesia de gás cerca de 3 min, até que o rato não está respondendo.
  3. Assegurar adequada profundidade de anestesia por beliscar o dedo do pé. Não deve haver nenhum movimento no pé ou na perna após o aperto de dedo do pé.
  4. Reduzir a anestesia de isoflurano para 2% para a manutenção da anestesia e ajustar a torneira para que a anestesia está fluindo para a máscara de anestesia.
  5. Colocar o rato ' s nariz da máscara de anestesia e ajustar o rato, de modo que é uma mentira do seu lado.
  6. Identificar a veia lateral da cauda.
    Nota: As veias de cauda lateral mentem em aproximadamente 10 e 2 o ' relógio com a face dorsal da cauda como 12 o ' relógio. Com o rato deitado de lado, a veia lateral da cauda deve ser voltado para cima
  7. Limpe a área de injeção com a almofada da preparação do álcool. Local da injeção é dois terços do comprimento da cauda.

5. Injetar o vetor

  1. Segure firmemente a cauda ligeiramente acima da área de injeção com um dedo diretamente sobre a veia lateral da cauda; isso vai dilatar a veia.
  2. Com o bisel voltado para cima, alinhar a agulha com a veia da cauda visível na mesma direção.
  3. Perfuram a pele sobre a veia da cauda enquanto tomar muito cuidado para evitar a outra mão segurando a cauda e pressionando a veia da cauda.
  4. Liberar a pressão da veia da cauda para permitir o fluxo de sangue normal.
  5. Mover a agulha na veia. Para assegurar que a agulha perfurou a veia da cauda, puxe levemente o êmbolo. Se a agulha está na veia, o sangue fluirá para a agulha.
    1. Reposicionar a agulha conforme necessário. Então, para estabilizar a agulha, mover a mão acima do local da injeção para abaixo do local da injeção e segure a extremidade da seringa contra cauda.
  6. Lentamente injete o vetor dentro da cauda (aproximadamente 20 µ l/s).
    Nota: A veia pode perder a cor como o vetor atravessa-lo. Sinais de que a solução foi injetada fora da veia incluem blebbing, branqueamento da pele, ou resistência quando injetar o vetor. Com a prática, exposição extra vascular pode ser minimizada.
  7. Depois que o vetor tem sido administrado, retire a agulha do rato e pressione com uma gaze contra o local da injeção para ajudar a conter a hemorragia para 30-60 s.

6. Limpar

  1. desativar o isoflurano anestesia e oxigênio. Monitorar o rato até que recupere a consciência e depois devolvê-lo à sua jaula.
  2. Cuidadosamente Coloque todas as agulhas no recipiente para objectos cortantes. Elimine todos os outros materiais descartáveis que são potencialmente contaminados com vírus adeno-associados em um recipiente apropriado risco biológico. Limpar as estações de trabalho com etanol a 70%.

7. Avaliar reflexo de fuga do membro posterior

Nota: membro posterior défices surgem geralmente 2-6 semanas após a transferência de genes de TDP-43, dependendo da dose de vetor.

  1. Sobre uma superfície plana clara de detritos, com dois dedos, pegue o rato ' s tail aproximadamente 2 cm do corpo. Levante o rato delicadamente até os membros dianteiros são pendurado enquanto visualiza a parte ventral inferior do rato.
    1. Executar o procedimento semanalmente ao longo do tempo-curso experimental após a transferência de genes (por exemplo, até 12 semanas após a transferência de genes).
      Nota: Também marcar défices do membro anterior dessa maneira, mas os défices de membro posterior são mais prováveis de ocorrer neste modelo, dependendo da dose de vetor usada.
  2. Observar os membros traseiros para 10 Nota s. se um ou ambos os membros traseiros cerrar em direção à linha média durante a 10 s.
  3. Repetir este teste para um total de três vezes com 30 s entre ensaios. Se um ou ambos os membros posteriores estão cerrados para cada um dos três ensaios, o rato está mostrando disfunção motora. Gravar os dados (manualmente nas notas) como qualquer défice de membro posterior unilateral ou bilateral presente se houver consistente apertamento em todos os três ensaios.

8. Avaliar a função motora sobre o rotarod

  1. para configurar o rotarod, coloque uma almofada do banco sob o rotarod e definir a aceleração de 4-40 rotações por minuto (rpm) mais 2 min (a taxa aumenta em ~0.3 rpm/s). Por um tempo-curso de 12 semanas, executar os assuntos em 2, 4, 8 e 12 semanas após o gene transfer.
  2. Permitir que
  3. o rato se adaptar à sala de testes de 20 min.
  4. Para treinar com o rato usar a rotarod pela primeira vez, primeiro iniciar o rotarod definir velocidade de 4 rpm, em seguida, coloque o rato sobre o rotarod. Permitir que o rato caminhar por uma revolução completa a 4 rpm e, em seguida, iniciar a aceleração e permitir que o rato andar sobre o rotarod até que ele cai. Continuar o treinamento até que o rato pode caminhar consistentemente pelo menos 40 s. Um rato saudável, jovem e adulto serão prontamente treinado dessa maneira.
    1. No caso de um rato com uma visível deficiência motora, que pode impedir que o rato uma latência de linha de base para cair de 40 s, fornecer o rato tentativas de formação 3-5 antes de começar a marcar rotarod.
  5. Para iniciar os testes rotarod, coloque o rato sobre o rotarod e começar a aceleração da rotarod. Observe o tempo em que o rato cai do rotarod; Esta é a latência para cair. Se o rato permanece sobre o rotarod depois de 120 s, cap a sessão neste momento, remova o rotarod o rato e gravar uma latência de queda de 120 s.
  6. Repetir o teste duas vezes mais para um total de três julgamentos. Para minimizar o efeito de fadiga, espaço de ensaios pelo menos 5 min separado. As pontuações dos três ensaios em média. Um rato adulto inquebrantável normalmente tem uma latência média a queda das > 40 s.
  7. Coloque o rato volta na gaiola e limpe o rotarod e áreas adjacentes com etanol a 70%.

9. Quantificação da expressão de GFP no cerebelo

  1. anestesiar os ratos e perfundir com salina tampão fosfato (PBS) e, em seguida, paraformaldeído 4%. Dissecar o cérebro e a medula espinhal e mergulhe os tecidos no fixador durante a noite e em seguida, movê-los para uma solução de sacarose de 30%. Depois de equilibração, corte 50 μm coronal seções em um micrótomo deslizante com congelamento fase 4 , 5 , 6.
  2. Escolher 3-6 seções do cerebelo que são espaçadas na vermis, o lobo central do cerebelo. Etiqueta fluorescente a GFP para maximizar o sinal. Use o anticorpo primário para GFP em 1: 500 e Alexa 488 anticorpo secundário conjugado a uma diluição de 1: 300 4 , 5 , 6.
    Nota: Ver referencia 4 , 5 , 6 para mais detalhes sobre a amostragem, corte e coloração procedimentos.
  3. Photomicrograph cada seção na região definida de interesse com uma lente de ampliação baixa usando um microscópio. Uso um objectivo de X 2,5 (N.A. 0,12) e filtro conjunto 10, 450-490/515-565 excitação/emissão). Manter as configurações da câmera (exposição vezes, por exemplo, 2 s) o mesmo através de amostras a analisar. Salve como um. Arquivo TIF.
  4. Abrir a Fotomicrografia no amplamente disponível programa Scion image; duas janelas serão aberto. Feche a janela indicada como " cores indexadas ".
  5. Escolher " opções ", então " densidade SliceŔ uma gama de tons será indicada em vermelho na janela tabela do Look-up (LUT). Na janela, use o cursor para preencher a rotulagem de GFP específica só e parar quando o fundo específico começa a ser levantada na imagem.
    Nota: Isto irá destacar a área fluorescente sobre a Fotomicrografia a quantificar. As configurações devem ser otimizadas para especificamente capturar todas as células fluorescentes visivelmente. Com a prática, este método pode precisamente destacar a fluorescência específica.
  6. Antes de medir a área fluorescente, primeiro assegurar que as medições feitas nas unidades corretas (pixels). Para fazer isso, clique em " Analyze ", então " ScaleŔ conjunto a quarta linha deveria dizer " unidades ". Na lista suspensa, escolha pixels para medir em pixels e, em seguida, clique " Okey ". Alternar entre as opções de análise de " incluem Interior furos " para garantir a inclusão de todo o corpo da célula na análise.
  7. Clique em
  8. para medir a área fluorescente, " analisar " e, em seguida, clique " medida ". Para ver esse valor, clique " Analyze " clique " mostrar ResultsŔ vai aparecer uma janela de resultados. A medição da área fluorescente será sob o título rotulado " área ".
  9. Para garantir a padronização entre as medições, não altere os valores realçados na janela LUT.
  10. , Uma vez que todas as medições foram registradas, os valores médios para cada animal (de 3 a 6 seções por animal). Utilize um teste estatístico apropriado para comparar as áreas transduzidas entre os grupos. 6

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Representative Results

TDP-43 induzidas motor deficiências devem surgir dentro de 2-6 semanas, dependendo da dose da AAV TDP-43 usado (Figura 1). Injeções de veia de cauda malsucedida resultará em parcial ou sem deficiências; a AAV deve atinjam a corrente sanguínea para produzir o efeito. Uma injeção bem sucedida de AAV GFP resultará em expressão de GFP em todo o cérebro e a medula espinhal, de uma forma de vetor-dose dependente. Ao usar o promotor recombinante forte a expressão de unidade, o citomegalovírus frango beta actina híbrido promotor, também conhecido como o promotor CAG, há expressão eficiente no SNC, bem como vários outros tecidos, como fígado e coração. 4 , 5 , 10 dentro do rato, CNS, quando usando AAV9 ou AAV PHP. Vetores de B, o padrão é predominantemente neuronal transdução e transdução glia apenas escassa, esporádica. 4 , 8 uma vez que não há diferença de gênero na eficiência de transdução foi observada em ratos com o método de larga escala, as fêmeas são normalmente usadas para transferência de genes por via venosa devido a seus pesos inferiores. 6

O método de imagem semi-quantitativo descrito é rápida e confiável, porque há uma excelente relação sinal-ruído. Uma amostra não-transfectadas é comparada com uma amostra transduzida na Figura 2 , com ambas as amostras coradas com o anticorpo GFP. Valores recolhidos destas amostras indicam ruído de 0,3% (a partir de valores listados na Figura 2B, D) na amostra não transformados, o que pode ser considerada insignificante. Dada a excelente relação sinal-ruído, este método é válido para comparações rápidas das condições experimentais, tais como tipos de vetor, dose de vetor, sexo, idade, etc.

Figure 1
Figura 1. Transferência de genes de AAV9 TDP-43 em larga escala para ratos provoca deficiência motora progressiva. Rotarod desempenho em 1-3 semanas após o gene transferência de controle GFP ou o gene ALS-relacionados TDP-43. Os sujeitos foram testados antes da transferência de genes e as medições posteriores foram expressos como uma razão para o ponto de tempo de base. Um rato não tratado normal vai ficar sobre o rotarod de 60-90 s nestas condições. Esta figura foi modificada em6.

Figure 2
Figura 2. Rápida quantificação da área fluorescente GFP-positivo no cerebelo após administração intravenosa de AAV para o rato. Uma, B) Non-transfectadas amostra que foi manchada com o anticorpo GFP. C, D) amostra de um rato recebendo AAV9 GFP. B, D) fatia de densidade a opção na imagem de Scion é usada para realçar seletivamente a área fluorescente em vermelho, e então os pixels vermelhos são contados pelo programa. A opção de densidade fatia deve destacar todas as células visíveis e fluorescentes como visto em C. A área vermelha, expressada em pixels quadrados, calculado pelo programa é mostrada em B, D. O ponto de tempo foi 4 semanas após a injeção de veia uma cauda de GFP AAV9 para um jovem rato adulto na dose de 1 x 1014 vector genomas/kg vetor. Barra de escala em lá é 536 µm; mesma ampliação na-i. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Uma variedade de rotas de entrega foram testados para vetores AAV: intraparenquimatosa, intra-cerebroventricular, intra-thecal, por via venosa, intranasal, intramuscular, etc. Cada rota pode ter vantagens específicas, bem como inconvenientes. Administração de cauda veia de AAV de ratos adultos é um método confiável para a realização de transdução consistente do SNC. O método de injeção periférica evita a introdução de uma cânula de injeção nos tecidos CNS e, portanto, minimamente invasivo. A expressão eficiente do CNS que pode ser alcançada por esse método é a maior vantagem da técnica. Outras vantagens práticas são que o método de injeção é muito rápido (cerca de 10 min por animal do início ao fim) e que as injeções de veia de cauda não são altamente técnicas e, portanto, podem ser dominadas rapidamente. Certamente, uma grande desvantagem é que um monte de vetor de alta concentração é necessária, que será uma questão de viabilidade se o AAV preparações são inferiores a 1 x 1013 vector genomas/ml. Com mais refinamento de vetor de direcionamento de recursos, esta abordagem poderia ser vantajoso para a terapia de gene clínicos no futuro, dado que o gene a entrega é por uma via periférica e, portanto, relativamente não-invasivo. Por outro lado, mais direto, injeções de fluido cerebrospinal intra poderiam ser vantajosas em abordagens pré-clínicos e clínicas por duas razões: mais limitados a propagação do vetor e o uso de doses mais baixas de vetor.

Em ratos com pigmentação mais escura, a veia da cauda pode ser mais difícil de identificar. Então, rotas alternativas de administração como injeções retro-orbital ou injeções intravenosas para a veia safena podem ser utilizadas. As injeções de retrô-orbital alvo um leito capilar denso e são, portanto, semelhantes a uma injeção intravenosa. Para os ratos e talvez para ratos também, o método retrô-orbital pode ser mais fácil do que injeções de veia da cauda, mas três estudos mostraram grande consistência de injeções de veia da cauda em ratos adultos. 6 , 8 , 9 a maior parte deste trabalho usado um forte promotor recombinante para a expressão do transgene de unidade, o promotor híbrido do citomegalovírus frango beta actina. 10 se o experimentador deseja delimitar a expressão para os neurônios no SNC, um promotor de tipo específico de célula pode ser tentado, por exemplo o promotor synapsin. 8 , 11

No que diz respeito o método de imagem, é um método rápido, semi-quantitativa para estimar a eficiência de transdução. Se realizado corretamente, em seguida, o ensaio produz uma estimativa fiável da área transduzida. O método padrão-ouro para a contagem de objetos em tecido CNS é chamado stereology. Demora cerca de 75 min por animal para realizar uma sonda stereological em uma região de interesse no cérebro, Considerando que o método descrito é mais rápido em 20 min por animal, ou até menos quando ampliados. Se todas as condições são mantidas iguais e da mesma região corretamente é amostrada, a consistência dos dados se aproxima a grande consistência de stereology, e grandes grupos de amostras podem ser analisados rapidamente em massa.

Há uma série de notas técnicas adicionais que garante ainda mais discussão. Para seção 1 sobre doses de vetor, as doses de vetor necessárias para a expressão do transgene eficiente em ratos foram determinadas por tentativa e erro e dose-resposta em Wang et al., et al. Dayton e Jackson et al, bem como doses anteriores usados em camundongos (Foust et al e Duque et al). 1 , 2 , 4 , 5 , 6 certamente um passo crítico e potencialmente limitante está produzindo alta-título AAV preparações para atingir as doses efectivas.

Para a secção 3 relativamente ao carregar o vetor para a agulha, as bolhas de ar na solução de injeção deve ser evitado como a melhor possível. Uma pequena quantidade de ar não deve ser problemática, como isso pode ser filtrado para fora pelos pulmões, mas volumes excessivos de ar injetado na veia podem causar uma embolia, potencialmente resultando em morte. 12 se as bolhas estão presentes na seringa, o vírus deve ser expulso da seringa, e uma seringa nova deve ser carregada. Para evitar a criação de bolhas, certifique-se de posicionar a agulha perto a queda do vetor sobre o parafilm com o bisel virado para baixo. Quando a maioria do vetor tem sido abordada na agulha, muito lentamente, elaborar o restante da solução. Forma uma pequena bolsa de ar na parte de trás da seringa. Este é um espaço morto e não será injetado. Para assegurar que ela permaneça em direção à traseira da seringa, mantenha a seringa horizontal ou apontado para baixo e não agite a seringa.

Para seção 5 sobre as injeções, para garantir que a injeção vai para a veia e não o tecido em torno da veia, uma vez que a agulha foi inserida, puxe ligeiramente o êmbolo para criar pressão negativa na ponta da agulha. Conforme mencionado, se a agulha está na veia, o sangue deve fluir de volta para a agulha e será visível na base da agulha. Enquanto injetando na veia, pouca resistência deve ser sentida quando a agulha é colocada adequadamente. Se a resistência significativa, então é provável que a injeção no tecido da cauda como descrito acima. Também é possível perfurar através da veia, causando uma "veia soprada", quando o ângulo que a agulha é inserida é muito íngreme, quando o calibre da agulha é grande demais para a veia, ou quando a velocidade de injeção é muito rápida, colocando muita pressão sobre a veia. Uma veia soprada pode ocorrer durante a punção inicial da veia ou durante a injeção. Para evitar a punção da veia durante a injeção ou ter a agulha tornar-se desalojado da veia, a seringa deve ser estabilizada, mantendo a extremidade da seringa contra a cauda como mencionado. Se a agulha se torna desalojada ou uma segunda injeção é necessária por outro motivo, a segunda injeção pode ser feita tanto na veia lateral da cauda, no lado oposto, ou mais perto para o corpo do mesmo lado.

Seção 8, o ensaio rotarod é executado em intervalos de 4 semanas, durante o experimento. Normal, ratos não tratados têm melhores resultados quando eles são mais jovens (4-6 semanas de idade) do que em idades mais velhas. Os défices no reflexo da fuga são plotados como sobrevivência da função de membro ao longo do tempo. As curvas de sobrevivência são analisadas por um teste de log-rank no software prisma.

Para a seção 9 sobre a análise de transdução, com a prática, o procedimento torna-se relativamente rápido, levando cerca de 20 min por animal ou menos. Este ensaio também é altamente confiável, porque não transfectadas tecidos que são processadas com o GFP que mancham o procedimento uma leitura basicamente negligenciável (Figura 2B), e porque há uma vasta gama dinâmica para a leitura. A maioria da fluorescência GFP deriva de células de Purkinje transduzidas, e assim seus grandes números fornecem um grande alcance dinâmico. Até agora, a eficiência de transferência do gene alcançada não tenha causado as leituras saturar em todo o campo (ou seja, transdução de 100% das células de Purkinje), pelo menos quando a transferência do gene é administrada a ratos adultos. Se saturação do campo inteiro fosse um problema, o sinal poderia ser reduzido pela aplicação de uma dose mais baixa de vetor em animais separados ou medindo só a mais fraca, nativa GFP fluorescência, renunciando o procedimento de coloração. Certamente a transdução de outros tipos de células no cerebelo também pode estar contribuindo para o sinal, mas a maioria do que é facilmente visível e contados pelo programa é claramente os corpos celulares das camadas de células de Purkinje e suas árvores dendríticas em molecular camadas ao longo do cerebelo, com base na sua posição e morfologia. Um desafio significativo para o método é que as bolhas de ar ou detritos fluorescente poderiam ser contado, que assim vão contaminar as leituras. Campos com este barulho e seções não são usados; limpas amostras grátis de ruído específico são necessárias. Desde que GFP é uma proteína estrangeira, não há nenhum ruído de fundo dentro do tecido, então a fluorescência específica pode ser precisamente capturada e estimada. Nesses estudos, as GFP fotomicrografias foram capturadas na cor e depois convertidas para escala de cinza usando um programa de imagem diferente Scion Image. No entanto, seria mais simples para capturar o GFP em preto e branco em primeiro lugar, para posterior análise em Scion Image. Estudos anteriores analisaram a transdução da medula espinhal os neurônios motores inferiores em uma base de porcentagem, ou seja, a percentagem de motoneurônios expressando GFP. 4 , 6 no entanto, a análise do cerebelo é mais rápida, exigindo menos seções e também parece ser mais consistente e confiável também (por exemplo, através de observadores individuais, tornando as avaliações). O método de imagem cerebelar rápido é, portanto, um bom índice rápido do sucesso da transferência de genes de periféricos-para-central. Análises da transdução da medula espinhal e exemplos da transdução de outros locais no sistema nervoso de ratos têm sido relatadas em Wang et al., et al. Dayton e Jackson et al 4 , 5 , 6

Em resumo, a via intravenosa de administração é minimamente invasiva; o CNS pode ser alvo de uma administração periférica sem colocar uma agulha no cérebro ou na medula espinhal. Juntamente com o aperfeiçoamento de direcionamento, terapias de gene pré-clínicos e clínicos relevantes vão continuar a usar a entrega por via venosa, enquanto muitos tipos de futuros uma infinidade de estudos funcionais básicos em ratos podem beneficiar-se a transdução expansiva em busca de agilizar o teste de hipótese da função do gene em vivo.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx e uma doação de caridade para a investigação de ALS de Thomas Lawson, para os quais somos gratos. Agradecemos a eliane pomar e Donna Burney para aconselhamento e formação. JAS foi apoiada pela Fundação mentiu e National Institutes of Health conceder GM103418.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

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References

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