Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fareyi bir geniş ölçekli merkezi sinir sistemi gen teslimi için yöntemleri kaplıdır. Bu örnekte, amacı tüm omurilik etkileyen bir hastalık taklit etmektir. Yaygın iletim bir terapötik protein MSS için bir kerelik, Çevre Yönetimi'nden teslim etmek için kullanılabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörleridir Nörobilim anahtar bir reaktif kümelenmiş için düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR), optogenetics, cre-lox hedefleme, vb. Bu yazının amacı geniş merkezi sinir sistemi (MSS) gen transferi kuyruk ven enjeksiyon AAV fare içinde çalışan araştırmacı yardım etmektir. Geniş ölçekli ifade koşulları yaygın patoloji ile ilgilidir ve bir fare modeli büyük boyutu ve fareler için karşılaştırıldığında insanlar fizyolojik benzerlikler nedeniyle önemlidir. Bu örnek uygulamada geniş ölçekli nöronal iletim tüm spinal kord, amyotrofik lateral skleroz (ALS) etkiler bir nörodejeneratif hastalık taklit etmek için kullanılır. Verimli geniş ölçekli CNS iletim terapötik protein faktörleri önceden klinik çalışmalarda sunmak için de kullanılabilir. Birkaç hafta sonra bir sonrası enjeksiyon ifade aralığı, iletim etkileri değerlendirilir. Yeşil flüoresan protein (GFP) denetim vektör için beyincik GFP miktarını hızla ve güvenle temel bir görüntüleme programı tarafından tahmin edilmektedir. ALS tarafından indüklenir motor hastalığı fenotipleri protein transactive yanıt 43 kDa (TDP-43) DNA'ya bağlanıcı protein ilgili için açıkları kaçış refleks ve rotarod tarafından attı. Hastalık modelleme ve gen tedavisi dışında geniş ölçekli gene burada açıklanan hedefleme için çeşitli potansiyel uygulamalar vardır. Bu yöntemin Genişletilmiş Kullanım Hipotez testleri sinir ve neurogenetics hızlandırdığını yardımcı olacak.

Introduction

Nöronlar içinde vivo transducing için verimli oldukları için rekombinant adeno ilişkili virüs (AAV) CNS araştırma için vazgeçilmez araçları vektörleridir. AAV vektörel çizimler farklı transgenes ve protein izoformlarının, farklı doku, farklı ana türler ve yönetim farklı yolları eğitimi için çok yönlü vardır. Örneğin, AAV fareler için çevresel, nispeten nöronlar MSS boyunca ilk olarak transduce için intravenöz enjeksiyon Foust vd ve Duque vd.'da açıklanan invazif olmayan, tarafından yönetilemez duruma gelir (bkz: JÜPİTER tarafından kağıt Gombash vd. (2014)). 1 , 2 , 3 bu gen teslim yaklaşım fareler verimli bir şekilde her iki yeşil flüoresan protein (GFP) ifade etmek için kullanılan veya ALS ilgili protein, transactive Yanıt MSS 43 kDa (TDP-43) DNA'ya bağlanıcı protein. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Rat sıçan fizyolojik ve metabolik parametreleri insanlar fareler karşılaştırıldığında daha yakın olduğundan ve davranışsal ve toksikolojik deneyleri özellikle fareler için tasarlanmış önemli çalışıyor. Ayrıca, daha fazla transgenik fare çizgi kullanılabilir hale gelmektedir bu AAV gen transferi çalışmalarda kullanılan.

Yöntemleri geniş CNS gen transferi fare ve hızlı, güvenilir miktar sonuçlar için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Geniş ölçekli CNS iletim ALS belirtiler Sıçanlarda TDP-43 spinal kord ifade ederek taklit etmek için kullanılır. TDP-43 vektör olarak Jackson ve ark. kullanılan genç yetişkin fareler için kuyruk ven enjeksiyonu yöntemidir 6 , 8 , 9 motor açıkları TDP-43-indüklenen tarafından iki yöntem birkaç hafta sonra attı: kaçış refleks ve Dayton vd ve Jackson ve ark. kullanılan gibi rotarod 5 , 6 , 7 , 9 denetim GFP vektör, otopsi analizi, beyincik floresan alan Jackson ve ark. içinde kullanılan iletim verimliliği dizini olarak hesaplanır 6 , 8 beyincik analiz CNS iletim periferik gen teslim sonra derece hızlı ve güvenilir bir dizin olduğu kanıtlanmıştır ve periferik orta gen transferi çalışırken yaklaşımlar çeşitli için uygulanabilir olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

tüm yordamları uygun NIH yönergeleri takip etti. Tüm yordamları hayvan bakım ve kullanım Komitesi LSU Sağlık Bilimleri Merkezi Shreveport'taki tarafından onaylanmış hayvan iletişim kuralları izledi. Kadın Sprague-Dawley Rat 6 hafta-in yaş, bu yordam için kullanıldı.

1. vektör gerekli doz/hacimleri belirlemek

  1. enjekte edilir ve viral vektör her hayvan için gerekli miktarını belirlemek farelerin tabanlı vektör hazırlık titresi (konsantrasyon) üzerinde tartmak. Daha önce sıçan CNS verimli ifade için başarılı olmuştur vektör dozlarda kullanın (Jackson ve ark bkz. 6).
    Not: AAV9 TDP-43 için ya da AAV9 GFP, tipik bir doz ise 3 x 10 13 arasında - 1 x 10 14 vektör genleri/kg. 6 hafta-in yaş, genç yetişkin fareler tartmak 150 g.
  2. Sistematik karşılaştırmalar için tüm hayvanlarda kg başına eşdeğer doz olun. Ses standart tavsiye enjeksiyon birimleri (250-500 µL için 250 gr iri fare) fazla olamaz emin olun. Genç Yetişkin fare için 200 μl tipik enjeksiyon birimdir.

2. İş istasyonu hazırlamak

  1. tüm gerekli malzemeleri toplamak: bir parafin film kare (yaklaşık 5 x 5 cm) hayvan, hayvan, gazlı bez yastıkları (hayvan başına 2-3), başına bir alkol hazırlık yastık başı damlalıklı ipuçları ve bir micropipette.
  2. % 70 etanol ile yüzey Temizleme tarafından çalışma yüzeyi hazırlamak. Bir Isıtma yastığı (~ 37 ° C) düşük ayarla sıcaklık ile yerleştirin. Bir tezgah yastık Isıtma yastığını üstüne yerleştirin.
  3. Gaz anestezi (isoflurane) hazırlayın. Yeterli oksijen ve gaz anestezi prosedürü için emin olun. İndüksiyon odası ve anestezi maskesi % 70 etanol ile temiz ve anestezi maskesi tezgah rampasında yer.

3. Vektör hazırlamak

  1. oda sıcaklığında vektör çözülme ve her hayvan için bir steril microcentrifuge tüp etiket.
  2. AAV hacmi belirlenen damlalıklı 1.1 uygun tüp içine adım ve istenen enjeksiyon hacmi (burada, 200 μl) kadar birim ile lactated zil getirmek ' s çözüm ya da serum.
  3. Darbe girdap 1-2 s için örnek ve santrifüj 5 için nabız tüp alt örnek getirmek s.
  4. Damlalıklı tüp ve parafin film kare üzerine fare için toplam enjeksiyon hacmi.
  5. 1 mL şırınga 30 gauge iğne yerleştirin.
  6. İğne eğimi parafin film vektör içine aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Tüm virüs iğne ve şırınga olana şırınga pistonu geri çek. Uygulama ile daha kolay olur iğne içine hava kabarcıkları çizim önlemek dikkatli olun.

4. Fareyi hazırlamak

  1. 1 L/dk'ya kadar oksijen açın ve isoflurane anestezi %5 için ayarlayın. Gaz anestezi indüksiyon odasına tüm bağlantı hortumları ve stopcock yönleri kontrol ederek akan olun.
  2. Fare yanıt vermiyor kadar gaz anestezi indüksiyon odasında yaklaşık 3 dakika, fareyi koyun.
  3. Ayak parmak pinching tarafından yeterli anestezi derinliği sağlamak. Ayak çimdik sonra ayak veya bacak hareket yok olmalıdır.
  4. Anestezi bakımı için % 2 isoflurane anestezi azaltmak ve anestezi anestezi maskesi akan stopcock ayarlayın.
  5. Fareyi yer ' s burun anestezi maskesi ve yan tarafında yatıyor sıçan ayarlayın.
  6. Tanımlamak yan kuyruk ven.
    Not: Yan kuyruk damarlar yalan yaklaşık 10 ve 2 o ' saatiyle 12 olarak kuyruk sırt üstünde o ' saat. Yan tarafında yalan fare ile yatay kuyruk ven yukarı bakmalıdır
  7. Alkol hazırlık pad ile enjeksiyon alanı silin. Üçte iki kuyruk uzunluğu aşağı enjeksiyon sitedir.

5. Vektör enjekte

  1. sıkıca kuyruk biraz enjeksiyon alanı tek parmakla üzerindeki doğrudan yanal kuyruk damar üzerinde tutun; bu damar genişletmek.
  2. Eğimi ile aynı yönde görünür kuyruk ven ile iğne hizalamak, karşı karşıya.
  3. Deri alarak büyük bir özen diğer yandan kuyruk tutarak ve kuyruk ven basarak önlemek için ise kuyruk damar üzerinde pierce.
  4. Yayın normal kan akışı için izin vermek kuyruk ven baskısı.
  5. İğne damar içine taşıyın. İğne kuyruğu damarı delmiş emin olmak için geri biraz pistonu üzerinde çek. İğne damar ise, kan iğne akacaktır.
    1. Yeniden konumlandırmak gerektiği gibi iğne. Sonra iğne stabilize etmek için el enjeksiyon sitenin altındaki enjeksiyon siteye yukarıda taşıyıp şırınga sonu karşı kuyruk tutun.
  6. Yavaş yavaş vektör kuyruk (yaklaşık 20 µL/s) enjekte.
    Not: Damar vektör akıyor olarak renk kaybı olabilir. Çözüm ven dışında enjekte edildi işaretleri dahil blebbing, deri veya direnç vektör enjekte zaman sarararak. Uygulama ile ekstra vasküler pozlama en aza indirilebilir.
  7. Vektör yönetilen sonra fare iğneden kaldırmak ve 30-60 s. için sıra kanamada yardımcı olmak için enjeksiyon izi karşı bir gazlı bez yastık tuşuna basın

6. Temizlik

  1. isoflurane kapat anestezi ve oksijen. Bilincinin tekrar yerine geleceğinden sıçan izlemek ve onun kafes dönün.
  2. Dikkatle tüm iğneler "Sharps" kapsayıcısına getirin. AAV ile uygun biohazard konteyner içine kontamine potansiyel olarak diğer tek kullanımlık malzeme atmayın. Çalışma istasyonları % 70 etanol ile temizlik.

7. Hindlimb kaçış refleks değerlendirmek

Not: Hindlimb açıkları genellikle 2-6 hafta sonra TDP-43 gen transferi, vektör doz bağlı olarak ortaya.

  1. Üzerinde düz yüzey net enkaz bir iki parmak ile fare kapmak ' s kuyruk yaklaşık 2 cm vücuttan. Ön ayakları sıçan ventral alt görüntülerken asılı olan kadar fareyi yavaşça kaldır.
    1. Gerçekleştirme yordamı haftalık boyunca deneysel zaman-gen transferi sonra (örneğin, yukarı 12 hafta sonrasına gen transferi).
      Not: Ayrıca forelimb açıkları bu şekilde Puan edinildi ama hindlimb açıkları bağlı olarak kullanılan vektör doz bu modelde oluşma olasılığı daha.
  2. Hindlimbs Eğer bir veya her iki hindlimbs orta hat 10 sırasında doğru sıkmak için 10 s. Not gözlemlemek s.
  3. Tekrar toplam 30 ile üç kez sınava s denemeler arasında. Eğer bir veya her iki hindlimbs her üç denemeler için kenetlenmişdurumda, fare motor fonksiyon bozukluğu gösteriyor. Tüm üç denemeler kenetlenmesi tutarlı ise verilerini (el ile notlar) ya da tek taraflı veya iki taraflı hindlimb açığı mevcut kayıt.

8. Rotarod üzerinde motor işlevleri değerlendirmek

rotarod ayarlamak için
  1. rotarod altında bir tezgah yastık yerleştirin ve ivme üzerinde 2 dk (oranını artırır tarafından ~0.3 d/d/s) 4-40 devir / dakika (devir/dakika) ayarlayın. 12 haftalık zaman-kurs için konularda çalıştırmak 2, 4, 8 ve 12 hafta sonra gene transfer.
  2. İzin ver 20 dakika süreyle test odasına alışmana sıçan
  3. Rotarod ilk kez kullanmak için fare tren ilk set 4 rpm hızında rotarod başlayın, sonra fareyi üzerinde rotarod yerleştirin. 4 RPM bir tam devrim için yürümek, o zaman ivme başlamak fareyi izin ve sıçan kadar düşüyor rotarod üzerinde yürümek izin. Fareyi sürekli olarak en az 40 için yürüyüş yapabilirsiniz kadar eğitim devam s. Sağlıklı, genç bir yetişkin fare kolayca bu şekilde eğitilecek.
    1. Bir göze çarpan motor bozukluğu olan bir sıçan söz konusu olduğunda hangi engelleyebilir sıçan 40 / düşmeye temel gecikme süresi elde s, fare rotarod puanlama başlamadan önce 3-5 Eğitim girişimleri sağlamak.
  4. Rotarod test başlamak için fareyi üzerinde rotarod yerleştirin ve rotarod ivme başlatmak. Not fareyi rotarod denk zaman; Bu sonbahar için gecikme süresi olur. Fareyi üzerinde rotarod 120 sonra kalırsa s, oturum bu noktada kap, fare rotarod kaldırmak ve bir sonbahar gecikme süresi 120 kaydetme s.
  5. Üç deneme olmak üzere toplam iki kez daha test yineleyin. Yorgunluk etkisini en aza indirmek için denemeler en az 5 dk arayla uzay. Üç deneme skoru ortalama. Zarar görmemiş bir yetişkin fare genellikle, düşmeye ortalama bir gecikme süresi vardır > 40 s.
  6. Kafesine döndü fare yerleştirin ve temiz rotarod ve çevresindeki % 70 etanol ile.

9. Miktar beyincik GFP ifadenin

  1. fareler anestezi ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ve % 4 paraformaldehyde ile sıvı. Beyin ve omurilik teşrih ve mendil sabitleştirici geceleme ıslatın ve ardından % 30 Sükroz çözüm taşıyın. Denge sonra 50 mikron koronal bölümler sahne 4 , 5 , 6 dondurma ile sürgülü bir microtome üzerinde kesti.
  2. Vermis, beyincik orta LOB eşit aralıklandırılmış 3-6 beyincik bölümlerini seçin. Fluorescently etiket GFP sinyal en üst düzeye çıkarmak için. Birincil antikor GFP için 1:500 ve 1:300 4 , 5 , 6 seyreltme Alexa 488 konjuge ikincil antikor kullanır.
    Not: Bkz: 4 , 5 , 6 örnekleme, daha fazla ayrıntı için başvuruları kesit ve yordamlar boyama.
  3. Bir düşük büyütme objektif bir mikroskop kullanarak her bölümünde tanımlanmış bölge ilgi photomicrograph. Kullanım bir 2.5 X amaç (N.A. 0,12) ve filtre ayarla 10, 450-490/515-565 uyarma/emisyon). Kamera ayarlarını tutmak (pozlama zaman, örneğin, 2 s) analiz edilecek örnekleri arasında aynı. Olarak kaydetmek bir. TIF dosyası.
  4. Photomicrograph yaygın olarak kullanılan "Soy" görüntü programında açın; iki pencere-ecek açık. Yakın olarak pencere belirtilen " dizine alınmış renk ".
  5. Seç " seçenekleri ", sonra " yoğunluk SliceŔ tonları çeşitli kırmızı arama tablo (LUT) penceresinde gösterilir. Penceresinde belirli GFP sadece etiketleme içinde doldurmak için imleci kullanın ve non-spesifik arka plan görüntüde alınmayı başladığında durmak.
    Not: Bu sayısal photomicrograph floresan alan vurgular. Ayarları özellikle gözle görülür floresan hücrelerin tümünü yakalamak için optimize edilmelidir. Uygulama ile bu yöntem tam olarak belirli Floresans vurgulayabilirsiniz.
  6. Floresan alan ölçme önce ilk yapılan ölçümler doğru birimlerinde (piksel) olduğundan emin olun. Bunu yapmak için tıklatın " analiz ", sonra " ScaleŔ ayarla Dördüncü satır demeliyim " birim ". Piksel piksel cinsinden ölçmek için tıklatın aþaðý açýlan listeden seçin " Tamam ". Çözümleme seçeneğini Değiştir " dahil iç delikleri " dahil tüm hücre vücut analiz edilmesi emin olmak için.
  7. Floresan alanı ölçmek için
  8. 'ı tıklatın " analiz " tıklatıp ardından " ölçü birimi ". Bu değer görmek için tıklatın " analiz " sonra'ı tıklatın " göstermek ResultsŔ sonuçlar pencere-ecek gözükmek. Floresan alan ölçüm etiketli başlığı altında olacaktır " alan ".
  9. Ölçümler arasında standardizasyon sağlamak için LUT penceresinde vurgulanmış değerleri değişmez.
  10. Tüm ölçümler kaydedildi kere,
  11. ortalama her hayvan (hayvan başına 3-6 bölümlerden) değerleridir. Uygun istatistiksel test grupları arasındaki transduced alanlara karşılaştırmak için kullanın. 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TDP-43 indüklenen motor bozuklukları AAV TDP-43 (şekil 1) kullanılan doz bağlı olarak 2-6 hafta içinde ortaya gereken. Başarısız kuyruk ven enjeksiyonları kısmi veya hiçbir bozuklukları neden olur; AAV etkisi üretmek için kan dolaşımına ulaşmalıdır. AAV GFP başarılı bir enjeksiyon GFP ifade beyin ve spinal kord boyunca bir vektör doz bağımlı şekilde neden olur. Sürücü ifade, Sitomegalovirüs tavuk beta aktin hibrid organizatörü CAG organizatörü olarak da bilinen güçlü rekombinant organizatörü kullanırken MSS yanı sıra karaciğer ve kalp gibi çeşitli diğer dokulara verimli ifade iş. 4 , 5 , 10 fare içinde AAV9 veya AAV PHP kullanırken CNS. B Vektörler, desen ağırlıklı olarak nöronal iletim ve yalnızca seyrek, sporadik gliyal hedefidirler. 4 , 8 herhangi bir cinsiyet farkı iletim verimliliği de, fareler geniş ölçekli yöntemiyle gözlenmiştir beri kadın genellikle daha düşük kendi ağırlıkları nedeniyle intravenöz gen transferi için kullanılır. 6

Çünkü mükemmel bir sinyal-gürültü oranı olan yarı kantitatif görüntüleme yöntemi hızlı ve güvenilir. Bir sigara transduced örnek Şekil 2 transduced bir örnek GFP antikor ile lekeli her iki örnekleri ile karşılaştırılır. Bu örnekler toplanan değerleri % 0,3 gürültüden ( şekil 2B, Dlistelenen değerleri) hangi önemsiz kabul edilebilir sigara transduced örnek gösterir. Mükemmel sinyal-gürültü oranı göz önüne alındığında, bu yöntem vektör türleri, vektör doz, cinsiyet, yaş, vb. gibi deneysel koşullar hızlı karşılaştırmalar için geçerlidir.

Figure 1
Şekil 1. Geniş ölçekli AAV9 TDP-43 gen transferi fareler için ilerici motor bozukluğu neden olur. Rotarod performans 1-3 hafta sonra gen Aktarım Denetim GFP veya ALS ile ilgili gen TDP-43. Konular gen transferi önce test edildi ve sonraki ölçümler temel saat noktasına bir oranı olarak ifade edildi. Normal tedavi edilmezse ispiyoncu rotarod 60-90 s Bu koşullar altında kalacak. Bu rakam6ile değiştirildi.

Figure 2
Şekil 2. Beyincik GFP pozitif floresan alanında hızlı miktar sonra fare için intravenöz AAV yönetim. GFP antikor ile lekeli a, B) sigara transduced örnek. C, D) örnek bir sıçan AAV9 GFP alma. B, D) yoğunluğu dilim seçenek "Soy" görüntü üzerinde seçerek kırmızı floresan belirginlefltirmek için kullanılır ve sonra kırmızı piksel program tarafından sayılır. Yoğunluk dilim seçenek görünür floresan hücrelerin tümünü C. içinde görüldüğü gibi vurgulamak gerekir B, ö. kare piksel olarak program tarafından hesaplanan ifade kırmızı alanı görüntülenir 4 hafta sonra AAV9 GFP kuyruk ven enjeksiyon genç yetişkin ispiyoncu, bir vektör 1 x 1014 vektör genleri/kg doz için zaman noktasıydı. A ölçek çubuğu 536 µm olduğunu; A-d aynı büyütme Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Teslimat rotalarını çeşitli AAV vektörel çizimler için test: içi parenkimal, içi-cerebroventricular, içi thecal, intravenöz, burunici, intra kas, vs. Her yol belirli avantajları hem de dezavantajları var. Kuyruk ven AAV yetişkin fareler için MSS tutarlı iletim ulaşmak için güvenilir bir yöntem bir ilçedir. Periferik enjeksiyon yöntemi bir enjeksiyon kanül giriş içine belgili tanımlık CNS doku önler ve bu nedenle minimal invaziv. Bu yöntemle elde verimli CNS ifade tekniği en büyük avantajı var. Enjeksiyon yöntemi çok olduğunu pratik diğer avantajları hızlı (yaklaşık 10 dakika başından sonuna kadar hayvan başına) ve kuyruk ven enjeksiyonları son derece teknik değildir ve bu nedenle hızlı bir şekilde hakim olamaz. Kesinlikle, bir sürü yüksek titresi vektör, hangi-ecek var olmak bir fizibilite sorunu AAV preps 1 x 1013 vektör genleri/ml altında iseniz gereklidir büyük bir dezavantaj olduğunu. Daha fazla yetenekleri hedefleme vektör arıtma ile bu yaklaşım avantajlı klinik gen tedavisi içinde belgili tanımlık gelecek için verilen gen teslim tarafından periferik bir yoldur ve böylece nispeten non-invaziv olabilir. Öte yandan, daha doğrudan intra cerebrospinal sıvı enjeksiyon iki nedenden dolayı preklinik ve klinik yaklaşımlar avantajlı olabilir: daha sınırlı vektör yayılmasını ve alt vektör dozlarda kullanımı.

Daha koyu pigmentasyon farelerle, kuyruk ven belirlemenin daha zor olabilir. Yani, alternatif rotalar yönetim retro-orbital enjeksiyonları veya Safen ven için intravenöz Enjeksiyonlar gibi kullanılabilir. Retro-orbital enjeksiyonları yoğun bir kapiller yatak hedef ve dolayısıyla bir intravenöz enjeksiyon için benzer. Çok ve belki de sıçanlar fareler için retro-orbital yöntemi kuyruk ven enjeksiyonları kolay olabilir ama üç çalışmalar büyük kuyruk ven enjeksiyonları tutarlılığını yetişkin fareler göstermiştir. 6 , 8 , 9 bu işlerin çoğunu bir güçlü rekombinant organizatörü sürücü transgene ifade, Sitomegalovirüs tavuk beta aktin hibrid organizatörü için kullanılır. 10 deneyci MSS nöronlarda ifade sınırlandırmak isterse, bir hücre türüne özgü organizatörü, örneğin synapsin organizatörü teşebbüs olabilir. 8 , 11

Görüntüleme yöntemi ile ilgili olarak, bu iletim verimliliği tahmin etmek için bir hızlı, yarı kantitatif yolu. Eğer doğru bir şekilde yürütülen, tahlil transduced alan güvenilir bir tahminini verir. CNS doku sayım nesneler için altın standart yöntem stereology denir. Açıklanan yöntemi ölçeklendiğinde 20 dk hayvan başına veya bile daha hızlı daha az ise beyin ilgi bir bölgede stereological bir araştırma yapmak için hayvan başına yaklaşık 75 dakika sürer. Tüm koşullar eşit tutulur ve aynı bölgede düzgün örneklenir, veri tutarlılığını stereology büyük tutarlılığını yaklaşımlar ve örneklerinin büyük gruplar hızlı bir şekilde topluca analiz edilebilir.

Daha fazla tartışma garanti ek teknik notlar vardır. Vektör doz ile ilgili bölüm 1 için verimli transgene ifade Sıçanlarda için gerekli vektör dozlarda deneme-yanılma ve doz-yanıt Wang vd., Dayton ve ark.ve Jackson vd., tarafından belirlendi yanı sıra önceki doz fareler (Foust vd ve Duque ve ark) kullanılır. 1 , 2 , 4 , 5 , 6 kesinlikle etkili doz elde etmek için yüksek-titresi AAV preps kritik ve potansiyel hızı sınırlaması adım üretiyor.

Bölüm 3 için vektör iğneyi enjeksiyon çözüm hava kabarcıkları içine yükleme ile ilgili olarak en iyi kaçınılmalıdır. Az miktarda hava bu akciğerler tarafından filtre uygulanabilir ama damar içine enjekte hava aşırı miktarda potansiyel olarak ölümle sonuçlanan bir Venöz hava embolisi neden olabilir gibi sorunlu olmamalıdır. 12 şırıngada baloncuklar yoksa, belgili tanımlık virüs--dan belgili tanımlık tenkıye ihraç ve yeni bir şırınga yüklü olmalıdır. Kabarcıklar oluşturulmasını önlemek için iğne vektör damla yakın aşağı bakacak şekilde eğim ile parafilm üzerinde konumlandırmak emin olun. İğne vektör çoğunluğu alınmıştır, çok yavaş kalan çözüm yukarı çekmek. Küçük bir hava boşluğu şırınga arka oluşturacaktır. Bu ölü boşluk ve değil eklenecek. Şırınga arkasına doğru kalmasını sağlamak için şırınga yatay veya sivri aşağıya doğru tutun ve şırınga fiske değil.

Bölüm 5 enjeksiyonları ile ilgili için enjeksiyon ven ve iğne eklendikten sonra ven çevreleyen doku olmadığı geçer emin olmak için biraz iğne ucunda negatif basınç oluşturmak için pistonu üzerinde çekin. Aynı derecede mezkur, iğne damar ise, kan geri iğne akışı gerekir ve iğne tabanında görünür hale gelir. Damar içine enjekte ederken, küçük direnç ne zaman iğne uygun şekilde yerleştirilir hissettim. Önemli direnç ile karşılaşılırsa, o zaman bu enjeksiyon kuyruk dokusuna yukarıda açıklandığı gibi gidiyor olasıdır. "Şişmiş damar" gauge iğne damar için çok büyük olduğunda iğne eklenir açı çok dik olduğunda veya enjeksiyon hızı damar üzerinde çok fazla baskı çok hızlı olduğunda neden ven yoluyla ponksiyon mümkündür. Bir şişmiş damar damar ilk ponksiyon sırasında veya enjeksiyon sırasında oluşabilir. Enjeksiyon sırasında damar delinme veya iğne damar yerinden haline sahip önlemek için şırınga belirtildiği gibi kuyruk karşı sonuna şırınga tutarak stabilize. İğne yerinden olur veya başka bir nedenle ikinci bir enjeksiyon gereklidir, ya yan kuyruk ven yakın aynı tarafta vücut için yukarı veya karşı tarafta ikinci enjeksiyon yapılabilir.

Bölüm 8 için rotarod tahlil deneme sırasında 4 haftalık aralıklarla çalıştırılır. Ne zaman onlar are genç (4-6 hafta eski) daha büyük yaş itibariyle Normal, daha iyi sonuçlar tedavi edilmezse fareler var. Kaçış refleks açıkları ekstremite fonksiyonu yaşama zamanla olarak çizilir. Hayatta kalma eğrileri günlük-rank testi prizma yazılım tarafından incelenir.

Bölüm 9 iletim analizi, uygulama ile ilgili yordamı nispeten hızlı, yaklaşık 20 dk hayvan başına veya daha az çekici hale gelir. Sigara transduced dokulara olan bu tahlil de son derece güvenilir çünkü yordamı boyama GFP ile işlenen bir temelde önemsiz okuma (Şekil 2B), ve çünkü okuma geniş bir dinamik alan. GFP floresan çoğu transduced Purkinje hücrelerinden türeyen ve böylece onların çok sayıda geniş bir dinamik alan sağlar. Şimdiye kadar gen transfer verimi elde tüm alanı (yani, Purkinje hücre % 100 iletim) arasında en az zaman emdirmek okuma neden olmayacağından gen transferi için yetişkin fareler yönetilir. Doygunluk, tüm alanın bir sorun olsaydı, o zaman sinyali ayrı hayvanlarda daha düşük bir vektör dozda uygulayabilir veya boyama yordamı gittiğiniçin sadece zayıf, yerli GFP Floresan, ölçme indirdi. Kesinlikle diğer hücre tiplerinin beyincik içinde iletim da sinyal ama ne kolayca görünür ve program tarafından sayılır açıkça Purkinje hücre katmanları hücre gövdelerinde ve onların dendritik ağaçlar arasında moleküler çoğu için katkıda Katmanlar boyunca kendi bilinen pozisyonu ve Morfoloji dayalı beyincik. Hava kabarcıkları veya floresan enkaz, hangi-böylece kontamine okumalar sayılması ki yöntemi önemli bir meydan okumadır. Bölümler ve bu gürültü alanlarla kullanılmaz; temiz örnekleri non-spesifik noise etkisi gereklidir. GFP yabancı bir protein olduğu için bu yüzden hiçbir arka plan gürültü doku içinde belirli Floresans kesin yakalanan ve tahmini. Bu çalışmalarda, GFP photomicrographs renkte yakalanan ve gri tonlamalı "Soy" görüntü farklı bir görüntüleme programı kullanarak dönüştürülen. Ancak, bu siyah beyaz GFP ilk etapta "Soy" görüntü daha sonraki analiz için yakalamak daha basit olurdu. Önceki çalışmalarda omurilik alt motor nöron yüzdesi olarak, yani, GFP ifade motoneurons yüzdesi iletim analiz. 4 , 6 ancak, beyincik analiz daha hızlı, daha az bölümleri gerektiren ve aynı zamanda daha tutarlı ve güvenilir de (örneğin, bireysel gözlemciler değerlendirmesi yapmak arasında) gibi görünüyor. Hızlı serebellar görüntüleme yöntemi böylece periferik orta gen transferi başarısı iyi bir hızlı dizin numarasıdır. Spinal kord iletim ve sıçan sinir sisteminin diğer sitelerde iletim örnekleri analizleri Wang vd., Dayton ve ark.ve Jackson ve ark. bildirilmiştir 4 , 5 , 6

Özetle, intravenöz yönetim minimal invaziv yoldur; MSS beyin ya da omurilik bir iğne koymadan bir çevresel yönetim tarafından hedeflenebilir. Hedefleme daha fazla arıtma ile birlikte ilgili önceden klinik ve klinik gen terapileri sayısız gelecekteki türleri içinde rats temel fonksiyonel çalışmaları için pek çok geniş iletim için arayışı içinde tarafından yararlanabilir iken intravenöz teslim, kullanmaya devam edecektir Gen fonksiyonu içinde vivo Hipotez testleri hızlandırmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

Bu eser ALS Derneği, Karyopharm tedavi, Inc, Meira GTx ve Thomas Lawson, kendisi için minnettarız ALS araştırma için bir hayırsever bağış tarafından finanse edildi. Biz Elysse Orchard ve Donna Burney tavsiye ve eğitim için teşekkür ederiz. JAS yalan Vakfı tarafından desteklenen ve ulusal sağlık Enstitüleri GM103418 verin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17, (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18, (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21, (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22, (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17, (1), 69 (2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12, (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20, (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23, (5), 237-246 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics