تعريب كمية البروتين غولجي بالتصوير كتلته مركز الأسفار

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

توطين سكان غولجي دقيقة أمر ضروري لفهم وظائف غولجي الخلوي. المجهر الضوئي التقليدية غير قادر على تحليل هيكل sub-غولجي. هنا يمكننا وصف البروتوكول لأسلوب الفحص المجهري التقليدي على أساس قرار فائقة لتحديد الكمية الترجمة sub-غولجي بروتين.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويتكون المجمع غولجي من الغشاء متسلسل مكدسة cisternae التي يمكن تصنيفها أيضا إلى مناطق فرعية-غولجي، بما في ذلك رابطة الدول المستقلة-غولجي، الآنسي-غولجي، عبر-غولجي و عبر-شبكة غولجي. الوظائف الخلوية من غولجي تتحدد بتوزيع المميزة البروتينات المقيم. القرار المكانية للفحص المجهري الخفيفة التقليدية منخفض جداً لحل الهيكل الفرعي-غولجي أو سيستيرناي. وهكذا، الميكروسكوب الإلكتروني المناعية والذهب أسلوب المفضل لترجمة بروتين على المستوى الفرعي-غولجي. ومع ذلك، تقنية وأداة تتجاوز قدرة معظم المعامل بيولوجيا الخلية. يصف لنا هنا لدينا طريقة وضعت مؤخرا القرار عظمى تسمى غولجي البروتين التعريب بالتصوير مراكز للإعلام (جليم) منهجياً وكمياً تعريب بروتين غولجي. جليم يستند إلى البروتوكولات القياسية fluorescence التوسيم والتقليدية واسع المجال أو مجاهر [كنفوكل]. أنها تنطوي على معايرة زيغ لوني تحول منظومة المجهرية، والحصول على صورة وتحليل ما بعد اكتساب. الترجمة sub-غولجي بروتين الاختبار كمياً يعبر كحاصل التعريب. وهناك أربع مزايا رئيسية من جليم؛ أنها سريعة، استناداً إلى الأساليب التقليدية وأدوات والتعريب والنتيجة الكمية، وأنه يتيح ~ 30 نانومتر القرار العملي على طول المحور غولجي. هنا يمكننا وصف البروتوكول مفصلاً من جليم إلى ترجمة اختبار البروتين غولجي.

Introduction

مجمع غولجي تلعب أدواراً أساسية في الاتجار الافرازية/اندوسيتيك للبروتينات والدهون (يشار إليها فيما بعد من الشحنات) في خلايا الثدييات1،،من23. في غولجي، الشحنات لا فرز لمختلف المكونات الخلوية دون بل أيضا تعديل بواسطة أنواع مختلفة من جليكوسيليشن. يتألف المجمع غولجي الثدييات عديدة مكدسات غولجي المتصلة جانبياً، الذي يتكون عادة من 4-11 الحويصلات غشاء محكم المتاخمة ومسطحة تسمى سيستيرناي. سيستيرناي غولجي متسلسل مكدسة تصنف مزيد، من واحدة من نهاية إلى أخرى، رابطة الدول المستقلة، والانسي و عبر-سيستيرناي. في ترانس-الجانب كدسة غولجي، عبر-معظم غشاء الكيس يتطور إلى شبكة أنبوبية والشبكة غشاء يسمى ترانس-شبكة غولجي (TGN)4. في مسار الافرازية، إدخال الشحنات المستمدة من هيولى (ER) مكدس غولجي في رابطة الدول المستقلة-الجانب وثم التتابع يمر الآنسي و عبر-سيستيرناي. الشحنات في نهاية المطاف إنهاء غولجي في ترانس-ديستينينج غولجي أو TGN إلى غشاء البلازما أو اندوسوميس أو حبيبات افرازية.

الآليات الجزيئية والخلوية كيفية عبور الشحنات كدسة غولجي وكيف يحافظ غولجي تنظيم cisternal تظل غامضة ولا يزال قيد نقاش المحتدم1حاليا. واحدة من الصعوبات في هذا المجال أن cisternae غولجي يمكن حلها إلا تحت المجهر الإلكتروني (م) منذ حل المجهر الضوئي (~ 200 nm) غير كاف لحل cisternae غولجي الفردية (< 100 نانومتر في كلا سمك سيستيرنال والمسافة). ولذلك، تتحدد الترجمة sub-غولجي البروتينات المقيمين وعبور الشحنات تقليديا م المناعية والذهب. بيد أن م المناعية والذهب وتطالب جداً من الناحية الفنية وأنها تتجاوز قدرة معظم المعامل بيولوجيا الخلية. على الرغم من أن يمكن حل م نانومتر الفرعية، والقرار تتيحها م المناعية والذهب يعوقها كثيرا حجم جسم المعقدة (الابتدائية بالإضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية) وجسيمات الذهب، ويمكن أن يكون أسوأ من 20 نانومتر. وعلاوة على ذلك، يتم الحصول على صور م من شرائح رقيقة 2D بدلاً من عرض ثلاثي الأبعاد عالمية غولجي، يمكن أن تؤدي إلى استنتاجات خاطئة استناداً إلى الموضع النسبي والتوجه ل قسم 2D5. على سبيل المثال، دراسة مقطع واحد م غير قادر على موثوق التفريق حويصلة من وجهة نظر متعامد أنبوب حيث يمكن أن يعرض كل ملامح الغشاء جولة مماثلة. الأخيرة ظهور تقنيات مجهرية فائقة القرار، مثل منظم 3D إضاءة مجهرية (3D-سيم)، وحفز الانبعاثات استنفاد (STED)، فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل) والتعمير البصرية العشوائية مجهرية ( العاصفة)، يجعل من الممكن لحل الهياكل الفرعية-غولجي تحت المجهر الخفيفة6. ومع ذلك، هناك مالا يقل عن أربعة من السلبيات التي يمكن أن تحد بشكل كبير استخداماتها في دراسة الخلية البيولوجية غولجي. 1) تقنيات فائقة القرار الحالي يتطلب تكوين الأجهزة باهظة الثمن وخاصة الذي أبعد من معظم المعامل بيولوجيا الخلية. 2) بروتوكولات التوسيم الأسفار الخاصة اللازمة لبعض التقنيات فائقة القرار. 3) وعلى الرغم من هذه التقنيات بموجب الشرط أفضل، المطالبة نانومتر 20-110 في القرار المكانية، القرار عملية الحصول على عينات حقيقية يمكن أن تكون أسوأ بكثير. 4) بالمقارنة بالفحص المجهري التقليدي، هذه التقنيات فائقة القرار لا تزال تواجه صعوبات في إجراء متعدد الألوان، 3D أو يعيش خلية التصوير، أما منفردة أو مجتمعة. ربما الأهم من ذلك، م المناعية والذهب وتقنيات مجهرية فائقة القرار العائد النوعي بدلاً من البيانات الكمية ومسلم.

محاولة جزئيا في حل المشاكل المذكورة أعلاه، وقد وضعنا مؤخرا أسلوب الفحص المجهري خفيفة تقليدية على أساس، الذي يدعى غولجي البروتين التعريب بالتصوير مراكز للإعلام (جليم)، منهجياً وكمياً تعريب غولجي البروتين بدقة تعادل م المناعية والذهب7. في هذا الأسلوب، ينتشر غولجي في خلايا الثدييات مثقف غولجي ميني-مداخن بمعاملة نوكودازولي، دواء ديبوليميريزينج ميكروتوبولي. وقد أثبتت الدراسات الواسعة أن الناجمة عن نوكودازولي غولجي ميني-مداخن (يشار إليها فيما بعد غولجي ميني-مداخن) تشبه مكدسات غولجي الأصلية في كل من المنظمة والوظائف الخلوية8،،من910، 11. حاصل التعريب (LQ) لاختبار البروتين يمكن الحصول عليها عن طريق جليم وأنها ترمز إلى الترجمة sub-غولجي الكمية. ويمكن مقارنة القيم العددية ل LQs وقاعدة LQ أكثر من 25 غولجي علامات كانت متاحة.

في جليم، غولجي ميني-مداخن المسماة ثلاثية GM130 الذاتية أو عن مناشئ وجالت مشري واختبار بروتين (x). GM130 وجالت-مشري، رابطة الدول المستقلةعبر-علامات غولجي على التوالي12،13، توفر نقطة مرجعية. الأخضر ثلاثية الأسفار، الأحمر (R)، (ز) واستعملنا (ب)، يتم عرض صورة مصطنعة كالأحمر والأخضر والأزرق، على التوالي. هو اعتمد مركز الكتلة الفلورية (يشار إليها فيما بعد مركز) لتحقيق القرار الفرعي بكسل. ويعرف المحور غولجي المتجه من مركز GM130 لتلك التي جالت مشري. وعلى غرار المكدس غولجي المصغر كهيكل أسطواني مع إنهائيه التماثل دوران حول محور غولجي. ولذلك، يمكن زيادة غرار غولجي كومة صغيرة كهيكل أحادي المحور غولجي. LQ من البروتين اختبار يعرف س دس/d1، الذي دx هو المسافة من المركز العاشر إلى من GM130، بينما د1 هي المسافة من مركز جالت-مشري لمن GM130. إذا كان مركز العاشر خارج المحور، يتم استخدام المسافة المحورية الإسقاط للحساب. المتغيرات، بما في ذلك غولجي المحور وزاوية المحوري، دس، د1، α زاوية وزاوية β، جليم تخطيطياً موضحة في الشكل 1. LQ مستقل من زاوية المحوري غولجي لو غولجي ميني-مداخن توجيه عشوائياً في خلية.

غولجي ميني-مداخن تظهر متنافرة في الصور. قمنا بتطوير ثلاثة معايير لتحديد أناليزابل غولجي ميني-مداخن جليم. 1) معيار نسبة الإشارة إلى الضجيج، الذي هو نسبة إجمالي كثافة غولجي كومة صغيرة للانحراف المعياري (SD) للخلفية ≥ 30 في كل قناة. هذا المعيار هو ضمان دقة تحديد المواقع الشامل للمركز، الذي يعتمد على نسبة إشارة إلى الضجيج غولجي ميني-مداخن. 2) معيار زاوية أو المسافة المحورية، الأمر الذي يتطلب د1≥ 70 نانومتر. د1 يتناقص مع زيادة الزاوية المحورية غولجي. عند الزاوية المحورية تقترب من 90° أو عمودي، يصبح كومة صغيرة غير الحل ك د1 يقترب من 0. د1≥ 70 نانومتر يمكن استبعاد فعالية قرب العمودي غولجي ميني-مداخن. 3) معيار co-الخطي، التي أما | تان α | أو | تان بيتا | هو ≤ 0.3. ويكفل هذا المعيار بما فيه الكفاية co الخطية لنموذجنا أحادي الأبعاد المكدس المصغر غولجي المراكز الثلاثة من كومة صغيرة. جميع المجاهر الخفيفة يعانون من زيغ التي يمكن أن تشوه خطير المواضع النسبية لمراكز ومضان أحمر وأخضر واستعملنا. زيغ نظم مجهر تجريبيا معايرة بالتصوير 110 نانومتر الخرز، والمسماة ثلاثية بالأسفار الحمراء والخضراء واستعملنا. لكل صورة حبة، وسط الأحمر يعرف الموقف الحقيقي من حبة ولوني تحولات من الأخضر واستعملنا مراكز مزودة بوظائف متعدد الحدود من الدرجة الأولى. مراكز غولجي ميني-مكدسات يتعرضون لوظائف متعدد الحدود لتصحيح اللوني التحولات في قنوات الأخضر واستعملنا.

من خلال جليم علينا التوصل إلى حل ل ~ 30 نانومتر على طول محور غولجي تحت الظروف القياسية. الأهم من ذلك، فإنه يوفر أسلوب المنهجي لتعيين أي البروتين غولجي كمياً. يمكن أن يؤديها جليم المجاهر التقليدية، مثل واسع المجال أو مجاهر [كنفوكل]، استخدام بروتوكولات وضع العلامات الفلورية شيوعاً. يمكن أن تأخذ بتصوير وتجهيز البيانات قصيرة قدر ساعة. جليم, أننا قد أظهر من خلال مباشرة الانتقال التدريجي من الشحنة الافرازية من رابطة الدول المستقلة-إلى ترانس-الجانب غولجي7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: فيما يلي بروتوكول خطوة بخطوة من جليم لتحديد المعلمة LQ اجفب تيروسيلبروتين سولفوترانسفيراسي 1 (TPST1)، مقيمين غولجي، إنزيم في خلايا هيلا.

1-إعداد غولجي المسمى Fluorescence ميني-مكدسات

  1. إعداد كوفيرسليبس الزجاج
    1. المتوسطة (دميم الكوة 0.3 مل العقيمة دولبيكو تعديل النسر) إلى بئر صفيحة 24-جيدا في غطاء زراعة الأنسجة.
    2. مسح قطعة من Φ 12 مم No.1.5 ساترة الزجاج باستخدام ورقة الأنسجة اللينة مست مع الإيثانول 70% لإزالة الحطام على سطح ساترة زجاجية. استخدام زوج من ملاقط حادة بإيجاز نقع في ساترة في الإيثانول 70% وتحويلها إلى لوحة 24-جيدا وبالوعة إلى الجزء السفلي من دميم العقيمة التي تتضمن أيضا.
      ملاحظة: يجري تعقيم الزجاج كوفيرسليبس تقليديا المشتعلة. ومع ذلك، كوفيرسليبس تحت هذا العلاج الكراك بسهولة أثناء وبعد ذلك التعامل. مغطس الإيثانول 70% غير فعالة في تعقيم الزجاج كوفيرسليبس دون الأضرار بها.
    3. مع غطاء يغطي، اترك لوحة 24-جيدا في 37 درجة مئوية CO حاضنة2 حتى الاستخدام.
  2. خلايا البذور
    1. الثقافة هيلا الخلايا (يشار إليها فيما بعد الخلايا) في قارورة T-25 في دميم وتستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS) (يشار إليها فيما بعد إكمال المتوسطة) في حاضنة2 37 درجة مئوية أول أكسيد الكربون تزويد 5% CO2. المضادات الحيوية ليست ضرورية هنا.
    2. عندما تصل إلى الخلايا ~ كونفلوينسي 80%، نضح المتوسطة الثقافة. أضف 1 مل من 0.25% يدتا التربسين في قارورة واحتضان خلايا 37 درجة مئوية CO2 حاضنة للحد الأدنى 2 أضف 1 مل المتوسطة كاملة في قارورة ومسح الخلايا خارج الجدار قارورة بلطف من بيبيتينج.
    3. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب الطرد المركزي العقيمة وتدور في ز 500 x لمدة 2 دقيقة بيليه الخلايا. نضح المادة طافية وتعليق بيليه خلية في المتوسط 1 مل كاملة.
    4. نضح المتوسطة في بئر جيدا 24 لوحة تتضمن ساترة زجاجية معقمة والبذور ~ 1 × 105 خلايا في البئر. أعلى حجم البئر مع المتوسطة كاملة إلى 0.5 مل. احتضان في حاضنة2 CO 37 درجة مئوية تزويد شركة 5%2. الثقافة الخلايا إلى ~ كونفلوينسي 80%.
  3. ترانسفيكت الخلايا
    ملاحظة: الخلايا انتشارا جيدا مفيدة يتم التصوير مشتتة غولجي ميني-مداخن.
    1. ترانسفيكت ~ 80% خلايا المتلاقية مع 80 نانوغرام مشري جالت7 و 320 نغ اجفب TPST1 والبلازميدات الحمض النووي (انظر الجدول للمواد) باستخدام كاشف تعداء وفقا للبروتوكول توفرها الشركة المصنعة. احتضان في حاضنة2 37 درجة مئوية أول أكسيد الكربون. تغيير المتوسطة بعد 4-6 ح الحاضنات. الخلايا على استعداد ~ 12 ح في وقت لاحق.
  4. العلاج نوكودازولي لتوليد غولجي ميني-مكدسات
    1. تحضير حلاً أسهم نوكودازولي (33 ملم) بتذويب 10 مغ نوكودازولي مسحوق في 1 مل ثنائي ميثيل سلفوكسيد. قاسمة الحل الأسهم ومخزن في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    2. تمييع 1 ميليلتر لحل نوكودازولي الأسهم (33 ملم) في 1 مل 37 درجة مئوية كاملة المتوسطة (تركيز نهائي 33 ميكرومتر). الطرد المركزي في سرعة قصوى لإزالة الجسيمات.
    3. نضح المتوسطة في البئر وإضافة 0.5 مل من 33 ميكرون نوكودازولي التي تحتوي على المتوسط كاملة. احتضان خلايا 37 درجة مئوية CO2 حاضنة حاء 3 المضي قدما إلى الفلورة وسم (القسم 1.5).
  5. وسم الفلورة
    ملاحظة: الاحتفاظ الخلايا في الظلام لتجنب فوتوبليتشينج جالت مشري و TPST1-اجفب.
    1. إعداد الكواشف لوسم الفلورة
      1. لإعداد 4% بارافورمالدهيد الحل، حل مسحوق بارافورمالدهيد 4% (w/v) في حارة 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتصفية الحل عن طريق 0.45 ميكرومتر التصفية. ويمكن تخزين الحل عند-20 درجة مئوية.
        تنبيه: بارافورمالدهيد السامة والمسببة للسرطان، ويمكن أن يسبب تهيج الجلد. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية).
      2. لإعداد المخزن المؤقت لتمييع الفلورية (FDB)، مزيج 5% (v/v) FBS، و 2% (w/v) البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني 1 x. تصفية الحل عن طريق 0.45 ميكرومتر التصفية وتخزين الحل عند-20 درجة مئوية.
      3. حل ز 5.35 NH4مسحوق الكلور في الماء 1 لتر لإعداد 100 ملم NH4Cl وتخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
      4. حل مسحوق صابونين 10% (w/v) في المياه إعداد 10% صابونين، الكوة، وتخزين الحل عند-20 درجة مئوية.
    2. التثبيت
      1. أشطف جيدا مرة واحدة مع 0.5 مل 1 × الحل برنامج تلفزيوني وإضافة 0.5 مل 4% بارافورمالدهيد الحل. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أشطف جيدا مرتين مع 0.5 مل س 1 برنامج تلفزيوني ومرتين مع 0.5 مل 100 ملم NH4ألغ شطف جيدا مرتين مع 0.5 مل س 1 برنامج تلفزيوني. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في الظلام.
    3. وصف الأسفار
      1. تمييع 1 ميليلتر الماوس المضادة GM130 جسم الأولية في fdb بقدرة تبلغ 500 ميليلتر يحتوي على 0.1% صابونين. عكس غطاء لوحة 24-جيدا وتطبيق 10 ميليلتر جسم الابتدائي المخلوط على الغطاء.
      2. استخدام زوج من ملاقط حادة لاستخراج ونقل ساترة الزجاج على قطره من ضمان مزيج الأجسام المضادة التي إلى جانب الخلية على اتصال مع الخليط. احتضان الخلايا مع خليط جسم الأولية ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: يمكن وضع الغطاء مع ساترة في كيس من بلاستيك هوميديفيد في الظلام.
      3. استخدام زوج من ملاقط حادة لاستخراج ونقل ساترة إلى البئر بجانب الخلية أعلى وشطف في برنامج تلفزيوني 1 x 0.5 مل ثلاث مرات في ≥ 30 دقيقة هزت لا لزوم لها.
      4. تمييع 1 ميليلتر fluorophore استعملنا الماعز مترافق المضادة الماوس مفتش (جسم الثانوي) في 500 ميليلتر FDB تحتوي على صابونين 0.1%.
      5. غسل وتنظيف سطح عكسي لغطاء لوحة 24-جيدا. تطبيق 10 ميليلتر جسم ثانوي استعملنا المخلوط على الغطاء. كرر الخطوات 1.5.3.2-1.5.3.3.
    4. تصاعد
      1. إعداد متوسطة المتصاعدة بخلط الجلسرين ز 1، ز 2.2 poly(vinyl alcohol) (MW ~ دا 31,000)، 1.2 مل م 1 تريس (pH 8) و 8.8 مل ح2O. حل الخليط في حمام مائي 60 درجة مئوية مع فورتيكسينج أحياناً. مخزن الحل عند-20 درجة مئوية.
      2. ذوبان الجليد المتوسطة المتصاعدة ونقل 10 ميليلتر إلى شريحة زجاج. تراكب ساترة (خلية الجانب الأسفل) إلى انخفاض المتوسط المتصاعدة. احتضان الشريحة الزجاجية في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو درجة حرارة الغرفة ح 1 تتصلب المتوسطة المتصاعدة. ختم ساترة مع طلاء الأظافر عديم اللون وتخزين الشرائح الزجاجية في-20 درجة مئوية.

2-إعداد حبات الفلورسنت لتصحيح لوني التحول

  1. تنظيف ساترة
    1. ضع بعناية قطعة من 25 مم No.1.5 الزجاج ساترة على رفوف بلاستيكية.
    2. نقل الرف ساترة لكوب 400 مل مليئة 300 مل 1 م هيدروكسيد الصوديوم و sonicate في سونيكاتور حمام (35 واط) لإيجاز 15 دقيقة شطف الرف في كوب 400 مل مليئة منزوع 300 مل من الماء. نقل الحامل إلى 400 مل كوب مليئة مل 300 99 ٪ الإيثانول و sonicate في سونيكاتور الحمام عن 15 دقيقة بإيجاز شطف الرف في كوب 400 مل مليئة منزوع 300 مل من الماء.
    3. كرر الخطوة 2.1.2 مرتين أخريين.
    4. شطف الرف مع ساترة في منزوع 300 مل من الماء في كوب 400 مل لأدنى 10 تكرار الخطوة مرتين أخريين. نقل الحامل إلى فرن 60 درجة مئوية والجاف ساترة حاء 1 مخزن ساترة المجففة في صحن بتري خالية من الغبار.
  2. التثبيت حبات الفلورسنت على ساترة زجاجية
    1. شمال البحر الأبيض المتوسط 110 تمييع متعدد الألوان الفلورية الخرز 1 في 80-fold x برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ميكروغرام/ميليلتر جيش صرب البوسنة. باختصار دوامة أنبوب لتفريق المجاميع حبة. نشر 60 ميليلتر المخفف الخرز إلى Φ تنظيفها 25 مم No.1.5 الزجاج ساترة (انظر الفرع 2-1) استخدام تلميح ماصة. جاف ساترة في مجفف متصلاً بمضخة فراغ في الظلام وجبل ساترة إلى شريحة زجاج في 50 ميليلتر تصاعد المتوسطة (راجع الخطوة 1.5.4.2).

3. الحصول على الصور

ملاحظة: يتطلب جليم الصور من ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء (دائرة الاستخبارات الوطنية) لحساب مركز الكتلة عالية الدقة. يمكن الحصول على الصورة بالمجاهر التقليدية مثل ليزر المسح [كنفوكل]، الغزل القرص [كنفوكل] أو واسع المجال المجهر. ويمكن استخدام مجهر واسع المجال مزودة بخطة اللازيغيه الهدف العدسات وجهاز استشعار صورة منخفضة ضوضاء، مثل جهاز اقتران (CCD) والعلمية التكميلية من أشباه الموصلات أكسيد المعدن (سكموس). يتم ضبط معلمات لاستشعار الصورة لضمان مجموعة ديناميكية القراءة-الضوضاء وارتفاع منخفض. يجب أن تكون مجهزة المجهر مع التكوين الأمثل لمرشحات الفلورية الخضراء ومشري واستعملنا فلوروفوري، وأنه يجب أن يكون لديك لا تذكر الأسفار عبر الحديث. ومن الناحية المثالية، يحقق نظام التصوير بمعدل أخذ عينات نايكست في x، محور y و z، التي تتطلب عادة x, y و z حجم فوكسل أن تكون أقل من 100، 100 و 200 نانومتر، على التوالي. X و y حجم فوكسل دائماً متساوون، ويشار إلى pixel_size. يمكن حساب pixel_size واسطة قسمة حجم جهاز استشعار الكاميرا التكبير النظام.

  1. صورة الخرز متعدد الألوان
    1. صورة الخرز متعدد الألوان في قنوات الأخضر والأحمر واستعملنا في البداية ونهاية كل دورة التصوير.
      ملاحظة: هنا، الصور تم الحصول عليها من خلال مجهر التقليدي واسع المجال برنامج التحصين الموسع-الأسفار (مقلوب) مجهزة 100 1.4 X نا خطة اللازيغيه الهدف والمرحلة يجهز، 200 وات هاليد معدني مصدر الضوء وكاميرا سكموس 16-بت. الأطوال الموجية لتصفية الإثارة (شريط التمرير)، مرآة مزدوج اللون (تمرير طويل) وتصفية الانبعاثات (شريط التمرير) المكعب تصفية قناة الأخضر هي 465-495، 505 و 515-555 نانومتر؛ وهذه للمكعب تصفية القناة الحمراء 528-553، 565 و 578-633 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ وهم للمكعب تصفية قناة استعملنا 590-650، 660، وشمال البحر الأبيض المتوسط 663-738. خلال اقتناء، حجم فوكسل على طول x، محور y و z 64 و 64 و 200 نانومتر، على التوالي.
    2. البحث عن مجال رؤية مع كثافة حبة جيدة.
    3. اكتساب رصات الصور ثلاثية الأبعاد في قنوات الأخضر والأحمر واستعملنا (قناةز، القناةR، القناةب، على التوالي). يأخذ الأجزاء 3 أعلاه وأدناه أفضل المستوى البؤري (7 أقسام كل مكدس الذاكرة المؤقتة). حفظ كدسات ثلاثة كثلاثة ملفات TIFF.
      ملاحظة: يتحدد وقت التعرض لكل قناة تجريبية زيادة النطاق الديناميكي، وتجنب التشبع بكسل والتقليل من فوتوبليتشينج. ويتم اختيار المعلمات الأخرى، مثل المرشحات و x، y و z حجم فوكسل، كما نوقش أعلاه.
  2. غولجي ميني-رصات الصور
    1. استخدام TPST1-اجفب وجالت مشري transfected والمسمى فلوريسسينتلي الشرائح (القسم 1.5) للبحث عن الخلايا أن التعبير عن TPST1-اجفب، ومستوى مشري جالت منخفضة أو متوسطة. اكتساب رصات الصور ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في الخطوة 3.1.3.

4. تحليل الصورة

  1. الحصول على مراكز حبات نيون
    1. في إيماجيج، قم بفتح مجموعة من الصور حبة تتكون من ثلاثة ملفات TIFF (ملف > صورة > فتح).
    2. متوسط 3 أقسام متتالية حول المقطع تركيزاً أفضل في قناةآر بالصورة > رصات > المشروع Z. إدخال رقم القسم من "شريحة بدء" و "إيقاف شريحة"، ومن بين الخيارات "نوع العرض"، حدد "متوسط كثافة".
    3. رسم المناطق ذات الاهتمام (رويس) التي تحتوي على لا الخرز في الصورة باستخدام "التحديدات المضلع". في "تحليل > تعيين قياسات"، تحقق من فقط "يعني قيمة الرمادي" و "الانحراف المعياري". ثم تنفيذ "تحليل > التدبير" للحصول على متوسط والتنمية المستدامة من العائد على الاستثمار.
    4. حساب كثافة الخلفية ك "يعني + 6 × SD". طرح الصورة مع القيم المناظرة في كثافة الخلفية من "عملية > الرياضيات > طرح"، إدخال قيمة كثافة الخلفية المقابلة لهذه القناة.
    5. كرر الخطوات من 4.1.2 إلى 4.1.4 للقناةز والقناةب رصات الصور باستخدام نفس بدء وإيقاف الشريحة والخلفية نفس العائد على الاستثمار. علما بأن عائد الاستثمار المستخدمة في الخطوة 4.1.3 يمكن نسخها إلى قناةز والصور قناةب .
    6. دمج ثلاث صور طرح الخلفية (الصورة > لون > دمج القنوات) عن طريق تحديد قناةآر كالأحمر، القناةز كالأخضر والقناةب اللون الأزرق. وسيتم الحصول على صورة مركبة واحدة تتكون من ثلاث قنوات.
    7. تشغيل إدارة العائد على الاستثمار (تحليل > أدوات > إدارة العائد على الاستثمار). رسم عائد مربعا حول الخرز واحد ضمان وجود حبة واحدة فقط ضمن كل عائد الاستثمار. إضافة العائد على الاستثمار لإدارة العائد على الاستثمار عن طريق الضغط على "t" في لوحة المفاتيح. كرر هذه العملية وإضافة رويس أكبر عدد ممكن.
    8. في "تحليل > تعيين قياسات"، تحقق من فقط "مركز الكتلة".
    9. حدد القناةR، في إدارة العائد على الاستثمار، وانقر فوق "قياس" للحصول على المراكز؛ عمودان المقابلة إلى x و y سيتم عرض تنسيق مراكز رويس في نافذة "النتيجة". نسخ ولصق العمودين في جدول بيانات.
    10. كرر الخطوة 4.1.9 للقناةز والقناةب.
    11. ترتيب إحداثيات مراكز في جدول واحد بالترتيب التالي: xR، صص، سز، صز، سب، وصب. حفظ جدول البيانات في تنسيق "csv." ك "beads.csv". ترك أي مساحة في اسم الملف.
  2. تحديد وقياس غولجي ميني-مكدسات
    1. تثبيت وحدات الماكرو اثنين (مرفق في المواد التكميلية) في إيماجيج، "عائد الاستثمار الكلي-غولجي التفتيش" و "الماكرو الناتج 3 قنوات بيانات بالإضافات > تثبيت". واضح دوروا مدير وإطار النتائج.
    2. فتح مجموعة من الصور المصغرة مكدس الذاكرة المؤقتة غولجي تتألف من ثلاثة ملفات TIFF (ملف > صورة > مفتوحة).
    3. كرر الخطوات 4.1.2-4.1.5 وحفظ الصور خصم معلومات أساسية ثلاثة لاستخدامها في وقت لاحق. سجل خلفية الحزب الديمقراطي الصربي لقناةآروالقناةز والقناةب SDR، SDز وبمن التنمية المستدامة، على التوالي، لاستخدامها لاحقاً.
    4. مكرر ثلاث صور خلفية طرح المتولدة من الخطوة 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
    5. في "عملية > صورة الإله الحاسبة"، قم أولاً بإضافة خلفية طرح القناةز للصور قناةآر . إضافة الصورة الناتجة إلى صورة خلفية طرح القناةب . أن الصورة الناتجة، في "الصورة > ضبط > العتبة"، حدد "تعيين" لإدخال "1" كما "أدنى مستوى العتبة". بعد الضغط على "تطبيق"، هو أدى إلى صورة ثنائية أبيض وأسود.
    6. في "تحليل > تحليل الجزيئات"، إدخال نطاق حجم "حجم (بكسل ^ 2)". إدخال "50-اللانهاية". تحقق من "استثناء على حواف" و "إضافة إلى إدارة". رويس التي تتضمن غولجي ميني-مداخن الآن تضاف إلى إدارة العائد على الاستثمار.
      ملاحظة: حجم مجموعة يجب تجريبيا تحديد لاستبعاد أصوات وعموما صغيرة.
    7. دمج ثلاث صور طرح الخلفية (الصورة > لون > دمج القنوات) من الخطوة 4.2.3 بتحديد قناةآر كالأحمر، القناةز كالأخضر والقناةب اللون الأزرق. يتم إنشاء صورة مركبة واحدة تتكون من ثلاث قنوات.
    8. تشغيل الماكرو "عائد الاستثمار الكلي-غولجي التفتيش" عن طريق تحديد "الإضافات > التفتيش دوروا غولجي الماكرو". في مربع الحوار التفاعلي، افحص بصريا كل عائد الاستثمار الحفاظ أو رفضها. حدد رويس التي تحتوي على كائن واحد في جميع القنوات الثلاث.
      ملاحظة: بعد تشغيل هذه الأداة، يتم حلها رويس المرفوضة من إدارة العائد على الاستثمار.
    9. تحقق من فقط "المنطقة"، "متوسط قيمة الرمادي" و "مركز الكتلة" "تحليل > القياسات المحددة". الحصول على البيانات من خلال إطلاق أداة ماكرو "الماكرو الناتج 3 قنوات البيانات" (الإضافات > القنوات 3 الماكرو-إخراج البيانات).
      ملاحظة: يتم عرض المناطق وكثافة يعني مراكز رويس (س وص) في قناةآروالقناةز والقناةب في إطار "النتائج".
    10. نسخ x و y إحداثيات مراكز في جدول بيانات وترتيبها حسب الترتيب التالي: xR، صص، سز، صز، سب، وصب. حفظ جدول البيانات كملف "csv."مينيستاكس(csv.). ترك أي مساحة في اسم الملف. الشروع في تصحيح لوني التحول من المراكز (الفرع 4-3) وحساب LQ (الفرع 4-4).
  3. تصحيح لوني-التحول من مراكز
    1. تثبيت Matlab برنامج التحويل البرمجي وقت التشغيل (MCR).
    2. تثبيت الملفات التالية في مجلد عمل مخصصة: my_train.exe و my_test.exe. نسخ ولصق "beads.csv" و "مينيستاكس.csv" الملفات في نفس المجلد.
    3. بدء تشغيل "موجه الأوامر" من Windows وتذهب إلى مجلد العمل عن طريق كتابة الأمر التالي " مؤتمر نزع السلاح path_of_working_folder".
    4. إنشاء ملف معايرة التحول اللوني باستخدام مراكز خرز. اكتب الأمر التالي "my_train.exe الخرز.csv المعايرة.mat 1". يتم إنشاء ملف يسمى ".matالمعايرة" في مجلد العمل. تجاهل الملفات الأخرى التي يتم إنشاؤها.
    5. تصحيح اللوني-التحول في مراكز غولجي ميني-مكدسات بكتابة الأمر التالي "my_test.exe مينيستاكس.csv corrected_ministacks.csv المعايرة.mat 1".
      ملاحظة: يتم إنشاء ملف باسم "corrected_ministacks.csv" في مجلد العمل. أنه يحتوي على إحداثيات مراكز، والتي هي مرتبة في الترتيب سزصز، سب وصبتصحيح لوني التحول. تجاهل الملفات الأخرى التي يتم إنشاؤها. الإحاطة علما بأن يعرف قناة الأحمر خالية من زيغ ومن ثم سص وصآر هي نفس البيانات الخام.
  4. حساب LQs
    1. إطلاق برامج تحليل البيانات ونسخ ولصق، في أدناه تسلسل، يعني قيم رمادية، المناطق الخلفية مخزونات النشر الاستراتيجي التي تم الحصول عليها من الخطوة 4.2.3 (مكان لهم في الصف 1) وتصحيح تحول لوني x و y إحداثيات غولجي ميني-مكدسات في قناةآر في ورقة عمل كأعمدة ألف إلى هاء وبالمثل، نقل البيانات المقابلة للقناةز والقناةب للأعمدة من F إلى ي وك أن س، على التوالي.
    2. إضافة أعمدة جديدة ثمانية ف أن ث، يدعى "كثافة المتكاملة لقناة آر"، "كثافة المتكاملة للقناة ز"، "كثافة المتكاملة للقناة ب"، d1، dx، ABS(tan a)، وتقاسم المنافع (ب تان) و LQ.
      1. الحق انقر فوق رأس العمود الخاصة بكل منها وحدد "تعيين قيم العمود" لحساب القيم في كل عمود. لعمود ف، إدخال "Col(A)Col(B)"؛ لعمود الإدخال فاء، "Col(F)Col(G)"؛ لعمود البحث، إدخال "Col(K)Col(L)"؛ للعمود S، الإدخال "pixel_size*Distance(Col(D)، Col(E)، Col(N)، Col(O))" حيث "pixel_size" هو حجم بكسل في شمال البحر الأبيض المتوسط؛ لعمود T، الإدخال "pixel_size*((Distance(Col(I)، Col(J)، Col(N)، Col(O))^2+Distance(Col(D)، Col(E)، Col(N)، Col(O))^2-Distance(Col(D)، Col(E)، Col(I)، Col(J))^2)/(2Distance(Col(D)، Col(E)، Col(N)، Col(O)))"؛ لعمود يو، الإدخال "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I)، Col(J)، Col(N)، Col(O))^2+Distance(Col(D)، Col(E)، Col(N)، Col(O))^2-Distance(Col(D)، Col(E)، Col(I)، Col(J))^2)/(2 Distance(Col(I)، Col(J)، Col(N)، Col(O))Distance(Col(D) ، Col(E)، Col(N)، Col(O))) "؛ للعمود الخامس، الإدخال "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D)، Col(E)، Col(I)، Col(J))^2+Distance(Col(D)، Col(E)، Col(N)، Col(O))^2-Distance(Col(I)، Col(J)، Col(N)، Col(O))^2)/(2 Distance(Col(D)، Col(E)، Col(I)، Col(J))Distance(Col(D) ، Col(E)، Col(N)، Col(O))) "؛ لعمود ث، إدخال "العقيد (T)/Col (S)".
    3. تصفية غولجي ميني-رزمة من المعايير الثلاثة المبينة في مقدمة.
      1. في برنامج تحليل البيانات، انتقل إلى "ورقة العمل > ورقة عمل الاستعلام" وحدد العمود المتغيرات لاختبار "إذا". تعيين الأسماء المستعارة التالية I1, I2, I3، d1، A و B للأعمدة "كثافة المتكاملة لقناة آر"، "كثافة المتكاملة للقناة ز"، "كثافة المتكاملة للقناة ب"، d1، ABS(tan a)، وتقاسم المنافع (تان ب)، على التوالي. في "إذا كان الشرط" مربع الإدخال "I1 > =30*cell(1,3) و I2 > =30*cell(1,8) و I3 > =30*cell(1,13) d1 > = 70 (A < = 0.3 أو ب < = 0.3)".
      2. حدد "استخراج إلى ورقة عمل جديدة"، انقر فوق "تطبيق". يتم استخراج الأعمدة A-W أناليزابل غولجي ميني-مكدسات إلى ورقة عمل جديدة.
    4. في ورقة عمل جديدة، انقر الحق أعلى العمود ث، حدد "الإحصاءات على عمود > الحوار مفتوحة". الاختيار "المجموع ن"، و "تعني"، "سراج الدين يعني"، "الرسوم البيانية". ثم يتم عرض التحليل الإحصائي ل LQs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مجهر الضوء الصف البحوث الحديثة مزودة بعدسة اللازيغيه خطة، مثل تلك المستخدمة في المختبر لدينا، يظهر أدنى انحراف لوني (الشكل 2أ). ومع ذلك، يمكن أن تكشف عن دراسة متأنية للصورة متعدد الألوان الفلورية حبة تحول الصور لون مختلف لنفس حبة (الشكل 2ب). نعرف أن القناة الحمراء خالية من زيغ وذلك مراكز للأسفار الأحمر هي مواقف حقيقية من الخرز. يمكن أن يمثله اللوني تحولات النسبي الفلورية الخضراء واستعملنا ناقلات الأخضر والأزرق الصادرة من مركز ومضان أحمر (الشكل 2-ج). ويتجلى اللوني التحول داخل الطائرة-التصوير تجريبيا الموجه الخضراء والزرقاء لكل حبة (الشكل 2د). لدينا المجهر، اللوني-التحولات ليست موحدة كمقادير واتجاهات التغيير تحولات حسب x و y المواقف. اللوني-التحول يمكن أن تؤثر تأثيراً كبيرا على دقة جليم كما يمكن أن يكون تحول مراكز استعملنا قدر 50 نانومتر. ولذلك يجب تصحيح لوني التحول. حالما يتم الحصول على مراكز خرز، نحن نوظف الدرجة الأولى تركيب متعدد الحدود معايرة وبعد تصحيح اللوني التحولات المراكز. الزيغ لوني التحول هو تحسن كبير بهذا النهج (الشكل 2 د-ز).

سيتم تجميع المجمع غولجي في خلايا الثدييات، في منطقة بيرينوكلير والتي عادة ما تكون غير قابل للحل تحت مجهر ضوئي تقليدية (الشكل 3أ). بعد العلاج نوكودازولي لمدة 3 ساعات، يختفي بيرينوكلير مجمع غولجي وتجميع العشرات من ميني-مداخن غولجي في مواقع خروج هيولى في جميع أنحاء السيتوبلازم (الشكل 3ب). قطع كبيرة من الغشاء غولجي ومجمعة غولجي ميني-مداخن موجودة ولم يتم اختيارهم للتحليل. ويبين الشكل 3جصورة مثال توضح اختيار غولجي ميني-مداخن. باستخدام أداة "التفتيش دوروا غولجي الماكرو"، 40 غولجي المحدد ميني-مداخن مذكورة في الشكل 3د. بعد تطبيق المعايير الثلاثة، كانت 21 غولجي ميني-أكوام أناليزابل والذي تم اختياره للحساب من LQs من TPST1-اجفب (الشكل 3د؛ وصفت بأنها "L")، مع إحصاءات ما هو مبين في الشكل 3ه. في المجموع، تم اختيار 111 أناليزابل غولجي ميني-رزمة من 12 زنزانة وتم قياس LQ TPST1-اجفب أن تكون 0.76 0.04 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ n = 111) (الشكل 3و). LQ TPST1-اجفب المناصب من بين جيانتين (LQ = 0.59) واجفب-Rab6 (LQ = 1.04)7. يقع بالقرب من GS15 (LQ = 0.83) و ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = 0.82). حددنا في المناطق الفرعية-غولجي وفقا LQs بالنظر في البيانات النوعية التعريب من الأدب: كاسيريس/ارجيك، <-0.25؛ رابطة الدول المستقلة، 0.00 ± 0.25؛ الآنسي، 0.50 ± 0.25؛ ترانس-غولجي و ± 0.25 TGN, 1.25-2.00 1.00. LQ TPST1-اجفب ولذلك يشير به عبر-غولجي التعريب، والاتفاق مع دراسة سابقة14.

Figure 1
الشكل 1 . الرسوم التوضيحية التخطيطي عرض المتغيرات المستخدمة في حساب جليم- (أ) xz عرض مكدس غولجي صغير يحتوي على مراكز co-المحوري GM130 وجالت مشري والبروتين x fluorescence عرض غولجي زاوية المحوري ومحور و دس د1. صورة المكدس غولجي المصغر هو إسقاط الطائرة الصورة. (ب) س ص ويرى كومة صغيرة غولجي مع مركز خارج المحور من البروتين × عرض α زاوية وزاوية β والإسقاط المحوري المسافة دس. A و B هي مقتبسة من الشكل 1ه و الرقم 1و لدينا المنشور السابق7، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . تصحيح اللوني التحول-- (أ) ألوان الصورة المدمجة من 110 الخرز متعدد الألوان نانومتر التي حصل عليها مجهر واسع المجال. كل حبة تنبعث الخضراء، الحمراء، واستعملنا (مصطنع ملونة كالأزرق) الأسفار. مقياس بار، 10 ميكرون. (ب) الموسع عرض صورة حبة واحدة مدمجة مع وني-تحول ملحوظ. مقياس بار، 200 نانومتر. (ج) رسم تخطيطي تظهر أن تحولات حبة الخضراء واستعملنا الصور يمكن أن يمثله ناقلات من مركز الصورة حبة حمراء (0, 0) إلى مراكز أخضر (الموجه الخضراء) والصور حبة استعملنا (ناقلات الأزرق)، على التوالي. (د، ه) أثر التصحيح لوني التحول. ضمن الحقل نفسه من الصورة، ناقلات الأخضر والأزرق المرسومة قبل وبعد التحول التصحيح. تصور التحول صغيرة، هو تضخيم حجم كل متجه 200-fold. (و، ز) مبعثر مؤامرات عرض مراكز الأخضر (النقاط الخضراء) والخرز استعملنا (تكون هذه النقاط زرقاء) قبل وبعد التحول التصحيح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . مثال نموذجي من جليم, هنا الحصول LQ TPST1-اجفب- خلية هيلا معربا عن TPST1-اجفب (الأخضر) وجالت-مشري (الأحمر) كانت الملون ل GM130 الذاتية (أزرق). (أ) ألف خلية نموذجية. (ب، ج، د، ه) تم تصويرها خلية تعامل مع نوكودازولي (ب). واختيرت أناليزابلي غولجي ميني-مداخن من الصورة، كما هو موضح في C. تتم تسمية المحدد غولجي ميني-مداخن بأرقام الهوية. يتم عرض الصور من هذه ملثمين غولجي ميني-المداخن أدناه د مع أرقام التعريف بهم. "L" يدل على أن المكدس غولجي صغيرة صالحة لحساب LQ (أناليزابل أكوام غولجي المصغر). ويبين الرسم البياني ل LQs مكدسات ميني 21 من الخلية ه. (و): الرسم البياني LQs مكدسات ميني 111 من 12 زنزانة. القيمة المعروضة في الرسم البياني هو يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مواد تكميلية: Inspection.ijm "دوروا" غولجي ماكرو، ماكرو-إخراج 3 قنوات data.ijm، رموز Matlab، template.opj My_train.exe، My_test.exe، وجداول البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

سابقا، كانت أساسا كمياً التعريب بروتين غولجي تحت المجهر الخفيفة بدرجة الترابط أو التداخل في صورة البروتين بصورة علامة غولجي التعريب المعروفة15،16، 17. العلاقة الناتجة أو معامل تداخل يعكس مدى قرب اختبار البروتين علامة غولجي مكانياً. وهناك محاذير ثلاثة على الأقل لهذا النهج. أولاً، الارتباط أو معامل تداخل غير الخطية وأنه لا يشير مباشرة إلى البعد المكاني. ثانيا، درجة الارتباط اعتماداً كبيرا على قرار النظام مجهرية. ولذلك، المعامل بين اثنين غولجي البروتينات غير ثابت مستقل عن النظام. ثالثا، يمكن أن يكون اثنين من البروتينات غولجي مع التعريب المحورية نفسها ولكن مختلفة التوزيع الأفقي على طول cisternae معاملات متميزة. ومن ثم الارتباط أو معامل متداخلة لا تشير إلى التعريب المحوري بروتين غولجي. في أسلوب بديل اقترحه ديججارد et alرابطة الدول المستقلة، و عبر-علامات غولجي والبروتين للاهتمام المسماة ثلاثية في معاملة نوكودازولي غولجي ميني-المكدسات, مماثلة إلى جليم. داخل كل كومة صغيرة غولجي، يتم الحصول على المناصب الثلاثة بكسل أقصى شدتها والموضع النسبي للبروتين الاختبار يحسب ك نسبة مسافة18. أسلوب غير قادر على التوصل إلى قرار بكسل فرعية، مما يحد كثيرا من تطبيقه. مقارنة بالأساليب الكمية السابقة، جليم، التي تم تطويرها بشكل مستقل ولكن يحمل مفهوم مماثل لتلك التي ديججارد et al., قادرة على قياس التعريب المحوري بروتين غولجي بدقة لم يسبق لها مثيل، والاتساق.

وقد عرضنا بروتوكول جليم للحصول على LQ من مناشئ أعرب البروتين معلم بروتينات فلورية خضراء-TPST1-اجفب. ويمكن تحديد LQ البروتين الذاتية إذا كان متوفراً الضد. اعتماداً على هذه الأنواع من الأجسام المضادة الأولية، الماوس أو الأرنب، ثم جسم GM130 مكافحة الأرانب أو الماوس، على التوالي، يمكن استخدامها في البروتوكول الثلاثي العلامات. الأرنب والماوس الأجسام المضادة GM130 لوسم الفلورة متوفرة تجارياً. قد أثبتنا سابقا أن الأجسام المضادة GM130 الأرنب والماوس تعطي نفس النتائج في جليم7. إذا كان اختبار البروتين أحمر جوهريا في الانبعاثات الأسفار، مثل الانصهار مشري، غولجي معلم بروتينات فلورية خضراء البروتين علامة مع LQ المعروفة في تركيبة مع GM130 وسم جسم يمكن استخدامه لتسمية ثلاثية الخلايا ونستنتج LQ البروتين اختبار غير مباشر. تحمل علامة البروتين هو LQ LQم والمسافة من مركز البروتين ماركر إلى أن GM130 دم، LQ من البروتين اختبار x يمكن أن تحسب ك (/dمدس) × LQم. واحد من أعظم مزايا جليم بالمقارنة مع مجهرية فائقة القرار أنه يمكن تطبيقها بسهولة على تصوير الخلايا الحية في الأجهزة المجهرية التقليدية. وقد حاولنا مزيج من ثلاثة البروتينات الفلورية، التجارة والنقل-Golgin84، GM130 مشري وجالت-iRFP670، للرصد بشكل حيوي LQ بروتينات فلورية خضراء-Golgin84 في واحد ميني-مداخن غولجي7.

في جليم، أن الخطوة الأكثر استهلاكاً للوقت هي تحليل اقتناء ما بعد، لا سيما فيما يتعلق باختيار أناليزابل غولجي ميني-مكدسات. غولجي ميني-مداخن غير متجانسة في الحجم والتركيب الجزيئي19، فمن غير الواضح إذا كان توزيع LQs (الشكل 3F) يمثل بنية متجانسة غولجي ميني-مداخن أو عدم التيقن من حساب لدينا LQ. بغض النظر عن الأسباب، وجدنا أنه من المهم أن تحتوي على عدد كبير من أناليزابل غولجي ميني-مداخن (n) ضمان دقة LQ، التي تعرض للخطر عندما يكون n صغيرة. عادة، تؤدي البيانات مع n ≥ 100 من خلايا متعددة LQs موثوق بها. ولذلك، يعطي جليم البيانات التعريب الفرقة في المتوسط، التعتيم من غولجي ميني-مداخن الفردية. قيد آخر من جليم أنها تفترض أن جميع غولجي البروتينات يكون توزيع ضيقة حول مركز واحد. أبلغ عن بعض البروتينات غولجي، مثل مفارز كوبي، ARF1، وقابل للذوبان N-اثيلماليميدي-يراعي عامل مرفق البروتين مستقبلات (الافخاخ)20،21، توزيعها على نطاق واسع من رابطة الدول المستقلة إلى ترانس- غولجي و TGN. أنه من غير المناسب ربما لدراسة التعريب غولجي بهم قبل LQ. جليم حاليا تنطوي على التحديد اليدوي ميني غولجي-المكدسات، وشاقة وغير موضوعية على حد سواء، سوف تكون تنمية جليم في المستقبل لتنفيذ أداة برمجية لتحديد تلقائياً غولجي ميني-مداخن مع الحد الأدنى من التدخل البشري.

ما هو القرار المكانية من جليم؟ نظراً LQ نسبة، وانيتلس، فإنه لا يشير إلى مسافة مكانية. هنا، نحن نحاول إعطاء وضع تقدير تقريبي جداً. ويمكن تعريف القرار المكانية من جليم كأصغر المسافة المحورية بين اثنين من البروتينات غولجي قابل للحل. دراسة LQs مختلف البروتينات غولجي7، وجدنا أن SEMs لمجموعات البيانات مع مجموعة n ≥ 100 حول 0.03. افتراض اثنين غولجي البروتينات ن نفس = 100 ووزارة شؤون المرأة = 0.03، غولجي هما البروتينات قد كبير التعريب المختلفة اختبار t (ف < 0.05)، أيقابلاً للحل، إذا كان الفرق بين ما LQs ≥ 3 × SEM = 0.09. من البيانات م، يمكن أن نقدر أن طول محوري من المكدس غولجي المصغر، وهي أيضا المسافة من GM130 إلى مشري جالت في جليم، ~ 300 نانومتر8. ومن ثم حل جليم يقدر بنحو 0.09 × 300 = 30 نانومتر على طول محور غولجي. في جليم، غلة ن أكبر عموما أصغر وزارة شؤون المرأة، مما يؤدي بدوره في دقة أعلى.

أنه من غير المناسب ربما لمقارنة مباشرة قرار جليم, لأن م المناعية والذهب منذ هذا الأسلوب الأخير لا تؤدي مباشرة إلى البيانات الكمية ومسلم. مشابهة جليم، يمكن تعريف القرار م المناعية والذهب على طول المحور غولجي كأصغر مسافة بين اثنين من علامات غولجي قابل للحل. لقياس قرارها يتطلب دراسة العلامات المزدوجة-المناعية-الذهب من اثنين من البروتينات غولجي عن كثب المجاورة لبعضها البعض على طول المحور غولجي. هذه الدراسة المنهجية غير متوفر ربما وفقا لمعرفتنا. كما ورد في المقدمة، أحد العوامل التي تحد في القرار المكانية م المناعية والذهب هو الحجم الكبير لجسم المعقدة، مما يجعل القرار يكون أسوأ من ~ 20 نانومتر. عامل مهم آخر يحد من دقة وضوح الصورة هو كثافة الجزيئات مستضد التوسيم. ووفقا لنظرية أخذ العينات نايكست، يجب أن يكون هناك اثنين على الأقل من جزيئات الذهب كل وحدة القرار. في معظم الدراسات المناعية والذهب م، المسافات بين جزيئات الذهب الجار هي عدم < 15 شمال البحر الأبيض المتوسط بسبب منخفض جداً وسم الكفاءة؛ وهذا يجعل من الصعب على هذا الأسلوب لتحقيق صورة من قرار أقل من 30 نانومتر. من وجهة النظر هذه، فإننا نقدر أن قرار جليم لا يضاهي على الأقل م المناعية والذهب.

جليم هو أسلوب قوي يعطي نتائج متسقة عالية. أنها مستقلة عن نوع المجهر المستخدمة. قد اختبرنا هذا القرص واسع المجال والغزل المجاهر [كنفوكل] أسفرت عن النتائج نفسها. وكانت LQs البروتينات غولجي نفس المكتسبة في دفعات مختلفة من التجارب أيضا في اتفاق جيد مع بعضها البعض. تم إنشاؤها LQ قاعدة بيانات تتألف من البروتينات المقيم مجموعة متنوعة من غولجي للمقارنة والتفسير. ونحن نتوقع أن استخدام أكثر من جليم في الأوساط البحثية إلى حد كبير توسع قاعدة البيانات. ونتيجة لذلك، قاعدة بيانات أكثر اكتمالا تصف كمياً توطين عدد كبير من البروتينات غولجي سوف يساعد كثيرا في فهم المنظمة والدالة المجمع غولجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

ونود أن أشكر "ستيفنس دال" (جامعة بريستول، بريستول، المملكة المتحدة) على بلازميد "الدنا" TPST1-اجفب، فضلا عن غوفنداراجان ناراسيمهان لاكشمي للمساعدة في تحسين البرامج. كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من المجلس الوطني للبحوث الطبية (نمرك/كبرج/007/2012)، ووزارة التعليم (أكرف Tier1 RG 18/11، RG 48/13 و RG132/15 وأكرف Tier2 MOE2015-T2-2-073) إلى

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (11), 005215 (2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. (2014).
  4. De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (4), 273-284 (2008).
  5. Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20, (15), 3471-3480 (2009).
  6. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, (2), 165-175 (2010).
  7. Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27, (5), 848-861 (2016).
  8. Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6, (11), 1071-1081 (2004).
  9. Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7, (4), 631-650 (1996).
  10. Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99, (3), 1101-1109 (1984).
  11. Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60, (2), 217-227 (1993).
  12. Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).
  13. Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93, (1), 223-229 (1982).
  14. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105, (6), Pt 1 2655-2664 (1987).
  15. Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168, (7), 1039-1051 (2005).
  16. Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
  17. Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13, (1), 119-133 (2002).
  18. Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55, (7), 709-719 (2007).
  19. Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129, (17), 3238-3250 (2016).
  20. Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15, (4), 1506-1518 (2004).
  21. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (11), 005231 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics