לוקליזציה כמותית של חלבון גולג'י על ידי הדמיה המסה מרכז של זריחה

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

ההתאמה המדויקת של תושבים גולג'י חיוני להבנת פונקציות הסלולר של גולג'י. עם זאת, מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי אין אפשרות לפענח את מבנה תת-גולג'י. כאן נתאר את פרוטוקול שיטה סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה קונבנציונאלי המבוסס באופן כמותי לקבוע לוקליזציה תת-גולג'י של חלבון.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הקומפלקס גולג'י מורכב cisternae ממברנה מוערמים באופן סדרתי אשר יכולים להיות מסווגים נוספים לתוך אזורים תת-גולג'י, כולל את חבר העמים-המדיאלי-גולג'י, גולג'י, טרנס-גולג'י ושומן טראנס-רשת גולג'י. פונקציות הסלולר של גולג'י נקבעים לפי ההתפלגות האופיינית מהחלבונים תושב. הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי הוא נמוך מדי כדי לפתור sub-גולג'י מבנה או cisternae. לפיכך, מיקרוסקופ אלקטרונים חיסונית-זהב היא שיטה של בחירה כדי להתאים לשפה חלבון ברמה תת-גולג'י. עם זאת, הטכניקה ואת כלי הנגינה הם מעבר ליכולת של רוב מעבדות ביולוגיה של התא. נתאר כאן שיטת רזולוציה סופר שפותחו לאחרונה שלנו נקרא גולג'י חלבון לוקליזציה על ידי הדמיה מרכזי מסה (GLIM) למקם באופן שיטתי, באופן כמותי חלבון גולג'י. GLIM מבוסס על קרינה פלואורסצנטית רגילה פרוטוקולים תיוג ו רחב-שדות קונבנציונלי או מיקרוסקופ קונפוקלי. זה כרוך הכיול של אברציה כרומטית-shift של המערכת מיקרוסקופיים, רכישת התמונה הניתוח שלאחר הרכישה. לוקליזציה תת-גולג'י של חלבון מבחן מבוטאת באופן כמותי המנה לוקליזציה. ישנם ארבע היתרונות העיקריים של GLIM; זה מהיר, המבוסס על שיטות קונבנציונליות וכלים, התוצאה לוקליזציה היא כמותית, היא מעניקה ~ 30 ננומטר רזולוציה מעשית לאורך הציר גולג'י. כאן נתאר את פרוטוקול מפורט של GLIM כדי להתאים לשפה בדיקת חלבון גולג'י.

Introduction

המתחם גולג'י ממלא תפקידים חיוניים ב סחר הפרשה/endocytic של חלבונים ושומנים (להלן וחקלאיים) תאים בתרבית של1,2,3. -גולג'י, ושינוע מטענים הם לא רק ממוין to תאים סלולריים תת השונים אלא גם שונה על-ידי סוגים מגוונים של גליקוזילציה. המתחם גולג'י יונקים כוללת רבים ערימות גולג'י מחוברים רוחבית, אשר מורכב בדרך כלל 4-11 ממברנה בחוזקה סמוכים ושטוחים שקי שנקרא cisternae. Cisternae גולג'י באופן סדרתי מוערמים מסווגים, מקצה אחד לשני, כמו חבר העמים, המדיאלי, טרנס-cisternae. - טרנס-הצד של ערימה גולג'י, טרנס-שק ממברנה רוב מתפתח מרשת ממברנה צינורי, רשת הנקראת טרנס-גולג'י רשת (TGN)4. השביל הפרשה וחקלאיים נגזר תוך-פלזמית (ER) הזן ערימה גולג'י-שלה cis-בצד ולאחר מכן ברצף להעביר דרך המדיאלי, טרנס-cisternae. וחקלאיים לצאת בסופו של דבר את גולג'י- טרנס-גולג'י או TGN destining קרום פלזמה, endosomes או בגרגרים הפרשה.

המנגנונים הסלולר המולקולריים של איך וחקלאיים מעבר ערימה גולג'י ושומר על איך גולג'י האירגון cisternal להישאר מסתורי והן נמצאות כרגע עדיין תחת דיונים1. אחד הקשיים בתחום זה היא כי cisternae גולג'י בלבד ניתן לפתור תחת מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מאז הרזולוציה של מיקרוסקופ אופטי (~ 200 ננומטר) אינה מספיקה לפתור גולג'י בודדים cisternae (< 100 ננומטר בעובי שני cisternal והמרחק). לכן, לוקליזציה תת-גולג'י של חלבונים תושב, הם מגיעים וחקלאיים כמקובל נקבעות לעוב חיסונית-זהב. עם זאת, לעוב חיסונית-זהב הוא תובעני מאוד טכנית, זה מעבר ליכולת של רוב מעבדות ביולוגיה של התא. למרות הרזולוציה של האלקטרומגנטיות יכול להיות תת ננומטר, הרזולוציה המוענקת על ידי לעוב חיסונית-זהב היא במידה רבה הקשו על ידי הגודל של הנוגדן מורכב (יסודי בתוספת הנוגדן המשני) לבין החלקיק זהב, זה יכול להיות גרוע יותר 20 ננומטר. יתר על כן, תמונות EM מתקבלים ממקטעים 2D דק-במקום תצוגה גלובלית תלת-ממד של גולג'י, אשר עלולה לגרום מסקנות שגויות בהתאם המיקום היחסי ואת כיוון ההדפסה של 2D סעיף5. לדוגמה, ללמוד מקטע יחיד אם אין אפשרות להבחין בצורה אמינה של שלפוחית מהתצוגה אורתוגונלית של צנורית, מאז שניהם ניתן להציג פרופילים זהים ממברנה עגול. הופעתו האחרונה של טכניקות במיקרוסקופ סופר רזולוציה, כגון מיקרוסקופ תאורה מובנה תלת-ממד (3D-SIM), גירוי דלדול פליטה (STED), מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (דקל), שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ ( סופה), מאפשר לפתור מבנים תת-גולג'י תחת מיקרוסקופ אור6. עם זאת, ישנם חסרונות לפחות ארבעה זה יכול להגביל באופן משמעותי את השימושים שלהם בחקר התא הביולוגי גולג'י. 1) רזולוציה סופר הנוכחי טכניקות דורש הגדרת תצורה של חומרה יקר ומיוחד אשר אינה רוב מעבדות ביולוגיה של התא. 2) פרוטוקולים תיוג זריחה מיוחד יש צורך כמה טכניקות סופר רזולוציה. 3) למרות, בתנאים הטובים ביותר, טכניקות אלו טוענים nm 20-110, רזולוציה מרחבית, הרזולוציה המעשי שהושג בדגימות אמיתי יכול להיות הרבה יותר גרוע. 4) בהשוואה מיקרוסקופ רגיל, טכניקות אלו סופר-רזולוציה עדיין יש קשיים בביצוע ססגוניות, תלת-ממד או לחיות תא הדמיה, ביחידים או בשילוב. כנראה והכי חשוב, חיסונית-זהב EM והן את הטכניקות מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה תשואות איכותי במקום נתונים כמותיים לוקליזציה.

ניסיון חלקית לפתור את הבעיות שהוזכרו לעיל, לאחרונה פיתחנו שיטה המקובלת מיקרוסקופ אור מבוסס, אשר הוזכר גולג'י חלבון לוקליזציה על ידי הדמיה מרכזי מסה (GLIM), למקם באופן שיטתי, באופן כמותי גולג'י חלבונים ברזולוציה מקבילה לזו של EM חיסונית-זהב7. בשיטה זו, גולג'י בתרבית תאים בתרבית של מפוזרת כמו מיני גולג'י-במחסן על ידי הטיפול של nocodazole, תרופה depolymerizing microtubule. מחקרים מקיפים הוכיחו כי nocodazole-induced גולג'י מיני-במחסן (להלן גולג'י מיני-ערימות) הדומים יליד ערימות גולג'י הארגון והן תאיים8,9,10, 11. ניתן לרכוש את המנה לוקליזציה (LQ) של חלבון מבחן דרך GLIM, זה מרמז על לוקליזציה תת כמותית-גולג'י. ניתן להשוות את הערכים המספריים של LQs, קיו מסד נתונים של יותר מ-25 גולג'י סמני הייתה זמינה.

ב GLIM, גולג'י מיני-במחסן הם עם התווית משולשת על ידי אנדוגני או ביטוי exogenously GM130, גולט-mCherry החלבון מבחן (x). GM130 וגולט-mCherry, cis- וטרנס-סמני גולג'י בהתאמה12,13, לספק נקודות התייחסות. טריפל פלורסצנטיות, אדום (R), ירוק (G) ומרחיקת אדום (B), באופן מלאכותי מוצגים כמו אדום, ירוק וכחול, בהתאמה. מרכז מסה קרינה פלואורסצנטית (להלן-המרכז) הוא מאומץ כדי להשיג תת פיקסל ברזולוציה. הציר גולג'י מוגדר וקטור ממרכז של GM130 לזה של גולט-mCherry. הערימה מיני גולג'י הוא המודל כמבנה גלילי עם אינסוף סימטריה סיבובית סביב הציר גולג'י. לכן, ערימה מיני גולג'י שניתן למדל נוספות כמו מבנה חד-ממדי לאורך הציר גולג'י. מנת משכל של החלבון במבחן x מוגדרת בתור dx/d1, שבו dx הוא המרחק מן המרכז של x לזו של GM130, בעוד d1 הוא המרחק מן המרכז גולט-mCherry של GM130. אם המרכז של x מהציר, מרחק צירית שלה הקרנה משמש לחישוב. המשתנים, כולל גולג'י ציר, זווית צירית, dx, d1, הזווית α β זווית, עבור GLIM מומחשים סכמטי באיור1. LQ היא עצמאית של הזווית צירית גולג'י למרות גולג'י מיני-במחסן אוריינט באקראי בתא.

גולג'י מיני-במחסן מופיעים inhomogeneous בתמונות. פיתחנו שלושת הקריטריונים לבחירת בקופסאת גולג'י מיני-ערימות עבור GLIM. 1. קריטריון) יחס אות לרעש, שבו היחס בין עוצמת ערימה מיני גולג'י כדי סטיית התקן (SD) של הרקע הכולל הוא ≥ 30 בכל ערוץ. קריטריון זה נועד להבטיח דיוק מיקום מרכז מסה, אשר תלויה יחס אות לרעש של מיני גולג'י-במחסן. 2) מפוח הזווית או המרחק הקריטריון, המחייב d1≥ 70 ננומטר. d1 יורדת עם העלייה של הזווית צירית גולג'י. כאשר הזווית צירית מתקרב 90° או אנכי, הערימה המצומצמת תהיה בלתי-ניתן לפתור כמו d1 מתקרב 0. d1≥ 70 nm יכול לכלול ביעילות ליד מיני גולג'י אנכי-במחסן.... 3 קריטריון) co-ליניאריות, שבו גם | שיזוף α | או | שיזוף β | הוא ≤ 0.3. קריטריון זה מבטיח שלושת המרכזים ערימה מיני יהיו מספיק co-ליניארי עבור שלנו מודל חד-ממדי של הערימה מיני גולג'י. מיקרוסקופ אור כל סובלים אברציה כרומטית אשר ברצינות יכולה לעוות את המיקומים היחסיים של מרכזי פלורסצנטיות מרחיקת אדום, ירוק ואדום. אברציה כרומטית של מיקרוסקופ מערכות השפעול מכויל על ידי הדמיה 110 חרוזים ננומטר, אשר עם התווית שלוש פעמים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מרחיקת אדום, ירוק ואדום. עבור כל תמונה חרוז, מרכז אדום מוגדר מיקומו האמיתי של החרוז, כרומטית-משמרות של מרכזי מרחיקת אדום וירוק הם מצויד ידי פונקציות פולינום מסדר ראשון. מוקדי גולג'י מיני-במחסן הם נתון את פונקציות פולינום לתקן כרומטית-במאזן ערוצי מרחיקת אדום וירוק.

באמצעות GLIM ניתן להשיג רזולוציה של ~ 30 ננומטר לאורך הציר גולג'י בתנאים רגילים. חשוב, זה מספק שיטה שיטתית למפות באופן כמותי את כל חלבון גולג'י. GLIM יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים, כגון שדה רחב או מיקרוסקופ קונפוקלי, באמצעות פרוטוקולים תיוג נפוצות של זריחה. הדמיה ועיבוד נתונים יכול לקחת קצר ככל שעה. דרך GLIM, ישירות הראו את המעבר פרוגרסיבי של המטען הפרשה מחבר ציס- טרנס-הצד של גולג'י7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: בהמשך הוא פרוטוקול צעד אחר צעד של GLIM לקביעת מתויג מנת משכל של EGFP tyrosylprotein sulfotransferase 1 (TPST1), אנזים תושב גולג'י, בתאים הלה.

1. הכנת התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית גולג'י מיני-במחסן

  1. להכין coverslips זכוכית דקה
    1. בינוני (DMEM aliquot 0.3 mL עקר Dulbecco ששינה הנשר) כדי טוב של צלחת 24-ובכן בשכונה תרביות רקמה.
    2. נגב חתיכת באופן כללי 12 מ"מ No.1.5 זכוכית coverslip בעזרת נייר טישו רך נכנס עם 70% אתנול להסרת פסולת על פני השטח של coverslip זכוכית. השתמש זוג מספריים חדים בקצרה לטבול את coverslip 70% אתנול, להעביר אותו המשקולת 24-ובכן, שקעו זה של DMEM סטרילי המכיל גם.
      הערה: coverslips זכוכית דקה כמקובל סטריליים על ידי בוער. עם זאת, coverslips תחת טיפול כזה לפצח בקלות במהלך טיפול לאחר מכן. 70% אתנול השריית יעילה לחיטוי coverslips זכוכית דקה מבלי לפגוע בהם.
    3. עם המכסה מכוסה, להשאיר הצלחת 24-ובכן ב- 37 ° C CO2 מגשים עד השימוש.
  2. תאי זרע
    1. התרבות התאים הלה (להלן תאים) בקבוקון T-25 ב DMEM בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS) (להלן שלם בינוני) בחממה2 37 ° C CO מסופקים עם 5% CO2. אנטיביוטיקה אינם הכרחיים כאן.
    2. כאשר תאים להגיע ~ 80% confluency, תשאף המדיום תרבות. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק, דגירה התאים חממה2 ° 37 C CO 2 דק להוסיף 1 mL בינוני מלא לתוך הבקבוק, לשטוף בעדינות את התאים מהקיר את הבקבוק על ידי pipetting.
    3. העברת תאים מנותקת צנטריפוגה סטרילי צינור ו ספין-500 x g למשך 2 דקות הצניפה התאים. וארוקן את תגובת שיקוע והשהה בגדר תא בינוני מלא 1 מ"ל.
    4. האחות המדיום בבאר של צלחת 24-ובכן המכילות את coverslip זכוכית מעוקר ואת זרע ~ עונה 1 פרק 105 תאים בתוך הבאר. למעלה את עוצמת הקול של הבאר עם שלם בינוני עד 0.5 מ"ל. דגירה של 37 ° C CO2 מגשים שסופק עם 5% CO2. התרבות התאים ~ 80% confluency.
  3. Transfect תאים
    הערה: תאים היטב להפיץ הם יתרון הדמיה מיני גולג'י מפוזר-במחסן....
    1. Transfect ~ 80% תאים confluent עם ng גולט-mCherry 807 ו- 320 ng TPST1-EGFP (ראה טבלה של חומרים) ה-DNA פלסמידים באמצעות תגובה כימית תקנים לפי הפרוטוקול המסופקים על ידי היצרן. דגירה ב חממה2 37 ° C CO. לשנות את המדיום לאחר 4-6 h הדגירה. התאים הם מוכנים ~ 12 שעות מאוחר יותר.
  4. טיפול Nocodazole כדי ליצור מיני גולג'י-במחסן
    1. להכין פתרון מניות nocodazole (33 מ מ) על ידי המסת אבקה nocodazole 10 מ ג של 1 מ"ל דימתיל סולפוקסיד. Aliquot הפתרון מניות וחנות ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
    2. למהול 1 µL של nocodazole מניות פתרון (33 מ מ) 1 מ"ל 37 ° C מלא בינוני (מיקרומטר 33 הריכוז הסופי). צנטריפוגה בשיא המהירות כדי להסיר חלקיקי החומר.
    3. האחות המדיום בבאר ולהוסיף 0.5 מ של 33 nocodazole מיקרומטר המכילות בינוני מלא. דגירה התאים חממה2 ° 37 C CO עבור 3 ח' להמשיך כדי immunofluorescence תיוג (סעיף 1.5).
  5. תיוג immunofluorescence
    הערה: לשמור תאים בחושך כדי להימנע photobleaching של גולט-mCherry, TPST1-EGFP.
    1. להכין ריאגנטים עבור תיוג immunofluorescence
      1. כדי להכין פתרון paraformaldehyde 4%, לפזר אבקת 4% (w/v) paraformaldehyde חמות 1 X buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ולסנן את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.45. הפתרון שניתן לאחסן ב-20 ° C.
        התראה: Paraformaldehyde רעילים ומסרטנים, זה יכול לגרום לגירוי העור. ללבוש את המתאים ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי).
      2. כדי להכין מאגר דילול קרינה פלואורסצנטית (FDB), מערבבים 5% (v/v) FBS ו- 2% (w/v) שור אלבומין (BSA) ב 1 x PBS. לסנן את הפתרון דרך מסנן מיקרומטר 0.45 ולאחסן את הפתרון ב-20 ° C.
      3. להמיס 5.35 g NH4Cl אבקת 1 ליטר מים להכין 100 מ מ NH4Cl ולאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
      4. לפזר אבקת סאפונין 10% (w/v) במים כדי להכין 10% סאפונין, aliquot ולאחסן את הפתרון ב-20 ° C.
    2. קיבעון
      1. לשטוף פעם 0.5 מ ל 1 x PBS פתרון ולהוסיף 0.5 מ ל 4% paraformaldehyde פתרון. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף היטב פעמיים PBS 1 x 0.5 mL, פעמיים עם 0.5 mL 100 מ מ NH4Cl. יש לשטוף היטב פעמיים עם PBS 1 x 0.5 mL. ניתן לשמור תאים ב- 1 x PBS ב 4 ° C בלילה בחושך.
    3. קרינה פלואורסצנטית תיוג
      1. למהול 1 µL העכבר anti-GM130 ראשי נוגדנים ב 500 µL FDB המכיל סאפונין 0.1%. הפוך את המכסה של צלחת 24-ובכן ולהחיל 10 התערובת נוגדן ראשוני µL על המכסה.
      2. השתמש זוג מספריים חדות כדי לחלץ ולהעביר את coverslip זכוכית אל הירידה של נוגדן תערובת להבטיח כי הצד התא הוא בקשר עם התערובת. דגירה התאים עם התערובת נוגדן ראשוני לשעה בטמפרטורת החדר.
        הערה: ניתן להניח את המכסה עם coverslip בשקית פלסטיק humidified בחושך.
      3. השתמש זוג מספריים חדות כדי לחלץ, להעביר coverslip את הבאר עם הצד תא למעלה, שוטפים אותה ב- PBS 1 x 0.5 mL במשך שלוש פעמים ב ≥ 30 דקות טלטול היא מיותרת.
      4. למהול 1 µL fluorophore מרחיקת אדום עז מצומדת אנטי-העכבר IgG (נוגדנים משניים) 500 µL FDB המכיל סאפונין 0.1%.
      5. לשטוף ולנקות את השטח הפוכה של המכסה של צלחת 24-. טוב. החל µL 10 נוגדנים משניים מרחיקת אדום התערובת על המכסה. חזור על שלבים 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. הרכבה
      1. הכן המדיום גובר על ידי ערבוב 1 g גליצרול, poly(vinyl alcohol) 2.2 g (MW ~ דה 31,000), 1.2 מ ל 1 מ' טריס (pH 8) ו- 8.8 מ ל H2O. להמיס התערובת בתוך אמבט מים 60 ° C עם מדי פעם vortexing. לאחסן את הפתרון ב-20 ° C.
      2. להפשיר את המדיום הרכבה ולהעביר µL 10 על זכוכית. מכסים את coverslip (תא בצד למטה) על גבי הירידה של הרכבה בינונית. דגירה השקופית זכוכית-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או בטמפרטורת החדר עבור h 1 להקשיח את המדיום הרכבה. לסגור את coverslip עם לק שקוף ולאחסן את השקופית זכוכית ב-20 ° C.

2. הכנת חרוזים פלורסנט לתיקון כרומטית-shift

  1. Coverslip ניקוי
    1. בזהירות המקום חתיכה של coverslip זכוכית No.1.5 25 מ מ על גבי ארון פלסטיק.
    2. העברה האצטבה עם coverslip גביע 400 מ ל מלא 300 מ"ל 1 M NaOH, sonicate ב sonicator אמבט (35 וואט) במשך 15 דקות בקצרה שטיפה המדף בתוך 400 מ ל מלא יונים 300 מ"ל מים. להעביר את המדף גביע 400 מ ל מלא 300 מ ל 99% אתנול, sonicate ב sonicator אמבט במשך 15 דקות בקצרה שטיפה המדף בתוך 400 מ ל מלא יונים 300 מ"ל מים.
    3. חזור על שלב 2.1.2 עוד פעמיים.
    4. לשטוף האצטבה עם coverslip יונים 300 מ"ל מים בתוך 400 מ ל במשך 10 דקות חזור על השלב פעמיים נוספות. להעביר את ארון תנור 60 ° C ויבש את coverslip עבור 1 ח' חנות coverslip מיובשות בצלחת פטרי ללא אבק.
  2. קיבעון החרוזים פלורסנט coverslip זכוכית
    1. לדלל 110 nm צבע רב פלורסנט חרוזים 80-fold ב 1 x PBS המכיל 0.1 µg/µL BSA. בקצרה מערבולת הצינור לפיזור אגרגטים חרוז. להפיץ 60 חרוזים µL מדולל על גבי coverslip זכוכית (ראו סעיף 2.1) No.1.5 25 מ מ באופן כללי נקי באמצעות טיפ פיפטה. יבש את coverslip ב desiccator מחובר משאבת ואקום בחושך והר את coverslip על זכוכית במדיום הרכבה 50 µL (ראה שלב 1.5.4.2).

3. ייבוא תמונות

הערה: GLIM דורשת תמונות של יחס אות לרעש גבוה (SNR) לחישוב מרכז מסה ברמת דיוק גבוהה. התמונה ניתן לרכוש באמצעות מיקרוסקופים רגילים כגון סריקת קונאפוקלית, לייזר דיסק ספינינג מיקרוסקופ קונפוקלי או שדה רחב. מיקרוסקופ שדה רחב מצויד עם עדשות מטרת התכנית-apochromatic, חיישן התמונה רעש נמוכה, כגון תשלום מצמידים מכשיר (CCD), מדעי משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (sCMOS) יכול לשמש. פרמטרים עבור חיישן התמונה מותאמים כדי להבטיח טווח דינמי לקריאה-רעש וגבוה נמוכה. המיקרוסקופ חייב להיות מצויד תצורת אופטימלית של מסנני קרינה פלואורסצנטית ירוק, mCherry, fluorophore מרחיקת אדום, בטח יש קרינה פלואורסצנטית זניח צולבות לדבר. באופן אידיאלי, מערכת ההדמייה משיגה קצב הדגימה של נייקוויסט ב- x, y ו- z, ציר בדרך כלל דורש x, y ו- z לגודל voxel פחות מ 100, 100 ו-200 nm, בהתאמה. X ו- y של voxel תמיד שווים בגודלם מכונים pixel_size. Pixel_size יכול להיות מחושב על ידי חלוקת גודל חיישן המצלמה על-ידי ההגדלה המערכת.

  1. תמונת צבע רב חרוזים
    1. תמונת צבע רב חרוזים בערוצים מרחיקת אדום, אדום וירוק בתחילתו ובסופו של דבר של כל הפעלה הדמיה.
      הערה: כאן, תמונות נרכשו דרך מיקרוסקופ אפינפרין רחב-שדות קונבנציונלי-זריחה (הפוכה) מצוידים 100 מטרת התכנית-apochromatic X 1.4 נה, הבמה ממונע, מקור האור של 200 וואט מטאל-הליד, מצלמה 16 סיביות sCMOS. אורכי הגל עבור מסנן עירור (הלהקה pass), מראה ודיקרואיק זוהר (פס ארוך), מסנן פליטה (הלהקה pass) של הקוביה מסנן הערוץ הירוק הם 465-495, 505 ו- 515-555 ננומטר; עבור הקוביה מסנן הערוץ האדום אלו 528-553, 565 ו 578-633 ננומטר; ואלו עבור הקוביה מסנן ערוץ מרחיקת אדום 590-650, 660, 663-738 ננומטר. במהלך הרכישה, לגודל voxel לאורך ה-x, y ו- z ציר הוא 64, 64 ו- 200 ננומטר, בהתאמה.
    2. למצוא מבט שדה עם חרוז טוב צפיפות.
    3. רוכשים את אוספי תמונות תלת-ממד בערוצים מרחיקת אדום, אדום וירוק (ערוץG, ערוץR, ערוץB, בהתאמה). לקחת 3 סעיפים מעל ומתחת את הטוב במישור המוקד (7 סעיפים לכל מחסנית). שמור את שלוש ערימות. שלושה קובצי TIFF.
      הערה: זמן החשיפה לכל ערוץ נקבע מדעית כדי להגדיל את הטווח הדינמי, להימנע פיקסל רוויה ולצמצם את photobleaching. פרמטרים נוספים, כגון מסננים, x, y ו- z לגודל voxel, נבחרו כמתואר לעיל.
  2. גולג'י מיני-אוספי תמונות
    1. שימוש TPST1-EGFP mCherry גאלט transfected, fluorescently עם תוויות שקופיות (סעיף 1.5) כדי לחפש את התאים את TPST1-EGFP אקספרס, רמה נמוכה או בינונית של גולט-mCherry. רוכשים את אוספי תמונות תלת-ממד כפי שמתואר בשלב 3.1.3.

4. תמונות ניתוח

  1. רכישת מרכזים של חרוזים פלורסנט
    1. ב- ImageJ, פתח את קבוצת תמונות חרוז המורכב שלושה קובצי TIFF (קובץ > תמונות > פתח).
    2. ממוצע 3 סעיפים רצופים סביב המקטע ממוקד ביותר בערוץR על ידי תמונה > ערימות > פרויקט Z. קלט מספר סעיף "התחל slice" ו- "Stop slice" ובחר בין אפשרויות של "השלכה"סוג","בעוצמה ממוצעת".
    3. צייר אזורים מעניינים (ROIs) המכילים אין חרוזים בתמונה באמצעות "מצולע בחירות". ב "נתח > הגדרת המידות", בדוק רק "ערך אפור מרושע" ואת "סטיית תקן". והוציאו "נתח > מדד" כדי להשיג את מתכוונת ו- SD של רועי.
    4. לחשב את עוצמת רקע כמו "אומר + 6 × SD". להחסיר את התמונה עם ערכי העוצמה של הרקע המתאים על-ידי "תהליך > מתמטיקה > הפחת", קלט בערך העוצמה רקע התואם לערוץ הזה.
    5. חזור על שלבים 4.1.2 כדי 4.1.4 עבור ערוץG ואוספי תמונות ערוץB באמצעות ההתחלה זהה ולהפסיק פרוסה ואת הרקע באותו ROI. שימו לב: רועי בשימוש בשלב 4.1.3 ניתן להעתיק אל ערוץG ותמונות ערוץB .
    6. למזג את שלוש תמונות רקע המופחת (תמונה > צבעים > מזג ערוצים) על-ידי בחירת ערוץR כאדום, ערוץG ירוקה, ערוץB בכחול. ניתן להשיג תמונה ללא הפרדות צבע אחת המורכבת בשלושה ערוצי.
    7. השקת רועי מנהל (נתח > כלים > רועי מנהל). צייר של רועי מרובע סביב חרוזים יחיד ולהבטיח כי יש חרוז אחד בלבד בתוך כל רואי. להוסיף את רועי מנהל רועי על-ידי לחיצה על "t" במקלדת. חזור על תהליך זה ולהוסיף ROIs רבים ככל האפשר.
    8. ב "נתח > הגדרת המידות", לבדוק רק "מרכז מסה".
    9. בחר ערוץR, במנהל רועי, לחץ על "למדוד" כדי להשיג מרכזי; שתי העמודות, התואמים את x ו- y קואורדינטות של מוקדי ROIs יוצג בחלון "תוצאת". העתק והדבק את שתי עמודות גיליון אלקטרוני.
    10. חזור על צעד 4.1.9 ערוץG וערוץB.
    11. לארגן את הקואורדינטות של מרכזי גיליון יחיד לפי הסדר הבא: xR, yR, xG, yGxB, ו- yB. שמור את הגיליון האלקטרוני בתבנית ". csv" "beads.csv". להשאיר מקום בשם הקובץ.
  2. בחר ולמדוד גולג'י מיני-במחסן
    1. להתקין שתי פקודות מאקרו (לצרף תוספת חומרים) ב- ImageJ, "רועי מאקרו-גולג'י פיקוח", "פלט מאקרו 3 ערוצי נתונים" על ידי תוספים > להתקין ". מנהל רועי ברורים והחלון תוצאה.
    2. פתח קבוצה של תמונות בערימה מיני גולג'י המורכב שלושה קובצי TIFF (קובץ > תמונות > פתוח).
    3. חזור על שלבים 4.1.2 - 4.1.5 ולשמור את שלוש המופחת-רקע תמונות לשימוש מאוחר יותר. הרשומה רקע מרחביות עבור ערוץR, ערוץG וערוץB SDR, SDG ו- SDB, בהתאמה, מאוחר יותר לשימוש.
    4. לשכפל את שלושת המופחת-רקע תמונות שנוצרו משלב 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
    5. ב- "תהליך > מחשבון תמונה", להוסיף הרקע-יש לחסר אותם זה ערוץG לתמונות ערוץR . להוסיף את התמונה המתקבלת לתמונה המופחת-רקע ערוץB . על התמונה המתקבלת, ב "תמונות > התאם > הסף", בחר "קבע" קלט "1" כמו "רמת הסף הנמוך". לאחר לחיצה על "החל", תמונה בינארית בשחור לבן היא תוצאה.
    6. ב "נתח > לנתח חלקיקים", קלט את גודל הטווח עבור "גודל (פיקסל ^ 2)". קלט "50-אינסוף". בדוק "אי-כלילה של בקצוות" ו- "הוסף למנהל". ROIs המכילה מיני גולג'י-במחסן יתווספו עכשיו מנהל רועי.
      הערה: גודל הטווח מדעית להיקבע להוציא קולות אשר בדרך כלל.
    7. למזג את שלוש תמונות רקע המופחת (תמונה > צבעים > מזג ערוצים) משלב 4.2.3 על-ידי בחירת ערוץR כאדום, ערוץG ירוקה, ערוץB בכחול. תמונה ללא הפרדות צבע אחת המורכבת בשלושה ערוצי נוצר.
    8. להפעיל את המאקרו "רועי מאקרו-גולג'י פיקוח" על-ידי בחירה "תוספים > מאקרו-גולג'י רועי הבדיקה". בתיבת הדו-שיח האינטראקטיבי, חזותית לבדוק כל רועי לשמור או לדחות אותה. בחר ROIs המכילים אובייקט בודד כל שלושה ערוצים.
      הערה: לאחר הפעלת כלי זה, שנדחו ROIs מסולקות מהמנהל רועי.
    9. צ'ק-אין רק "אזור", "ערך אפור רשע", "מרכז מסה" "נתח > הגדרת המידות". להשיג נתונים על-ידי שיגור כלי מאקרו של "פלט מאקרו שלושה ערוצי נתונים" (תוספים > מאקרו-פלט 3 ערוצי נתונים).
      הערה: אזורים, כלומר עוצמות ומרכזי (x ו- y) של ROIs ערוץR, ערוץG , ערוץB מוצגים בחלון "תוצאת".
    10. העתק x ו- y הקואורדינטות של מרכזי לתוך גיליון אלקטרוני ולסדר אותם לפי הסדר הבא: xR, yR, xG, yGxB, ו- yB. שמור את הגיליון האלקטרוני קובץ "csv" (ministacks. csv). להשאיר מקום בשם הקובץ. המשך תיקון כרומטית-shift המרכזים (סעיף 4.3) וחישוב מנת משכל (סעיף 4.4).
  3. תיקון כרומטית-shift של מרכזי
    1. התקן Matlab מהדר זמן ריצה (בתפוז).
    2. להתקין את הקבצים הבאים בתיקיית עבודה ייעודי: my_train.exe ו- my_test.exe. העתק והדבק "beads.csv" ו-"ministacks. csv" קבצים באותה תיקיה.
    3. השקת "שורת הפקודה" של Windows ועבור אל תיקיית העבודה על-ידי הקלדת הפקודה הבאה " cd path_of_working_folder".
    4. צור קובץ כיול כרומטית-shift באמצעות מרכזי של חרוזים. הקלד את הפקודה הבאה "my_train.exe חרוזים. csv כיול.mat 1". קובץ בשם"כיול.mat" נוצר בתוך תיקיית העבודה. התעלם קבצים אחרים שנוצרו.
    5. תקן כרומטית-משמרת המרכזים של מיני גולג'י-במחסן על-ידי הקלדת הפקודה הבאה "my_test.exe ministacks. csv corrected_ministacks. csv כיול.mat 1".
      הערה: קובץ בשם"corrected_ministacks. csv" נוצר בתוך תיקיית העבודה. הוא מכיל כרומטית-shift הציון המתוקן של מרכזי, אשר מסודרים לפי הסדר של xG, yG,B ו- yB. התעלם קבצים אחרים שנוצרו. שימו לב המוגדר ערוץ הצבע האדום חינם של אברציה כרומטית, ולכן xR ו- yR זהים כנתונים גולמיים.
  4. חישוב LQs
    1. להפעיל את תוכנת ניתוח נתונים, העתק והדבק, להלן רצף, מתכוון ערכי אפור, אזורים, רקע מרחביות המתקבל שלב 4.2.3 (למקם אותם בשורה 1) וכרומטית-shift מתוקן x ו- y הקואורדינטות של מיני גולג'י-ערימות ערוץR ל גליון כעמודות A עם אי באופן דומה, העברת הנתונים המתאימים עבור ערוץG וערוץB על עמודות F J, K כדי O, בהתאמה.
    2. להוסיף עמודות חדשות 8 P W, בשם "משולב האינטנסיביות של ערוץ R", "משולב האינטנסיביות של ערוץ G", "משולב האינטנסיביות של ערוץ B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b), קיו.
      1. העליון של העמודה בהתאמה קליק ימני ובחר "להגדיר ערכי עמודה" לחישוב ערכים עבור כל אחת מהעמודות. עבור עמודה P, קלט "Col(A)Col(B)"; עבור עמודה קיו, קלט "Col(F)Col(G)"; עבור עמודה R, קלט "Col(K)Col(L)"; עבור עמודה זו, קלט "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" שם "pixel_size" הוא גודל הפיקסל ב ננומטר; עבור עמודה T, קלט "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; עבור עמודה U, קלט "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; עבור עמודה V, קלט "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; עבור עמודה W, קלט "Col (T) / Col (S)".
    3. לסנן את המיני גולג'י-במחסן לפי שלושת הקריטריונים המתוארים מבוא.
      1. תוכנת ניתוח של נתונים, כנס ל "גליון עבודה > שאילתת גליון" בחר עמודה משתנים למבחן "אם". להקצות הכינויים הבאים I1, I2, I3, d1, A ו- B עבור עמודות "עוצמה משולבת של ערוץ R", "משולב האינטנסיביות של ערוץ G", "עוצמה משולבת של ערוץ B", d1, ABS(tan a) ו- ABS (tan b), בהתאמה. ב "אם התנאי" תיבת, קלט "I1 > =30*cell(1,3), I2 > =30*cell(1,8) ו- I3 > =30*cell(1,13) AND d1 > = 70 AND (A < = 0.3 או B < = 0.3)".
      2. בחר "לחלץ את גליון חדש", לחץ על "החל". העמודות A-W של מיני גולג'י בקופסאת-במחסן מחולצים לגליון עבודה חדש.
    4. בגליון העבודה החדש, לחץ לחיצה ימנית העליונה של העמודה W, בחר "סטטיסטיקה בעמודה > הדו-שיח פתיחה". הסימון "הכולל N", "רשע", "SE של ממוצע", "היסטוגרמות". ניתוח סטטיסטי של LQs לאחר מכן, מוצגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המחקר המודרני כיתה מיקרוסקופ אור מצויד עם עדשת apochromatic התוכנית, כמו זה בשימוש במעבדה שלנו, מראה אברציה כרומטית מינימלי (איור 2א). עם זאת, בדיקה זהירה של תמונת צבע רב חרוז פלורסנט יכול לחשוף את המשמרת של תמונות צבע שונה של החרוז אותו (איור 2B). אנו מגדירים כי ערוץ הצבע האדום חינם של אברציה כרומטית, ולכן הם מוקדי פלואורסצנטי אדום העמדות נכון של חרוזים. היחסי כרומטית-המשמרות של קרינה פלואורסצנטית מרחיקת אדום וירוק יכול להיות מיוצג על ידי וקטורים ירוק וכחול שמקורם במרכז פלואורסצנטי אדום (איור 2C). משמרת כרומטית בתוך המישור ההדמיה מודגם מדעית על ידי וקטור ירוק וכחול עבור כל חרוז (איור 2D). עבור שלנו מיקרוסקופ, המשמרות-כרומטי אינם אחידים מגניטודות והן כיוונים של משמרות משתנות x ו y עמדות. המשמרת-כרומטי יכול להשפיע באופן משמעותי על הדיוק של GLIM המשמרת של מרכזי מרחיקת אדום יכול להיות ככל 50 ננומטר. לפיכך יש לתקן כרומטית-shift. ברגע מרכזי של חרוזים נרכשים, אנו מעסיקים הולם פולינומיאלי מסדר ראשון, לכייל ולתקן לאחר מכן כרומטית-המשמרות של מרכזי. אברציה כרומטית-shift מאוד משופרת על ידי גישה זו (איור 2 D-G).

בתרבית של תאים, המתחם גולג'י נצבר באזור perinuclear, אשר בדרך כלל אינו ניתן לזיהוי תחת מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי (איור 3א). לאחר טיפול nocodazole למשך 3 שעות, perinuclear הגולגי נעלם ולהרכיב עשרות מיני גולג'י-במחסן באתרי יציאה רשתית תוך-פלזמית ברחבי הציטופלסמה (איור 3ב). נתחים גדולים של קרום גולג'י וערמות צבורים גולג'י מיני-נוכחים, הם לא נבחרו לניתוח. תמונה לדוגמה המדגימה את מבחר מיני גולג'י-במחסן מוצג באיור 3ג'. בעזרת הכלי "רועי מאקרו-גולג'י פיקוח", גולג'י שנבחר 40 מיני-במחסן מפורטים איור 3ד'. לאחר החלת את שלושת הקריטריונים, מיני גולג'י 21-במחסן היו בקופסאת שבחרת עבור החישוב של LQs של TPST1-EGFP (איור 3D; תווית של "L"), עם הסטטיסטיקה שלהם שמוצג באיור 3E. בסך הכל, 111 בקופסאת גולג'י מיני-ערימות נבחרו מתוך 12 תאים ועל מנת משכל של TPST1-EGFP נמדדה להיות 0.76 0.04 (זאת אומרת ± SEM; n = 111) (איור 3F). מנת משכל של TPST1-EGFP עמדות זה בין giantin (מנת משכל = 0.59) ו- EGFP-Rab6 (מנת משכל = 1.04)7. זה ליד GS15 (מנת משכל = 0.83) ו- ST6GalT1-AcGFP1 (מנת משכל = 0.82). הגדרנו את האזורים sub-גולג'י על פי LQs בהתחשב הסבת האיכותני נתונים מן הספרות: ערש/ERGIC, <-0.25; cis, 0.00 ± 0.25; המדיאלי, 0.50 ± 0.25; טרנס-גולג'י, 1.00 ± 0.25, TGN, 1.25-2.00. מנת משכל של TPST1-EGFP ולכן מציינת שלה טרנס-לוקליזציה גולג'י, אשר הוא מסכים עם המחקר הקודם14.

Figure 1
איור 1 . איורים סכמטית מציג המשתנים המשמשים בחישוב של GLIM. (א) תצוגה xz במחסנית מיני גולג'י בעלת מרכזי co-צירית של GM130, גולט-mCherry, חלבון x פלורסצנטיות מציג גולג'י ציר, זווית צירית, dx ו- d1. התמונה של הערימה מיני גולג'י היא שלה הקרנה למטוס התמונה. תצוגת xy (B) במחסנית מיני גולג'י ל'מרכז מהציר של חלבון x מציג הזווית α, β זווית והקרנה צירית מרחק dx. A ו- B מותאמים של איור 1E ואיור 1F של שלנו הקודם הפרסום7, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . תיקון של המשמרת-כרומטי. (א) התמונה הממוזגת תלת-צבעי של 110 חרוזים צבע רב ננומטר, שנרכשה על ידי מיקרוסקופ שדה רחב. כל חרוז פולט ירוק, אדום, מרחיקת אדום (באופן מלאכותי נצבעים בכחול) זריחה. סולם בר, 10 מיקרומטר. (B) להציג מוגדל של תמונה בודדת-חרוז הממוזג עם מורגש כרומטית-משמרת. קנה המידה של בר, 200 ננומטר. (ג) A תרשים סכמטי מראה כי משמרות של חרוז מרחיקת אדום וירוק תמונות יכול להיות מיוצג על ידי וקטורים ממרכז התמונה חרוז אדום (0, 0) אל מוקדי ירוק (וקטורית ירוק) ותמונות חרוז מרחיקת אדום (וקטורית כחול), בהתאמה. (יח, E) השפעת התיקון כרומטית-shift. תוך באותו שדה תמונה, ירוק וכחול וקטורים מותוות לפני, אחרי משמרת תיקון. כדי להמחיש את המשמרת זעירים, סדר הגודל של כל וקטור מוגבר 200-fold. (F, G) פיזור החלקות מציג מרכזי של ירוק (נקודות ירוקות) וחרוזים מרחיקת אדום (נקודות כחולות) לפני ואחרי תיקון shift. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . דוגמה טיפוסית של GLIM, כאן רכישת מנת משכל. של TPST1-EGFP. תא הלה לבטא TPST1-EGFP (ירוק), גולט-mCherry (אדום) היה מוכתם GM130 אנדוגני (כחול). (א) א תא טיפוסי. (B, C, D, E) תא שטופלו nocodazole היה עם תמונה (B). מהתמונה, נבחרו בקופסאת גולג'י מיני-במחסן כפי שמוצג ב- C. מיני גולג'י הנבחר-במחסן מסומנות על ידי מספרי זיהוי. תמונות של המיני-ערימות אלו גולג'י רעולי פנים מוצגות להלן ברה עם מספרי זיהוי שלהם. "L" מציין כי הערימה מיני גולג'י הוא תקף החישוב של מנת משכל (בקופסאת גולג'י מיני ערימות). היסטוגרמה של LQs של 21 מיני-במחסן מהתא מוצג ב- E. (F) היסטוגרמה של LQs של מיני 111-במחסן של 12 תאים. הערך המוצג בהיסטוגרמה זה זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תוספת חומרים: מאקרו-גולג'י רועי inspection.ijm, פלט מאקרו 3 ערוצי data.ijm, קודי Matlab, template.opj My_train.exe, My_test.exe וגיליון אלקטרוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבר, הלוקליזציה של חלבון גולג'י תחת מיקרוסקופ אור הייתה לכמת בעיקר על ידי מידת המתאם או חופפים של התמונה של החלבון עם התמונה של סימן גולג'י לוקליזציה ידוע15,16, 17. המתאם המתקבל או מקדם חופפים משקף כמה קרוב החלבון הבדיקה היא דה מרקר גולג'י במרחב. ישנן לפחות שלוש אזהרות עבור גישה זו. ראשית, המתאם או מקדם חופפים לא לינארית, זה לא לציין ישירות מרחק מרחבית. שנית, מידת המתאם תלויה באופן ביקורתי הרזולוציה של מערכת מיקרוסקופיים. לכן, המקדם בין שני חלבונים גולג'י אינו קבוע שאינו תלוי במערכת. השלישי, שני חלבונים גולג'י עם לוקליזציה צירית זהה אך חלוקה הלטראלי שונה לאורך cisternae יכול להיות ברורים המקדמים. לפיכך, המתאם או מקדם חופפים אינו מציין לוקליזציה צירית של חלבון גולג'י. ב שיטה חלופית המוצע על ידי Dejgaard et al., חבר העמים, טרנס-גולג'י סמני החלבון עניין הם עם התווית שלוש פעמים ב nocodazole התייחסו גולג'י מיני-במחסן, הדומה GLIM. תוך כל ערימה מיני גולג'י, עמדות של הפיקסלים העוצמה המקסימלית שלושה נרכשים, המיקום היחסי של החלבון בדיקה מחושבת כעבודה יחס מרחק18. עם זאת, השיטה שלהם אין אפשרות להשיג רזולוציה פיקסל משנה, אשר מגביל מאוד את היישום שלה. לעומת שיטות כמותיות קודמות, GLIM, אשר פותחה באופן עצמאי אבל נושא רעיון דומה לזה של Dejgaard et al., היא היכולת לכמת לוקליזציה צירית של חלבון גולג'י עם עקביות ודיוק חסר תקדים.

הצגנו את הפרוטוקול של GLIM לרכוש מנת משכל של exogenously ביטוי מתויג GFP חלבונים - TPST1-EGFP. מנת משכל של חלבון אנדוגני יכול להיקבע אם הנוגדן שלה זמין. תלוי בזן של נוגדן ראשוני, עכבר או ארנב, ואז נוגדן anti-GM130 ארנבת או עכבר, בהתאמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול תיוג משולש. נוגדנים אנטי-GM130 הארנב והן העכבר עבור תיוג immunofluorescence זמינים מסחרית. בעבר הראו כי הארנב ועכבר נוגדנים anti-GM130 לתת את אותן תוצאות ב- GLIM7. אם החלבון המבחן הוא מהותי אדום פליטת קרינה פלואורסצנטית, כגון mCherry פיוז'ן, גולג'י מתויג GFP סמן חלבון עם קיו ידוע בשילוב עם תיוג נוגדן GM130 יכול לשמש לתאים טריפל-תווית ולהסיק בעקיפין מנת משכל של החלבון מבחן. בהנחה של החלבון הסמן LQ LQמ' והוא המרחק מן המרכז של החלבון הסמן של GM130 dm, מנת משכל של החלבון במבחן x יכול להיות מחושב (dx/dמ') × LQמ'. אחד היתרונות הגדולים של GLIM לעומת סופר רזולוציה מיקרוסקופ הוא כי ניתן בקלות להחיל אותה על ההדמיה תא בשידור חי בקונבנציונלי setups מיקרוסקופיים. ניסינו שילוב של שלושה חלבונים פלורסצנטיות, GFP-Golgin84, mCherry-GM130, גולט-iRFP670, לניטור באופן דינמי את מנת משכל של GFP-Golgin84 גולג'י יחיד מיני-במחסן7.

ב- GLIM, השלב הכי הגוזלות זמן הוא הניתוח שלאחר הרכישה, במיוחד על הבחירה של מיני גולג'י בקופסאת-במחסן.... כפי גולג'י מיני-במחסן הטרוגנית הן בגודלו והן ההרכב המולקולרי19, לא ברור אם חלוקת LQs (איור 3F) מייצג את הארכיטקטורה הטרוגנית של מיני גולג'י-במחסן או הוודאות של חישוב שלנו . קיו. בין הגורמים, מצאנו כי חשוב יש מספר גדול של בקופסאת גולג'י מיני-במחסן (n) כדי להבטיח את הדיוק של מנת משכל, אשר נפגעת כאשר n הוא קטן. בדרך כלל, נתונים עם n ≥ 100 ממספר תאים התשואות LQs אמין. לכן, GLIM נותן בממוצע-אנסמבל הסבת נתונים, מסתיר את האינדיבידואליות של מיני גולג'י-במחסן. מגבלה נוספת של GLIM היא כי הוא מתבסס על ההנחה כי כל החלבונים גולג'י יש התפלגות צר סביב מרכז יחיד. כמה חלבונים גולג'י, כגון COPI subunits, ARF1, מסיסים N-ethylmaleimide-רגיש גורם מצורף חלבון קולטן (מלכודות)20,21, דווחו שאליהן בהרחבה cis trans- גולג'י, את TGN. . זה כנראה לא מתאים ללמוד שלהם לוקליזציה גולג'י על ידי מנת משכל. כפי GLIM כיום כרוך בחירה ידנית של המיני גולג'י-במחסן, שהוא גם מפרך וגם סובייקטיבי, לפיתוח עתידי של GLIM יהיה ליישם כלי תוכנה כדי לבחור גולג'י מיני-במחסן עם התערבות אנושית מינימלית.

מהי הרזולוציה המרחבית של GLIM? מאז מנת משכל הוא יחס, אשר unitless, מספר זה אינו מציין מרחק מרחבית. כאן, אנו מנסים לתת הערכה גסה מאוד. ניתן להגדיר את הרזולוציה המרחבית של GLIM המרחק הקטן ביותר בין שני חלבונים גולג'י ניתן לזיהוי. בחינת LQs של חלבונים שונים גולג'י7, מצאנו כי SEMs של נתונים (datasets) עם טווח 100 n ≥ סביב 0.03. בהנחה שני חלבוני גולג'י את n זהה = 100 ו- SEM = 0.03, גולג'י שני חלבונים יש לוקליזציה שונים משמעותית על ידי t-test (p < 0.05), דהיינו, ניתן לזיהוי, אם ההפרש בין שלהם LQs ≥ 3 × SEM = 0.09. מנתוני EM, אנו יכולים להעריך כי אורך צירית הערימה מיני גולג'י, אשר גם הוא המרחק GM130 גאלט-mCherry ב GLIM, הוא ~ 300 nm8. לפיכך, ברזולוציה של GLIM מוערך 0.09 × 300 = 30 ננומטר לאורך הציר גולג'י. ב- GLIM, n גדול בדרך כלל מניבה SEM קטנות יותר, אשר בתורו תוצאות ברזולוציה גבוהה יותר.

. זה כנראה לא מתאים להשוות ישירות את הרזולוציה של GLIM לזה של לעוב חיסונית-זהב מאז הטכניקה השנייה אינה נותנת ישירות נתונים כמותיים לוקליזציה. בדומה GLIM, הרזולוציה של לעוב חיסונית-זהב לאורך הציר גולג'י ' יכולה להיות מוגדרת כ המרחק הקטן ביותר בין שני סמנים גולג'י ניתן לזיהוי. כדי למדוד את הרזולוציה שלה דורש לימוד כפול-חיסונית-זהב תיוג של שני חלבונים גולג'י שאינם סמוכים זה לזה באופן הדוק לאורך הציר גולג'י. המחקר מערכתית כזה אינו זמין כנראה על פי הידע שלנו. כפי שפורט במבוא, אחד הגורמים המגביל הרזולוציה המרחבית של לעוב חיסונית-זהב הוא גודלו של הנוגדן מורכב, מה שהופך את הרזולוציה להיות גרוע יותר מאשר ~ 20 ננומטר. עוד חשוב הגורם המגביל של רזולוציית התמונה היא צפיפות תיוג של מולקולות של אנטיגן. על פי תורת הדגימה נייקוויסט, חייב להיות לפחות שני חלקיקי זהב ליחידה רזולוציה. רוב מחקרים EM חיסונית-זהב, של המרחקים בין חלקיקי זהב שכן הם לא < 15 ננומטר עקב נמוך מאוד תיוג יעילות; זה מקשה על טכניקה זו להשיג תמונה ברזולוציה של פחות מ- 30 ננומטר. מנקודת המבט הזו, אנו מעריכים כי הרזולוציה של GLIM הוא לפחות לזו של לעוב חיסונית-זהב.

GLIM היא שיטה חזקה זה נותן תוצאות מאוד עקביות. . זה עצמאית של הסוג של מיקרוסקופ המשמש. בדקנו מיקרוסקופ קונפוקלי הזה דיסק שדה רחב, המסתובבים הניבו תוצאות זהות. LQs של החלבונים גולג'י אותו רכשה קבוצות שונות של הניסויים היו גם בהסכם טוב אחד עם השני. LQ מסד נתונים המורכב חלבונים תושב טווח מגוון של גולג'י נוצרה עבור השוואה ופרשנות. אנו מצפים כי השימוש GLIM בקהילה מחקר נוסף תרחיב באופן משמעותי את מסד הנתונים. כתוצאה מכך, בנוסף מסד נתונים באופן כמותי המתארת הלוקליזציה של מספר גדול של חלבוני גולג'י יעזור מאוד להבין את הארגון והתפקוד של המתחם גולג'י.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות ד סטיבנס (אוניברסיטת בריסטול, בריסטול, אנגליה) על פלסמיד דנ א TPST1-EGFP, וכן Narasimhan Govindarajan לאקשמי שעזרת עם תוכנת אופטימיזציה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן נבחרת המועצה למחקר רפואי (NMRC/CBRG/007/2012), משרד החינוך (RG Tier1 AcRF 18/11, RG 48/13 ו- RG132/15 ו- AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) שראשי

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (11), 005215 (2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. (2014).
  4. De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (4), 273-284 (2008).
  5. Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20, (15), 3471-3480 (2009).
  6. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, (2), 165-175 (2010).
  7. Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27, (5), 848-861 (2016).
  8. Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6, (11), 1071-1081 (2004).
  9. Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7, (4), 631-650 (1996).
  10. Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99, (3), 1101-1109 (1984).
  11. Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60, (2), 217-227 (1993).
  12. Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).
  13. Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93, (1), 223-229 (1982).
  14. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105, (6), Pt 1 2655-2664 (1987).
  15. Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168, (7), 1039-1051 (2005).
  16. Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
  17. Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13, (1), 119-133 (2002).
  18. Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55, (7), 709-719 (2007).
  19. Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129, (17), 3238-3250 (2016).
  20. Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15, (4), 1506-1518 (2004).
  21. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (11), 005231 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics