Количественные локализация белка Гольджи изображения его масса центр флуоресценции

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Точная локализация Гольджи жителей имеет важное значение для понимания клеточных функций Гольджи. Однако не удалось разрешить суб Гольджи структуры обычных оптической микроскопии. Здесь мы описываем протокол для обычных микроскопии основанные метода суперразрешением количественно определить суб Гольджи локализация белка.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Комплекс Гольджи состоит из межклеточная серийно сложены мембраны, которые могут быть далее разделены на суб Гольджи регионы, включая СНГ-Гольджи, медиальной Гольджи, транс-Гольджи и транс-Гольджи сети. Клеточных функций Гольджи определяется характерное распределение его резидентов белков. Пространственное разрешение обычных световой микроскопии слишком мала, чтобы разрешить суб Гольджи структуры или межклеточная. Таким образом электронная микроскопия иммуно золото является методом выбора для локализации белков на уровне суб Гольджи. Однако техника и инструмент выходят за рамки возможностей большинства лаборатории биологии клетки. Здесь мы описываем наш недавно разработанных суперразрешением метод, вызываемый Гольджи белка локализации изображений центры масс (GLIM) систематически и количественно локализовать Гольджи белка. GLIM основана на стандартных флуоресценции маркировки протоколы и обычных-поля или конфокальные микроскопы. Она включает в себя калибровка хроматической сдвига аберрации микроскопические системы, загрузки изображений и анализа после приобретения. Суб Гольджи локализация белка тест количественно выражается как фактор локализации. Существует четыре основных преимущества GLIM; Это быстрый, основанные на традиционных методов и инструментов, в результате локализацией количественных, и он дает ~ 30 Нм практические резолюции вдоль оси Гольджи. Здесь мы описываем подробный протокол GLIM для локализации тест Гольджи белка.

Introduction

Комплекс Гольджи играет существенную роль в секреторную/endocytic людьми из белков и липидов (далее грузов) в mammalian клетках1,2,3. В Гольджи грузов являются не только отсортированы по различным субклеточном отсеков, но также изменены различные виды гликозилирования. Млекопитающих Гольджи комплекс включает в себя многочисленные боково связанные стеки Гольджи, который обычно состоит из 4-11 плотно прилегающие и плоские мембраны мешков называемые межклеточная. Серийно сложены межклеточная Гольджи далее подразделяются, от одного конца до другого, как СНГ, медиальной и транс-межклеточная. На транс-боковые стека Гольджи, транс-большинство мембраны мешок превращается в трубчатых и ретикулум мембраны сеть под названием транс-Гольджи сети (TGN)4. В секреторную путь, грузов, полученных от эндоплазменный ретикулум (ER) введите Гольджи стека в СНГ-стороне и затем последовательно проходят через медиальной и транс-межклеточная. Грузов в конечном итоге выход Golgi в транс-Гольджи или TGN предназначения в плазматической мембране, endosomes или секреторных гранул.

Молекулярных и клеточных механизмов как грузов транзита Гольджи стека и как Гольджи сохраняет свою cisternal Организации остаются загадочными и в настоящее время все еще горячие дебаты1. Одна из трудностей в этой области является, что Гольджи межклеточная могут быть решены только при электронной микроскопии (EM) со времени принятия резолюции оптический микроскоп (~ 200 Нм) является недостаточным для решения индивидуальных Гольджи межклеточная (< 100 Нм в обоих cisternal толщины и расстояние). Таким образом суб Гольджи локализации-резидентов белков и транзитных грузов, условно определяются EM иммуно золото. Однако EM иммуно золото очень технически сложных и это выходит за рамки возможностей большинства лаборатории биологии клетки. Хотя резолюции EM может быть югу нанометров, резолюции, обеспечиваемой EM иммуно золото значительно затрудняется размер антител комплекса (основной плюс вторичное антитело) и золотые частицы, и он может быть хуже, чем 20 Нм. Кроме того EM изображения получаются из 2D тонких секций вместо 3D глобальное представление Гольджи, который может привести к ошибочным выводам в зависимости от относительной позиции и ориентации 2D раздела5. Например изучая EM односекционный способна надежно дифференцировать везикул от ортогональных мнению трубочку, так как оба может отображать одинаковых круглых мембраны профили. Недавнее появление суперразрешением микроскопии методы, такие как 3D-структурированных освещения микроскопии (3D-SIM), стимулировали выбросов истощения (интереса), photoactivated локализации микроскопии (PALM) и стохастические оптических реконструкции микроскопии ( Шторм), делает возможным решить суб Гольджи структуры под легкие Микроскопы6. Однако есть по крайней мере четыре недостатки, которые могут значительно ограничить их использование в изучении биологических клеток Гольджи. 1) текущего суперразрешением методы требуют дорогих и специальные аппаратной конфигурации, которая выходит за рамки большинства лаборатории биологии клетки. 2) специальные флуоресценции маркировки протоколы необходимы для некоторых методов суперразрешением. 3) хотя, в лучших условиях, эти методы утверждают 20-110 Нм в пространственным разрешением, практические резолюции, полученные в реальных образцов может быть гораздо хуже. 4) в сравнении с обычными микроскопии эти супер-резолюции методы по-прежнему испытывают трудности в проведении многоцветная, 3D или жить клеток изображений, поодиночке или в сочетании. Наверное самое главное, иммуно золото EM и методы микроскопии суперразрешением выход качественных вместо количественных локализации данных.

Попытке частично решить проблемы, упомянутые выше, мы недавно разработали обычной световой микроскопии основанные метод, который называется Гольджи белка локализации изображения центры масс (GLIM), систематически и количественно локализовать Golgi белка с разрешением эквивалентна иммуно золото EM7. В этом методе Гольджи культивируемых клеток млекопитающих рассеивается как Гольджи мини стеки, лечение Нокодазол, микротрубочки depolymerizing наркотиков. Обширные исследования показали, что Нокодазол индуцированной Гольджи мини стеки (далее мини стеки Гольджи) напоминают родной Гольджи стеки в Организации и клеточных функций8,9,10, 11. Локализации (LQ) частное от деления теста белка могут быть приобретены через GLIM и он обозначает количественные суб Гольджи локализации. Численные значения LQs можно сравнить и LQ базы данных более чем 25 Гольджи маркеров была доступна.

В GLIM Гольджи мини стеки, тройной меченых эндогенного или экзогенно выраженной GM130, Галт mCherry и тест белка (x). GM130 и Галт mCherry, СНГ- и транс-Гольджи маркеры соответственно12,13, предоставления ориентиры. Тройной флуоресценции, красный (R), зеленый (G) и far-red (B), искусственно отображаются как красный, зеленый и синий, соответственно. Центр флуоресценции массы (далее центр) принимается для достижения субпиксельной резолюции. Гольджи оси определяется как вектор от центра GM130, Галт mCherry. Мини-стек Гольджи моделируется как цилиндрические структуры с бесконечной вращательная симметрия вокруг оси Гольджи. Таким образом Гольджи мини-стек может моделироваться далее как одномерные структуры вдоль оси Гольджи. Альбумин белка тест x определяется как dx/d1, в котором dx — это расстояние от центра x, GM130, в то время как d1 представляет собой расстояние от центра Галт mCherry, GM130. Если центр x-оси, его осевое расстояние проекции используется для вычисления. Переменные, включая Гольджи оси, осевой угол, dx, д1, угол α и β угол, для GLIM схематически показан на рисунке 1. LQ независима от Golgi осевой угол хотя Гольджи мини стеки Ориент случайно в клетке.

Гольджи мини-стеки неоднородных в изображениях. Мы разработали три критерия для выбора анализируемые Гольджи мини стеки для GLIM. 1) отношение сигнал шум критерий, в котором отношение общей интенсивности Гольджи мини-стек стандартное отклонение (SD) фона составляет ≥ 30 в каждом канале. Этот критерий является обеспечить точность позиционирования центра масс, которая зависит от соотношения сигнал шум Гольджи мини-стеков. 2 осевой угол или расстояние критерий, который требует d1≥ 70 нм. d1 уменьшается с увеличением угла осевой Гольджи. При осевом угол приближается к 90° или вертикальные, Мини-стек становится неразрешимым как d1 приближается к 0. d1≥ 70 нм можно эффективно исключить вблизи вертикальных Гольджи мини стеки. 3) в которых либо co линейность критерий | загар α | или | загар β | Это ≤ 0,3. Этот критерий гарантирует, что трех центров мини-стек достаточно co линейная для нашего одномерной модели мини-стек Гольджи. Все легкие Микроскопы страдают от хроматические аберрации, которые могут серьезно исказить относительные позиции флуоресценции красного, зеленого и far-red центров. Хроматическая аберрация Микроскоп систем экспериментально Калибровка изображения 110 Нм бусы, которые обозначены тройной флуоресценции красного, зеленого и far-red. Для каждого изображения из бисера центр Красного определяется как истинное положение шарик и хроматические смены зеленого и far-red центры оснащены первого порядка полиномиальных функций. Центры Гольджи мини стеки подвергаются полиномиальных функций исправить хроматические сдвиги в зеленых и far-red каналы.

Через GLIM мы можем достичь урегулирования ~ 30 Нм вдоль оси Golgi в стандартных условиях. Важно то, что он предоставляет системный метод количественно сопоставить любой белок Гольджи. GLIM могут выполняться с обычными Микроскопы, например поля или конфокальные микроскопы, используя общие протоколы Маркировка флуоресцирования. Визуализация и обработка данных может занять как час короче. Через GLIM, мы непосредственно продемонстрировали прогрессивного перехода секреторной грузов из стран СНГ- транс-стороне Гольджи7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Ниже приводится пошаговое протокол GLIM для определения отмеченных LQ EGFP tyrosylprotein sulfotransferase 1 (TPST1), Golgi-резидентов фермента, в клетки HeLa.

1. Подготовка флуоресцировани обозначенного Гольджи мини стеки

  1. Подготовка стекла coverslips
    1. Аликвота 0,3 мл стерильного Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) хорошо 24-ну плиты в культуре ткани капюшоном.
    2. Протрите кусочком Φ 12 мм No.1.5 стеклянные coverslip использованием мягкой оберточной бумаги вонзилась с 70% этанол, чтобы удалить мусор на поверхности стекла coverslip. Используйте пинцет острый кратко замочить coverslip в 70% этиловом спирте, передать его в пластину 24-Ну и затопить его к нижней части хорошо содержащие стерильные DMEM.
      Примечание: Условно стекла coverslips стерилизуются, пылающий. Однако coverslips под такое лечение легко трещины во время впоследствии обработки. 70% этанол замачивания является эффективным в стерилизации coverslips стекла без их повреждения.
    3. С крышкой охватывает оставьте 24-ну пластины в 37 ° C CO2 инкубатора до использования.
  2. Клетки семян
    1. Культура НеЬа клетки (далее) в T-25 колбу в DMEM дополнена 10% плода Bovine сыворотки (FBS) (далее полного среднего) в инкубатор 37 ° C CO2 поставляется с 5% CO2. Здесь не нужны антибиотики.
    2. Когда клетки достигает ~ 80% confluency, аспирационная питательной среды. Добавить 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в колбу и инкубации клеток в 37 ° C CO2 инкубатора для полного среднего 2 мин добавить 1 мл в колбу и осторожно промойте клетки от стены колбу, закупорить.
    3. Отдельные клетки перехода к стерильной центрифугирования трубки и спина на 500 x g за 2 мин до Пелле клетки. Аспирационная супернатант и приостановить Пелле клеток в 1 мл полного среднего.
    4. Аспирационная среднего в хорошо 24-ну пластины, содержащий стерилизованные стеклянные coverslip и семян ~ 1 x 105 клеток в колодец. Пополните объем колодец с полным средне-0,5 мл. Инкубируйте в 37 ° C CO2 инкубатора поставляется с 5% CO2. Культура клетки ~ 80% confluency.
  3. Transfect клетки
    Примечание: Хорошо распространение клетки являются выгодными для визуализации дисперсной Гольджи мини стеки.
    1. Transfect ~ 80% вырожденная клетки с 80 ng Галт mCherry7 и 320 нг TPST1-EGFP (см. Таблицу материалы) ДНК плазмиды с помощью трансфекции реагент согласно протоколу, предоставляемых производителем. Инкубируйте в инкубатор 37 ° C CO2 . Изменения среды после 4-6 ч инкубации. Клетки готовы ~ 12 h позже.
  4. Лечение Нокодазол для создания Гольджи мини стеки
    1. Подготовьте раствор Нокодазол (33 мм) путем растворения порошка Нокодазол 10 мг в 1 мл диметилсульфоксида. Алиготе Стоковый раствор и хранить при-20 ° C для длительного хранения.
    2. Разбавьте 1 мкл Нокодазол раствор (33 мм) в 1 мл 37 ° C полного среднего (конечная концентрация 33 мкм). Центрифуга для удаления твердых частиц с максимальной скоростью.
    3. Аспирационная среднего в хорошо и добавить 0,5 мл 33 Нокодазол мкм, содержащие полного среднего. Инкубируйте клетки в 37 ° C CO2 инкубатора для 3 h. приступить к иммунофлюоресценции маркировки (раздел 1.5).
  5. Этикетировочный иммунофлуоресценции
    Примечание: Держать клетки в темноте, чтобы избежать Фотообесцвечивание Галт mCherry и TPST1-EGFP.
    1. Подготовка реагентов для Этикетировочный иммунофлуоресценции
      1. Подготовить раствор параформальдегида 4%, растворить порошок параформальдегида 4% (w/v) в горячей 1 X-фосфатный буфер (PBS) и фильтра решение через 0.45 мкм фильтром. Раствор можно хранить при температуре от-20 ° C.
        Предупреждение: Параформальдегида токсичных и канцерогенных и это может вызвать раздражение кожи. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
      2. Чтобы подготовить буфером для разбавления проб флуоресцирования (FDB), смешайте 5% (v/v) FBS и 2% (w/v) бычьим сывороточным альбумином (БСА) в однократном ПБС. Фильтр решение через 0.45 мкм фильтром и сохранить решение при-20 ° C.
      3. Растворите 5.35 g NH4Cl порошка в 1 Л воды 100 мм NH4Cl подготовить и сохранить решение при комнатной температуре.
      4. Растворите порошок сапонин 10% (w/v) в воде для подготовки 10% сапонинов, аликвота и сохранить решение при-20 ° C.
    2. Фиксация
      1. Промыть хорошо раз с 0,5 мл 1 x PBS раствор и добавить 0,5 мл 4% раствора параформальдегида. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре. Промыть скважину дважды с PBS 1 x 0,5 мл и дважды с 0,5 мл 100 мм NH4Cl. промыть скважину дважды с PBS 1 x 0.5 мл. Клетки могут храниться в однократном ПБС на 4 ° C на ночь в темноте.
    3. Маркировка флуоресцирования
      1. Разбавьте 1 мкл мыши анти GM130 основное антитело в 500 мкл FDB содержащий 0.1% сапонинов. Обратный крышка плиты 24-Ну и применять 10 мкл основное антитело смесь на крышке.
      2. Используйте пинцет острый для извлечения и передачи coverslip стекла на падение обеспечения смесь антител, которое стороны ячейки находится в контакте с смеси. Инкубируйте клетки с основное антитело смеси за 1 ч при комнатной температуре.
        Примечание: Крышка с coverslip могут помещаться в увлажненные пластиковый мешок в темноте.
      3. Используйте острые пинцет для извлечения и передачи coverslip колодец с ячейки стороной вверх и промойте его в PBS 1 x 0.5 мл три раза в ≥ 30 мин встряхивания нет необходимости.
      4. Разбавьте 1 мкл far-red Флюорофор конъюгированных коза анти мыши IgG (вторичное антитело) в 500 мкл FDB содержащий 0.1% сапонинов.
      5. Вымыть и очистить обратную поверхность крышки 24-ну пластины. Примените 10 мкл far-red вторичное антитело смесь на крышке. Повторите шаги 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. Монтаж
      1. Подготовка монтажа средних путем смешивания 1 г глицерина, 2,2 g poly(vinyl alcohol) (МВт ~ 31000 Da), 1,2 мл 1 М трис (рН 8) и 8,8 мл H2O. Растворение смеси в ванну воды 60 ° C с иногда vortexing. Хранят раствор при температуре-20 ° C.
      2. Оттепель монтажа средних и передачи 10 мкл на стеклянное скольжение. Наложение coverslip (клеток стороной вниз) на падение среднего монтажа. Инкубируйте стеклянное скольжение при 37 ° C за 30 мин или комнатной температуре в течение 1 ч для упрочнения монтажа средних. Уплотнение coverslip с бесцветным лаком и хранить стеклянное скольжение при-20 ° C.

2. Подготовка флуоресцентные бусы для коррекции хроматической сдвига

  1. Coverslip очистка
    1. Осторожно поместите кусок 25 мм No.1.5 стеклянные coverslip на пластиковую решетку.
    2. Передача стойку с coverslip 400 мл стакан наполнен 300 мл 1 M NaOH и sonicate в sonicator баня (35 Вт) для 15 минут кратко ополосните шкаф в 400 мл стакан заполнены с 300 мл деионизированной водой. Передача стойки для 400 мл стакан, наполненный 300 мл 99% этанола и sonicate в sonicator баня на 15 мин кратко ополосните шкаф в 400 мл стакан заполнены с 300 мл деионизированной водой.
    3. Повторите шаг 2.1.2 еще два раза.
    4. Промывайте стойку с coverslip в 300 мл деионизированной воды в стакан 400 мл на 10 мин повторить шаг еще два раза. Передача стойки до 60 ° C духовку и сухой coverslip за 1 ч. хранить сушеные coverslip в чашке Петри пыли.
  2. Иммобилизация флуоресцентные бусы на стекло coverslip
    1. Разбавьте 110 Нм бусины многоцветные флуоресцентный 80-fold в 1 x PBS содержащих 0,1 мкг/мкл рабочего раствора БСА. Кратко вихревой трубе разогнать шарик агрегатов. Распространение 60 мкл разбавленный бусы на очищенный Φ 25 мм No.1.5 стекло coverslip (см. раздел 2.1) с помощью кончика пипетки. Сухой coverslip в эксикатор, подключенных к вакуумного насоса в темноте и смонтировать coverslip на стекло слайд в 50 мкл монтажа среде (см. шаг 1.5.4.2).

3. изображение приобретение

Примечание: GLIM требует изображений высокое соотношение сигнал шум (SNR) для высокой точности расчета центра масс. Изображение может быть приобретена обычных Микроскопы, таких как лазерное сканирование конфокальный, вращающийся диск конфокальный или поля микроскопа. Микроскоп поля с план apochromatic объективов и низкий уровень шума изображения датчик, например зарядовой (связью ПЗС) и научных взаимодополняющих металло оксидных полупроводников (sCMOS) может быть использован. Параметры датчика изображения корректируются для обеспечения низкого чтения шум и высокий динамический диапазон. Микроскоп должны быть оборудованы оптимальной конфигурации флуоресценции фильтры для зеленого, mCherry и far-red Флюорофор, и он должен иметь незначительное флуоресценции кросс talk. В идеале, система электронного фотографирования достигает Найквиста дискретизации в x, y и z ось, которая обычно требует x, y и z размер voxel будет меньше, чем 100, 100 и 200 Нм, соответственно. X и y размер voxel всегда равны и называются pixel_size. Pixel_size можно рассчитать путем деления размера сенсора камеры системы масштаба.

  1. Бисер многоцветные изображения
    1. Бисер многоцветные изображения в зеленый, красный и far-red каналы в начале и в конце каждой сессии изображений.
      Примечание: Здесь, изображения были приобретены через обычные epi поля флуоресценции микроскоп (перевернутый) оснащен 100 X NA 1.4 план apochromatic цель, моторизованного столика, 200 Вт источник света-металлогалогенные и 16-разрядных sCMOS камеры. Длин волн для возбуждения фильтр (band pass), дихроичное зеркало (длинный пас) и фильтр (band pass) выбросов Куба фильтр зеленого канала являются 465-495, 505 и 515-555 Нм; те, для красного канала фильтр Куба, 528-553, 565 и 578-633 нм; и те для куба фильтр far-red канала 590-650, 660 и 663-738 Нм. Во время приобретения, размер voxel вдоль x, y и z оси — 64, 64 и 200 Нм, соответственно.
    2. Найдите поле зрения с хорошим шарик плотности.
    3. Приобрести стеки 3D изображений в зеленый, красный и far-red каналов (каналG, каналR, каналB, соответственно). Возьмите 3 секции выше и ниже лучших фокальной плоскости (7 секций в стек). Сохраните три стеки как три TIFF-файлы.
      Примечание: Время экспозиции для каждого канала определяется эмпирически увеличить динамический диапазон, избежать насыщения пикселей и свести к минимуму Фотообесцвечивание. Другие параметры, такие как фильтры и x, y и z размер voxel, выбираются, как описано выше.
  2. Гольджи мини стеки изображений
    1. Использование TPST1-EGFP Галт mCherry transfected и дневно помечены слайды (раздел 1.5), чтобы найти ячейки, что Экспресс TPST1-EGFP и низким или средним уровнем Галт mCherry. Приобрести стеки 3D изображений, как описано в пункте 3.1.3.

4. анализ

  1. Приобрести центры флуоресцентные бусины
    1. В ImageJ, откройте набор изображений из бисера, состоящий из трех файлов TIFF (файл > изображения > Открыть).
    2. Средняя 3 последовательных секции вокруг лучших целенаправленного секции в каналеR изображение > стеки > Z проекта. Введите номер раздела «Начало фрагмента» и «Остановить срез» и среди вариантов «проекции типа», выберите «Средней интенсивности».
    3. Нарисуйте регионах, представляющих интерес (ROI), которые содержат не бисер в изображения с помощью «Многоугольник выбора». В «анализ > набор измерений», только «Среднее значение серого» и «Отклонение». Затем выполнить «анализ > мера» для получения среднего и SD ROI.
    4. Рассчитать интенсивность фона как «средний + 6 × SD». Вычесть изображение с соответствующими значениями интенсивности фон, «процесс > математика > вычесть», введите значение интенсивности фона, соответствующий этому каналу.
    5. Повторите шаги 4.1.2 для 4.1.4 для каналаG и каналB стеки изображений с помощью же начать и остановить срез и тот же фон ROI. Обратите внимание, что ROI используется в шаге 4.1.3 могут быть скопированы в каналG и каналB образы.
    6. Слияние трех вычитается фонового изображения (изображение > Цвет > объединить каналы), выбрав каналR как красный, каналG как Грин и каналB как синий. Будет получен один составное изображение, состоящее из трех каналов.
    7. Запустите Менеджер ROI (анализ > Инструменты > Менеджер ROI). Рисование квадратного ROI вокруг единого бусы, обеспечение того, что существует только один шарик внутри каждой ROI. Добавьте ROI рентабельность менеджер, нажав «t» на клавиатуре. Повторите этот процесс и добавить столько ROIs как можно скорее.
    8. В «анализ > набор измерений», проверить только «центр масс».
    9. Выберите каналR, в диспетчере ROI, нажмите кнопку «Измерение» для получения центры; две колонки соответствующий x и y координаты центров ROI будет отображаться в окне «Результат». Скопируйте и вставьте два столбца в таблицу.
    10. Повторите шаг 4.1.9 дляG и каналB.
    11. Организовать координаты центров в одну таблицу в следующем порядке: xR,R, y xG, yG,B, x и yB. Сохраните эту таблицу в формате «CSV» как «beads.csv». Не оставляют места в имени файла.
  2. Выберите и измерить Гольджи мини стеки
    1. Установите два макроса (см. Дополнительные материалы) в ImageJ, «Макро-Гольджи ROI инспекция» и «Макро-выпуск 3 канала данных» плагины > установить». Четкие ROI менеджер и результат окна.
    2. Откройте набор мини-стек изображений Гольджи, состоящий из трех файлов TIFF (файл > изображения > Open).
    3. Повторите шаги 4.1.2 - 4.1.5 и сохранить три вычитается фонового изображения для последующего использования. Запись фон SDs для каналаR, каналG и каналB как SDRиG SD SDB, соответственно, позднее использовать.
    4. Дублировать три вычитается фон изображения, сгенерированные из шага 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
    5. В «процесс > изображения калькулятор», сначала необходимо добавить фон вычитается каналG каналR изображений. Добавьте полученное изображение изображение вычитается фон каналаB . На результирующее изображение в «изображение > Настройка > порог», выберите «установить» для ввода «1» как «Низкий пороговый уровень». После нажатия кнопки «Применить», приводится чёрно-белое изображение двоичные.
    6. В «анализ > анализ частиц», диапазон размера для «размер (пиксель ^ 2)». Ввод «50-бесконечности». Проверить «Исключая на краях» и «Менеджер». Трансформирования, содержащие Гольджи мини стеки теперь добавляются к диспетчеру ROI.
      Примечание: Диапазон размеров должны быть эмпирически решимости исключить звуки, которые обычно малы.
    7. Слияние трех вычитается фонового изображения (изображение > Цвет > объединить каналы) из шага 4.2.3, выбрав каналR как красный, каналG как Грин и каналB как синий. Генерируется один составное изображение, состоящее из трех каналов.
    8. Запустите макрос «Макро-Гольджи ROI инспекция», выбрав «плагины > макро-Гольджи ROI инспекции». В диалоговом окне Интерактивные визуально проверьте каждый ROI, чтобы сохранить или отклонить его. Выберите трансформирования, которые содержат один объект во всех трех каналах.
      Примечание: После запуска этого инструмента, отклоненные трансформирования, исключаются из диспетчера ROI.
    9. Проверить только «Район», «Среднее значение серого» и «Центр масс» «анализ > набор измерений». Приобретение данных путем запуска макрос инструмент «Макро-выпуск 3 канала данных» (плагины > макро-выпуск 3 каналы данных).
      Примечание: Районы, средней интенсивности и центры трансформирования в каналR,G канал и каналB (x и y) отображаются в окне «Результат».
    10. Копия x и y координаты центров в электронную таблицу и расположить их в следующем порядке: xR,R, y xG, yG,B, x и yB. Сохраните электронную таблицу как файл «CSV» (ministacks.csv). Не оставляют места в имени файла. Перейти к коррекции хроматической сдвиг центров (раздел 4.3) и LQ вычисления (статья 4.4).
  3. Коррекции хроматических сдвиг центров
    1. Установите время выполнения компилятор Matlab (мкр).
    2. Установить следующие файлы в выделенный рабочую папку: my_train.exe и my_test.exe. Скопируйте и вставьте «beads.csv» и «ministacks.csv» файлы в той же папке.
    3. Запуск «Команднойстроки» Windows и перейдите в рабочую папку, введя следующую команду « cd path_of_working_folder».
    4. Создайте файл хроматической сдвига калибровки с помощью центров бисера. Введите следующую команду «my_train.exe бусы.csv калибровки.mat 1». В рабочей папке создается файл с именем «калибровка.mat». Игнорируйте другие файлы, которые создаются.
    5. Исправьте хроматические смещение центров Гольджи мини стеки, введя следующую команду «my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv калибровки.mat 1».
      Примечание: Файл с именем «corrected_ministacks.csv» создается в рабочей папке. Он содержит хроматические сдвиг скорректированные координаты центров, которые расположены в порядке xG, yG, x yBиB . Игнорируйте другие файлы, которые создаются. Принять к сведению, что красный канал определяется как свободный хроматических аберраций и, следовательно, xR и yR такие же, как необработанные данные.
  4. Расчет LQs
    1. Запуск программного обеспечения для анализа данных и копирования и вставки, в ниже последовательности, значит, серые значения, районы, фон SDs, полученные из шага 4.2.3 (место их в строке 1) и исправить хроматические сдвига x и y координаты Гольджи мини-стеков в каналеR в лист как столбцы A-е. Аналогичным образом передать соответствующие данные дляG и каналB столбцы F, J и K-O, соответственно.
    2. Добавьте восемь новых столбцов P W, под названием «Комплексная интенсивность канала R», «комплексной интенсивность канала G», «комплексной интенсивность канала B», d1, dx, ABS(tan a), ABS (загар b) и LQ.
      1. Щелкните правой кнопкой мыши в верхней части соответствующих столбцов и выберите пункт «Установка значений столбцов» для вычисления значения каждого столбца. Для столбца P, ввод «Col(A)Col(B)»; для столбца Q, ввод «Col(F)Col(G)»; для столбца R, ввод «Col(K)Col(L)»; для столбца S, ввод «pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))» «pixel_size», где размер пикселя в Нм; для столбца T, ввод «pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))»; для столбца U, ввод «Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) «; для столбца V, ввод «Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) «; для столбца W, ввод «Коль (T) / Col (S)».
    3. Фильтр по трем критериям, описанным в ВведениеГольджи мини стеки.
      1. В программное обеспечение анализа данных, перейдите к «лист > лист запроса» и выберите столбец переменные для теста «Если». Назначить следующие псевдонимы I1, I2, I3, d1, A и B для столбцов «комплексной интенсивность канала R», «комплексной интенсивность канала G», «комплексной интенсивность канала B», d1, ABS(tan a) и ABS (загар b), соответственно. В «если условие» поле ввода «I1 > =30*cell(1,3) и I2 > =30*cell(1,8) и I3 > =30*cell(1,13) и d1 > = 70 и (A < = 0,3 или B < = 0,3)».
      2. Выберите «Извлечь новый лист», нажмите «Применить». Столбцы A-W анализируемые Гольджи мини-стеков извлекаются на новый лист.
    4. В новый лист, щелкните правой кнопкой мыши в верхней части колонки W, выберите «статистические данные о столбце > открыть диалоговое окно». Флажок «N всего», «Среднее», «SE среднее», «Гистограммы». Статистический анализ LQs затем отображается.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Современные исследования класс световой микроскоп с объективом apochromatic план, как он используется в нашей лаборатории, показывает минимальный хроматические аберрации (рисA). Однако тщательного изучения флуоресцентные шарик многоцветные изображения может выявить смещение различных цветных изображений же шарик (рис. 2B). Мы определяем, что красный канал бесплатно хроматические аберрации, и поэтому центры красной флуоресценции являются истинной позиции бусины. Относительной хроматической смены зеленого и far-red флуоресценции может быть представлен зеленый и синий векторов, происходящих от центра красной флуоресценцией (рис. 2C). Хроматические сдвига в плоскости изображения эмпирически иллюстрируется зеленый и синий вектор для каждого из бисера (Рисунок 2D). Для нашей микроскопа, хроматические изменения не являются единообразными как величины и направления изменения сдвигов по x и y позиции. Хроматические сдвиг может существенно повлиять на точность GLIM как сдвиг far-red центров может быть как 50 Нм. Поэтому необходимо исправить хроматические сдвига. После приобретения центры бисера, мы используем первого порядка Полиномиальные оборудование для калибровки и впоследствии исправить хроматические смены центров. Хроматические сдвига аберрации значительно улучшить путем такой подход (Рисунок 2 - D-G).

В клетках млекопитающих комплекс Гольджи агрегируются в районе perinuclear, который, как правило, не разрешить под микроскопом обычных оптических (рисA). После Нокодазол лечения для 3 часов perinuclear комплекс Гольджи исчезает, и десятки Гольджи мини стек собрать в местах выхода эндоплазматического ретикулума всей цитоплазме (рис. 3B). Большие куски Гольджи мембраны и агрегированных Гольджи мини стеки присутствуют, и они не были выбраны для анализа. Пример изображения, иллюстрирующие выбор Гольджи мини стеков показано на рис. 3C. Используя средство «Макро-Гольджи ROI инспекции», 40 выбранных Гольджи мини стеки, перечислены в рисунке 3D. После применения трех критериев, 21 Гольджи мини стеки были анализируемые и выбрали для расчета LQs TPST1-EGFP (рис. 3D; помечены как «L»), с их статистику, показанный на рисунке 3E. В общей сложности 111 анализируемые Гольджи мини стеки были отобраны из 12 клеток и LQ TPST1-EGFP измерялась в 0.76 0,04 (среднее ± SEM; n = 111) (Рисунок 3F). LQ TPST1-EGFP позиции его между giantin (LQ = 0,59) и EGFP-Rab6 (LQ = 1,04)7. Он находится вблизи GS15 (LQ = 0,83) и ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = 0,82). Мы определили суб Гольджи регионов согласно LQs рассматривая качественные локализации данных из литературы: ERES/ERGIC, < -0,25; СНГ, 0.00 ± 0,25; медиально, 0,50 ± 0,25; транс-Гольджи, 1.00 ± 0,25 и TGN, 1,25-2.00. LQ TPST1-EGFP поэтому указывает его транс-Гольджи локализации, которая согласна с предыдущем исследовании14.

Figure 1
Рисунок 1 . Схематические иллюстрации показаны переменные, используемые в расчетах GLIM. (A) xz вид Гольджи мини-стек, который имеет коаксиальный центров GM130, Галт mCherry и белка x флуоресценции показаны Гольджи, оси, осевой угол, dx и d1. Образ Гольджи мини-стек является его проекция на плоскости изображения. (B) xy вид Гольджи мини-стек с центром внеосевого белка x показаны угол α, β угол и проекции осевое расстояние dx. A и B являются адаптировано из рисунка 1E иF Рисунок 1нашей предыдущей публикации7, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Коррекции хроматической сдвига. (A) трехцветная объединенного изображения 110 Нм разноцветный бисер приобретена микроскопом поля. Каждый шарик излучает зеленый, красный и far-red (искусственно цветные как синий) флуоресценции. Шкалы, 10 мкм. (B) расширенное представление объединенного изображения сингл шарик с заметные хроматические сдвига. Масштаб бар, 200 Нм. (C) A Схематическая диаграмма, показывающая, что смены изображений зеленого и far-red шарик может быть представлен векторы из центра изображения красный шарик (0,0) для центров Грин (зеленый вектор) и far-red (синий) шарик изображений, соответственно. (D, E) Эффект коррекции хроматической сдвига. В той же области изображения зеленый и синий векторы выводятся до и после перехода коррекции. Чтобы визуализировать крошечные сдвига, кратное усиливается масштабы каждого вектора. (F, G) Точечные показаны центры Грин (зеленый точек) и far-red (синие точки) бусы, до и после коррекции сдвига. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Типичный пример GLIM, здесь приобретения LQ TPST1-EGFP. Клетки HeLa, выражая TPST1-EGFP (зеленый) и Галт mCherry (красный) окрашивали для эндогенного GM130 (синий). (A) A типичных клеток. (B, C, D, E) Образы ячейки с Нокодазол (B). От изображения анализируемые Гольджи мини стеки были отобраны как показано C. Выбранный Гольджи мини стеки помечены на идентификационные номера. Изображения этих масках Гольджи мини стеки отображаются ниже ре с их идентификационные номера. «L» означает, что мини-стек Гольджи действителен для расчета LQ (анализируемые Гольджи мини стеки). Гистограмма LQ 21 мини-стеков из ячейки отображается в E. (F) гистограммы LQs 111 мини стеки из 12 клеток. Значение, указываемое в гистограмме, среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные материалы: Макро-Гольджи ROI inspection.ijm, макро-вывода 3 каналов data.ijm, Matlab коды, My_train.exe, My_test.exe и таблицы template.opj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ранее локализация белка Гольджи под световой микроскопии главным образом была количественно оценена степень корреляции или дублирование изображения белка с изображением Гольджи маркер известных локализации15,16, 17. Результате корреляции или дублирование коэффициент отражает, как близко тестирования белок является маркер Гольджи пространственно. Существует по меньшей мере три предостережения для этого подхода. Во-первых корреляция или перекрывающихся коэффициент нелинейных и непосредственно не показывают пространственное расстояние. Во-вторых степень корреляции зависит от резолюции микроскопические системы. Таким образом коэффициент между двумя Гольджи белки системы независимые константой не является. В-третьих, две Гольджи белки с же осевой локализации, но различные боковые распределения вдоль межклеточная может иметь различные коэффициенты. Следовательно корреляции или дублирование коэффициент не указывают осевой локализация белка Гольджи. В альтернативный метод, предложенный Dejgaard и др., СНГ, транс-Гольджи маркеров и протеина интереса тройной помечены в Нокодазол лечение Гольджи мини стеки, похож на GLIM. В каждой мини-стек Гольджи приобретаются позиции трех максимальной интенсивности пикселей и относительное положение теста белка рассчитывается как соотношение расстояние18. Однако их метод не может добиться субпиксельной резолюции, которая значительно ограничивает его применение. По сравнению с предыдущим количественных методов, GLIM, которая была независимо разработана, но несет аналогичную концепцию, Dejgaard и др., способен дать количественную оценку осевой локализации Гольджи белка с беспрецедентной точности и последовательности.

Мы представили протокол GLIM приобрести LQ экзогенно выраженной белка GFP-меткой TPST1-EGFP. LQ эндогенного белка может быть определена, если ее антитела. В зависимости от вида основного антитела, мышь или кролика, а затем кролика или мыши антитела анти GM130 соответственно, могут использоваться в протоколе тройной маркировки. Кролик и мыши антитела анти GM130 для Этикетировочный иммунофлуоресценции коммерчески доступны. Ранее мы показали, что кролик и мыши антител анти GM130 давать те же результаты в GLIM7. Если тест белок неразрывно красной флуоресценцией выбросов, например mCherry фьюжн, GFP-тегами Гольджи маркер белка с известными LQ в сочетании с GM130 антитела маркировки могут быть использованы для клеток тройной лейбл и косвенно вывести LQ теста белка. Предполагая белка маркера LQ LQм и расстояние от центра белка маркера, GM130 dm, Альбумин белка тест x может быть рассчитана как (dx/dm) × LQм. Один из величайших преимуществ GLIM по сравнению с суперразрешением микроскопии является, что она легко может применяться к живой клетки изображения в обычных микроскопических установок. Мы пробовали сочетание трех флуоресценции белков, GFP-Golgin84, mCherry-GM130 и Галт iRFP670, для динамического наблюдения за LQ GFP-Golgin84 в одном Гольджи мини стеки7.

В GLIM наиболее длительным шагом является анализ после приобретения, особенно по подбору анализируемые Гольджи мини стеки. Как гетерогенной в размер и молекулярный состав19Гольджи мини стеки, неясно, если распределение LQs (Рисунок 3F) представляет гетерогенной архитектуре Гольджи мини стеки или неопределенности наших расчета LQ. Независимо от причины мы обнаружили, что важно иметь большое количество анализируемые Гольджи мини стеки (n) для обеспечения точности LQ, который нарушается, когда n мал. Как правило данные с n ≥ 100 из нескольких клеток дает надежные LQs. Таким образом GLIM дает ансамбль в среднем локализации данных, заслоняя индивидуальность Гольджи мини стеки. Еще одним ограничением GLIM является, что она предполагает, что все Гольджи белки имеют узкое распределение вокруг единого центра. Некоторые белки Гольджи, например COPI субблоков, ARF1 и растворимых N-ethylmaleimide чувствительных фактор привязанности белка рецептора (ловушки)20,21, были зарегистрированы широко распространить из СНГ для транс- Гольджи и TGN. Это вероятно неуместно для изучения их локализации Гольджи, LQ. Как GLIM в настоящее время включает в себя ручной выбор Гольджи мини стеки, который является трудоемким и субъективным, будущее развитие GLIM будет осуществлять программное средство для автоматического выбора Гольджи мини стеки с минимальным вмешательством человека.

Что такое пространственное разрешение GLIM? Так как LQ является соотношение, которое unitless, он не указывает пространственное расстояние. Здесь мы пытаемся дать очень приблизительные оценки. Пространственное разрешение GLIM можно определить как наименьший осевое расстояние между двумя разрешимое Гольджи белков. Изучение LQs различных Гольджи белки7, мы обнаружили, что SEMs наборов данных с n ≥ 100 диапазон около 0,03. Предполагая, что два Гольджи белки же n = 100 и SEM = 0,03, два Гольджи, белки имеют значительные различной локализации, t тест (p < 0,05), то есть, может быть разрешено, если разница между их LQs ≥ 3 × SEM = 0,09. Из данных, EM, мы можем оценить, что осевой Гольджи мини-стек, который также является расстояние от GM130 до Галт mCherry в GLIM, составляет ~ 300 Нм8. Таким образом, резолюция GLIM составляет 0,09 × 300 = 30 Нм вдоль оси Гольджи. В GLIM больше n обычно дает меньше SEM, который в свою очередь приводит к более высоким разрешением.

Это вероятно неуместно непосредственно сравнить резолюции GLIM что ет иммуно золото, поскольку последний метод непосредственно не дают локализации количественных данных. Подобно GLIM, резолюции иммуно золото EM вдоль оси Гольджи может определяться как наименьшее расстояние между двумя маркерами разрешимое Гольджи. Чтобы измерить его резолюции требует изучения двойной иммуно золото маркировки два Гольджи белков, которые тесно прилегающих друг к другу вдоль оси Гольджи. Такие системные исследования вероятно недоступна в соответствии наши знания. Как указывалось во введении, одним из сдерживающих факторов в пространственное разрешение иммуно золото EM является большой размер антител комплекса, что делает резолюции будет хуже, чем ~ 20 Нм. Еще одним важным ограничивающим фактором разрешение изображения является маркировка плотность антигена молекул. Согласно теории выборки Найквиста должны быть по крайней мере две золотые частицы на единицу резолюции. В большинстве исследований EM иммуно золото расстояния между частицами сосед золото не < 15 Нм из-за очень низкой маркировки энергоэффективности; Это делает его трудным для этой техники для достижения разрешение изображения меньше, чем 30 Нм. С этой точки зрения мы оцениваем, что резолюции GLIM по меньшей мере сопоставимы с EM иммуно золото.

GLIM — надежный метод, который дает результаты, весьма последовательной. Это зависит от типа используемых микроскопа. Мы протестировали этот диск-поля и спиннинг конфокальные микроскопы, дали такие же результаты. LQ же Гольджи белков, приобрел в различных серий экспериментов были также хорошо согласуются друг с другом. База данных LQ, состоящий из различных диапазона Golgi-резидентов белков был создан для сравнения и интерпретации. Мы ожидаем, что больше использование GLIM в научно-исследовательское сообщество значительно расширит базу данных. Следовательно количественном описании локализации большое количество белков Гольджи более полная база данных поможет в понимании организации и функции комплекса Гольджи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить D. Стивенс (Бристольский университет, Бристоль, Соединенное Королевство) за TPST1-EGFP ДНК плазмиды, а также Лакшми Нарасимхан ГОВИНДАРАДЖАН за помощь в оптимизации программного обеспечения. Эта работа была поддержана субсидии от национального совета медицинских исследований (NMRC/CBRG/007/2012), министерства образования (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 и RG132/15 и AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) л.л.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (11), 005215 (2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. (2014).
  4. De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (4), 273-284 (2008).
  5. Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20, (15), 3471-3480 (2009).
  6. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, (2), 165-175 (2010).
  7. Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27, (5), 848-861 (2016).
  8. Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6, (11), 1071-1081 (2004).
  9. Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7, (4), 631-650 (1996).
  10. Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99, (3), 1101-1109 (1984).
  11. Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60, (2), 217-227 (1993).
  12. Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).
  13. Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93, (1), 223-229 (1982).
  14. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105, (6), Pt 1 2655-2664 (1987).
  15. Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168, (7), 1039-1051 (2005).
  16. Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
  17. Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13, (1), 119-133 (2002).
  18. Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55, (7), 709-719 (2007).
  19. Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129, (17), 3238-3250 (2016).
  20. Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15, (4), 1506-1518 (2004).
  21. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (11), 005231 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics