इमेजिंग द्वारा एक Golgi प्रोटीन के मात्रात्मक स्थानीयकरण प्रतिदीप्ति मास के अपने केंद्र

Biology

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Summary

Golgi निवासियों की सटीक स्थानीयकरण Golgi के सेलुलर कार्यों को समझने के लिए आवश्यक है । हालांकि, पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी उप Golgi संरचना को हल करने में असमर्थ है । यहां हम एक पारंपरिक सूक्ष्म आधारित सुपर संकल्प विधि के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए मात्रात्मक एक प्रोटीन के उप Golgi स्थानीयकरण निर्धारित करते हैं ।

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Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

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Abstract

Golgi परिसर में धारावाहिक खड़ी झिल्ली cisternae के होते हैं जो आगे उप-Golgi क्षेत्रों में वर्गीकृत किया जा सकता है, जिसमें सीआईएस-Golgi, औसत दर्जे का Golgi, ट्रांस-Golgi और ट्रांस-Golgi नेटवर्क शामिल हैं । Golgi के सेलुलर कार्य अपने निवासी प्रोटीन की विशेषता वितरण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं । पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के स्थानिक संकल्प उप Golgi संरचना या cisternae को हल करने के लिए बहुत कम है । इस प्रकार, bliss-गोल्ड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विकल्प की एक विधि उप Golgi स्तर पर एक प्रोटीन स्थानीयकृत है । हालांकि, तकनीक और साधन सबसे सेल जीवविज्ञान प्रयोगशालाओं की क्षमता से परे हैं । हम यहां का वर्णन हमारे हाल ही में विकसित सुपर संकल्प विधि Golgi प्रोटीन स्थानीयकरण नामक मास (ग्लीम) के इमेजिंग केन्द्रों द्वारा व्यवस्थित करने के लिए और मात्रात्मक एक Golgi प्रोटीन स्थानीयकृत । ग्लीम मानक प्रतिदीप्ति लेबलिंग प्रोटोकॉल और पारंपरिक व्यापक क्षेत्र या फोकल सूक्ष्मदर्शी पर आधारित है । यह सूक्ष्म प्रणाली के रंगीन बदलाव वाकया, छवि अधिग्रहण और बाद के अधिग्रहण विश्लेषण के अंशांकन शामिल है । एक परीक्षण प्रोटीन के उप-Golgi स्थानीयकरण मात्रात्मक स्थानीयकरण गुणांक के रूप में व्यक्त किया जाता है । ग्लीम के चार मुख्य फायदे हैं; यह तेजी से है, पारंपरिक तरीकों और उपकरणों के आधार पर, स्थानीयकरण परिणाम मात्रात्मक है, और यह ~ 30 एनएम Golgi अक्ष के साथ व्यावहारिक संकल्प affords । यहां हम ग्लीम के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक परीक्षण Golgi प्रोटीन स्थानीयकृत ।

Introduction

Golgi परिसर में प्रोटीन और लिपिड के स्रावी/endocytic तस्करी में आवश्यक भूमिका निभाता है (इसके बाद कार्गो) स्तनधारी कोशिकाओं में1,2,3। Golgi में, कार्गो केवल विभिन्न उप सेलुलर डिब्बों के लिए हल नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह भी ग्लाइकोसिलेशन के विविध प्रकार के द्वारा संशोधित । स्तनधारी Golgi परिसर में कई बाद में जुड़े Golgi ढेर, जो आम तौर पर 4-11 कसकर आसंन और फ्लैट झिल्ली sacs cisternae बुलाया शामिल हैं । धारावाहिक में खड़ी Golgi cisternae आगे वर्गीकृत कर रहे हैं, एक छोर से दूसरे के लिए, के रूप में सीआईएस, औसत दर्जे का और ट्रांस-cisternae । ट्रांसएक Golgi ढेर के पक्ष में, ट्रांससबसे झिल्ली थैली एक ट्यूबलर और जालिका झिल्ली नेटवर्क में विकसित ट्रांस-Golgi नेटवर्क (TGN)4कहा जाता है । स्रावी मार्ग में, endoplasmic जालिका (एर) से प्राप्त कार्गो अपने सीआईएससाइड पर एक Golgi स्टैक दर्ज करें और फिर क्रमिक रूप से औसत और ट्रांस-cisternae के माध्यम से गुजरती हैं । कार्गो अंततः ट्रांस-Golgi या प्लाज्मा झिल्ली, endosomes या स्रावी granules को नसीब TGN पर Golgi से बाहर निकलें ।

आणविक और सेलुलर तंत्र के कैसे कार्गो पारगमन एक Golgi स्टैक और कैसे Golgi रखता है अपने cisternal संगठन रहस्यमय रहते है और वर्तमान में अभी भी एक गर्म बहस के तहत1। इस क्षेत्र में कठिनाइयों में से एक यह है कि Golgi cisternae केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के तहत एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (~ २०० एनएम) के संकल्प के बाद हल किया जा सकता है व्यक्तिगत Golgi cisternae (< १०० एनएम दोनों cisternal मोटाई में हल करने के लिए अपर्याप्त है और दूरी) । इसलिए, उप Golgi स्थानीयकरण निवासी प्रोटीन और पारगमन कार्गो के पारंपरिक bliss-गोल्ड EM द्वारा निर्धारित कर रहे हैं । हालांकि, bliss-गोल्ड EM बहुत तकनीकी रूप से मांग है और यह सबसे सेल जीवविज्ञान प्रयोगशालाओं की क्षमता से परे है । हालांकि उंहें का संकल्प उप नैनोमीटर हो सकता है, bliss द्वारा afforded संकल्प गोल्ड उंहें बहुत एंटीबॉडी परिसर (प्राथमिक प्लस माध्यमिक एंटीबॉडी) और सोने के कण के आकार से प्रभावित है, और यह से भी बदतर हो सकता है 20 एनएम । इसके अलावा, EM छवियां 2d पतली से प्राप्त कर रहे है बजाय Golgi, जो गलत निष्कर्ष में रिश्तेदार की स्थिति और 2d खंड5के उंमुखीकरण के आधार पर परिणाम कर सकते है की एक 3 डी ग्लोबल देखने के वर्गों । उदाहरण के लिए, एक EM एकल खंड का अध्ययन करने में असमर्थ है मज़बूती से एक tubule के ओर्थोगोनल दृश्य से एक पुटिका अंतर के बाद से दोनों समान दौर झिल्ली प्रोफाइल प्रदर्शन कर सकते हैं । सुपर संकल्प सूक्ष्म तकनीक, जैसे 3d संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (3d-SIM) के हाल ही के आगमन, उत्सर्जन में कमी (STED) उत्तेजित, photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) और stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी ( तूफान), यह प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत उप Golgi संरचनाओं को हल करने के लिए संभव बनाता है6. हालांकि, Golgi के सेल जैविक अध्ययन में उनके उपयोगों को सीमित कर सकते है कि कम से कम चार कमियां हैं । 1) वर्तमान सुपर संकल्प तकनीक महंगी और विशेष हार्डवेयर विंयास जो सबसे सेल जीवविज्ञान प्रयोगशालाओं से परे है की आवश्यकता है । 2) विशेष प्रतिदीप्ति लेबलिंग प्रोटोकॉल कुछ सुपर संकल्प तकनीकों के लिए आवश्यक हैं । 3) हालांकि, सबसे अच्छी हालत के तहत, इन तकनीकों स्थानिक संकल्प में 20-110 एनएम का दावा है, व्यावहारिक वास्तविक नमूनों में प्राप्त संकल्प बहुत बदतर हो सकता है । 4) पारंपरिक माइक्रोस्कोपी की तुलना में, इन सुपर संकल्प तकनीक अभी भी बहुरंगा, 3 डी या लाइव सेल इमेजिंग, या तो अकेले या संयोजन में आयोजित करने में कठिनाइयों है. शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, दोनों bliss गोल्ड EM और सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक गुणात्मक के बजाय मात्रात्मक स्थानीयकरण डेटा उपज ।

आंशिक रूप से उपर्युक्त समस्याओं को हल करने का प्रयास, हम हाल ही में एक पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी आधारित विधि है, जो Golgi प्रोटीन स्थानीयकरण के नाम पर है विकसित की इमेजिंग केन्द्रों द्वारा मास (ग्लीम), करने के लिए व्यवस्थित और मात्रात्मक एक Golgi स्थानीयकृत bliss के लिए एक प्रस्ताव के बराबर में प्रोटीन-गोल्ड EM7। इस विधि में, Golgi स्तनधारी कोशिकाओं में nocodazole, एक microtubule depolymerizing दवा के उपचार के द्वारा Golgi मिनी के ढेर के रूप में फैलाया जाता है । व्यापक अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि nocodazole प्रेरित Golgi मिनी ढेर (इसके बाद Golgi मिनी ढेर) बारीकी से दोनों संगठन और सेलुलर कार्यों में देशी Golgi ढेर के समान8,9,10, 11. एक परीक्षण प्रोटीन के स्थानीयकरण गुणांक (LQ) ग्लीम के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है और यह मात्रात्मक उप Golgi स्थानीयकरण का अर्थ है । LQs के संख्यात्मक मानों की तुलना की जा सकती है और 25 से अधिक Golgi मार्करों का एक LQ डेटाबेस उपलब्ध हो गया है ।

ग्लीम में, Golgi मिनी स्टैक ट्रिपल-अंतर्जात या exogenously व्यक्त GM130, GalT-mCherry और परीक्षण प्रोटीन (एक्स) द्वारा लेबल कर रहे हैं । GM130 और GalT-mCherry, सीआईएस-और ट्रांस-Golgi मार्करों क्रमशः12,13, संदर्भ अंक प्रदान करते हैं । ट्रिपल प्रतिदीप्ति, रेड (आर), ग्रीन (जी) और दूर लाल (बी), कृत्रिम रूप से क्रमशः लाल, हरे और नीले रंग के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं । केंद्र प्रतिदीप्ति मास (इसके बाद केंद्र) के उप पिक्सेल संकल्प को प्राप्त करने के लिए अपनाया है । Golgi अक्ष वेक्टर के रूप में GM130 के केंद्र से GalT-mCherry के लिए परिभाषित किया गया है । Golgi मिनी ढेर Golgi अक्ष के आसपास अनंत घूर्णन समरूपता के साथ एक बेलनाकार संरचना के रूप में मॉडलिंग की है । इसलिए, एक Golgi मिनी ढेर आगे Golgi अक्ष के साथ एक आयामी संरचना के रूप में मॉडलिंग की जा सकती है । परीक्षण प्रोटीन एक्स के LQ डीएक्स/d1के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसमें डीएक्स के लिए है कि GM130 के केंद्र से दूरी है, जबकि डी1 GalT के केंद्र से दूरी है mCherry की है कि GM130 । यदि x का केंद्र ऑफ अक्ष है, तो उसके प्रक्षेपण के सलए दूरी का परिकलन के लिए उपयोग किया जाता है । चर, जिसमें Golgi अक्ष, अक्षीय कोण, dx, d1, कोण α और कोण β, के लिए ग्लीम के लिए योजनाबद्ध रूप से चित्रा 1में सचित्र हैं । LQ Golgi अक्षीय कोण से स्वतंत्र है, हालांकि Golgi मिनी ढेर एक सेल में बेतरतीब ढंग से ओरिएंट ।

Golgi मिनी टैक् स छवियों में सजातीय दिखाई देते हैं । हम तीन मानदंड विकसित करने के लिए विश्लेषण Golgi मिनी ग्लीम के लिए ढेर का चयन करें । 1) संकेत करने वाली शोर अनुपात कसौटी, जिसमें एक Golgi मिनी की कुल तीव्रता का अनुपात पृष्ठभूमि के मानक विचलन (एसडी) करने के लिए ढेर प्रत्येक चैनल में 30 ≥ है. यह कसौटी द्रव्यमान के केंद्र की स्थिति सटीकता सुनिश्चित करने के लिए है, जो Golgi मिनी-स्टैक्स के सिग्नल-टू-शोर अनुपात पर निर्भर करता है. 2) अक्षीय कोण या दूरी की कसौटी, जो d1≥ ७० एनएम की आवश्यकता है । d1 Golgi के सलए कोण की वृद्धि के साथ घट जाता है । जब अक्षीय कोण ९० ° या ऊर्ध्वाधर आ रहा है, मिनी ढेर गैर-अचल हो जाता है के रूप में d1 आ रहा है 0 । डी1≥ ७० एनएम प्रभावी रूप से ऊर्ध्वाधर Golgi मिनी ढेर के पास बाहर कर सकते हैं । 3) सह रेखीय कसौटी, जिसमें या तो | तण α | या | तण β | ≤ ०.३ है । इस कसौटी यह सुनिश्चित करता है कि एक मिनी के तीन केंद्रों पर्याप्त सह Golgi मिनी के हमारे एक आयामी मॉडल के लिए रैखिक-ढेर हैं । सभी प्रकाश सूक्ष्मदर्शी रंगीन वाकया है जो गंभीरता से लाल, हरे और दूर लाल प्रतिदीप्ति केंद्रों के सापेक्ष पदों को विकृत कर सकते से ग्रस्त हैं । माइक्रोस्कोप सिस्टम के रंगीन वाकया प्रयोगात्मक ११० एनएम मोती, जो ट्रिपल-लाल, हरे और दूर लाल प्रतिदीप्ति द्वारा लेबल कर रहे हैं द्वारा तुले हुए है । प्रत्येक मनका छवि के लिए, लाल रंग के केंद्र मनका और रंगीन की सही स्थिति के रूप में परिभाषित किया गया है-हरे और दूर के लाल केंद्रों के पहले आदेश बहुपद कार्यों से सज्जित हैं । Golgi मिनी के केंद्र-ढेर हरे और दूर-लाल चैनलों में रंगीन बदलावों को सही करने के लिए बहुपद कार्यों के अधीन हैं ।

ग्लीम के माध्यम से हम मानक शर्तों के तहत Golgi अक्ष के साथ ~ 30 एनएम के एक संकल्प को प्राप्त कर सकते हैं । महत्वपूर्ण बात यह है कि यह किसी भी Golgi प्रोटीन को मात्रात्मक रूप से मैप करने के लिए एक व्यवस्थित विधि प्रदान करता है । ग्लीम ऐसे व्यापक क्षेत्र या फोकल सूक्ष्मदर्शी के रूप में पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी, द्वारा किया जा सकता है, आम प्रतिदीप्ति लेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर । इमेजिंग और डेटा प्रोसेसिंग एक घंटे के रूप में कम के रूप में ले सकते हैं । ग्लीम के माध्यम से, हम सीधे सीआईएस-Golgi7के ट्रांससाइड करने के लिए से स्रावी कार्गो के प्रगतिशील संक्रमण का प्रदर्शन किया है ।

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Protocol

नोट: नीचे EGFP-टैग tyrosylprotein sulfotransferase 1 (TPST1), Golgi कोशिकाओं में एक हेला निवासी एंजाइम के LQ का निर्धारण करने के लिए ग्लीम के एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल है ।

1. प्रतिदीप्ति-त्यसपछि Golgi मिनी टैक् स की तैयारी

  1. ग् coverslips तैयार करें
    1. Aliquot ०.३ मिलि बाँझो Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) एक ऊतक संस्कृति हूड में एक 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से ।
    2. Φ के एक टुकड़े को पोंछें 12 मिमी No. 1.5 ग्लास coverslip ७०% इथेनॉल के साथ नरम ऊतक कागज dabbed का उपयोग करने के लिए कांच coverslip की सतह पर मलबे को हटाने । तेजी से चिमटी की एक जोड़ी का प्रयोग करें संक्षेप में ७०% इथेनॉल में coverslip भिगोने के लिए, यह 24 में स्थानांतरण अच्छी तरह से थाली और यह अच्छी तरह से बाँझ DMEM युक्त के नीचे करने के लिए सिंक ।
      नोट: कांच coverslips ज्वलंत द्वारा परंपरागत रूप से निष्फल रहे हैं । हालांकि, इस तरह के उपचार के तहत coverslips आसानी से बाद में हैंडलिंग के दौरान दरार । ७०% इथेनॉल भिगोने उंहें नुकसान पहुंचाए बिना गिलास coverslips बंध्याकरण में प्रभावी है ।
    3. ढक्कन कवर के साथ, उपयोग जब तक ३७ ° c CO2 मशीन में 24-well थाली छोड़ दें ।
  2. बीज कोशिकाओं
    1. संस्कृति हेला कोशिकाओं (इसके बाद के कक्ष) में एक टी 25 कुप्पी DMEM में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक (इसके बाद पूरा माध्यम) में एक ३७ ° c co2 मशीन 5% co2के साथ आपूर्ति की । एंटीबायोटिक्स यहां जरूरी नहीं हैं ।
    2. जब कोशिकाओं तक पहुंच ~ ८०% प्रवाह, महाप्राण संस्कृति माध्यम । कुप्पी में ०.२५% Trypsin-EDTA की 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक ३७ डिग्री सेल्सियस सह में कोशिकाओं को मशीन 2 मिनट के लिए 2 मशीनी । कुप्पी में 1 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम जोड़ें और धीरे से pipetting द्वारा कुप्पी दीवार से कोशिकाओं को फ्लश ।
    3. स्थानांतरण एक बाँझ केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए अलग कोशिकाओं और 2 मिनट के लिए ५०० एक्स जी में स्पिन कोशिकाओं गोली करने के लिए । महाप्राण supernatant और 1 मिलीलीटर पूरा मध्यम में सेल गोली निलंबित ।
    4. अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह प्लेट में मध्यम महाप्राण निष्फल ग्लास coverslip और बीज ~ 1 x 105 कोशिकाओं के कुआं में । ०.५ मिलीलीटर के लिए पूरा माध्यम के साथ अच्छी तरह से ऊपर की मात्रा ऊपर । एक ३७ डिग्री सेल्सियस co2 मशीन 5% co2के साथ आपूर्ति में मशीन । संस्कृति ~ ८०% के लिए कोशिकाओं को प्रभावित ।
  3. Transfect कक्ष
    नोट: अच्छी तरह से प्रसार कोशिकाओं इमेजिंग फैलाया Golgi मिनी ढेर के लिए लाभप्रद हैं ।
    1. Transfect ~ ८०% के साथ धाराप्रवाह कोशिकाओं ८० एनजी GalT-mCherry7 और ३२० एनजी TPST1-EGFP ( सामग्री की तालिकादेखें) डीएनए plasmids निर्माता द्वारा प्रदान की प्रोटोकॉल के अनुसार एक अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर । एक ३७ डिग्री सेल्सियस CO2 मशीन में मशीन । 4-6 एच मशीन के बाद मध्यम बदलें । कक्ष तैयार हैं ~ 12 h बाद में ।
  4. Nocodazole उपचार Golgi मिनी-पोट उत्पन्न करने के लिए
    1. 1 एमएल dimethyl sulfoxide में 10 मिलीग्राम nocodazole पाउडर को भंग करके एक nocodazole स्टॉक सॉल्यूशन (३३ mM) तैयार करें । Aliquot स्टॉक समाधान और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण के लिए ।
    2. 1 एमएल ३७ डिग्री सेल्सियस पूरा मध्यम (अंतिम एकाग्रता ३३ µ एम) में nocodazole स्टॉक समाधान (३३ मिमी) की एक µ एल पतला । शीर्ष गति पर केंद्रापसारक बात कण को दूर करने के लिए ।
    3. मीडियम को वेल में महाप्राण और इसमें ०.५ एमएल का ३३ µ मी nocodazole युक्त पूरा मीडियम डालें. 3 ज. इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग (धारा १.५) के लिए आगे बढ़ना के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस सह2 मशीन में कोशिकाओं की मशीन ।
  5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग
    नोट: GalT-mCherry और TPST1-EGFP के photobleaching से बचने के लिए कोशिकाओं को अंधेरे में रखें ।
    1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग के लिए रिएजेंट तैयार करें
      1. 4% paraformaldehyde समाधान तैयार करने के लिए, 4% (डब्ल्यू/वी) भंग गर्म 1x फास्फेट में paraformaldehyde पाउडर (पंजाब) खारा और ०.४५ µm फिल्टर के माध्यम से समाधान फिल्टर । समाधान-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
        सावधानी: Paraformaldehyde विषैला और यलो है और यह त्वचा की जलन पैदा कर सकता है । उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (पीपीई) पहनें ।
      2. प्रतिदीप्ति कमजोर पड़ने बफर (FDB) तैयार करने के लिए, 5% (वी/वी) FBS, और 2% (डब्ल्यू/वी) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) 1x पंजाब में मिश्रण । समाधान ०.४५ µm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर और-20 ° c पर समाधान संग्रहीत करें ।
      3. 1 एल पानी में ५.३५ जी एनएच4सीएल पाउडर को भंग १०० मिमी एनएच4सीएल तैयार करने के लिए और कमरे के तापमान पर समाधान की दुकान ।
      4. 10% saponin तैयार करने के लिए पानी में saponin पाउडर (डब्ल्यू/वी) भंग, aliquot और-20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान.
    2. निर्धारण
      1. ०.५ मिलीलीटर 1x पंजाबियों समाधान के साथ अच्छी तरह से एक बार कुल्ला और ०.५ मिलीलीटर 4% paraformaldehyde समाधान जोड़ें । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन । अच्छी तरह से दो बार कुल्ला ०.५ एमएल 1x पंजाबियों के साथ और दो बार के साथ ०.५ मिलीलीटर १०० मिमी एनएच4सीएल. ०.५ मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ अच्छी तरह से दो बार कुल्ला । कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पंजाब में अंधेरे में रातोंरात रखा जा सकता है ।
    3. प्रतिदीप्ति लेबलिंग
      1. पतला 1 µ l माउस एंटी-GM130 प्राथमिक एंटीबॉडी में ५०० µ l FDB युक्त ०.१% saponin. 24 अच्छी तरह से प्लेट के ढक्कन रिवर्स और ढक्कन पर 10 µ एल प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण लागू होते हैं ।
      2. तेज चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए निकालने और एंटीबॉडी मिश्रण के ड्रॉप पर गिलास coverslip हस्तांतरण सुनिश्चित करना है कि सेल पक्ष मिश्रण के साथ संपर्क में है । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
        नोट: coverslip के साथ ढक्कन अंधेरे में एक humidified प्लास्टिक की थैली में रखा जा सकता है ।
      3. तेज चिमटी की एक जोड़ी का प्रयोग करें निकालने और सेल पक्ष के साथ अच्छी तरह से coverslip हस्तांतरण करने के लिए और यह ०.५ मिलीलीटर 1x पंजाब में ≥ 30 मिनट में तीन बार के लिए कुल्ला । मिलाते अनावश्यक है ।
      4. पतला 1 µ l सुदूर-लाल fluorophore संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी (माध्यमिक एंटीबॉडी) मे ५०० µ l FDB युक्त ०.१% saponin.
      5. 24-वेल प्लेट के ढक्कन की रिवर्स सरफेस को धोकर साफ कर लें । ढक्कन पर 10 µ एल दूर लाल माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण लागू करें । दोहराएँ चरण 1.5.3.2-1.5.3.3.
    4. बढ़ते
      1. 1 जी ग्लिसरॉल, २.२ जी पाली (vinyl शराब) (मेगावाट ~ ३१,००० Da), १.२ मिलीलीटर 1 मीटर Tris (पीएच 8) और ८.८ एमएल एच2ओ मिश्रण से बढ़ते माध्यम को तैयार । कभी-कभार भंवर के साथ एक ६० ° c पानी स्नान में मिश्रण भंग । -20 ° c पर समाधान संग्रहीत है ।
      2. बढ़ते मध्यम और एक गिलास स्लाइड पर 10 µ एल हस्तांतरण गल । बढ़ते माध्यम की बूंद पर coverslip (सेल की ओर नीचे) ओवरले । बढ़ते माध्यम कठोर करने के लिए 1 एच के लिए 30 मिनट या कमरे के तापमान के लिए ३७ ° c पर ग्लास स्लाइड की मशीन । coverslip को बेरंग-नेल पॉलिश से सील करें और ग्लास स्लाइड को-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर दीजिये ।

2. रंगीन-शिफ्ट सुधार के लिए फ्लोरोसेंट मोतियों की तैयारी

  1. Coverslip सफाई
    1. ध्यान से एक प्लास्टिक की रैक पर 25 mm No. 1.5 ग्लास coverslip का एक टुकड़ा जगह है ।
    2. रैक coverslip के साथ एक ४०० मिलीलीटर ३०० मिलीलीटर 1 मीटर NaOH और sonicate के लिए 15 मिनट के लिए एक स्नान sonicator (३५ वाट) में भरा चोंच के साथ स्थानांतरण । संक्षिप्त कुल्ला एक ४०० मिलीलीटर में रैक ३०० मिलीलीटर पानी से भरा चोंच । रैक एक ४०० मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण ३०० मिलीलीटर ९९% से भरा चोंच और 15 मिनट के लिए स्नान sonicator में sonicate. संक्षिप्त कुल्ला एक ४०० मिलीलीटर में रैक ३०० मिलीलीटर पानी से भरा चोंच ।
    3. दोहराएं चरण 2.1.2 दो बार ।
    4. ३०० मिलीलीटर में coverslip के साथ रैक कुल्ला 10 मिनट के लिए एक ४०० मिलीलीटर चोंच में पानी में । दोहराएं कदम दो और बार । एक ६० डिग्री सेल्सियस ओवन के लिए रैक हस्तांतरण और 1 एच के लिए coverslip सूखे coverslip एक धूल से मुक्त पेट्री पकवान में स्टोर ।
  2. कांच coverslip पर फ्लोरोसेंट मोतियों की स्थिरीकरण
    1. ११० एनएम बहु रंग फ्लोरोसेंट मोतियों ८० पतला-1x पंजाब में ०.१ µ g/µ एल BSA युक्त में गुना । संक्षेप में, मनका समुच्चय फैलाने के लिए ट्यूब भंवर । फैले ६० µ l साफ Φ 25 mm No. 1.5 ग्लास coverslip (धारा २.१ देखें) एक पिपेट टिप का उपयोग करने पर मोती पतला । अंधेरे में एक वैक्यूम पंप से जुड़े एक desiccator में coverslip सूखी और ५० µ एल बढ़ते मध्यम में एक गिलास स्लाइड पर coverslip माउंट (कदम 1.5.4.2 देखें) ।

3. छवि अधिग्रहण

नोट: ग्लीम बड़े पैमाने पर गणना के उच्च परिशुद्धता केंद्र के लिए उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) की छवियों की आवश्यकता है. छवि ऐसे लेजर फोकल स्कैनिंग के रूप में पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी द्वारा अधिग्रहीत किया जा सकता है, डिस्क फोकल या व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप कताई । एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप योजना-apochromatic उद्देश्य लेंस और एक कम शोर छवि संवेदक, जैसे एक आरोप-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) और वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड अर्धचालक (sCMOS) के साथ सुसज्जित किया जा सकता है । छवि संवेदक के लिए पैरामीटर एक कम पढ़ें-शोर और उच्च गतिशील रेंज सुनिश्चित करने के लिए समायोजित कर रहे हैं. माइक्रोस्कोप हरे, mCherry और दूर-लाल fluorophore के लिए प्रतिदीप्ति फिल्टर के इष्टतम विन्यास के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए, और यह नगण्य प्रतिदीप्ति पार बात होनी चाहिए. आदर्श रूप में, इमेजिंग प्रणाली एक्स, वाई और जेड धुरी है, जो आम तौर पर एक voxel के एक्स, वाई और जेड आकार की आवश्यकता होती है में एक Nyquist नमूना दर को प्राप्त १००, १०० और २०० एनएम, क्रमशः से कम है । voxel का x और y आकार हमेशा समान होता है और इंहें pixel_size के रूप में संदर्भित किया जाता है । pixel_size सिस्टम आवर्धन द्वारा कैमरा संवेदक आकार विभाजित करके गणना की जा सकती है ।

  1. छवि बहु रंग मोती
    1. शुरुआत में और हर इमेजिंग सत्र के अंत में हरे, लाल और दूर-लाल चैनलों में छवि बहु रंग मोती ।
      नोट: यहां, छवियों को एक पारंपरिक व्यापक क्षेत्र महामारी-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (औंधा) 100X NA १.४ योजना-apochromatic उद्देश्य, मोटर चालित मंच, २०० वाट धातु-halide प्रकाश स्रोत और 16 बिट sCMOS कैमरा से सुसज्जित के माध्यम से अधिग्रहीत किया गया । उत्तेजना फ़िल्टर के लिए तरंग दैर्ध्य (बैंड दर्रा), dichroic मिरर (लांग पास) और ग्रीन चैनल फिल्टर घन के उत्सर्जन फिल्टर (बैंड दर्रा) ४६५-४९५, ५०५ और ५१५-५५५ एनएम हैं; लाल चैनल फ़िल्टर घन के लिए वे ५२८-५५३, ५६५ और ५७८-६३३ एनएम हैं; और उन के लिए सुदूर लाल चैनल फ़िल्टर घन ५९०-६५०, ६६० और ६६३-७३८ एनएम हैं । अधिग्रहण के दौरान, एक्स, वाई और जेड अक्ष के साथ एक voxel का आकार क्रमशः ६४, ६४ और २०० एनएम है ।
    2. अच्छा मनका घनत्व के साथ देखने के एक क्षेत्र का पता लगाएं ।
    3. हरे, लाल और दूर-लाल चैनल (चैनलजी, चैनलआर, चैनलबी, क्रमशः) में 3d छवि स्टैक प्राप्त करें । ऊपर और सबसे अच्छा फोकल विमान (ढेर प्रति 7 वर्गों) के नीचे 3 वर्गों ले लो । तीन स्टैक के रूप में तीन TIFF फ़ाइलें सहेजें ।
      नोट: प्रत्येक चैनल के लिए जोखिम समय empirically गतिशील रेंज को अधिकतम करने के लिए, पिक्सेल संतृप्ति से बचने और photobleaching को कम करने के लिए निर्धारित है । अंय पैरामीटर, जैसे फ़िल्टर्स और x, y और z आकार voxel के ऊपर चर्चा के रूप में चुना जाता है ।
  2. इमेज Golgi मिनी टैक् स
    1. TPST1-EGFP और GalT-mCherry transfected का उपयोग करें और फ्लोरोसेंट लेबल (धारा १.५) स्लाइड कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस TPST1-EGFP और एक कम या मध्यम स्तर GalT-mCherry का पता लगाने के लिए । 3d छवि स्टैक के रूप में चरण 3.1.3 में वर्णित मोल ।

4. छवि विश्लेषण

  1. फ्लोरोसेंट मोतियों का अधिग्रहण केंद्र
    1. ImageJ में, मनका तीन TIFF फ़ाइलों से मिलकर छवियों का एक सेट खुला (फ़ाइल > छवि > खोलो) ।
    2. चैनलR में सबसे अच्छा केंद्रित अनुभाग के आसपास औसत 3 लगातार अनुभाग > स्टैक्स > Z प्रोजेक्ट । "प्रारंभ स्लाइस" और "स्लाइस रोकें" की अनुभाग संख्या इनपुट, और "प्रोजेक्शन प्रकार" के विकल्पों के बीच, "औसत तीव्रता" का चयन करें ।
    3. "बहुभुज चयन" का उपयोग कर छवि में कोई मोती होते हैं कि ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों ड्रा. में "विश्लेषण > सेट माप", जांच केवल "ग्रे मूल्य मतलब" और "मानक विचलन". तो फिर निष्पादित "विश्लेषण > माप" मतलब और रॉय के एसडी प्राप्त करने के लिए ।
    4. पृष्ठभूमि तीव्रता की गणना के रूप में "मतलब + 6 × एसडी". इसी पृष्ठभूमि तीव्रता मूल्यों के साथ छवि घटाना द्वारा "प्रक्रिया > मठ > घटाना", इस चैनल के लिए इसी पृष्ठभूमि तीव्रता मान इनपुट.
    5. समान प्रारंभ और स्लाइस रोकें और समान पृष्ठभूमि ROI का उपयोग करके चैनलG और चैनलB छवि स्टैक्स के लिए 4.1.4 के लिए चरण 4.1.2 दोहराएं । ध्यान दें कि चरण 4.1.3 में उपयोग किए जाने वाले ROI की प्रतिलिपि चैनलG और चैनलB छवियों पर बनाई जा सकती है
    6. तीन पृष्ठभूमि-घटाई गई छवियां (छवि > रंग > मर्ज चैनल्स) का चयन कर चैनलR के रूप में लाल, चैनलG के रूप में हरा और चैनलB के रूप में नीला मर्ज करें । एक समग्र छवि तीन चैनलों से मिलकर प्राप्त किया जाएगा ।
    7. लांच रॉय प्रबंधक (विश्लेषण > उपकरण > रॉय प्रबंधक) । प्रत्येक रॉय के भीतर केवल एक मनका है यह सुनिश्चित करना है कि एक मोती के आसपास एक वर्ग रॉय ड्रा । roi प्रबंधक को कुंजीपटल पर "टी" दबाकर रॉय जोड़ें । इस प्रक्रिया को दोहराएँ और यथासंभव अधिक से अधिक ROIs जोड़ें.
    8. में "विश्लेषण > सेट माप", केवल "द्रव्यमान का केंद्र" की जाँच करें.
    9. चैनलRका चयन करें, ROI प्रबंधक में, केन्द्रों को प्राप्त करने के लिए "माप" पर क्लिक करें; x और y ROIs के केंद्रों के समंवय करने के लिए इसी दो कॉलम "परिणाम" विंडो में प्रदर्शित किया जाएगा । प्रतिलिपि बनाएं और दो स्तंभों को किसी स्प्रेडशीट में चिपकाएं ।
    10. चैनलG और चैनलBके लिए चरण 4.1.9 दोहराएं ।
    11. निम्न क्रम में किसी एकल स्प्रेडशीट में केन्द्रों के निर्देशांक व्यवस्थित करें: xr, yr, xG, yg, xb, और yB. "मनका. csv" के रूप में ". csv" स्वरूप में स्प्रेडशीट सहेजें. फ़ाइल नाम में कोई रिक्ति नहीं छोड़ें ।
  2. चुनें और मापने Golgi मिनी-पोट
    1. ImageJ में दो मैक्रोज़ ( पूरक सामग्रियोंमें अनुलग्न) स्थापित करें, "मैक्रो-Golgi ROI निरीक्षण" और "मैक्रो-आउटपुट 3 चैनल डेटा" प्लगइंस > स्थापित करें "। रॉय प्रबंधक और परिणाम विंडो साफ़ करें ।
    2. Golgi मिनी का एक सेट खोलें-तीन TIFF फ़ाइलों से मिलकर छवियां ढेर (फ़ाइल > छवि > खोलो) ।
    3. दोहराएँ चरण 4.1.2-4.1.5 और तीन पृष्ठभूमि-घटाई छवियाँ बाद में उपयोग के लिए सहेजें । बाद में उपयोग के लिए क्रमश: चैनलr, चैनलg और चैनलB के रूप में sdr, sdG और sdBके लिए बैकग्राउंड एसडीएस रिकॉर्ड करें ।
    4. चरण 4.2.3 (Ctrl + Shift + D) से उत्पन्न तीन पृष्ठभूमि-घटाई गई छवियों को डुप्लिकेट बनाएँ.
    5. "प्रक्रिया > छवि कैलकुलेटर" में, पहले पृष्ठभूमि-घटाई चैनलG चैनलR छवियां जोड़ें । परिणामी छवि को पृष्ठभूमि-घटाया चैनलB छवि में जोड़ें । परिणामी छवि में, "छवि > समायोजित करें > थ्रेशोल्ड" में, "सबसे निचले थ्रेशोल्ड स्तर" के रूप में "1" इनपुट के लिए "सेट" चुनें. "लागू करें" दबाने के बाद, एक काले और सफेद बाइनरी छवि का परिणाम है ।
    6. "विश्लेषण > विश्लेषण कणों" में, इनपुट आकार सीमा के लिए "आकार (पिक्सेल ^ 2)". इनपुट "५०-इन्फिनिटी" । "किनारों पर शामिल नहीं" और "प्रबंधक में जोड़ें" की जांच करें । ROIs युक्त Golgi मिनी स्टैक अब रॉय प्रबंधक में जोड़े जाते हैं ।
      नोट: आकार सीमा empirically आम तौर पर छोटे हैं जो शोर को बाहर करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए.
    7. तीन पृष्ठभूमि-घटाई गई छवियां (छवि > रंग > मर्ज चैनल्स) को चरण 4.2.3 सेR के रूप में लाल, चैनलG के रूप में हरा और चैनलB के रूप में नीला का चयन करके मर्ज करें । एक समग्र छवि तीन चैनलों से मिलकर उत्पंन होता है ।
    8. मैक्रो भागो "मेक्रो-Golgi रॉय निरीक्षण" का चयन करके "प्लगइंस > स्थूल-Golgi रॉय निरीक्षण" । सहभागी संवाद बॉक्स में, विज़ुअल रूप से प्रत्येक ROI को रखने या अस्वीकार करने के लिए निरीक्षण करता है. उन ROIs का चयन करें जिनमें सभी तीन चैनल में एकल ऑब्जेक्ट हो ।
      नोट: इस उपकरण को चलाने के बाद, अस्वीकार कर दिया ROIs रॉय प्रबंधक से समाप्त कर रहे हैं ।
    9. केवल "क्षेत्र" की जांच करें, "ग्रे मूल्य का मतलब है" और "में द्रव्यमान का केंद्र" विश्लेषण > सेट माप "। "मैक्रो-आउटपुट 3 चैनल डेटा" (प्लगइंस > मैक्रो-आउटपुट 3 चैनल डेटा) मैक्रो उपकरण लॉंच करके डेटा प्राप्त करना ।
      नोट: क्षेत्र, मतलब तीव्रता, और केंद्र (एक्स और वाई) में ROIs के चैनलR, चैनलG और चैनलB "परिणाम" विंडो में प्रदर्शित होते हैं ।
    10. कॉपी एक्स और वाई एक स्प्रेडशीट में केंद्रों के निर्देशांक और उन्हें निम्नलिखित क्रम में व्यवस्था: एक्सआर, वाईआर, एक्सजी, वाईजी, एक्सबी, और वाईबी. स्प्रेडशीट को ". csv" फ़ाइल (ministacks. csv) के रूप में सहेजें । फ़ाइल नाम में कोई रिक्ति नहीं छोड़ें । केंद्रों (धारा ४.३) और LQ गणना (धारा ४.४) के रंगीन-शिफ्ट सुधार के लिए आगे बढ़ें ।
  3. रंगीन-केंद्रों की शिफ्ट सुधार
    1. Matlab कंपाइलर रनटाइम (MCR) स्थापित करें ।
    2. एक समर्पित कार्य फ़ोल्डर में निंन फ़ाइलें स्थापित करें: my_train. exe और my_test. exe । एक ही फ़ोल्डर में "मोतियों. csv" और "ministacks. csv" फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाएं और चिपकाएं ।
    3. Windows के "कमांड प्रॉंप्ट" लॉंच करें और निंन आदेश " cd path_of_working_folder"टाइप करके कार्य फ़ोल्डर पर जाएं ।
    4. मोतियों का केंद्र का उपयोग करके एक रंगीन बदलाव अंशांकन फ़ाइल उत्पन्न करते हैं । "my_train. exe मोती. csv अंशांकन. mat 1" निंन आदेश टाइप करें । कार्य फ़ोल्डर में "अंशांकन. mat" नामक फ़ाइल बनाई जाती है । उत्पन्न होती हैं जो अन्य फ़ाइलों पर ध्यान न दें ।
    5. निंनलिखित कमांड "my_test. exe ministacks. csv corrected_ministacks. csv अंशांकन. mat 1" टाइप करके Golgi मिनी टैक् स के केंद्रों की रंगीन-शिफ्ट को सही करें ।
      नोट: कार्य फ़ोल्डर में "corrected_ministacks. csv" नामक फ़ाइल बनाई जाती है । यह है कि एक्सजी, वाईजी, एक्सबी और वाईबीके क्रम में व्यवस्था कर रहे हैं, जो केन्द्रों के सही निर्देशांक, रंगीन बदलाव शामिल हैं । बनाए जाते है जो अंय फ़ाइलों पर ध्यान न दें । ध्यान रखें कि लाल चैनल रंगीन वाकया से मुक्त के रूप में परिभाषित किया गया है और इसलिए एक्सआर और वाईआर कच्चे डेटा के रूप में ही कर रहे हैं ।
  4. LQs की गणना
    1. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर लांच और कॉपी और पेस्ट, नीचे अनुक्रम में, ग्रे मूल्यों, क्षेत्रों, चरण 4.2.3 से प्राप्त पृष्ठभूमि एसडीएस मतलब है (उन्हें पंक्ति 1 पर जगह) और रंगीन-shift सही x और y चैनल में Golgi मिनी-पोट के निर्देशांकR में कार्यपत्रक स्तंभ के रूप में A to E । इसी प्रकार, क्रमशः चैनलG और चैनलB के स्तंभ F से J और K तक के लिए इसी डेटा को स्थानांतरित करें ।
    2. डब्ल्यू के लिए आठ नए कॉलम पी, नाम "चैनल आर की एकीकृत तीव्रता", "चैनल के एकीकृत तीव्रता जी", "चैनल बी के एकीकृत तीव्रता", d1, dx, abs (तन ए), abs (टैन बी) और LQ ।
      1. संबंधित स्तंभ के शीर्ष पर दायाँ क्लिक करें और प्रत्येक स्तंभ के मानों की गणना करने के लिए "स्तंभ मान सेट करें" चुनें. स्तंभ P के लिए, इनपुट "कर्नल (A) कर्नल (B)"; स्तंभ Q, के लिए इनपुट "कर्नल (F) कर्नल (G)"; स्तंभ R, के लिए इनपुट "कर्नल (K) कर्नल (L)"; स्तंभ S के लिए, इनपुट "pixel_size * दूरी (स्तंभ (D), कर्नल (E), कर्नल (N), कर्नल (O))" जहां "pixel_size" एनएम में पिक्सेल का आकार है; कॉलम टी के लिए, इनपुट "pixel_size * (((दूरी (कर्नल (), कर्नल (जे), कर्नल (एन), कर्नल (ओ)) ^ 2 + दूरी (कर्नल (डी), कर्नल (ई), कर्नल (एन), कर्नल (ओ)) ^ 2-दूरी (कर्नल (डी), कर्नल (e), कर्नल (I), कर्नल (J)) ^ 2)/(2Distance (स्तंभ (D), कर्नल (e), कर्नल (N), कर्नल (O))))"; कॉलम यू के लिए, इनपुट "Abs (टैन (Acos (((दूरी (कर्नल (I), कर्नल (जे), कर्नल (एन), कर्नल (ओ)) ^ 2 + दूरी (कर्नल (डी), कर्नल (ई), कर्नल (एन), कर्नल (O))) ^ 2-दूरी (कर्नल (D), कर्नल (E), कर्नल (I), कर्नल (J)) ^ 2)/(2 दूरी (कर्नल (I), कर्नल (जे), कर्नल (एन), कर्नल (ओ)) दूरी (कर्नल (डी) , कर्नल (E), कर्नल (N), कर्नल (O)))))) "; स्तंभ V के लिए, इनपुट "Abs (टैन (Acos (((दूरी (स्तंभ (d), कर्नल (ई), कर्नल (I), कर्नल (J)) ^ 2 + दूरी (कर्नल (डी), कर्नल (ई), कर्नल (एन), कर्नल (o))) ^ 2-दूरी (कर्नल (I), कर्नल (J), कर्नल (N), कर्नल (o)) ^ 2)/(2 दूरी (कर्नल (डी), कर्नल (ई), कर्नल (I), कर्नल (जे)) दूरी (कर्नल (डी) , कर्नल (E), कर्नल (N), कर्नल (O)))))) "; स्तंभ W के लिए, इनपुट "कर्नल (T)/Col (S)" ।
    3. परिचयमें वर्णित तीन मापदंडों द्वारा Golgi mini-स्टैक को फ़िल्टर करें ।
      1. डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में, "कार्यपत्रक > कार्यपत्रक क्वेरी" पर जाएं और "If" परीक्षण के लिए स्तंभ चरों का चयन करें । निम्नलिखित उपनाम असाइन करें I1, टेक्नॉलॉजीज, I3, d1, ए और बी कॉलम के लिए "एकीकृत तीव्रता चैनल आर", "एकीकृत तीव्रता के चैनल जी", "एकीकृत तीव्रता के चैनल बी", d1, एबीएस (तन ए) और एबीएस (टैन बी), क्रमशः. "यदि स्थिति" बॉक्स में, इनपुट "I1 > = 30 * सेल (1, 3) और टेक्नॉलॉजीज > = 30 * सेल (1, 8) और I3 > = 30 * सेल (1, 13) और d1 > = 70 और (A < = 0.3 या B < = 0.3)".
      2. "नए कार्यपत्रक में निकालें" चुनें, "लागू करें" पर क्लिक करे. स्तंभ a-W का विश्लेषण करने वाला Golgi mini-स्टैक किसी नए कार्यपत्रक में निकाले जाते हैं ।
    4. नए कार्यपत्रक में, स्तंभ W के शीर्ष पर दायां क्लिक करें, "स्तंभ पर आंकड़े > खुले संवाद" का चयन करें । "N कुल", "मतलब", "माध्य के एसई", "हिस्टोग्राम" की जांच करें । LQs का सांख्यिकीय विश्लेषण तो प्रदर्शित होता है.

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Representative Results

आधुनिक अनुसंधान ग्रेड प्रकाश माइक्रोस्कोप एक योजना apochromatic लेंस, जैसे हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल एक के साथ सुसज्जित, ंयूनतम रंगीन वाकया (चित्रा 2) से पता चलता है । हालांकि, बहु रंग फ्लोरोसेंट मनका छवि के एक सावधान परीक्षा एक ही मनका के विभिंन रंग छवियों की पारी प्रकट कर सकते है (चित्रा 2बी) । हम परिभाषित करते है कि लाल चैनल रंगीन वाकया से मुक्त है और इसलिए लाल प्रतिदीप्ति के केंद्रों मोतियों की सही स्थिति है । रिश्तेदार रंगीन-हरे और दूर लाल प्रतिदीप्ति के बदलाव हरे और नीले लाल प्रतिदीप्ति के केंद्र (चित्रा 2सी) से उत्पंन वैक्टर द्वारा प्रतिनिधित्व किया जा सकता है । रंगीन-इमेजिंग विमान के भीतर बदलाव empirically प्रत्येक मनका के लिए हरे और नीले सदिश द्वारा सचित्र है (चित्रा 2डी) । हमारे माइक्रोस्कोप के लिए, रंगीन-शिफ्टों के रूप में दोनों परिमाण और बदलाव की दिशाओं एक्स और वाई के पदों के अनुसार परिवर्तन के समान नहीं हैं । रंगीन बदलाव काफी दूर लाल केंद्रों के रूप में ५० एनएम के रूप में ज्यादा हो सकता है की बदलाव के रूप में ग्लीम की सटीकता को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए रंगीन-shift सही किया जाना चाहिए । एक बार मोतियों की केंद्र का अधिग्रहण कर रहे हैं, हम पहली आदेश बहुपद फिटिंग जांचना और बाद में केंद्रों के रंगीन-परिवर्तन सही काम करते हैं । रंगीन बदलाव वाला वाकया इस दृष्टिकोण से काफी सुधरा है (चित्रा 2 डी जी).

स्तनधारी कोशिकाओं में, Golgi परिसर perinuclear क्षेत्र है जो आम तौर पर एक पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) के तहत हल नहीं है पर एकत्रित की है । 3 घंटे के लिए nocodazole उपचार के बाद, perinuclear Golgi परिसर गायब हो जाता है और Golgi मिनी के दर्जनों ढेर endoplasmic भर जालिका कोशिका बाहर निकलें साइटों पर इकट्ठा (चित्रा 3बी) । Golgi झिल्ली और एकत्रित Golgi मिनी स्टैक का बड़ा हिस्सा मौजूद है और वे विश्लेषण के लिए चयनित नहीं हैं । Golgi मिनी-स्टैक्स के चयन को दर्शाने वाला एक उदाहरण छवि चित्रा 3Cमें दिखाया गया है । "मैक्रो-Golgi रॉय निरीक्षण" टूल का उपयोग करके, ४० चयनित Golgi mini-टैक् स चित्रा 3डीमें सूचीबद्ध हैं । तीन मानदंडों को लागू करने के बाद, 21 Golgi मिनी ढेर विश्लेषण कर रहे थे और TPST1 के LQs की गणना के लिए चुना-EGFP (चित्रा 3डी; "एल" के रूप में लेबल), उनके आंकड़ों के साथ चित्रा 3में दिखाया। कुल में, १११ विश्लेषण Golgi मिनी ढेर 12 कोशिकाओं से चयन किया गया था और TPST1-EGFP के LQ ०.७६ ०.०४ होना मापा गया था (मतलब ± SEM; n = १११) (चित्रा3 एफ) । LQ के TPST1-EGFP के बीच यह स्थिति giantin (LQ = ०.५९) और EGFP-Rab6 (LQ = १.०४)7. यह GS15 के निकट है (LQ = ०.८३) और ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = ०.८२) । हमने साहित्य से गुणात्मक स्थानीयकरण डेटा पर विचार करके LQs के अनुसार उप-Golgi क्षेत्रों को परिभाषित किया है: ERES/ERGIC, <-०.२५; सीआईएस, ०.०० ± ०.२५; औसत दर्जे का, ०.५० ± ०.२५; ट्रांस-Golgi, १.०० ± ०.२५ और TGN, १.२५-२.०० । TPST1-EGFP का LQ इसलिए अपने ट्रांस-Golgi स्थानीयकरण का संकेत देता है, जो पिछले अध्ययन14के साथ समझौते में है ।

Figure 1
चित्र 1 . योजनाबद्ध रेखांकन ग्लीम की गणना में प्रयुक्त चर दिखा । () एक Golgi मिनी ढेर के xz दृश्य है कि सह के अक्षीय केंद्र है GM130, GalT-mCherry और प्रोटीन एक्स प्रतिदीप्ति दिखा Golgi धुरी, अक्षीय कोण, डीएक्स और डी1. Golgi मिनी की छवि ढेर छवि विमान पर अपने प्रक्षेपण है । () एक Golgi मिनी की xy दृश्य बंद के साथ ढेर-प्रोटीन एक्स के अक्ष केंद्र दिखा कोण α, कोण β और प्रक्षेपण के सलए दूरी डीएक्सA और B , क्रमशः हमारे पिछले प्रकाशन7के चित्रा 1 और चित्रा 1एफ से अनुकूलित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . रंगीन-शिफ्ट के सुधार. () तीन रंग की मर्ज की गई छवि ११० एनएम बहु रंग मोती एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत की । प्रत्येक मनका का उत्सर्जन करता है हरे, लाल, और दूर लाल (कृत्रिम रूप से नीले रंग के रूप में) प्रतिदीप्ति । स्केल बार, 10 µm. () एक नजर रंगीन-shift के साथ एक विलय एकल-मनका छवि के बढ़े हुए दृश्य । स्केल बार, २०० एनएम । () एक योजनाबद्ध चित्र दिखा रहा है कि हरी और दूर की पाली-लाल मनका छवियों को लाल मनका छवि (0, 0) के केंद्र से वैक्टर द्वारा प्रतिनिधित्व किया जा सकता है हरे (हरे सदिश) और दूर लाल (नीले सदिश) मनका छवियां, क्रमशः । (, ) रंगीन-shift सुधार का प्रभाव । छवि के एक ही क्षेत्र के भीतर, हरे और नीले वैक्टर पहले और बदलाव के बाद सुधार की साजिश रची है । छोटे बदलाव कल्पना करने के लिए, प्रत्येक सदिश की भयावहता २०० प्रवर्धित है गुना । (, ) तितर बितर भूखंडों हरी (हरे डॉट्स) और दूर लाल (नीले डॉट्स) के केंद्र दिखा रहा है और पहले पाली सुधार के बाद मोती । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . ग्लीम का एक विशिष्ट उदाहरण, यहाँ TPST1-EGFP के LQ का अधिग्रहण. एक हेला सेल एक्सप्रेस TPST1-EGFP (हरा) और GalT-mCherry (लाल) अंतर्जात GM130 (नीला) के लिए दाग थे । () एक विशिष्ट कोशिका. (B, C, D, E) nocodazole के साथ इलाज किया गया एक सेल imaged (B) था । छवि से, विश्लेषण Golgi मिनी ढेर के रूप में चुना गया Cमें दिखाया गया है । चयनित Golgi मिनी-स्टैक पहचान संख्याओं द्वारा लेबल किए गए हैं । इन नकाबपोश Golgi मिनी-स्टैक की छवियाँ उनकी पहचान संख्याओं के साथ D में नीचे प्रदर्शित की जाती हैं । "L" Golgi मिनी स्टैक LQ (विश्लेषण Golgi मिनी-स्टैक) की गणना के लिए मान्य है कि नोट करता है । सेल से 21 मिनी टैक् स के LQs का हिस्टोग्राम में दिखाया गया है । () 12 कक्षों से १११ मिनी-टैक के LQs का हिस्टोग्राम । हिस्टोग्राम में दिखाया मान ± SEM मतलब है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक सामग्री: स्थूल-Golgi ROI निरिक्षण. ijm, मैक्रो-आउटपुट 3 चैनल data. ijm, Matlab कोड्स, My_train. exe, My_test. exe, और स्प्रेडशीट टेम्पलेट. opj.

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Discussion

पहले, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत एक Golgi प्रोटीन का स्थानीयकरण मुख्य रूप से सहसंबंध या ज्ञात स्थानीयकरण के एक Golgi मार्कर की छवि के साथ प्रोटीन की छवि के अतिव्यापी की डिग्री से मात्रा था15,16, 17. परिणामी सहसंबंध या अधिव्याप्त गुणांक कैसे बंद परीक्षण प्रोटीन Golgi मार्कर के लिए स्थानिकी है दर्शाता है । इस दृष्टिकोण के लिए कम से कम तीन निरंतर कर रहे हैं । पहले, सहसंबंध या अधिव्याप्त गुणांक रेखीय है और यह स्थानिक दूरी को सीधे संकेत नहीं करता है । दूसरा, सहसंबंध की डिग्री गंभीर रूप से सूक्ष्म प्रणाली के संकल्प पर निर्भर है । इसलिए, दो Golgi प्रोटीन के बीच गुणांक एक सिस्टम-स्वतंत्र स्थिरांक नहीं है । तीसरे, एक ही अक्षीय स्थानीयकरण लेकिन cisternae साथ अलग पार्श्व वितरण के साथ दो Golgi प्रोटीन अलग गुणांक हो सकते हैं । इसलिए, सहसंबंध या अतिव्यापी गुणांक एक Golgi प्रोटीन के अक्षीय स्थानीयकरण का संकेत नहीं है । एक वैकल्पिक Dejgaard एट अलद्वारा प्रस्तावित विधि में, सीआईएस, ट्रांसGolgi मार्करों और ब्याज की प्रोटीन ट्रिपल-nocodazole इलाज Golgi मिनी ढेर, ग्लीम के समान में लेबल हैं । प्रत्येक Golgi मिनी ढेर के भीतर, तीन अधिकतम तीव्रता पिक्सल के पदों का अधिग्रहण कर रहे है और परीक्षण प्रोटीन के सापेक्ष स्थिति एक दूरी अनुपात18के रूप में गणना की जाती है । हालांकि, उनके विधि उप पिक्सेल संकल्प है, जो बहुत अपने आवेदन सीमा को प्राप्त करने में असमर्थ है । पिछले मात्रात्मक तरीकों की तुलना में, ग्लीम, जो स्वतंत्र रूप से विकसित किया गया था, लेकिन Dejgaard एट अलके लिए एक समान अवधारणा भालू, अभूतपूर्व सटीकता और निरंतरता के साथ एक Golgi प्रोटीन के अक्षीय स्थानीयकरण मात्रा में सक्षम है.

हम ग्लीम के प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए exogenously व्यक्त GFP-टैग प्रोटीन-TPST1-EGFP के LQ अधिग्रहण । अगर इसकी एंटीबॉडी उपलब्ध है तो अंतर्जात प्रोटीन का LQ निर्धारित किया जा सकता है । प्राथमिक एंटीबॉडी, माउस या खरगोश की प्रजातियों पर निर्भर करता है, तो एक खरगोश या माउस विरोधी GM130 एंटीबॉडी, क्रमशः, ट्रिपल लेबलिंग प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग के लिए खरगोश और माउस विरोधी GM130 एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । हम पहले से दिखा दिया है कि खरगोश और माउस विरोधी GM130 एंटीबॉडी ग्लीम में एक ही परिणाम दे7। यदि परीक्षण प्रोटीन प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में आंतरिक रूप से लाल है, जैसे mCherry फ्यूजन, LQ GM130 लेबलिंग के साथ संयोजन में ज्ञात एंटीबॉडी के साथ एक GFP-टैग Golgi मार्कर प्रोटीन का इस्तेमाल किया जा सकता है ट्रिपल-लेबल कोशिकाओं और परोक्ष रूप से परीक्षण प्रोटीन के निकालना LQ । मार्कर प्रोटीन LQ मान रहा है LQm और GM130 की है कि करने के लिए मार्कर प्रोटीन के केंद्र से दूरी डीएमहै, परीक्षण प्रोटीन एक्स के LQ (डीएक्स/dएम) × LQएमके रूप में गणना की जा सकती है । सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी की तुलना में ग्लीम का सबसे बड़ा लाभ में से एक यह है कि यह आसानी से पारंपरिक सूक्ष्म setups में लाइव सेल इमेजिंग करने के लिए लागू किया जा सकता है । हम तीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन, GFP-Golgin84, mCherry-GM130 और GalT-iRFP670 के संयोजन की कोशिश की है, गतिशील रूप से LQ-GFP के एकल Golgin84 मिनी ढेर में Golgi की निगरानी के लिए7

ग्लीम में, सबसे अधिक समय लेने वाली कदम के बाद अधिग्रहण विश्लेषण है, विशेष रूप से विश्लेषण Golgi मिनी के चयन पर ढेर । के रूप में Golgi मिनी ढेर दोनों आकार और आणविक रचना19में विषम हैं, यह स्पष्ट नहीं है अगर LQs के वितरण (चित्रा 3F) Golgi मिनी के विषम वास्तुकला का प्रतिनिधित्व करता है या ढेर की हमारी गणना की अनिश्चितता lq. कारणों की परवाह किए बिना, हमने पाया कि यह विश्लेषण Golgi मिनी स्टैक्स (n) की एक बड़ी संख्या के लिए LQ की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो समझौता है जब n छोटा है । आमतौर पर, n ≥ १०० के साथ डेटा एकाधिक कक्षों से विश्वसनीय LQs पैदावार । इसलिए, ग्लीम पहनावा-औसत स्थानीयकरण डेटा देता है, Golgi मिनी के व्यक्तित्व के ढेर अस्पष्ट । ग्लीम की एक और सीमा है कि यह मानता है कि सभी Golgi प्रोटीन एक केंद्र के चारों ओर एक संकीर्ण वितरण किया है । ऐसे प्रचुर यूनिटों, ARF1 और घुलनशील एन ethylmaleimide-संवेदनशील कारक अनुलग्नक प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) के रूप में कुछ Golgi प्रोटीन,20,21, सीआईएस से ट्रांसकरने के लिए व्यापक रूप से वितरित करने के लिए सूचित किया गया है- Golgi और TGN । यह शायद LQ द्वारा उनके Golgi स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त है । के रूप में ग्लीम वर्तमान में Golgi मिनी के मैनुअल चयन पोट शामिल है, जो दोनों श्रमसाध्य और व्यक्तिपरक है, ग्लीम के भविष्य के विकास के लिए एक सॉफ्टवेयर उपकरण को लागू करने के लिए स्वचालित रूप से ंयूनतम मानव हस्तक्षेप के साथ Golgi मिनी ढेर का चयन होगा ।

ग्लीम का स्थानिक संकल्प क्या है? चूंकि LQ एक अनुपात है, जो एकजुट है, यह एक स्थानिक दूरी का संकेत नहीं है । यहां, हम एक बहुत मोटा अनुमान देने का प्रयास । ग्लीम के स्थानिक संकल्प दो संपति Golgi प्रोटीन के बीच सबसे छोटी अक्षीय दूरी के रूप में परिभाषित किया जा सकता है । विभिंन Golgi प्रोटीन की जांच LQs7, हमने पाया है कि SEMs के साथ डेटासेट n ≥ १०० रेंज के आसपास ०.०३ । मान लें कि दो Golgi प्रोटीन एक ही n = १०० और SEM = ०.०३, दो Golgi प्रोटीन है t-परीक्षण (p < ०.०५), के द्वारा महत्वपूर्ण अलग स्थानीयकरण, यदि उनके LQs के बीच का अंतर है ≥ 3 × SEM = ०.०९ । EM डेटा से, हम अनुमान लगा सकते हैं कि Golgi मिनी-टैक की अक्षीय लम्बाई, जो कि GM130 से GalT-mCherry तक की दूरी भी ग्लीम में है, ~ ३०० एनएम8है । इसलिए, ग्लीम के संकल्प को Golgi अक्ष के साथ ०.०९ × ३०० = 30 एनएम होने का अनुमान है । ग्लीम में, एक बड़ा n आम तौर पर पैदावार छोटे SEM, जो उच्च संकल्प में परिणाम बारी में ।

यह शायद करने के लिए सीधे ग्लीम के संकल्प की तुलना अनुचित है bliss-गोल्ड उंहें उत्तरार्द्ध तकनीक के बाद से सीधे मात्रात्मक स्थानीयकरण डेटा उपज नहीं है । ग्लीम के लिए इसी तरह, Golgi अक्ष के साथ bliss सोने EM के संकल्प दो संपति Golgi मार्करों के बीच सबसे छोटी दूरी के रूप में परिभाषित किया जा सकता है । अपने संकल्प को मापने के लिए दोहरे bliss के अध्ययन-सोने दो Golgi प्रोटीन है कि बारीकी से Golgi धुरी के साथ एक दूसरे से सटे है के लेबल की आवश्यकता है । इस तरह के प्रणालीगत अध्ययन हमारे ज्ञान के अनुसार शायद अनुपलब्ध है । के रूप में परिचय में चर्चा की, bliss के स्थानिक संकल्प में सीमित कारकों में से एक-गोल्ड EM एंटीबॉडी परिसर के बड़े आकार है, जो संकल्प करता है से भी बदतर ~ 20 एनएम है । छवि संकल्प का एक अंय महत्वपूर्ण सीमित कारक प्रतिजन अणुओं के लेबल घनत्व है । Nyquist नमूना सिद्धांत के अनुसार, संकल्प इकाई के प्रति कम से कम दो सोने के कण होने चाहिए । सबसे bliss में गोल्ड EM अध्ययन, पड़ोसी सोने के कणों के बीच दूरी बहुत कम लेबलिंग दक्षता के कारण < 15 एनएम नहीं हैं; यह मुश्किल इस तकनीक के लिए एक छवि संकल्प से कम 30 एनएम प्राप्त करने के लिए बनाता है । देखने के इस बिंदु से, हम अनुमान है कि ग्लीम का संकल्प कम से bliss के लिए तुलनीय है सोने उंहें ।

ग्लीम एक दमदार तरीका है जो बेहद सुसंगत परिणाम देता है । यह इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के प्रकार से स्वतंत्र है । हम परीक्षण किया है कि व्यापक क्षेत्र और कताई डिस्क फोकल सूक्ष्मदर्शी एक ही परिणाम झुकेंगे । प्रयोगों के विभिन्ना बैचों में अधिग्रहीत एक ही Golgi प्रोटीन के LQs भी एक-दूसरे के साथ अच्छे समझौते में थे. एक LQ Golgi निवासी प्रोटीन की एक विविध रेंज से मिलकर डाटाबेस की तुलना और व्याख्या के लिए उत्पंन किया गया है । हमें उंमीद है कि अनुसंधान समुदाय में ग्लीम के अधिक उपयोग काफी डाटाबेस का विस्तार होगा । नतीजतन, एक अधिक पूरा डेटाबेस मात्रात्मक Golgi प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के स्थानीयकरण का वर्णन काफी संगठन और Golgi परिसर के समारोह को समझने में मदद मिलेगी ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम डी स्टीफंस (ब्रिस्टल, ब्रिस्टल, यूनाइटेड किंगडम के विश्वविद्यालय) TPST1-EGFP डीएनए प्लाज्मिड के लिए, साथ ही लक्ष्मी Narasimhan Govindarajan सॉफ्टवेयर अनुकूलन के साथ मदद करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम राष्ट्रीय आयुर्विज्ञान अनुसंधान परिषद् (NMRC/CBRG/007/2012) से अनुदान द्वारा समर्थित था, शिक्षा मंत्रालय (AcRF Tier1 आरजी 18/11, आरजी 48/13 और RG132/15 और AcRF Tier2 MOE2015-2 टी-2-073) से L.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

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References

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