Floresans Merkezi kütlesi Imaging tarafından Golgi protein nicel yerelleştirme

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Golgi sakinlerinin kesin yerelleştirme Golgi hücresel işlevlerini anlamak için önemlidir. Ancak, geleneksel optik mikroskobu alt-Golgi yapısı dönüştürememiş demektir. Burada iletişim kuralı için kantitatif bir protein alt-Golgi yerelleştirme belirlemek geleneksel mikroskobu dayalı süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

CISdahil olmak üzere alt-Golgi bölgelere daha fazla sınıflandırılabilir seri olarak yığılmış membran cisternae Golgi kompleksi oluşur-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi ve trans-Golgi ağ. Golgi hücresel işlevlerini kendi ikamet proteinler karakteristik dağıtım tarafından belirlenir. Konvansiyonel ışık mikroskobu Uzaysal çözünürlük alt-Golgi yapısı veya cisternae gidermek için çok düşüktür. Böylece, IMMUNO-altın elektron mikroskopi sub-Golgi düzeyinde bir protein yerelleştirmek için seçim yöntemidir. Ancak, teknik ve araç çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları yeteneği vardır. Biz burada Golgi protein yerelleştirme merkezleri kütlenin (ışık) sistematik ve kantitatif Golgi protein yerelleştirmek için Imaging tarafından denilen bizim son zamanlarda geliştirilen süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır. IŞIK standart floresan etiketleme iletişim kuralları ve geleneksel geniş-alan veya confocal mikroskoplar üzerinde temel alır. Shift renk sapmaları mikroskobik sistem, resim alma ve sonrası edinme analiz kalibrasyonu içerir. Bir test protein alt-Golgi lokalizasyonu kantitatif yerelleştirme bölüm ifade edilir. IŞIK dört ana avantajı vardır; hızlı, geleneksel yöntemler ve araçlar dayalı, yerelleştirme sonucudur nicel ve bu tanıyor ~ 30 nm pratik çözünürlük Golgi eksen boyunca. Burada bir test Golgi protein yerelleştirmek için ışık detaylı Protokolü açıklar.

Introduction

Golgi kompleksi memeli hücreleri1,2,3' te proteinler ve yağlar (bundan sonra yükler) salgı/endositik kaçakçılığı önemli rol oynar. Golgi yükler sadece için çeşitli alt hücresel kompartmanlarda sıralanmış ama aynı zamanda glikozilasyon çeşitli türlerine göre değişiklik. Memeli Golgi kompleksi çok sayıda yanal bağlı Golgi yığınlar, ki genellikle 4-11 sıkı bitişik ve düz zar kesesi cisternae denilen oluşur oluşur. Seri olarak yığılmış Golgi cisternae daha fazla, diğer bir ucundan CIS, medial ve transkategorize edilir-cisternae. Trans-yan Golgi yığın, trans- transolarak adlandırılan borulu ve retikulum membran ağın çoğu membran sac geliştirir-Golgi ağ (TGN)4. Salgı yol endoplazmik retikulum (ER) türetilmiş yükler, CIS, Golgi yığın girin-yan ve daha sonra sırayla medial ve transyoluyla geçmek-cisternae. Gönderileri sonunda Golgi trans, çıkmak-Golgi veya TGN plazma zarı, endosomes veya salgı granül destining.

Nasıl yükler Golgi yığın transit ve Golgi cisternal kuruluşu nasıl saklandığına ilişkin moleküler ve hücresel mekanizmaları gizemli kalır ve hala bir hararetli tartışmalara1altında şu anda. Bu alandaki zorluklardan biri Golgi cisternae bir optik mikroskobu çözünürlük beri sadece elektron mikroskobu (EM) altında çözülebilir (~ 200 nm) bireysel Golgi cisternae (< 100 nm her iki cisternal kalınlıkta gidermek için yeterli değil ve mesafe) Bu nedenle, alt-Golgi yerelleştirme ikamet proteinlerin ve transit gönderileri geleneksel belirlenir tarafından IMMUNO-altın EM. Ancak, IMMUNO-altın EM çok teknik olarak talep ediyor ve çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları yeteneği. EM çözünürlük-ebilmek var olmak alt nanometre, IMMUNO-altın EM tarafından tanınan çözünürlüğü büyük ölçüde karmaşık antikor (birincil ve ikincil antikor) boyutunu ve altın parçacık tarafından engel oluyor ve 20 kötü olabilir rağmen nm. Ayrıca, EM görüntüleri 2D ince-bölümler yerine bağlı olarak göreceli konumunu ve yönünü 2D bölüm5hatalı sonuçlara yol açabilir Golgi 3D bir genel görünümünü elde edilir. Örneğin, bir EM tek bölüm okuyan ondan beri her ikisi de aynı yuvarlak membran profiller görüntüleyebilirsiniz güvenilir bir tübül ortogonal görünümünden bir vezikül ayırt değiştiremiyor. Emisyon tükenmesi (STED), photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (3D yapılı aydınlatma mikroskobu (3D-SIM), gibi süper çözümleme mikroskobu teknikleri son gelişiyle uyarılmış Fırtına), alt-Golgi yapıları ışık mikroskoplar6altında çözmek sağlar. Ancak, önemli ölçüde kullanımları hücre biyolojik çalışmada, Golgi sınırlayabilirsiniz en az dört dezavantajları vardır. 1) geçerli süper çözümleme teknikleri çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları olan pahalı ve özel donanım yapılandırması gerektirir. 2) bazı süper çözümleme teknikleri için özel Floresans etiketleme iletişim kurallarına gerek. 3) rağmen en iyi koşul altında bu tekniklerin 20-110 nm mekansal çözünürlükte iddia, gerçek örneklerinde elde pratik çözünürlük çok daha kötü olabilir. 4) içinde karşılaştırma için geleneksel mikroskobu, bu süper çözümleme teknikleri hala yürütülmesi konusunda zorluklar çok renkli, 3D veya hücre Imaging, tek başına veya birlikte yaşamak. Muhtemelen en önemlisi IMMUNO-altın EM ve süper çözümleme mikroskobu teknikleri nitel nicel yerelleştirme veri yerine verim.

Kısmen yukarıda belirtilen sorunları çözmek çalışırken, biz son zamanlarda Golgi protein yerelleştirme merkezleri kütlenin (ışık), sistematik ve kantitatif bir Golgi yerelleştirmek için Imaging tarafından adlı bir konvansiyonel ışık mikroskobu dayalı yöntem geliştirdik IMMUNO-altın EM7eşdeğer bir çözünürlükte protein. Bu yöntemde, kültürlü memeli hücrelerinde Golgi Golgi mini-yığınlar nocodazole, bir Mikrotubul depolymerizing ilaç tedavisi tarafından dağınık olduğunu. Nocodazole kaynaklı Golgi mini yığınlarının (bundan sonra Golgi mini-yığınlar) yakından organizasyon ve hücresel işlevler8,9,10yerli Golgi yığınlarda benzer kapsamlı çalışmalar göstermiştir, 11. Bir test protein yerelleştirme sayının (LQ) ışık elde edilebilir ve nicel alt-Golgi yerelleştirme gösterir. LQs sayısal değerler karşılaştırılabilir ve 25'ten fazla Golgi işaretlerinin LQ veritabanı mevcut olmuştur.

IŞIK içinde endojen veya exogenously ifade GM130, GalT-mCherry ve test protein (x) tarafından üç kez etiketli Golgi mini-yığınlar. GM130 ve GalT-mCherry, CIS- ve trans-Golgi işaretleri sırasıyla12,13, referans noktaları sağlamak. Üçlü Floresan, kırmızı (R), yeşil (G) ve far-red (B), yapay olarak kırmızı, yeşil ve mavi sırasıyla görüntülenir. Merkezi Floresans kitle (bundan sonra Merkezi) alt piksel çözünürlük elde etmek için kabul edilir. Golgi eksen GalT-mCherry olan için GM130 merkezi üzerinden vektör olarak tanımlanır. Golgi Mini yığın Golgi ekseni etrafında sonsuz dönme simetri ile silindirik yapısı olarak modellenmiştir. Bu nedenle, Golgi Mini yığını daha fazla Golgi eksen boyunca tek boyutlu bir yapı olarak modellenebilir. LQ testi protein x dx/d1dx olduğu x merkezine uzaklik bu GM130, d1 GM130 olan için merkezi GalT-mCherry dan mesafe olsa, olarak tanımlanır. X Merkezi Eksen dışı projeksiyon Aksiyel uzaklığı hesaplama için kullanılır. Golgi eksen, Aksiyel açı, dx, d1, açı α ve β açısı, ışık için de dahil olmak üzere değişkenler, şematik Resim 1' de gösterilmiştir. LQ Golgi Aksiyel açısı bağımsız olsa da Golgi mini-yığınlar rastgele bir hücreye yönlendirmek.

Golgi mini-yığınlar Albümdeki inhomogeneous görünür. Analyzable Golgi mini-yığınlar ışık için seçmek için üç ölçüt geliştirdik. 1) sinyal-gürültü oranı kriteri, hangi ≥ 30 her kanaldaki arka plan standart sapma (SD) Golgi Mini yığıta toplam yoğunluğunu oranıdır. Bu ölçüt Merkezi kütlenin, Golgi mini-yığınlar sinyal noise oranları üzerinde bağlıdır konumlandırma doğruluğunu sağlamaktır. 2) d1≥ 70 gerektirir Aksiyel açı ya da mesafe kriteri, nm. d1 Golgi Aksiyel açısı artış ile azalır. Ne zaman Aksiyel açı 90 ° yaklaşıyor ya da dikey, Mini yığını d1 sigara çözülebilir olur 0 yaklaşıyor. d1≥ 70 nm etkili bir şekilde dikey Golgi mini-yığınlar hariç. 3) co-doğrusallık ölçütü, hangi da | tan α | veya | tan β | ≤ 0,3 olduğunu. Bu ölçüt mini bir yığın üç Merkezi yeterince co-doğrusal Golgi Mini yığını için bizim tek boyutlu model olmasını sağlar. Tüm ışık mikroskoplar renk sapması olan kırmızı, yeşil ve far-red floresan merkezleri göreli konumları ciddi deforme edebilirsiniz acı. Renk sapmaları mikroskop sistemlerinin deneysel olarak kırmızı, yeşil ve far-red floresan tarafından üç kez etiketli 110 nm boncuk Imaging tarafından kalibre edilmiş. Her boncuk görüntüsünün kırmızı merkezi boncuk gerçek konumunu tanımlanır ve Kromatik vardiya-yeşil ve far-red merkezleri tarafından birinci dereceden polinom fonksiyonların donatılmıştır. Golgi mini-yığınlar merkezlerinden Kromatik yeşil ve far-red Kanallar olarak kaydırır düzeltmek için polinom fonksiyonların tabi.

IŞIK ile a kararlılık-in elde edebilirsiniz ~ 30 nm standart koşullar altında Golgi eksen boyunca. Önemlisi, kantitatif Golgi protein var eşlemek için uyguladıkları bir yöntem sağlar. IŞIK geleneksel mikroskoplar, geniş alanlı gibi veya confocal mikroskoplar, ortak Floresans etiketleme iletişim kuralları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Görüntüleme ve veri işleme gibi bir saat gibi kısa sürebilir. IŞIK, biz doğrudan salgı kargo aşamalı geçiş CIS- transiçin göstermiştir-Golgi7yan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Işık adım adım bir protokol tyrosylprotein EGFP LQ öğesini sulfotransferazlar 1 (TPST1), bir Golgi ikamet enzimi, HeLa hücreleri belirlemek için aşağıdadır.

1. Golgi Floresans etiketli Mini-yığınlar hazırlanması

  1. Cam coverslips hazırlamak
    1. Aliquot 0.3 mL steril Dulbecco modifiye kartal'ın orta (DMEM) 24-şey plaka bir doku kültürü başlıklı bir kuyu için.
    2. Bir parça Φ 12 mm No.1.5 cam coverslip cam coverslip yüzeyinde enkaz kaldırmak için % 70 etanol ile sildi yumuşak kağıt mendil kullanarak silin. Kısaca, coverslip % 70 etanol emmek 24-şey plaka transfer ve de içeren steril DMEM altına lavabo bir çift keskin cımbız kullanın.
      Not: Cam coverslips geleneksel yanan tarafından sterilize. Ancak, bu tedavi altında coverslips kolayca daha sonra işleme sırasında çatlamak. % 70 etanol iliklerine kadar onlara zarar vermeden cam coverslips sterilize etkili olur.
    3. Kapak ile örtülü 24-şey plaka 37 ° C'de CO2 kuluçka makinesi kadar kullanmak bırakın.
  2. Tohum hücreleri
    1. Kültür HeLa hücreleri (bundan sonra hücreleri) DMEM % 10 ile desteklenmiş bir T-25 şişesi Fetal sığır Serum (FBS) (bundan sonra tam orta) 37 ° C CO2 kuluçka %5 CO2ile birlikte. Antibiyotik burada gerekli değildir.
    2. Hücreleri ulaştığınız zaman ~ %80 confluency, kültür orta Aspire edin. 1 mL % 0.25 ekleyin tripsin-EDTA balonun içine ve 37 ° C CO2 kuluçka 2 dk. eklemek 1 mL tam orta için hücre şişeye kuluçkaya ve yavaşça pipetting tarafından hücreleri şişesi duvarından floş.
    3. Müstakil hücreleri bir steril Santrifüjü tüp ve 500 x g hücreleri cips 2 min için spin aktarın. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet 1 mL tam ortamda askıya alma.
    4. Steril cam coverslip ve tohum içeren 24-şey plaka kuyusu ortamda Aspire edin ~ 1 x 105 hücreleri iyi. Sesi iyi 0.5 ml tam orta ile top. %5 CO2ile sağlanan bir 37 ° C CO2 kuluçka kuluçkaya. Hücrelere kültür ~ %80 confluency.
  3. Hücre transfect
    Not: İyi yaymak dağınık Golgi mini-yığınlar görüntüleme için avantajlı hücrelerdir.
    1. Transfect ~ %80 80 ng GalT-mCherry7 Konfluent hücrelerle ve 320 ng TPST1-EGFP (bakınız Tablo reçetesi) DNA plazmid üreticisi tarafından sağlanan protokolüne göre transfection reaktif kullanarak. 37 ° C CO2 kuluçka makinesine kuluçkaya. Orta sonra 4-6 h kuluçka değiştirin. Hücreleri hazırız ~ 12 h daha sonra.
  4. Golgi mini-yığınları oluşturmak için Nocodazole tedavi
    1. Nocodazole hisse senedi çözüm (33 mM) 10 mg nocodazole tozu 1 mL Dimetil sülfoksit çözülerek hazırlayın. Aliquot hisse senedi çözüm ve mağaza-20 ° c uzun süreli depolama için.
    2. Nocodazole hisse senedi çözüm (33 mM) 1 µL 1 mL 37 ° C tam orta (son konsantrasyonu 33 µM) oranında seyreltin. En yüksek hızda partikül madde kaldırmak için santrifüj kapasitesi.
    3. İyi orta Aspire edin ve tam orta içeren 33 µM nocodazole 0.5 mL ekleyin. Hücreleri bir 37 ° C CO2 kuluçka (Bölüm 1.5) etiketleme ayirt için 3 h. devam et için kuluçkaya.
  5. Ayirt etiketleme
    Not: hücreleri GalT-mCherry ve TPST1-EGFP photobleaching önlemek için karanlıkta bırakın.
    1. Reaktifler ayirt etiketleme için hazırlamak
      1. %4 paraformaldehyde çözeltisi hazırlamak için sıcak 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) X % 4 (w/v) paraformaldehyde toz geçiyoruz ve çözüm 0,45 µm filtreden filtre. Belgili tanımlık eriyik-ebilmek var olmak stok-20 ° C'de
        Uyarı: Toksik ve kanserojen Paraformaldehyde ve cilt tahrişine neden olabilir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giymek.
      2. Floresans seyreltme arabellek (FDB) hazırlamak için %5 (v/v) FBS ve %2 (w/v) sığır serum albumin (BSA) 1 x PBS içinde karıştırın. Çözüm 0,45 µm ile filtre ve çözüm-20 ° C'de depolayın
      3. 5.35 g NH4Cl tozu 100 mM NH4Cl hazırlamak ve çözüm oda sıcaklığında saklamak için 1 L suda çözülür.
      4. Su % 10 saponin, aliquot hazırlamak ve çözüm-20 ° C'de depolamak için % 10 (w/v) saponin toz geçiyoruz
    2. Fiksasyon
      1. İyi bir kez PBS çözüm x 0.5 mL 1 ile durulayın ve 0.5 mL % 4 paraformaldehyde çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Yani 0.5 mL 1 x PBS ile iki kez ve iki kez ile 0.5 mL 100 mM NH4CL durulama iyi durulama 0.5 mL 1 x PBS ile iki kez. Hücreler karanlıkta gecede 4 ° C'de 1 x PBS içinde tutulabilir.
    3. Floresans etiketleme
      1. 1 µL fare anti-GM130 birincil antikor 500 µL FDB kapsayan %0,1 saponin içinde sulandırmak. 24-şey plaka kapak ters ve 10 µL birincil antikor karışımı kapağı üzerine uygulayın.
      2. Bir çift keskin cımbız ayıklamak ve cam coverslip karışımı ile temas ve hücre takımıdır antikor karışımı sağlanması damla üzerine aktarmak için kullanın. Birincil antikor karışımı oda sıcaklığında 1 h için hücrelerle kuluçkaya.
        Not: Kapak coverslip ile oksijen bir plastik torba içinde belgili tanımlık karanlık yerleştirilebilir.
      3. Ayıklamak ve üç kez ≥ 0.5 mL 1 x PBS durulayın ve yukarı coverslip hücre tarafı iyi transfer için bir çift keskin cımbız kullanın 30 dk. Çalkalamalı gereksiz.
      4. 1 µL far-red fluorophore konjuge keçi Anti-IgG (ikincil antikor) içinde fare 500 µL FDB kapsayan %0,1 saponin sulandırmak.
      5. 24-şey plaka kapağını geriye doğru yüzeyi temizleyin ve yıkayın. Kapağı 10 µL far-red ikincil antikor karışımı uygulamak. Adımları yineleyin 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. Montaj
      1. 1 g gliserol, 2,2 g poly(vinyl alcohol) karıştırılarak montaj orta hazırlamak (MW ~ 31.000 Da), 1.2 mL 1 M Tris (pH 8) ve 8,8 mL H2O. erime 60 ° C su banyosu ile zaman zaman vortexing karışımı. Çözüm-20 ° C'de depolayın
      2. Montaj orta çözülme ve 10 µL bir cam slayt üzerine aktarın. Coverslip (hücre tarafı aşağı) Montaj orta damla yerleşimi. Cam kaymak için 30 dk 37 ° C veya oda sıcaklığında montaj orta sertleşmesine 1 h için kuluçkaya. Renksiz oje ile coverslip mühür ve cam slayt-20 ° C'de depolayın

2. renk-shift düzeltme floresan boncuk hazırlanması

  1. Temizlik Coverslip
    1. Dikkatle 25 mm No.1.5 cam coverslip plastik bir raf üzerine bir parça yerleştirin.
    2. Transfer coverslip ile raf bir 400 mL kabı için 1 M NaOH ile 300 mL dolu ve banyo sonicator (35 Watt) 300 mL deiyonize su ile durulama 400 mL kabı rafa dolu 15 dk. kısa bir süre için solüsyon içeren temizleyicide. 15 dk. kısaca durulama 400 mL kabı rafa 300 mL deiyonize su banyosu sonicator solüsyon içeren temizleyicide ve raf 300 mL % 99 etanol ile dolu bir 400 mL kabı transfer.
    3. 2.1.2 iki kez daha tekrarlayın.
    4. Coverslip 300 mL deiyonize su ile raf bir 400 mL ölçek 10 dk. tekrarlamak için iki kez daha adım durulayın. 60 ° C fırın raf aktarmak ve coverslip 1 h. mağaza tozsuz Petri kabına kurutulmuş coverslip için kuru.
  2. İmmobilizasyon floresan boncuk cam coverslip üzerinde
    1. 110 nm çok renkli floresan boncuk 80-fold içinde 1 PBS kapsayan 0,1 µg/µL BSA x oranında seyreltin. Kısaca girdap tüp boncuk toplamları dağıtmak için. 60 seyreltilmiş µL boncuk temizlenmiş Φ 25 mm No.1.5 cam coverslip (bakınız Bölüm 2.1) üzerine yayılmış bir pipet ucu kullanarak. Karanlıkta bir vakum pompası bağlı bir desiccator coverslip kuru ve coverslip 50 µL montaj orta bir cam slayt üzerine monte (bkz. Adım 1.5.4.2).

3. resim alma

Not: Yüksek hassasiyetli Merkezi kütlenin hesaplama için yüksek sinyal gürültü oranı (SNR) görüntülerini ışık gerektirir. Görüntü confocal, tarama dönen disk confocal veya geniş alanlı mikroskop lazer gibi geleneksel mikroskoplar tarafından elde edilebilir. Planı apochromatic objektif lens ve bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) ve bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) gibi düşük gürültü görüntü sensörü ile donatılmış geniş alanlı mikroskop-ebilmek var olmak kullanılmış. Görüntü sensörü için parametreleri düşük bir okuma gürültü ve yüksek dinamik aralığı sağlamak için ayarlanır. Mikroskop floresan filtre yeşil, mCherry ve far-red fluorophore için en uygun yapılandırma ile donatılmış olması gerekir ve ihmal edilebilir Floresans çapraz-hadis olması gerekir. İdeal olarak, görüntüleme sistemi x, Nyquist örnekleme hızı elde genellikle x, y ve z boyutu 100'den küçük olmak bir Voksel gerektirir, y ve z ekseni, 100 ve 200 nm, anılan sıraya göre. X ve y Voksel boyutunu her zaman eşit ve pixel_size adlandırılır. Pixel_size kamera sensör boyutu sistem büyütme tarafından bölünmesi ile hesaplanır.

  1. Görüntü çok renkli boncuklar
    1. Yeşil, kırmızı ve far-red kanal başında ve görüntüleme her oturumun sonunda görüntü çok renkli boncuklar.
      Not: Burada, 100 X NA 1.4 planı apochromatic amaç, motorlu sahne, 200 Watt metal halide ışık kaynağı ve 16-bit sCMOS kamera ile donatılmış (ters) geleneksel geniş alanlı epi-floresan mikroskop aracılığıyla görüntüleri elde. 465-495, 505 ve 515-555 nm dalga boyu uyarma filtre (bant geçiren), dikroik ayna (uzun pası) ve emisyon filtre (bant geçiren) yeşil kanal filtre küp için vardır; 528-553, 565 ve 578-633 nm Bunlar kırmızı kanalı filtre küp için; ve 590-650, 660 ve 663-738 nm bunlar far-red kanal filtre küp için. Satın alma, bir Voksel x boyunca boyutunu y ve z ekseni 64, 64 ve 200 nm, sırasıyla bulunuyor.
    2. Görüş alanı iyi boncuk yoğunluğu ile bulmak.
    3. 3D görüntü yığınları yeşil, kırmızı ve far-red kanalları (G, kanalR, kanalB, sırasıyla kanal) edinin. 3 bölümden üstündeki ve altındaki en iyi odak düzlemi (yığın başına 7 bölümler) alın. Üç yığınları üç TIFF dosyaları olarak kaydedin.
      Not: Her kanal için çekim hızı kameranın dinamik alanı en üst düzeye çıkarmak, piksel doygunluk kaçınmak ve photobleaching en aza indirmek için ampirik olarak belirlenir. Diğer parametreleri, filtreler ve x, y ve z Voksel boyutunu gibi yukarıda da açıklandığı gibi seçilir.
  2. Görüntü Golgi mini-yığınları
    1. Kullanım TPST1-EGFP ve GalT-mCherry transfected ve o hızlı TPST1 EGFP ve GalT-mCherry düşük veya orta düzeyde hücreleri bulmak için (Bölüm 1.5) slaytlar fluorescently etiketli. 3D görüntü yığınları 3.1.3 adımda anlatıldığı gibi elde.

4. görüntü analizi

  1. Floresan boncuk merkezlerinden elde
    1. ImageJ içinde üç TIFF dosyaları oluşan boncuk fotoğraf bir dizi açın (Dosya > Görüntü > açın).
    2. 3 ardışık bölümleri kanalR görüntü tarafından en iyi odaklı bölümünde çevresinde ortalama > Yığınlar > Z proje. "Başlangıç dilim" ve "Stop dilim" istediğiniz bölüm numarasını girin ve "projeksiyon tip" Seçenekler arasında "Ortalama yoğunluğu" seçin.
    3. Hiçbir boncuk "Çokgen seçimleri" kullanarak görüntü içeren bölgeleri (ROIs) ilgi çekmek. İçinde "Analyze > Set ölçümleri", sadece "Ortalama gri değeri" ve "Standart sapma" kontrol edin. O zaman idam etmek "Analyze > ölçü" ortalama ve SD yatırım Getirisi elde etmek için.
    4. Arka plan yoğunluk. "ortalama + 6 × SD" olarak hesaplamak Görüntü ile ilgili arka plan yoğunluk değerleri tarafından çıkarma "işlem > Matematik > çıkarma", bu kanala karşılık gelen arka plan yoğunluk değeri girin.
    5. Aynı başlangıç kullanarak 4.1.2-4.1.4 kanalG ve kanalB görüntü yığınları için adımları yineleyin ve dilim ve aynı arka plan yatırım Getirisi durdurmak. KanalG kanalB görüntüleri. için yatırım Getirisi 4.1.3 adımda kullanılan Not kopyalanabilir
    6. Üç arka plan düşülen görüntüleri birleştirme (Görüntü > renk > kanalları Birleştir) kanalR kırmızı seçerek,G yeşil olarak kanal ve kanalB mavi olarak. Üç kanal oluşan tek bir bileşik görüntü elde edilir.
    7. ROI Yöneticisi'ni başlatma (Analyze > Araçlar > ROI Yöneticisi). Her yatırım Getirisi içinde tek bir boncuk olduğunu kontrol ettikten tek boncuk etrafında kare bir yatırım Getirisi çizin. Yatırım Getirisi "t" üstünde belgili tanımlık klavye tuşlarına basarak ROI Yöneticisi için ekleyin. Bu adımları tekrarlayın ve mümkün olduğunca çok sayıda ROIs ekleyin.
    8. İçinde "Analyze > Set ölçümleri", sadece "Merkezi kütlenin" kontrol edin.
    9. KanalR, ROI Yöneticisi'nde seçin, "merkezleri; elde etmek için ölçüsü" iki sütun karşılık gelen x ve y koordinat ROIs sayılı "Sonuç" penceresinde görüntülenir. Kopyalayın ve iki sütun bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.
    10. 4.1.9 kanalG ve kanalBiçin adımları yineleyin.
    11. Tek bir tablo aşağıdaki sırada merkezlerinde koordinatlarını düzenlemek: xR, yR,Gx, yG,B, x ve yB. Elektronik tablo "beads.csv" ".csv" biçiminde kaydedin. Dosya adında boşluk bırakın.
  2. Seçin ve Golgi mini-yığınlar ölçmek
    1. İki makro ( Ek malzemeleriçinde ekli) ImageJ, "Makro-Golgi ROI muayene" ve "Makro-çıkış 3 kanal veri" eklentileri yüklemek > yüklemek ". Açık ROI Yöneticisi ve sonuç penceresi.
    2. Golgi Mini yığın fotoğraf üç TIFF dosyaları oluşan bir dizi açın (Dosya > Görüntü > açık).
    3. Adımları 4.1.2 - 4.1.5 yineleyin ve üç arka plan düşülen görüntüleri daha sonra kullanmak için kaydedebilirsiniz. Kayıt arka plan SDs kanalR, kanalG ve kanalB SDR, SDG ve SDB, sırasıyla, daha sonra kullanın.
    4. 4.2.3 (Ctrl + SHIFT + D) adımından oluşturulan üç arka plan düşülen görüntüleri yinelenen.
    5. İçinde "işlem > görüntü hesap makinesi", ilk olarak kanalR resimlere kanalG arka plan düşülen ekleyin. Sonuçta elde edilen görüntüyü arka plan düşülen kanalB görüntüsüne ekleyebilirsiniz. Elde edilen görüntüye içinde "görüntü > ayar > eşik", "" 1"olarak"Düşük eşik düzeyi"giriş için Kur" seçeneğini. "Uygula" tuşuna bastıktan sonra siyah beyaz bir ikili görüntü sonuçlandı.
    6. İçinde "Analyze > parçacıklar analiz", giriş için boyut aralığının "boyutu (piksel ^ 2)". "50-sonsuz" girdi. "Kenarlarda dışla" adlı ve "Yöneticisi Ekle". Golgi mini-yığınlar içeren ROIs şimdi ROI Yöneticisi için eklenir.
      Not: Boyut aralığı ampirik olarak genellikle küçük sesler dışlamak için belirlenmelidir.
    7. Üç arka plan düşülen görüntüleri birleştirme (Görüntü > renk > kanalları Birleştir) adım 4.2.3 kanalR kırmızı seçerek,G yeşil olarak kanal ve kanalB mavi olarak. Üç kanal oluşan tek bir bileşik görüntü oluşturulur.
    8. Makroyu çalıştırabilirsiniz "Makro-Golgi ROI muayene" seçerek "Eklentiler > makro-Golgi ROI muayene". Etkileşimli iletişim kutusunda, almak veya reddetmek için her yatırım Getirisi kontrol edin. Tüm üç kanal tek bir nesnede içeren ROIs seçin.
      Not: Bu aracı çalıştırdıktan sonra ROI Yöneticisi'nden reddedilen ROIs ortadan kalkar.
    9. Sadece "Alan", "Ortalama gri değeri" ve "Merkezi kütlenin" iade "Analyze > Set ölçümleri". Makro alet "Makro-çıkış 3 kanal veri" başlatarak verisini almak (Eklentiler > makro-çıkış 3 kanalları veri).
      Not: Alanları, ortalama yoğunluklarda ve merkezlerinin (x ve y) ROIs kanalR, kanalG ve kanalB "Sonuç" penceresinde görüntülenir.
    10. Kopya x ve y koordinatlarını merkezleri bir elektronik tabloya ve onları aşağıdaki sıraya göre düzenleyebilirsiniz: xR, yR,Gx, yG,B, x ve yB. Elektronik bir ".csv" (ministacks.csv) dosyası olarak kaydedin. Dosya adında boşluk bırakın. Kromatik kaymalı düzeltme (Bölüm 4.3) merkezlerinin ve LQ hesaplama (Bölüm 4.4) için devam edin.
  3. Renk-shift düzeltme merkezleri
    1. MATLAB derleyici çalışma zamanı (MCR) yükleyin.
    2. Aşağıdaki dosyalar özel bir çalışma klasöre yükleyin: my_train.exe ve my_test.exe. Kopyala Yapıştır "beads.csv" ve"ministacks.csv" dosyaları aynı klasörde.
    3. "Komut istemi" Windows başlatın ve aşağıdaki komutu yazarak çalışma klasörüne gidin " cd path_of_working_folder".
    4. Merkezleri boncuk kullanarak bir renk kayması kalibrasyon dosyası oluşturma. Aşağıdaki komut "my_train.exe boncuk.csv kalibrasyon.mat 1" yazın. "Kalibrasyon.mat" adlı bir dosya içinde çalışma klasörü oluşturulur. Oluşturulan diğer dosyaları yoksayar.
    5. Kromatik shift-Golgi mini-yığınlar sayılı "my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv kalibrasyon.mat 1" aşağıdaki komutu yazarak düzeltin.
      Not:"corrected_ministacks.csv" adlı bir dosya içinde çalışma klasörü oluşturulur. Kromatik kaymalı sırasına göreG,G,B ve yBx y x düzenlenmiş olan merkezleri, düzeltilmiş koordinatlarını içerir. Oluşturulan diğer dosyaları yoksayar. Kırmızı kanalı olarak tanımlanır not alın ücretsiz renk sapmaları ve bu nedenle xR ve yR ham veri olarak aynıdır.
  4. LQs hesaplanması
    1. Veri analiz yazılımı ve Kopyala ve Yapıştır, başlatmak gri değerler, alanlar, arka plan SDs 4.2.3 adımından elde edilen sıra demek (satır 1 yer onları) ve Kromatik-shift düzeltilmiş x ve y Golgi mini-kanalR yığınlarda koordinatlarını bir çalışma sayfası E. için A sütunları olarak Benzer şekilde, kanalG ve kanalB için karşılık gelen veri sütunları F J ve K o, sırasıyla aktarın.
    2. Sekiz yeni sütunlar P adında "entegre yoğunluğunu kanal R", "Kanal G entegre yoğunluğu", "entegre yoğunluğunu kanal B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) ve LQ W için ekleyin.
      1. İlgili sütunun üst sağ tıklayın ve "Sütun değerleri her sütunun değerleri hesaplamak için ayarla" seçin. Sütun için P, giriş "Col(A)Col(B)"; sütun için Q, giriş "Col(F)Col(G)"; sütun için R, giriş "Col(K)Col(L)"; S sütun için giriş "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" "pixel_size" NM; piksel boyutunu olduğu yerde T sütun için giriş "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; U sütun için giriş "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; V sütun için giriş "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; W sütun için giriş "Col (T) / Col (S)".
    3. Golgi mini yığınlarının girişbölümünde açıklanan üç ölçütlere göre filtre uygulayın.
      1. Veri analiz yazılımı gidin "çalışma sayfası > çalışma sorgu" ve "Eğer" test için sütun değişkenleri seçin. Aşağıdaki diğer adlar I1, I2, I3, atama d1, A ve B için sütunları "entegre yoğunluğunu kanal R", "Kanal G entegre yoğunluğu", "Kanal B entegre yoğunluğu", d1, ABS(tan a) ve ABS (tan b), anılan sıraya göre. İçinde "Eğer koşul" giriş kutusu, "I1 > =30*cell(1,3) ve I2 > =30*cell(1,8) ve I3 > =30*cell(1,13) ve d1 > = 70 ve (A < = 0,3 veya B < 0,3 =)".
      2. "Ayıklamak için yeni çalışma" seçin, "Uygula"'yı tıklatın. Sütun A-W analyzable Golgi mini-yığınlar, yeni bir çalışma sayfasına ayıklanır.
    4. Yeni çalışma sayfasında sağ sütunun W, select üst tıklayın "sütun istatistikleri > Aç iletişim". Onay "N toplam", "Yani", "Demek SE", "Çubuk". LQs istatistiksel analizi sonra görüntülenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bizim laboratuarda kullanılan gibi bir planı apochromatic objektifle donatılmış modern araştırma sınıf ışık mikroskobu çok az renk sapmaları (Şekil 2A) gösterir. Ancak, dikkatli bir muayene çok renkli floresan boncuk görüntünün üst karakter aynı boncuk (Şekil 2B) farklı renk görüntülerin ortaya çıkarabilir. Biz kırmızı kanalı renk sapmaları özgür ve bu nedenle kırmızı Floresans merkezlerinden boncuk doğru pozisyonlar vardır tanımlar. Göreli Kromatik-vardiya yeşil ve far-red floresan yeşil ve mavi vektörel çizimler kırmızı Floresans (Şekil 2C) Merkezi'nden kaynaklanan temsil edilebilir. Kromatik-shift görüntüleme-düzlem içinde ampirik olarak vektör yeşil ve mavi için her boncuk (Şekil 2D) tarafından gösterilmektedir. Bizim mikroskop için renk vardiya büyüklükleri ve vardiya değişim x göre yön olarak düzgün değildir ve y konumlarını. Far-red merkezleri kayması olduğu kadar 50 olabilir gibi Kromatik kaymalı önemli ölçüde ışık doğruluğunu etkileyebilir nm. Bu nedenle Kromatik kaymalı düzeltilmiş olması gerekir. Boncuk merkezlerinden elde sonra kalibre ve daha sonra renk vardiya merkezlerinin düzeltmek için birinci dereceden polinom uygun istihdam. Shift Kromatik aberasyon bu yaklaşım (Şekil 2 D-G) tarafından büyük ölçüde artırıldı.

Memeli hücrelerinde Golgi kompleksi genellikle geleneksel optik mikroskop (şekil 3A) altında çözülebilir değildir perinükleer alanda toplanır. Nocodazole tedavi için 3 saat sonra perinükleer Golgi kompleksi kaybolur ve sitoplazma (şekil 3B) boyunca endoplazmik retikulum çıkış sitelerdeki Golgi mini-yığınlar düzinelerce toplayın. Golgi membran ve toplanan Golgi mini-yığınları büyük boyutta mevcuttur ve analiz için seçilen değil. Golgi mini-yığınlar yelpazesi gösteren bir örnek görüntü şekil 3' teCgösterilir. Mini-yığınlar şekil 3' teDlistelenen 40 seçili Golgi "Makro-Golgi ROI muayene" aracını kullanarak. Üç ölçüt uygulandıktan sonra 21 Golgi mini-yığınlar analyzable ve seçilen hesaplama LQs, TPST1-EGFP (şekil 3D; "L" etiketli), şekil 3'Egösterilen onların istatistikleri ile. Toplamda, 111 analyzable Golgi mini-yığınlar 12 hücrelerden seçildi ve TPST1-EGFP LQ 0,76 0,04 olmak ölçüldü (ortalama ± SEM; n 111 =) (şekil 3F). TPST1-EGFP LQ, giantin arasında konumlandırmaktadır (LQ 0.59 =) ve EGFP-Rab6 (LQ = 1.04)7. GS15 olduğunu (LQ 0.83 =) ve ST6GalT1-AcGFP1 (LQ 0,82 =). Edebiyat nitel yerelleştirme verileri dikkate alınarak alt-Golgi bölgeleri LQs göre tanımlamış olduğunuz: ERES/ERGIC, <-0.25; CIS, 0.00 ± 0,25; medial, 0.50 ± 0,25; Trans-Golgi, 1,00 ± 0,25 ve TGN, 1,25-2.00. TPST1-EGFP LQ, bu nedenle onun transgösterir-bir önceki çalışmada14ile anlaşma olduğunu Golgi yerelleştirme.

Figure 1
Resim 1 . IŞIK hesaplamasında kullanılan değişkenler gösterilen şematik çizimler. (A)xz görünümü Golgi Mini yığınının, GM130, GalT-mCherry ve protein koaksiyel merkezleri vardır x ekseni, eksenel açı, dx ve d1Golgi gösteren Floresans. Golgi Mini yığın onun projeksiyon görüntü düzlem üzerine görüntüdür. (B) xy görünümüyle protein açısı α, β açısı ve projeksiyon Aksiyel gösteren x eksen dışı Merkezi Golgi Mini yığın mesafe dx. A ve B adapte şekil 1E ve şekil 1F bizim önceki yayın7, anılan sıraya göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Kromatik kaymalı düzeltme. (A) üç renkli Birleştirilen görüntüyü 110 nm çok renkli boncuklar geniş alanlı mikroskop tarafından satın aldı. Her boncuk yayar yeşil, kırmızı ve far-red (yapay mavi renkli) floresan. Ölçek bar, 10 µm. (B) büyütülmüş bir birleştirilmiş tek-boncuk resmin görünümünü göze çarpan renk vardiya. Ölçeği 200 bar, nm. Vardiya yeşil ve far-red boncuk görüntülerin vektörel çizimler tarafından kırmızı boncuk görüntü (0,0) Merkezi'nden green (yeşil vektör) ve far-red (mavi vektör) boncuk görüntüler, merkezleri için sırasıyla temsil edilebilir olduğunu gösteren (C) A şematik diyagramı. (D, E) Kromatik kaymalı düzeltme etkisi. Görüntünün aynı alandaki, yeşil ve mavi vektörel çizimler daha önce çizilen ve sonra düzeltme vardiya. Küçük vardiya görselleştirmek için her vektör büyüklüğü 200-fold güçlendirilmiş. (F, G) Dağılım gösteren merkezleri green (yeşil nokta) ve far-red (mavi noktalar) boncuk önce ve sonra üst karakter düzeltme çizer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Burada TPST1-EGFP LQ edinme ışık, tipik bir örneği. Bir HeLa hücre TPST1-EGFP (yeşil) ve GalT-mCherry (kırmızı) ifade lekeli için endojen GM130 (mavi). (A) A tipik hücre. (B, C, D, E) Nocodazole ile tedavi bir hücre görüntüsü (B). Görüntüden analyzable Golgi mini-yığınlar Ciçinde gösterildiği gibi seçildi. Seçili Golgi mini-yığınlar kimlik numaralarıyla etiketlenir. Bu maskeli Golgi mini yığınlarının görüntülerini aşağıda D içinde onların kimlik numaraları ile görüntülenir. "L" Golgi Mini yığın LQ (analyzable Golgi Mini yığınlar) hesaplanması için geçerli olup olmadığını gösterir. 21 mini yığınlarının hücreden LQs histogramını Eiçinde gösterilir. (F) Histogram LQs 111 mini yığınlarının 12 hücrelerden biri. Histogram içinde gösterilen değerdir ortalama ± SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek malzemeler: Makro-Golgi ROI inspection.ijm, makro-çıkış 3 kanalları data.ijm, Matlab kodları, My_train.exe, My_test.exe ve elektronik tablo template.opj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Daha önce yerelleştirme ışık mikroskobu altında Golgi protein ağırlıklı olarak korelasyon veya protein görüntünün Golgi işaret bilinen Yerelleştirme15,16resimle örtüşen tarafından sayılabilir, 17. Elde edilen korelasyon veya örtüşen katsayısı ne kadar yakın test Golgi işaretçisi için dağınık şekilde proteindir yansıtır. Bu yaklaşım için en az üç uyarılar vardır. İlk olarak, korelasyon veya örtüşen katsayısı doğrusal olmayan ve doğrudan kayma mesafesi göstermez. İkinci olarak, korelasyon derecesi eleştirel mikroskobik sisteminin çözünürlüğüne bağlıdır. Bu nedenle, iki Golgi protein arasındaki katsayısını sistemden bağımsız sabit değildir. Üçüncü, iki Golgi protein ile aynı Aksiyel yerelleştirme ama cisternae boyunca farklı yanal dağıtım farklı katsayıları sahip olabilir. Bu nedenle, korelasyon veya örtüşen katsayısı Golgi protein Aksiyel yerelleştirme göstermez. Dejgaard ve diğerleritarafından önerilen alternatif bir yöntem olarak., CIS, trans-Golgi işaretleri ve faiz protein üçlü etiketli nocodazole tedavi Golgi mini-yığınlar, ışık için benzer. Her Golgi Mini yığını içinde üç en fazla yoğunluk piksel pozisyonlar iktisap ve test protein göreli konumunu bir mesafe oranı18hesaplanır. Ancak, bu yöntem uygulama büyük ölçüde sınırlar alt piksel çözünürlük elde değiştiremiyor. Önceki Nicel Metodlar, ışık, bağımsız olarak geliştirilmiştir ancak Dejgaard ve ark' e benzer bir kavram ayılar karşılaştırıldığında., eksenel yerelleştirme Golgi protein benzeri görülmemiş doğruluğu ve tutarlılığı ile ölçmek yapabiliyor.

Biz ışık LQ exogenously ifade GFP öğesini protein - TPST1-EGFP elde etmek için protokol sundu. Onun antikor varsa endojen protein LQ belirlenebilir. Birincil antikor, fare veya tavşan sonra bir tavşan veya fare anti-GM130 antikor tür bağlı olarak sırasıyla üçlü etiketleme iletişim kuralında kullanabilirsiniz. Ayirt etiketleme için tavşan ve fare anti-GM130 antikorları ticari olarak kullanılabilir. Biz daha önce tavşan ve fare anti-GM130 antikorları ışık7' aynı sonuçlar verdiğini göstermiştir. Test protein özünde mCherry füzyon, GFP öğesini Golgi marker protein GM130 antikor etiketleme ile birlikte bilinen LQ ile üçlü etiketli hücreleri için kullanılan ve dolaylı olarak LQ testi protein anlamak gibi floresan emisyon kırmızı ise. Marker protein varsayarak LQ LQm , işaretleyici protein Merkezi'nden Uzaklik GM130 olan dm, LQ testi protein x (dx/dm) × LQmhesaplanabilir. Süper çözünürlük mikroskobu ile karşılaştırıldığında ışık en büyük avantajlarından biri bunu kolayca canlı hücre görüntülemede geleneksel mikroskobik kurulumları için uygulanabilir olduğunu. Biz-si olmak güvenilir üç Floresans proteinler, GFP-Golgin84, mCherry-GM130 ve GalT-iRFP670, bir arada dinamik olarak LQ, GFP-Golgin84 tek Golgi mini-yığınlar7izlemek için.

IŞIK, sonrası edinme analiz, özellikle analyzable Golgi mini-yığınlar yelpazesi en zaman alıcı bir adımdır. Golgi mini-yığınlar her iki boyutu ve moleküler kompozisyonu19heterojen olduğundan, Golgi mini-yığınlar türdeş olmayan mimarisi veya bizim hesaplanması belirsizlik LQs (şekil 3F) dağıtımını temsil ediyorsa belli değil LQ. Nedenleri ne olursa olsun bulduk n küçükken hangi tehlikeye analyzable Golgi mini-LQ doğruluğunu sağlamak için yığınları (n) çok sayıda sahip olmak önemlidir. Tipik olarak, veri n ≥ 100 üzerinden birden çok hücre ile güvenilir LQs verir. Bu nedenle, ışık yerelleştirme topluluğu ortalama veri, Golgi mini-yığınlar bireysellik engellemeyecek verir. Başka bir ışık tüm Golgi proteinler tek bir merkezi etrafında dar bir dağıtım olduğunu varsayar kısıtlamasıdır. COPI alt birimleri, ARF1 ve çözünür N ethylmaleimide duyarlı faktör ek protein reseptörü (tuzaklarına)20,21, gibi bazı Golgi proteinler CIS transiçin geniş dağıtmak rapor- Golgi ve TGN. Muhtemelen onların Golgi yerelleştirme LQ tarafından eğitim uygun değil. IŞIK şu anda Golgi mini yığınlarının hem zahmetli hem de öznel olan el ile seçimi içerir ışık gelecekteki gelişimini Golgi mini-yığınları ile çok az insan müdahale otomatik olarak seçmek için bir yazılım aracı uygulamak olacaktır.

IŞIK Uzaysal çözünürlük nedir? LQ unitless, bir oranı bu yana kayma bir mesafe anlamına gelmez. Burada, çok kaba bir tahmin vermek girişimi. IŞIK Uzaysal çözünürlük iki çözülebilir Golgi protein arasındaki en küçük Aksiyel mesafe olarak tanımlanabilir. LQs çeşitli Golgi proteinler7inceleyerek, SEM çevresinde 0,03 n ≥ 100 aralığı ile veri kümeleri bulduk. Varsayarsak iki Golgi protein aynı n = 100 ve SEM 0.03, protein var önemli farklı yerelleştirme tarafından iki Golgi = t-Testi (p < 0,05), Yani, çözülebilir, onların LQs arasındaki farkı ≥ 3 × SEM ise 0,09 =. EM verilerden de GM130 GalT-mCherry ışık içinde mesafedir, Golgi Mini yığın Aksiyel uzunluğu olduğunu tahmin edebilirsiniz ~ 300 nm8. Bu nedenle, ışık çözünürlüğe 0,09 × 300 = 30 olarak tahmin nm Golgi eksen boyunca. IŞIK, daha büyük bir n genellikle sırayla daha yüksek çözünürlükte sonuç daha küçük SEM verir.

İkinci tekniği doğrudan nicel yerelleştirme veri yol değil bu yana doğrudan ışık çözünürlük IMMUNO-altın EM olan için karşılaştırmak muhtemelen uygun değil. Benzer şekilde ışık, Golgi eksen boyunca IMMUNO-altın EM çözünürlüğü iki çözülebilir Golgi işaretçileri arasındaki en küçük mesafe olarak tanımlanabilir. Çözünürlüğü ölçmek için çift-IMMUNO-altın Golgi ekseni boyunca birbirine yakından bitişik iki Golgi protein etiketlerine göre çalışma gerektirir. Sistemik böyle çalışma bizim bilgimize göre muhtemelen kullanılamaz. Giriş bölümünde açıklandığı gibi IMMUNO-altın EM ile mekansal çözünürlükte sınırlayan faktörler daha kötü olamaz Çözünürlük yapar antikor kompleksi, büyük boy biridir ~ 20 nm. Başka bir önemli sınırlayıcı faktör görüntü çözünürlüğü antijen moleküllerin etiketleme yoğunluğudur. Nyquist örnekleme teoriye göre en az iki altın parçacıkları çözünürlük birim başına olmalı. Çoğu IMMUNO-altın EM çalışmalarda, komşu altın parçacıkları arasındaki mesafeleri değil < 15 nm nedeniyle çok düşük verimlilik etiketleme; Bu zor bir görüntü çözünürlüğü daha az 30 elde etmek bu tekniği için yapar nm. Bu açıdan, ışık çözünürlüğü en az IMMUNO-altın EM karşılaştırılabilir olduğunu tahmin ediyoruz.

IŞIK son derece tutarlı sonuçlar veren sağlam bir yöntemdir. Mikroskop kullanılan tür bağımsızdır. Aynı sonuç vermedi o geniş alanlı ve iplik disk confocal mikroskoplar test ettik. LQs deneyler farklı toplu işlemleri satın aynı Golgi proteinlerin de birbirleri ile iyi anlaşma vardı. Golgi farklı aralığı ikamet proteinlerin oluşan bir LQ veritabanı karşılaştırma ve yorumu için oluşturuldu. Biz daha fazla ışık araştırma topluluk kullanımını önemli ölçüde veritabanı genişletin bekliyoruz. Sonuç olarak, kantitatif açıklayan çok sayıda Golgi proteinler yerelleştirilmesini daha eksiksiz bir veritabanı büyük organizasyon ve işlev Golgi kompleksi anlamada yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Ö Stephens (University of Bristol, Bristol, İngiltere) TPST1-EGFP DNA plazmid yanı sıra için Lakshmi Narasimhan Govindarajan yazılım optimizasyonu ile yardımcı olduğunuz için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser L.L. Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (NMRC/CBRG/007/2012), Milli Eğitim Bakanlığı (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 ve RG132/15 ve AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) hibe tarafından desteklenmiştir

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (11), 005215 (2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. (2014).
  4. De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (4), 273-284 (2008).
  5. Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20, (15), 3471-3480 (2009).
  6. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, (2), 165-175 (2010).
  7. Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27, (5), 848-861 (2016).
  8. Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6, (11), 1071-1081 (2004).
  9. Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7, (4), 631-650 (1996).
  10. Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99, (3), 1101-1109 (1984).
  11. Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60, (2), 217-227 (1993).
  12. Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).
  13. Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93, (1), 223-229 (1982).
  14. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105, (6), Pt 1 2655-2664 (1987).
  15. Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168, (7), 1039-1051 (2005).
  16. Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
  17. Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13, (1), 119-133 (2002).
  18. Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55, (7), 709-719 (2007).
  19. Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129, (17), 3238-3250 (2016).
  20. Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15, (4), 1506-1518 (2004).
  21. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (11), 005231 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics