Localização de quantitativa de uma proteína de Golgi por imagem sua massa centro de fluorescência

Biology

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Summary

A localização exacta dos residentes de Golgi é essencial para a compreensão de Golgi a funções celulares. No entanto, a microscopia óptica convencional é incapaz de resolver a estrutura sub-Golgi. Aqui descrevemos o protocolo para um método de super-resolução microscopia convencional baseado determinar quantitativamente a localização sub-Golgi de uma proteína.

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Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

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Abstract

O complexo de Golgi consiste de pequenos membrana empilhados em série que podem ser classificados ainda mais em regiões sub-Golgi, incluindo o cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi e trans-rede de Golgi. Funções celulares do Golgi são determinadas pela distribuição característica de suas proteínas residentes. A resolução espacial de microscopia de luz convencional é demasiado baixa para resolver pequenos ou sub-Golgi estrutura. Assim, a microscopia eletrônica de imuno-ouro é um método de escolha para localizar uma proteína ao nível sub-Golgi. No entanto, o instrumento e a técnica estão além da capacidade da maioria dos laboratórios de biologia celular. Descrevemos aqui nosso método recentemente desenvolvido Super-resolução chamado a localização da proteína de Golgi por imagem centros de massa (GLIM) sistematicamente e quantitativamente localizar uma proteína de Golgi. GLIM baseia-se na rotulagem protocolos padrão de fluorescência e campo amplo convencional ou microscópios confocal. Envolve a calibração de aberração cromática-mudança do sistema microscópico, a aquisição de imagens e a análise de pós aquisição. A localização de sub-Golgi de uma proteína de teste é expressa quantitativamente como o quociente de localização. Existem quatro principais vantagens de GLIM; é rápida, com base em métodos convencionais e ferramentas, o resultado de localização é quantitativo e que proporciona ~ 30 resolução de nm prático ao longo do eixo de Golgi. Aqui descrevemos o protocolo detalhado de GLIM localizar um teste de proteína de Golgi.

Introduction

O complexo de Golgi desempenha funções essenciais no tráfico endocítica/secretoras de proteínas e lipídios (doravante cargas) em células de mamíferos1,2,3. No Golgi, cargas não são apenas classificadas para vários compartimentos celulares sub mas também modificadas por diversos tipos de glicosilação. O complexo de Golgi dos mamíferos compreende várias pilhas de Golgi lateralmente ligadas, que normalmente consiste de sacos de membrana firmemente adjacentes e plana de 4-11 chamados pequenos. Os pequenos de Golgi empilhados em série são mais categorizados, de um lado para o outro, como cis, medial e trans-pequenos. Para o trans-lado de uma pilha de Golgi, o trans-sac de membrana mais se desenvolve em uma rede de membrana tubular e retículo chamada trans-Golgi rede (TGN)4. Na via secretora, cargas derivadas do retículo endoplasmático (ER) Insira uma pilha de Golgi em seus cis-lado e em seguida sequencialmente passar medial e trans-pequenos. Cargas eventualmente sair do Golgi na trans-Golgi ou TGN destining à membrana plasmática, endossomos ou grânulos secretórios.

Os mecanismos moleculares e celulares de como cargas de trânsito uma pilha de Golgi e como o Golgi mantém sua organização cisternal permaneçam misteriosos e atualmente ainda estão sob um acalorado debate1. Uma das dificuldades neste campo é que pequenos de Golgi só podem ser resolvidos sob a microscopia de elétron (EM), desde a resolução do microscópio óptico (~ 200 nm) é insuficiente para resolver pequenos individuais de Golgi (< 100 nm em ambos espessura cisternal e a distância). Portanto, a localização de sub-Golgi das proteínas residentes e cargas em trânsito são convencionalmente determinado pelo EM imuno-ouro. No entanto, o EM imuno-ouro é tecnicamente muito exigente e está além da capacidade da maioria dos laboratórios de biologia celular. Embora a resolução da EM pode ser sub nanômetros, a resolução proporcionada pelo imuno-ouro EM grandemente é dificultada pelo tamanho do complexo anticorpo (primária mais anticorpo secundário) e a partícula de ouro e pode ser pior que 20 nm. Além disso, EM imagens são obtidas a partir 2D-cortes finos em vez de uma vista global 3D do Golgi, que pode resultar em conclusões errôneas dependendo da posição relativa e orientação do 2D seção5. Por exemplo, estudar uma única EM-seção é incapaz de confiantemente diferenciar uma vesícula do vista ortogonal de um túbulo desde que ambos podem exibir perfis idênticos membrana redondo. O recente advento de técnicas de microscopia de super-resolução, tais como a microscopia de iluminação 3D-estruturado (3D-SIM), estimulou a depleção de emissão (STED), microscopia de localização fotoativados (PALM) e reconstrução óptica estocástico microscopia ( TEMPESTADE), torna possível resolver estruturas sub-Golgi sob microscópios de luz6. No entanto, existem pelo menos quatro inconvenientes que podem limitar significativamente seus usos no estudo biológico celular do Golgi. 1) atual Super-resolução técnicas exigem a configuração de hardware caro e especial, que está além da maioria dos laboratórios de biologia celular. 2) protocolos de etiquetagem de fluorescência especiais são necessárias para algumas técnicas de super-resolução. 3) embora, nas melhores condições, estas técnicas afirmam 20-110 nm na resolução espacial, resolução prática obtida em amostras reais pode ser muito pior. 4) em comparação com a microscopia convencional, essas técnicas de super-resolução ainda tem dificuldades em realizar multicoloridas, 3D ou vivem a célula de imagem, isoladamente ou em combinação. Provavelmente o mais importante, tanto EM imuno-ouro e as técnicas de microscopia de super-resolução rendem qualitativo em vez de dados quantitativos de localização.

Tentar resolver parcialmente os problemas mencionados acima, recentemente desenvolvemos um método de microscopia de luz convencional com base, que é chamado a localização da proteína de Golgi por imagem centros de massa (GLIM), sistematicamente e quantitativamente localizar um Golgi proteína em uma resolução equivalente do imuno-ouro EM7. Neste método, o Golgi em células de mamíferos cultivadas é dispersado como minipilhas de Golgi pelo tratamento de nocodazole, uma droga depolymerizing de microtúbulos. Extensos estudos têm demonstrado que induzida por nocodazole Golgi minipilhas (doravante Golgi mini-stacks) assemelham a pilhas de Golgi nativas em organização e funções celulares8,9,10, 11. O quociente de localização (LQ) de uma proteína de teste pode ser adquirido através de GLIM e denota a localização sub-Golgi quantitativa. Os valores numéricos de QI pode ser comparados e um banco de dados do QI de mais de 25 marcadores de Golgi está disponível.

Em GLIM, minipilhas de Golgi são triplo-etiquetados por GM130 expressa forma exógena ou endógena, GalT-mCherry e a proteína de teste (x). GM130 e mCherry-GalT, cis- e trans-marcadores de Golgi12,13, fornecem, respectivamente, pontos de referência. A fluorescência tripla, vermelha (R), verde (G) e far-red (B), artificialmente são exibidos como vermelho, verde e azul, respectivamente. Centro de massa da fluorescência (doravante centro) é adotado para alcançar sub pixels de resolução. O eixo de Golgi é definido como o vetor do centro de GM130 ao de GalT-mCherry. Pilha mini de Golgi é modelada como uma estrutura cilíndrica com simetria de rotação infinita em torno do eixo de Golgi. Portanto, uma pilha mini de Golgi pode ser ainda mais modelada como uma estrutura unidimensional ao longo do eixo de Golgi. O QI da proteína teste x é definido como dx/d1, em que dx é a distância do centro da x ao de GM130, enquanto d1 é a distância do centro de GalT-mCherry ao de GM130. Se o centro do x está fora do eixo, sua distância de projeção axial é usada para o cálculo. As variáveis, incluindo Golgi eixo, ângulo axial, dx, d1, ângulo α e β ângulo, para GLIM são ilustradas esquematicamente na Figura 1. LQ é independente do ângulo axial Golgi embora minipilhas de Golgi orientam-se aleatoriamente em uma célula.

Minipilhas de Golgi aparecem não homogênea em imagens. Desenvolvemos três critérios para selecionar o minipilhas de Golgi analisáveis para GLIM. 1) o critério da relação sinal-ruído, em que a relação da intensidade total de uma pilha de Golgi mini para o desvio padrão (SD) do plano de fundo é ≥ 30 em cada canal. Este critério é garantir a exatidão de posicionamento do centro de massa, que varia de acordo com os rácios de sinal-ruído de minipilhas de Golgi. 2) o critério ângulo ou distância axial, que exige d1≥ 70 nm. d1 diminui com o aumento do ângulo axial de Golgi. Quando o ângulo axial se aproxima de 90° ou vertical, a mini pilha torna-se não puder ser resolvido como d1 aproxima-se 0. d1≥ 70 nm pode excluir efetivamente perto de minipilhas de Golgi verticais. 3) o critério de co-linearidade, em que | tan α | ou | tan β | é ≤ 0.3. Este critério garante que os três centros de um mini pilha são suficientemente co-linear para nosso modelo unidimensional de pilha mini de Golgi. Todos os microscópios de luz sofrem de aberração cromática que pode seriamente distorcem a posição relativa dos centros de fluorescência vermelha, verde e far-red. A aberração cromática de sistemas microscópio experimentalmente é calibrada por imagem 110 grânulos nm, que são triplo-etiquetados por fluorescência vermelha, verde e far-red. Para cada imagem do grânulo, o centro de vermelho é definido como a verdadeira posição do cordão de e cromático-turnos de verdes e far-red centros estão equipados por funções polinomiais de primeira ordem. Centros de minipilhas de Golgi estão sujeitos às funções polinomiais para corrigir os turnos-cromática nos canais verdes e far-red.

Através de GLIM nós pode alcançar uma resolução de ~ 30 nm ao longo do eixo de Golgi sob condições normais. Importante, ele fornece um método sistemático para quantitativamente, mapear qualquer proteína de Golgi. GLIM pode ser executada por microscópios convencionais, tais como campo amplo ou microscópios confocal, usando protocolos de etiquetagem de fluorescência comuns. A imagem e processamento de dados podem levar tão curtos quanto uma hora. Através de GLIM, diretamente demonstrámos a transição progressiva da carga secretora de cis- Trans-lado do Golgi7.

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Protocol

Nota: Abaixo está um passo a passo protocolo de GLIM para determinar a tyrosylprotein marcadas LQ de EGFP sulfotransferase 1 (TPST1), uma enzima residente de Golgi, em células HeLa.

1. preparação de pilhas de Golgi fluorescência-etiquetada Mini

  1. Preparar as lamelas de vidro
    1. Médio (DMEM do alíquota 0,3 mL estéril Dulbecco modificado águia) para um bem de uma placa de 24 em um capuz de cultura de tecidos.
    2. Limpe um pedaço da lamela de vidro do No.1.5 12 mm Φ usando papel de tecido macio dabbed com etanol a 70% para remover os resíduos na superfície da lamela de vidro. Use um par de Pinças afiadas para brevemente embeber a lamela em etanol a 70%, transferi-lo para a placa de 24 e afundá-lo no fundo do DMEM estéril contendo bem.
      Nota: As lamelas de vidro convencionalmente são esterilizadas por flamejante. No entanto, as lamelas sob tal tratamento facilmente crack durante manipulação posteriormente. imersão de etanol 70% é eficaz na esterilização as lamelas de vidro sem danificá-los.
    3. Com a tampa coberta, deixe a placa de 24 a 37 ° c CO2 incubadora até o uso.
  2. Células de semente
    1. Cultura HeLa células (daqui por diante) em um frasco de T-25 em DMEM suplementado com 10% Fetal bovino soro (FBS) (doravante completo médio) numa incubadora 37 ° C CO2 fornecido com 5% de CO2. Os antibióticos não são necessários aqui.
    2. Quando atingem células ~ 80% confluência, Aspire o meio de cultura. Adicionar 1 mL de 0,25% Trypsin-EDTA para o balão e incube as celulas em uma incubadora de 37 ° C CO2 por 2 min. adicionar 1 mL de meio completo para o frasco e lave delicadamente as células da parede do balão pipetando.
    3. Transferi células destacadas para um tubo de centrifugação estéril e girar a 500 x g por 2 min para as células de Pelotas. Aspirar o sobrenadante e suspender o centrifugado em 1 mL de meio completo.
    4. Aspire o meio no poço da placa de 24 contendo a lamela de vidro esterilizado e semente ~ 1 x 105 células no poço. Completar o volume do poço com meio completo a 0,5 mL. Incube numa incubadora 37 ° C CO2 fornecida com 5% de CO2. Cultura de células para ~ confluência de 80%.
  3. Transfect células
    Nota: Células bem-distribuídos são vantajosas para minipilhas de Golgi dispersos de imagem.
    1. Transfect ~ 80% confluentes com 80 ng GalT-mCherry7 e 320 ng TPST1-EGFP plasmídeos de DNA (ver Tabela de materiais) usando um reagente de Transfeccao de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Incube em uma incubadora de 37 ° C CO2 . Mude o meio após incubação de 4-6 h. As células estão prontas ~ 12 h depois.
  4. Tratamento de Nocodazole para gerar pilhas de Golgi mini
    1. Prepare uma solução stock de nocodazole (33mm) dissolvendo-se 10 mg de pó de nocodazole em Dimetilsulfóxido 1ml. Alíquota da solução estoque e loja a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.
    2. Dilua 1 µ l de solução-mãe de nocodazole (33mm) médio completo 37 ° C e 1 mL (concentração final 33 µM). Centrifugar a velocidade máxima para remover partículas em suspensão.
    3. Aspire o meio no poço e adicionar 0,5 mL de 33 nocodazole µM, contendo meio completo. Incube as células em uma incubadora de 37 ° C CO2 por 3 h. proceder à imunofluorescência rotulagem (seção 1.5).
  5. Rotulagem de imunofluorescência
    Nota: Manter as células no escuro para evitar fotobranqueamento de GalT-mCherry e TPST1-EGFP.
    1. Preparar os reagentes para a rotulagem de imunofluorescência
      1. Para preparar a solução de paraformaldeído 4%, dissolver o pó de paraformaldeído 4% (p/v) em quente 1 X salina tamponada fosfato (PBS) e filtrar a solução através de filtro de 0,45 µm. A solução pode ser armazenada a-20 ° C.
        Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico e cancerígeno e pode causar irritação da pele. Use o equipamento de protecção adequado (EPI).
      2. Para preparar o tampão de diluição de fluorescência (FDB), misture 5% (v/v) FBS e 2% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) em PBS 1x. Filtrar a solução através de filtro de 0,45 µm e armazenar a solução a-20 ° C.
      3. Dissolva 5,35 g NH4Cl pó em 1 L de água para preparar 100 mM NH4Cl e armazenar a solução à temperatura ambiente.
      4. Dissolver o pó de saponina de 10% (p/v) em água para preparar 10% saponina, alíquota e armazenar a solução a-20 ° C.
    2. Fixação
      1. Lave uma vez bem com 0,5 mL 1 x solução de PBS e adicionar 0,5 mL de solução de paraformaldeído 4%. Incube durante 20 min à temperatura ambiente. Lave o bem duas vezes com PBS 1x de 0,5 mL e duas vezes com 0,5 mL 100mm NH4CL Rinse poço duas vezes com 0,5 mL 1X PBS. As células podem ser mantidas em 1X PBS a 4 ° C durante a noite, no escuro.
    3. Rotulagem de fluorescência
      1. Diluir 1 µ l do mouse anti-GM130 anticorpo primário em saponina de 0.1% contendo 500 µ l FDB. Reverter a tampa da placa de 24 poços e aplique a mistura de anticorpo primário 10 µ l para a tampa.
      2. Use um par de Pinças afiadas para extrair e transferir a lamela de vidro sobre a gota de anticorpo mistura garantindo que o lado de célula está em contato com a mistura. Incube as células com a mistura de anticorpo primário por 1h à temperatura ambiente.
        Nota: A tampa com a lamela pode ser colocada em um saco plástico umidificado no escuro.
      3. Usar um par de Pinças afiadas para extrair e transferir a lamela para o poço com o lado da célula acima e enxaguá-lo em 0,5 mL 1X PBS para três vezes em ≥ 30 min. agita é desnecessária.
      4. Dilua 1 µ l fluoróforo far-red cabra conjugado anti-mouse IgG (anticorpo secundário) em saponina de 0.1% contendo 500 µ l FDB.
      5. Lave e limpe a superfície reversa da tampa da placa de 24 poços. Aplica a mistura de far-red anticorpo secundário 10 µ l para a tampa. Repita os passos de 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. Montagem
      1. Preparar o meio de montagem pela mistura de glicerol 1 g, poly(vinyl alcohol) 2,2 g (MW ~ Da 31.000), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) e 8,8 mL H2O. dissolver a mistura em um banho de água de 60 ° C com ocasionalmente num Vortex. Armazenar a solução a-20 ° C.
      2. Descongelar o meio de montagem e transferência de 10 µ l de uma lâmina de vidro. Sobreposição de lamela (lado da célula para baixo) para a gota de meio de montagem. Incube a 37 ° C por 30 min ou temperatura ambiente durante 1 h endurecer o meio de montagem a lâmina de vidro. Selar a lamínula com esmalte incolor e armazenar a lâmina de vidro a-20 ° C.

2. preparação dos grânulos fluorescentes para correção cromática-turno

  1. Lamela limpeza
    1. Cuidadosamente coloque um pedaço de 25 mm No.1.5 lamela de vidro em uma cremalheira plástica.
    2. O rack com a lamela de transferência para um copo de 400 mL cheio de 300 mL, 1 M de NaOH e proceda à sonicação em um sonicador de banho (35 Watts) por 15 min. brevemente enxaguar o rack em um copo de 400 mL cheio de 300 mL de água desionizada. Transferir o rack para um copo de 400 mL cheio de 300 mL 99% de etanol e proceda à sonicação no sonicador de banho durante 15 min. brevemente enxaguar o rack em um copo de 400 mL cheio de 300 mL de água desionizada.
    3. Repita a etapa 2.1.2 mais duas vezes.
    4. Enxágue o rack com a lamela em 300 mL de água desionizada num copo de 400 mL por 10 min. repetir o passo mais duas vezes. Transferir o rack para um forno de 60 ° C e secar a lamela para h. 1 loja a lamela secada em um prato de Petri livre de poeira.
  2. Imobilização dos grânulos fluorescentes no sentido do lamela de vidro
    1. Dilua 110 nm multi cor fluorescente grânulos em 80-fold 1 x PBS contendo 0,1 µ g / µ l BSA. Brevemente o vórtice do tubo para dispersar os agregados do grânulo. Espalhar 60 grânulos µ l diluída no sentido do Φ limpo 25mm No.1.5 vidro lamela (ver secção 2.1) utilizando uma pipeta de ponta. Secar a lamela num exsicador ligado a uma bomba de vácuo no escuro e montar a lamela numa lâmina de vidro no meio de montagem 50 µ l (consulte a etapa 1.5.4.2).

3. aquisição de imagem

Nota: GLIM requer imagens de alta relação sinal-ruído (SNR) para cálculo do centro de massa de alta precisão. A imagem pode ser adquirida por microscópios convencionais, tais como o exploração do laser confocal, microscópio confocal ou campo amplo de disco girando. Um microscópio de campo amplo, equipado com lentes de objetivas plano-apocromático e um sensor de imagem de baixo ruído, como um dispositivo de carga acoplada (CCD) e científico complementares de óxido metálico semicondutor (sCMOS) pode ser usado. Parâmetros para o sensor de imagem são ajustados para garantir uma gama dinâmica de leitura-ruído e alta baixa. O microscópio deve estar equipado com a configuração ideal dos filtros de fluorescência para verde, mCherry e far-red fluoróforo, e deve ter conversas cruzadas-fluorescência insignificante. Idealmente, o sistema da imagem latente atinge uma taxa de amostragem de Nyquist no x, eixo y e z, que normalmente requer o x, y e z de tamanho de um voxel para ser menos de 100, 100 e 200 nm, respectivamente. O x e y tamanho de voxel de sempre são igual e são referidos como pixel_size. O pixel_size pode ser calculado dividindo o tamanho do sensor de câmera pela ampliação do sistema.

  1. Grânulos de cores multi imagem
    1. Grânulos de cores multi imagem nos canais verdes, vermelhos e far-red no início e no final de cada sessão de imagens.
      Nota: Aqui, imagens foram adquiridas através de um microscópio convencional campo amplo epi-fluorescência (invertido) equipado com 100 X at 1.4 plano-apocromático objetivo, palco motorizado, fonte de luz de metal haleto de 200 watts e câmera de 16 bits sCMOS. Os comprimentos de onda de excitação filtro (passa-banda), espelho dicroico (passe longo) e filtro de emissão (passa-banda) do cubo filtro canal verde são 465-495, 505 e 515-555 nm; para o cubo do filtro de canal vermelho são 528-553, 565 e 578-633 nm; e são para o cubo do filtro de canal far-red 590-650, 660 e 663-738 nm. Durante a aquisição, o tamanho de um voxel ao longo do x, y e z axis é 64, 64 e 200 nm, respectivamente.
    2. Encontre um campo de visão com densidade de bom do grânulo.
    3. Adquira pilhas de imagem 3D em verdes, vermelhos e far-red canais (canalG, canalR, canalB, respectivamente). Tome 3 seções acima e abaixo o melhor plano focal (7 seções por pilha). Salve as três pilhas como três arquivos TIFF.
      Nota: O tempo de exposição para cada canal é determinado empiricamente para maximizar a gama dinâmica, evitar saturação de pixel e minimizar fotobranqueamento. Outros parâmetros, tais como filtros e o x, y e z tamanho do voxel, são escolhidos, como discutido acima.
  2. Minipilhas de Golgi imagem
    1. Uso TPST1-EGFP e GalT-mCherry transfectadas e fluorescente etiquetado slides (seção 1.5) para encontrar as células que expressa TPST1-EGFP e um nível médio ou baixo de GalT-mCherry. Adquira pilhas de imagem 3D, conforme descrito na etapa 3.1.3.

4. análise de imagens

  1. Adquirir centros de grânulos fluorescentes
    1. No ImageJ, abrir um conjunto de imagens de grânulo, consistindo de três arquivos TIFF (arquivo > imagem > abrir).
    2. Média de 3 seções consecutivas em torno de seu melhor focado no canalR por imagem > pilhas > projeto Z. O número de seção de "Fatia de início" e "Stop fatia" de entrada e entre as opções de "tipo de projeção", selecione "Intensidade média".
    3. Desenhe as regiões de interesse (ROIs) que contêm sem grânulos na imagem usando "Seleções polígono". Em "Analyze > conjunto de medições", olha só o "Valor médio cinza" e o "Desvio padrão". Em seguida, executar "Analyze > medida" para obter a média e o SD do ROI.
    4. Calcular a intensidade de fundo como "médio + 6 × SD". Subtrair a imagem com os valores de intensidade de fundo correspondente por "processo > matemática > Subtract", o valor de intensidade de fundo correspondente a este canal de entrada.
    5. Repita etapas 4.1.2 para 4.1.4 para canalG e pilhas de imagem de canaisB usando o mesmo iniciar e parar a fatia e o mesmo fundo ROI. Observe que o ROI usado na etapa 4.1.3 pode ser copiado para o canalG e imagens do canalB .
    6. Mesclar as imagens de fundo-subtraídos três (imagem > cor > Mesclar canais), selecionando o canalR como vermelho,G como verde do canal e canalB como azul. Uma única imagem composta consistindo de três canais será obtida.
    7. Inicie o Gerenciador de ROI (Analyze > Ferramentas > Gerenciador de ROI). Desenhe um quadrado ROI em torno de grânulos único, garantindo que não há apenas uma pérola dentro de cada ROI. Adicione o ROI para Gerenciador de ROI pressionando "t" do teclado. Repita esse processo e adicionar ROIs tantos quanto possível.
    8. Em "Analyze > conjunto de medições", verificar apenas "centro de massa".
    9. Selecione o canalR, no ROI Manager, clique em "Medir" para obter os centros; duas colunas correspondentes para x e y coordenadas dos centros de ROIs serão exibida na janela de "Resultado". Copie e cole as duas colunas em uma planilha.
    10. Repita a etapa 4.1.9 para canalG e canalB.
    11. Organizar as coordenadas dos centros em uma única planilha na seguinte ordem: xR, y,R, xG, y,G, x,Be yB. Salve a planilha no formato "CSV" como "beads.csv". Deixe nenhum espaço no nome do arquivo.
  2. Selecione e medir minipilhas de Golgi
    1. Instalar duas macros (anexadas em Materiais suplementares) em ImageJ, "Inspeção de Macro-Golgi ROI" e "Dados de 3 canais de saída-Macro" por Plugins > instalar ". Clara ROI manager e janela de resultado.
    2. Abrir um conjunto de imagens de mini pilha de Golgi composto por três arquivos TIFF (arquivo > imagem > abrir).
    3. Repita as etapas 4.1.2 - 4.1.5 e salvar as imagens de fundo-subtraídos três para uso posterior. Recorde o fundo SDs para canalR, canalG e canalB como SDR, SDG e SDB, respectivamente, para mais tarde usar.
    4. Duplica as três imagens subtraídas de fundo geradas da etapa 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
    5. No "processo > Calculadora de imagem", primeiro adicionar o plano de fundo-subtraído do canalG para imagens canalR . Adicione a imagem resultante para a imagem de fundo-subtraído o canalB . A imagem resultante, em "imagem > ajustar > limiar", selecione "definir" a entrada "1" como "Nível de limiar mais baixo". Depois de pressionar "Aplicar", uma preto e branca imagem binária é resultou.
    6. Em "Analyze > analisar partículas", o intervalo de tamanho de entrada "tamanho (pixel ^ 2)". Entrada "50-infinito". Verifique "Exclui nas bordas" e "Adicionar ao Gerenciador". ROIs contendo pilhas de Golgi mini agora são adicionados ao Gerenciador de ROI.
      Nota: A escala do tamanho deve ser determinada empiricamente a excluir os ruídos que são geralmente pequenos.
    7. Mesclar as imagens de fundo-subtraídos três (imagem > cor > Mesclar canais) da etapa 4.2.3 selecionando o canalR como vermelho,G como verde do canal e canalB como azul. É gerada uma imagem composta única, consistindo de três canais.
    8. Executar a macro "Inspeção de Macro-Golgi ROI", selecionando "Plugins > inspeção Macro-Golgi ROI". Na caixa de diálogo interativo, inspecione visualmente cada ROI para manter ou rejeitá-lo. Selecione ROIs que contêm um único objeto em todos os três canais.
      Nota: Depois de executar essa ferramenta, ROIs rejeitados são eliminados do gerente do ROI.
    9. Verificar apenas "Área", "Valor de cinza médio" e "Centro de massa" "Analyze > conjunto de medições". Aquisição de dados com a ferramenta macro "Dados de 3 canais de Macrosaída" de (Plugins > Macrosaída 3 canais de dados).
      Nota: Áreas, médios intensidades e centros (x e y) de ROIs em canalR, canalG e canalB são exibidos na janela de "Resultado".
    10. Cópia x e y coordenadas dos centros em uma planilha e organizá-los na seguinte ordem: xR, y,R, xG, y,G, x,Be yB. Salve a planilha como um arquivo "CSV" (ministacks. csv). Deixe nenhum espaço no nome do arquivo. Proceda à correção cromática-deslocamento dos centros (seção 4.3) e cálculo de QI (seção 4.4).
  3. Correção cromática-deslocamento dos centros
    1. Instale o Runtime de compilador Matlab (MCR).
    2. Instalar os seguintes arquivos em uma pasta de trabalho dedicado: my_train.exe e my_test.exe. Copiar e colar "beads.csv" e"ministacks. csv" arquivos na mesma pasta.
    3. Inicie o "Prompt de comando" do Windows e vá para a pasta de trabalho, digitando o seguinte comando " cd path_of_working_folder".
    4. Gere um arquivo de calibração cromática-turno usando centros dos grânulos. Digite o seguinte comando "my_train.exe grânulosCSV calibraçãoMat 1". Um arquivo chamado"calibraçãoMat" é criado na pasta de trabalho. Ignore outros arquivos que são gerados.
    5. Corrigi o cromática-shift de centros de minipilhas de Golgi, digitando o seguinte comando "my_test.exe ministacks. csv corrected_ministacks. csv calibraçãoMat 1".
      Nota: Um arquivo chamado"corrected_ministacks. csv" é criado na pasta de trabalho. Ele contém cromático-turno corrigidas coordenadas dos centros, que são organizados na ordem de xG, y,G, xB e yB. Ignore outros arquivos que são criados. Tome nota que o canal vermelho é definido como livre de aberração cromática e, portanto, xR e yR são os mesmos como dados brutos.
  4. Cálculo do LQs
    1. Lançar o software de análise de dados e copiar e colar, no abaixo sequência, quer dizer, áreas, valores de cinza de fundo SDs obtidos de passo 4.2.3 (colocá-los na linha 1) e cromática-shift corrigido x e y coordenadas do minipilhas de Golgi no canalR em um planilha como colunas à E. Da mesma forma, transferi dados correspondentes para canalG e canalB para colunas F, J e K para O, respectivamente.
    2. Adicione oito novas colunas P a W, chamado "intensidade integrada de canal R", "intensidade integrada de canal G", "intensidade integrada de canal B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (bronzeado b) e LQ.
      1. Parte superior da coluna respectiva com o botão direito e selecione "Definir valores da coluna" para calcular os valores de cada coluna. Para coluna de P, a entrada "Col(A)Col(B)"; para coluna Q, entrada "Col(F)Col(G)"; para coluna R, entrada "Col(K)Col(L)"; para coluna S, entrada "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" onde "pixel_size" é o tamanho do pixel em nm; para coluna T, entrada "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; para coluna U, entrada "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; para coluna V, entrada "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; coluna W, entrada "Col (T) / Col (S)".
    3. Filtro minipilhas de Golgi, os três critérios descritos na introdução.
      1. Do software de análise de dados, vá para "planilha > planilha consulta" e selecionar as variáveis de coluna para teste "If". Atribuir os seguintes aliases I1, I2, I3, d1, A e B para colunas "integrado intensidade do canal R", "intensidade integrada de canal G", "intensidade integrada de canal B", d1, ABS(tan a) e ABS (bronzeado b), respectivamente. Na "se condição" caixa de entrada "I1 > =30*cell(1,3) e I2 > =30*cell(1,8) e I3 > =30*cell(1,13) e d1 > = 70 e (A < = 0.3 ou B < = 0.3)".
      2. Selecione "Extrair para nova planilha", clique em "Aplicar". Colunas A-W de minipilhas de Golgi analisáveis são extraídos para uma nova planilha.
    4. Na nova planilha, clique direito no topo da coluna W, selecione "estatísticas sobre coluna > caixa de diálogo aberta". Seleção "Total de N", "Média", "SE de dizer", "Histogramas". A análise estatística do LQs é exibida.

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Representative Results

O pesquisa moderna da classe microscópio equipado com uma lente apocromático plano, como o usado em nosso laboratório, mostra uma aberração cromática mínima(Figura 2). No entanto, uma examinação cuidadosa da imagem do grânulo fluorescente multi cor pode revelar a mudança de imagens de cor diferente da mesma esfera (Figura 2B). Definimos que o canal vermelho é livre de aberração cromática e, portanto, centros de fluorescência vermelha são as verdadeiras posições dos grânulos. Os relativos cromática-turnos de fluorescência verde e far-red podem ser representados por vetores de verdes e azuis originários do centro da fluorescência vermelha (Figura 2C). A mudança cromática-dentro do plano de imagem empiricamente é ilustrada pelo vetor verde e azul para cada grânulo (Figura 2D). Para nosso microscópio, os cromática-turnos não são uniformes como magnitudes e direções de mudança de turnos, de acordo com o x e y posições. A mudança cromática pode afetar significativamente a precisão de GLIM como o deslocamento dos centros de far-red pode ser tanto quanto 50 nm. Portanto, cromático-turno deve ser corrigida. Uma vez que os centros dos grânulos são adquiridos, nós empregamos primeira ordem polinomial encaixe para calibrar e posteriormente corrigir os turnos-cromático dos centros. A aberração cromática-turno é melhorada por esta abordagem (Figura 2 D-G).

Em células de mamíferos, o complexo de Golgi é agregado na área perinuclear, que geralmente não é resolvida sob um microscópio óptico convencional(Figura 3). Após o tratamento de nocodazole por 3 horas, o complexo de Golgi perinuclear desaparece e dezenas de minipilhas de Golgi montam no retículo endoplasmático saída sites em todo o citoplasma (Figura 3B). Grandes pedaços de membrana do Golgi e minipilhas de Golgi agregados estão presentes e eles não são selecionados para análise. Uma imagem de exemplo ilustrando a seleção de minipilhas de Golgi é mostrada na Figura 3C. Usando a ferramenta de "Inspeção de Macro-Golgi ROI", 40 Golgi selecionado minipilhas estão listados na Figura 3D. Depois de aplicar os três critérios, 21 minipilhas de Golgi eram analisáveis e escolhido para o cálculo do LQs de TPST1-EGFP (Figura 3D; rotulado como "L"), com suas estatísticas, mostradas na Figura 3E. No total, 111 analisáveis minipilhas de Golgi foram selecionadas 12 células e o QI de TPST1-EGFP foi medido como sendo 0,04 0,76 (média ± SEM; n = 111) (Figura 3-F). O QI de TPST1-EGFP posiciona-lo entre giantin (LQ = 0,59) e Rab6-EGFP (LQ = 1,04)7. É perto de GS15 (LQ = 0,83) e ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = 0,82). Nós definimos as regiões sub-Golgi segundo LQs considerando dados qualitativos localização de literatura: a ERES/ERGIC, <-0.25; cis, ± 0,00 0,25; medial, 0.50 ± 0,25; Trans-Golgi, 1,00 ± 0,25 e TGN, 1,25-2,00. O QI de TPST1-EGFP, portanto, indica sua trans-localização de Golgi, que está de acordo com um anterior estudo14.

Figure 1
Figura 1 . Ilustrações esquemáticas mostrando variáveis utilizadas no cálculo de GLIM. Vista de xz (A) de uma pilha de Golgi mini possui centros de co-axial de GM130, GalT-mCherry e proteína x fluorescência mostrando Golgi eixo, ângulo axial, dx e d1. A imagem da pilha mini Golgi é sua projeção para o plano de imagem. (B) xy vista de uma pilha de Golgi mini com fora do eixo central da proteína x mostrando o ângulo α, β ângulo e projeção axial distância dx. A e B são adaptados da Figura 1E e Figura 1F de nossa publicação anterior7, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Correção da mudança cromática-. (A) a imagem mesclada três cores de 110 grânulos de cor multi nm adquiridos por um microscópio de campo amplo. Cada grânulo emite verde, vermelho e far-red (artificialmente coloridos como azul) fluorescência. Escala da barra, 10 µm. (B) alargada visualização de uma imagem de single-grânulo mesclada com uma perceptível mudança cromática. Escala da barra, 200 nm. (C), um diagrama esquemático mostrando que turnos de imagens pérola verde e far-red podem ser representados por vetores do centro da imagem do grânulo vermelho (0,0) para centros de verde (verde vetoriais) e imagens de grânulo de far-red (vector azul), respectivamente. (D, E) O efeito da correção cromática-turno. Dentro do mesmo campo de imagem, vetores de verdes e azuis são plotadas antes e depois da mudança de correção. Para visualizar a pequena mudança, a magnitude de cada vetor é amplificada 200-fold. (F, G) Dispersão plota apresentando centros de verde (pontos verdes) e os grânulos de far-red (pontos azuis), antes e após a correção de turno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Um exemplo típico de GLIM, aqui adquirir o QI de TPST1-EGFP. Uma célula HeLa expressando TPST1-EGFP (verde) e GalT-mCherry (vermelho) foram corados por GM130 endógenos (azul). (A), A célula típica. (B, C, D, E) Uma célula tratada com nocodazole foi fotografada (B). Na imagem, minipilhas de Golgi analisáveis foram selecionados como mostrado em C. Minipilhas de Golgi selecionados são identificados por números de identificação. Imagens destas minipilhas de Golgi mascarados são exibidas abaixo em D com seus números de identificação. "L" indica que a pilha mini de Golgi é válida para o cálculo do Qi (pilhas de Golgi mini analisáveis). Histograma de LQs de 21 minipilhas da célula é mostrada em mi. (F) histograma do LQs de 111 minipilhas de 12 células. O valor mostrado no histograma é média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materiais complementares: Macrosaída 3 canais data.ijm macro-Golgi ROI inspection.ijm, códigos de Matlab, template.opj My_train.exe, My_test.exe e planilha.

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Discussion

Anteriormente, a localização de uma proteína de Golgi sob a microscopia de luz principalmente foi quantificada pelo grau de correlação ou a sobreposição da imagem da proteína com a imagem de um marcador de Golgi de localização conhecida15,16, 17. A correlação resultante ou sobreposta coeficiente reflete o quão perto a proteína de teste é o marcador de Golgi espacialmente. Existem pelo menos três advertências para esta abordagem. Em primeiro lugar, a correlação ou coeficiente de sobreposição é não-linear e diretamente não indica distância espacial. Em segundo lugar, o grau de correlação é criticamente dependente da resolução do sistema microscópico. Portanto, o coeficiente entre duas proteínas de Golgi não é uma constante independente do sistema. Terceiro, duas proteínas de Golgi com a mesma localização axial mas diferente distribuição lateral ao longo de pequenos podem ter coeficientes distintos. Daí, a correlação ou coeficiente de sobreposição não indica a localização axial de uma proteína de Golgi. Em um método alternativo, proposto por Dejgaard et al., cis, trans-Golgi marcadores e a proteína de interesse são triplo-etiquetadas em nocodazole tratados minipilhas de Golgi, semelhantes ao GLIM. Dentro de cada pilha mini de Golgi, são adquiridas as posições dos três pixels de intensidade máxima e a posição relativa da proteína do teste é calculada como uma relação de distância18. No entanto, seu método é incapaz de atingir o sub pixels de resolução, que limita consideravelmente a sua aplicação. Em comparação com métodos quantitativos anteriores, GLIM, que foi desenvolvida de forma independente, mas tem um conceito semelhante ao de Dejgaard et al., é capaz de quantificar a localização axial de uma proteína de Golgi com consistência e exatidão sem precedentes.

Apresentamos o protocolo de GLIM para adquirir o QI de forma exógena expressa proteína GFP-etiquetado-TPST1-EGFP. O QI de proteína endógena pode ser determinado se seu anticorpo está disponível. Dependendo da espécie de um anticorpo anti-GM130 coelho ou rato, rato ou coelho e o anticorpo primário, respectivamente, pode ser usado no protocolo triplo-rotulagem. Tanto o coelho e o rato de anticorpos anti-GM130 para a rotulagem de imunofluorescência são comercialmente disponíveis. Demonstramos anteriormente que o coelho e o rato anticorpos anti-GM130 dar os mesmos resultados em GLIM7. Se a proteína de teste é intrinsecamente vermelha em emissão de fluorescência, como fusão de mCherry, um Golgi GFP-etiquetado proteína marcador com LQ conhecido em combinação com GM130 anticorpo rotulagem pode ser usado para células de tripla-rótulo e deduzir indiretamente o QI da proteína do teste. Assumindo que a proteína marcador LQ é LQm e a distância do centro da proteína marcador para o de GM130 é dm, o QI da proteína teste x pode ser calculado como (dx/dm) × QIm. Uma das maiores vantagens de GLIM em comparação com microscopia de super-resolução é que facilmente pode ser aplicado para a imagem de célula viva em configurações microscópicas convencionais. Tentamos uma combinação de três proteínas fluorescência, GFP-Golgin84, mCherry-GM130 e GalT-iRFP670, para monitorar dinamicamente o LQ de GFP-Golgin84 em um único minipilhas de Golgi7.

Em GLIM, a etapa mais demorada é a análise de pós aquisição, especialmente na seleção de minipilhas de Golgi analisáveis. Como minipilhas de Golgi são heterogêneos em tamanho e composição molecular19, não está claro se a distribuição do LQs (Figura 3F) representa a arquitetura heterogênea de minipilhas de Golgi ou a incerteza de nosso cálculo da LQ. Independentemente da causa, achamos que é importante ter um grande número de analisáveis Golgi minipilhas (n) para garantir a precisão do QI, que é comprometido quando n é pequeno. Normalmente, dados com n ≥ 100 de várias células produz LQs confiáveis. Portanto, GLIM dá dados de localização em média ensemble, obscurecendo a individualidade dos minipilhas de Golgi. Outra limitação de GLIM é que ele pressupõe que todas as proteínas de Golgi tem uma distribuição estreita em torno de um único centro. Algumas proteínas de Golgi, como subunidades COPI, ARF1 e solúvel N-sensível-proteà fator acessório da proteína do receptor (SNAREs)20,21, têm sido relatadas para distribuir amplamente de cis para o trans- Golgi e o TGN. É provavelmente inadequado estudar sua localização de Golgi pelo QI. Como GLIM atualmente envolve a seleção manual de minipilhas de Golgi, que é trabalhoso e subjetiva, o futuro desenvolvimento da GLIM será implementar uma ferramenta de software para selecionar automaticamente mini pilhas de Golgi com mínima interferência humana.

Qual é a resolução espacial de GLIM? Uma vez que o QI é uma relação, que é unitless, ele não indica uma distância espacial. Aqui, vamos tentar dar uma estimativa muito grosseira. A resolução espacial de GLIM pode ser definida como a menor distância axial entre duas proteínas de Golgi pode ser resolvidas. Examinando LQs de várias proteínas de Golgi7, descobrimos que SEMs de conjuntos de dados com escala de 100 n ≥ em torno de 0,03. Supondo que duas proteínas de Golgi tem o mesmo n = 100 e SEM = 0,03, o Golgi duas proteínas têm significativa diferente localização pelo teste t (p < 0,05), ou seja, puder ser resolvido, se a diferença entre seus LQs ≥ 3 × SEM = 0,09. A partir dos dados de EM, podemos estimar que o comprimento axial da pilha mini de Golgi, que também é a distância entre GM130 GalT-mCherry em GLIM, é ~ 300 nm8. Portanto, a resolução de GLIM é estimada em 0,09% × 300 = 30 nm ao longo do eixo de Golgi. Em GLIM, um maior n geralmente produz SEM menor, que por sua vez, resulta em maior resolução.

É provavelmente inapropriado comparar diretamente a resolução de GLIM do EM imuno-ouro desde a último técnica não produz diretamente dados quantitativos de localização. Semelhante ao GLIM, a resolução do EM imuno-ouro ao longo do eixo de Golgi pode ser definida como a menor distância entre dois marcadores de Golgi pode ser resolvidos. Para medir sua resolução requer o estudo de dual-imuno-ouro rotulagem de duas proteínas de Golgi pròxima adjacentes uns aos outros ao longo do eixo de Golgi. Tal estudo sistêmico é provavelmente não está disponível de acordo com nosso conhecimento. Como discutido na introdução, um dos fatores limitantes na resolução espacial do EM imuno-ouro é o grande tamanho do anticorpo complexo, que faz com que a resolução será pior que ~ 20 nm. Outro importante fator limitante da resolução da imagem é a densidade de rotulagem das moléculas de antígeno. De acordo com a teoria de amostragem de Nyquist, deve haver pelo menos duas partículas de ouro por unidade de resolução. Na maioria dos estudos de EM imuno-ouro, as distâncias entre as partículas de ouro vizinho está não < 15 nm devido a baixíssima rotulando eficiência; Isso torna difícil para esta técnica conseguir uma resolução de imagem inferior a 30 nm. Deste ponto de vista, estimamos que a resolução de GLIM é pelo menos comparável do EM imuno-ouro.

GLIM é um método robusto que dá resultados muito consistentes. É independente do tipo de microscópio usado. Nós testamos esse microscópios confocal de campo amplo e girando disco rendeu os mesmos resultados. QI das proteínas de Golgi mesmas adquiridas em diferentes lotes de experimentos também estava em boa concordância com os outros. Gerou-se um banco de dados do QI composto por proteínas de residente uma gama diversificada de Golgi para comparação e interpretação. Esperamos que mais uso de GLIM na Comunidade de pesquisa significativamente irá expandir o banco de dados. Por conseguinte, um banco de dados mais completo quantitativamente, descrevendo a localização de um grande número de proteínas de Golgi grandemente ajudará na compreensão da organização e função do complexo de Golgi.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a D. Stephens (Universidade de Bristol, Bristol, Reino Unido) para o plasmídeo de DNA TPST1-EGFP, bem como Lakshmi Nunes Govindarajan ajuda com a otimização de software. Este trabalho foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de pesquisa médica (NMRC/CBRG/007/2012), Ministério da educação (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 e 15/RG132 e AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) para L.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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