大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

Bioengineering

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Summary

無細胞転写・翻訳プラットフォームの新世代は、生化学システムの in vitro遺伝子回路の実行を構築するために設計されています。この記事で私たちはすべて大腸菌無細胞 TXTL システムを使用して彼らのゲノムからのバクテリオファージ MS2、ΦΧ174、T7 などの合成方法について説明します。

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Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

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Abstract

試験管反応の基礎および応用科学を実行する新しい機能を提供するより汎用性とモジュール性、エンジニア リング、無細胞転写・翻訳 (TXTL) システムの新世代。過去 10 年間携帯無料 TXTL 斬新な学際的な研究領域定量と合成に関連する生物学の広い範囲のための強力な技術となっています。新しい TXTL プラットフォームは、構築し、合成又は天然の遺伝子回路の実施により生化学システムを尋問すると特に便利です。体外TXTL 実証されています急速にプロトタイプ規制要素と生物学的ネットワーク同様に要約として便利な分子の自己組織化メカニズムは、生活システム。この資料でどのように伝染性のバクテリオファージ、MS2 (RNA)、ΦΧ174 などを述べる (ssDNA) および T7 (dsDNA) 完全すべて大腸菌、無細胞 TXTL 系を用いたワンポット反応で彼らのゲノムから合成されます。3 つの coliphages の合成は、プラクの試金を使用して定量化されます。どのように合成バクテリオファージの収量反応の生化学的設定に依存を示します。ペグの 8000 系の制御された濃度をエミュレート分子クラウディング大きさの命令によって合成されたファージの量に影響します。バクテリオファージを増幅する方法と彼らのゲノムを浄化する方法について述べる。プロトコルとこの作品で示された結果のセットは無細胞合成生物学と工学の学際的な研究者に関心のはずです。

Introduction

過去 10 年間無料のセルの表現技術を創発的学際的な研究領域合成と定量的に関連する生物学の新しいアプリケーションに対応し設計されています。もともと独立した生きている有機体の蛋白質を表現するために使用、新しい携帯無料 TXTL システムは両方基本的な応用科学12、かなりこの技術の範囲を広げるために開発されています。TXTL プラットフォームの新世代はユーザーフレンドリーをできるように設計されている効率的 (到達するとバッチ モード3におけるタンパク質合成の 2 mg/mL) より転写4のレベルで汎用性とするようモジュールを簡単に統合自然小説または既存の生物学的システム5,6の機能を拡張する合成関数。特に、携帯無料 TXTL システムとなっている規制要素または小さな遺伝的回路7,8,9などの遺伝的プログラムのラピッドプロトタイピングの便利なデザイン、ビルド、テストを減らすことによって数日サイクルします。驚くことに、新しい TXTL システムは、coliphages10,11, アクティブなゲノムの再構成をサポートする十分な性能を示す強いの完全な合成など大規模な DNA プログラムを処理できます。DNA は、生き物のエンティティがエンコードされます。

TXTL システムは、従来の in vitro建設的な生化学的アッセイに比べて多くの技術的な優位性を提示します。携帯無料 TXTL は、遺伝子発現のプロセスを生きている細胞の複雑な細胞質とは対照的削減とオープン環境で最終製品にリンクします。TXTL では、DNA を利用して、現代 DNA のアセンブリ技術と手頃な価格、気難しいタンパク質精製工程を必要としないに加えて高速生化学システムの in vitro、再構成します。無細胞発現分子間相互作用12の深い郭清をできるように、生化学的な反作用の部品のほとんどへの直接アクセスを提供します。TXTL 反応では、生きている細胞ではほとんど不可能で生化学と生物物理設定変更できます。これらの利点と最近の改善を考えると、TXTL 技術、合成および量的な生物学の代替プラットフォームとして人気が高まってください。それは TXTL 反応の実行に関連する適切なプラクティスを開発するためにこのようなプラットフォームを使用する方法を理解する重要な TXTL を使用して、研究コミュニティは急速に成長しているし、TXTL は、バイオ エンジニア リングの標準的な技術になって、結果の解釈。

この記事での合成、ワンポット反応でバクテリオファージのゲノムから11、MS2 などすべてのエシェリヒア属大腸菌の TXTL システムを使用する方法について説明 (RNA、3.4 kb)、ΦΧ174 (ssDNA、5.4 kb)、および T7 (dsDNA、40 kb)。どのようにファージ量合成反応 (マグネシウムとカリウム濃度) の生化学的な設定の一部に関して変更を示します。ペグ範囲 8000 濃度をエミュレート分子クラウディング バクテリオファージ合成に劇的な効果は、桁違いです。同時に転写、翻訳のプロセスを要約、関連生物学および生物物理学の基本的な質問に対処するための興味深い自己集合、単一試験管反応でこのような大規模な生化学的なシステムの実現10 (遺伝子発現制御、自己集合), だけでなく、新しいナノ構造13を構築するバクテリオファージ関数情報の転用などのアプリケーションを開発します。TXTL の実用的なに加えて我々 はプラクの試金によってバクテリオファージ増幅、ゲノム抽出と精製・ ファージ定量化メソッドを提供します。本稿では提案手法はエシェリヒア属大腸菌の抽出による無細胞システムを使用し、バクテリオファージに興味がある者に適しています。

この作品で提示プロトコルはフォローとしてまとめることができます: 1) バクテリオファージ増幅 (日 1: 接種の準備細胞、2 日目: 単一のプラーク、複数のバクテリオファージの成長と濃度、および 3 日目: バクテリオファージの浄化)、2) 二重座礁させたゲノム DNA の抽出(フェノール/クロロホルム抽出)、3) 携帯無料ファージ反応と抗体実験 (日 1: 宿主細胞をプレートし、寒天プレートを作る 2 日目: 無細胞反応とホスト細胞の前培養と一日 3: ホスト細胞文化およびバクテリオファージ価)。

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Protocol

注: 以下増幅し抽出法は主として多くの二本鎖 DNA ファージ、バクテリオファージ T7 など、腸内細菌のファージ T4、または腸内細菌バクテリオファージ λ (L) の汎化可能な。彼らは主にそのゲノムが商業源からの購入のため用意されていないバクテリオファージのため使用される

1 バクテリオファージ増幅

注: 単一プラーク, マルチ サイクル (SPMC) バクテリオファージの生産技術が陳 の T4 ファージの説明されて。 14 次のバクテリオファージの増幅、DNA 抽出法は、大腸菌 二本鎖 DNA ファージ、例えば T7、T4、または l. のための一般化プロトコルの究極の成功に大きく依存して選択したホスト細胞株 ' 重複感染の条件に耐える能力。宿主細胞が重複感染の下で安定したまたは重複感染が決して到達しない、換散がこの重要な段階の間に決して到達しない場合、合流の換散のプロトコルを続行することをお勧めします。高速遠心分離とファージを遠心速度でペレット化を介して細胞残屑を分離するが含まれます。すべての次の条件およびパラメーターの一般的な出発点としてものです。ローカル ホストの細胞ラインの最適条件が異なる; 場合があります。判断し、適切な条件を順守

  1. 接種細胞の準備
    1. 10 mL 大腸菌 宿主細胞と 15 mL の培養管のルリア ベルターニカミラ (LB) メディアを接種する など、B または K12
    2. 250 rpm と 37 にシェーカーで ° c. を残す一晩彩度に成長します
  2. シングル プラーク、マルチ サイクル バクテリオファージの成長および濃度
    1. 主務のバクテリオファージのプラクのプレートを準備する暖かい 1 h、37 ° C でいくつかの LB 寒天培地プレートまたは一晩します
    2. ファージ株式 (例えば T7、T4、または L) 10 ~ 2-10 3 ファージ/mL を目指して LB 媒体の濃度既知のいくつか希釈液を準備します
    3. 各プレートに集中して宿主細胞の一晩成長の追加 100 μ L.
    4. 準備の選択ボリューム バクテリオファージ希釈 10 100 バクテリオファージ/プレートから範囲に対応します。各プレートにバクテリオファージ希釈の必要量を追加 (例えば、100 μ L の 10 3 ファージ/mL; これは 〜 100 プラクを生成する必要があります)。37 ° C でプレートをインキュベートし、カウント アップ タイマー (+ 0 h) を開始します。4-5 博インキュベート
    5. 250 mL フラスコとシェーカー 250 rpm と 37 に設定の場所で 49 mL LB メディアを準備 ° C
    6. で + 2.5 h、希薄 49 mL の LB 培地を含む予め温めておいたフラスコに一晩成長から飽和細胞文化の 1 mL を追加して 50 倍の細胞します。セルがログの増加 (+ 4-5 h) に達すれば、測定吸光度 600 nm (外径 600)。1.0 = 8 x 10 の OD 600 変換を用いた細胞の濃度を決定する 8 セル/mL
    7. 。 2 x 10
    8. Dilute 7 セル/mL 追加ポンド成長媒体を使用して。インキュベーターからバクテリオファージのプラクを含む寒天プレートを取り外します。すぐにコアし、1 つのプラークを除去する滅菌パスツール ピペット末を使用します。希薄化後のセルにプラークを爆破し、37 ° C (+ 6-7 h) さらに 2 時間インキュベートします
    9. 1.5 mL チューブ、追加の 10 μ L のクロロホルム (CHCL 3)、すぐに高速でボルテックスに 500 μ L のサンプルを取って、完全な感染症のためのテスト。ソリューションが明らかにかどうかを確認します。一度細胞が完全に感染している別の 2 h (+ 8-9 h) インキュベートします
      。 注: セルは、完全に感染している場合彼らが急速に溶解 (< 2 分) ソリューションを明らかにします。その他の結果は、以下の ディスカッション セクション でと見なされます。セル superinfected されますが、この時点まで溶解がないです。DNase や遠心分離によって収穫の添加がバクテリオファージの劣化を防ぐためにすぐに始める必要があります溶解が始まる場合
    10. 5 μ G/ml と遠心分離機に追加 DNase 細胞ペレットへの 4 ° C で 8,000 x g で。上清を捨てます。5 μ g/ml の DNase バッファーの 1 x TRIS 塩化マグネシウム (TM) (50 mM トリス ph 7.8, 10 mM MgCl 2) 10 mL にペレットを再懸濁します。高速では、細胞を溶解 CHCL 3 と渦の 500 μ L を追加します。4時 10 分、12,000 × g で遠心分離により明らかにする ° c. デカント 15 mL の円錐管に 4 店清 ° C

2。バクテリオファージの精製

注: ショ糖浄化、バクテリオファージのサイズに大きく依存します。分離するバクテリオファージの質量に関する考慮事項が行われなければならないし、勾配条件に調整が実行されます。10 以上 13 バクテリオファージ/mL の最終的なウイルス抗体がこの方法で簡単に達成可能である

  1. TM バッファー x 1 w/v スクロースを 5% と 45% の 12 mL を準備します
  2. 4 の遠心管に 45% ショ糖のピペッティング 2.5 ml 準備 4 x 5-45% のサッカロースの勾配。トップ 〜 2.6 mL 5% ショ糖、液管の縁から 2 mm に達すると停止します
    。 注: はショ糖液の表面が付いている接触のピペット チップを置き、非常にゆっくりと液体を分配します。ライターのショ糖液は、明確な境界を形成の上に重い、フロートされます。背景光に対して保持されている場合に、適切に階層化されたソリューションの 〜 1 mm のインターフェイスがあります
  3. ミックス グラデーションを形成器 43 グラデーションを使用して傾斜管回転 23 rpm で 86 ° s。すぐに必要な場合パラフィン フィルムでカバーし、4 で保管 ° C
  4. それぞれのトップから削除 500 μ L 準備 1 mL pipettor と ± 0.002 g. 内にバランスを蔗糖グラデーション
  5. プール ファージ懸濁液すべてのチューブ (ステップ 1.2.9) から。1 mL ピペットを使用する液体の表面が付いている接触の先端および急速なピペッティングを混在させないよう注意しながら、ショ糖密度勾配の上にボリュームを非常にゆっくりと調剤で、懸濁液 500 μ L を追加します。70,000 x g で 4 ° C で 20 分間遠心
    メモ: 残高 ± 0.002 g. 小さいファージ内に準備されたグラデーションをかけてまで 1 h.
  6. 滅菌注射器と鈍カニューレを使用してファージ バンドを削除します
    。 注: 側から見ると、バクテリオファージ バンド厚くてミルキー周辺は、高さ、約 5 mm と比較して、遠心分離機管の下の半分の方法に位置しています。
    1. 埋没、鈍カニューレ先端までのソリューションには、バクテリオファージ バンドの非常に上端を中心です。バクテリオファージ バンドの大半が削除されるまで、シリンジのプランジャーを描画することによってバンドを削除します
  7. 3 4 遠心チューブに中断されたバクテリオファージとショ糖ボリュームを追加します。以上 1.5 mL/チューブを追加します。3 ~ 4 mm 冷 1 管の上部から塗りつぶし TM x。パラフィン フィルムでカバーし、ミックスに反転します。超遠心機と 4 ° C で 1 時間 145,000 x g でスピンに戻る場所ペレット。小さいファージは最大 2 h. をかかることがあります
  8. はすぐに上澄みを注ぎ、使い捨てワイプで逆さまにドレインします。余分な上清を除去する滅菌綿棒でチューブの内側を拭いて
  9. 分割 200-400 μ L 冷たい 1 x すべて TM ペレットし、一晩 4 ° C で再懸濁します; 揺れは必要ではありません
    。 注: ペレットは、クリーンではない場合、膜糸ビット など DNA など、プールおよび 17,000 x g に遠心機で追加の遠心分離を行う
  10. 抗体を作る前日 10 mL LB 成長媒体で 大腸菌 宿主細胞の文化を準備し、一晩 250 rpm と 37 ° C に設定振動インキュベーターに残します。バクテリオファージ株式の価を行う前に、少なくとも 1 h 37 ° C で培養皿の適切な量をインキュベートします
    。 注: めっきされるバクテリオファージ株式の希釈液の数によって異なりますをインキュベートする板の数: バクテリオファージ株式のそれぞれのユニークな希釈が 2 つの培養皿を必要とする (例えば、バクテリオファージ株式の 4 つの異なる希釈 8 培養皿が必要).
  11. は、2.5 g LB と 0.6 g バクト-寒天を 100 mL のボトルに追加することによって上の寒天の 100 mL を準備します。脱イオン水 100 mL とオートクレーブのボリューム内に固体を溶解します。オートクレーブ後ゆっくりと反転ボトル 6-8 回ソリューション全体で寒天を均質化します。. の温度を平衡に 15 〜 20 分の 45 ° C の水浴でボトルを配置
  12. LB ソリューションが付いているバクテリオファージ在庫のシリアル希薄を準備します
    1. 追加 990 μ L LB 10 μ L ファージ株式 100 希釈用。渦を均質化します。10 倍希釈、900 μ L にバクテリオファージ株式の 100 μ L を追加ポンド渦を均質にします
    2. 斑 (10-100 斑) の可算番号を取得する必要な回数として上記の希釈系列を繰り返します
      。 注: これを達成するため、希釈するバクテリオファージ在庫 2-3 桁のバクテリオファージ/mL の反応の面で期待されるバクテリオファージの収穫よりも少ない。たとえば、特定バクテリオファージ株式 10 11 伝染性のバクテリオファージ/mL が含まれる場合は、10 バクテリオファージ株式をプレート 8-倍または 10 9-倍希釈
  13. (培養管の数はめっきされるバクテリオファージ株式希薄の数に等しい) 14 mL の培養管を組み立てることによってバクテリオファージの抗体のための領域を準備します。氷に手順 2.12 から希薄バクテリオファージ株式のサンプルとステップ 2.10 から宿主の細菌細胞を配置
  14. 準備マスター ミックス 5.25 mL 上の寒天 (ステップ 2.11) をピペットで 220 μ L はバクテリオファージのサンプル (ステップ 2.12) を希釈し、50 μ L 細菌に宿主細胞 (ステップ 2.10) 14 mL 培養管します。カルチャ チューブと高速で渦をキャップします
    1. 4 で残りのバクテリオファージ ソリューションを格納 ° C
  15. 37 ° C の定温器からの 2 つの培養皿 (ステップ 2.10) を取得します。(泡) なしの最初のプレートの中心にゆっくりとマスター ミックスの 2.5 mL を追加します。優しく手で全体の文化板にまたがるようにマスター ミックスを均等に配布するプレートを回転させます。2 番目のプレートを繰り返します。上の寒天の凝固をように 20 分を待ちます。4-7 のための 37 ° C でプレートを孵化させなさい
  16. 斑をカウントし、各反作用のサンプルのバクテリオファージの濃度を決定する
    。 注: 斑は 1-2 mm クリア サークルの宿主細胞のカーペットで不透明として表示されます。代表の結果は、 図 1 を参照してください。成功したバクテリオファージの生産 10 12-10 13 バクテリオファージ/mL の最終濃度になります

3。二本鎖ゲノム DNA 抽出

注: 揺れ、希釈、フェノールと水相間の厚さ、固蛋白質境界層を開発する遠心分離手順を最適化する必要があります。これは蛋白質の汚染物の無料最高純度ゲノムを生成します。初期の希釈は最終的なバクテリオファージの抗体に依存です。非常に高価ファージ株式 (≥ 10 13 バクテリオファージ/mL) 低価の在庫 (10 ~ 10-10 11 バクテリオファージ/mL) が必要がありますのみ、抽出前に、の 10-20 倍希釈を必要があります、2 倍または none。以降の手順で固体蛋白質層を形成することは困難だ、水性懸濁液は高 DNA 濃度のため運転できる粘りの抽出を続行する前にバクテリオファージ株式より高い希釈を検討してください。いずれかをピペッティング時に、ワイドボア ピペット チップを使用することが重要です任意のゲノム処理ステップ水溶液。多くのバクテリオファージのゲノムは非常に大きく、ピペットせん断を通して簡単に断片化されました。さらに、任意のボルテックス明示的避けるべき、これは深刻なゲノムをせん断します

  1. X 新しい 1.5 mL チューブに TM バッファー 1 ステップ 2.9 を 400 μ L からのバクテリオファージの株式の一部を希釈します
  2. は、Tris:Phenol:Chloroform の等量を希釈に追加します。5 分遠心 5 ~ 10 分、ベンチトップ遠心分離機で 17,000 x g で得られたエマルジョンの研究室にロッカーの上に優しくまたは手で混合物を振る
    注: 基になるフェノール相の表面に明確な白いタンパク質の層が存在します
  3. 界面の境界を邪魔しないように世話新しい管へ上部の水相を削除します
  4. 3 フェノール抽出の合計のための 2 回のステップ 3.2 3.3 追加を繰り返します。新鮮な管に水相を転送し、CHCl 3 の等しい量を追加します。振ると遠心分離機 (ステップ 3.2)。きれいな管に水溶液中の DNA サンプルを転送します
  5. は、浄化された DNA の量を見積もる。3 M 酢酸ナトリウム (CH 3 COONa) の 0.4 のボリュームと 95% のエタノール (エタノール) の 3 つのボリュームを追加します。一晩沈殿物のための-20 ° C のフリーザーに配置します。10-15 分、ベンチトップ遠心分離機で 17,000 × g で遠心分離
    注: DNA が、すぐに脱水してチューブのサスペンションの塊として見えるようになります。適切な結果のペレットは白と管の底面に対してよくまとめ
  6. は、削除し、デカントまたはピペットで上澄みを廃棄します。追加 500 μ L 70 %etoh ペレット フロート チューブの底から無料までチューブを軽く振ると。17,000 x g で 5 分間削除で遠心し、エタノール、ペレットを邪魔しないように世話を破棄します
  7. 繰り返し手順 3.6。空気は、ペレットに 30-60 分追加 50 μ L ddH 2 O または卓上ペレットを乾燥し RT で 1 時間インキュベートまたは再懸濁しますに 4 ° C で一晩します。280 吸収測定を使用して DNA の濃度を決定する nm
    。 注: 予想される濃度は、0.5-5 μ g/μ L は、この手法を使用します。最終的なゲノムの濃度を決定するため全ゲノムの分子量で割ります

4。無細胞ファージ反応とファージ価実験

  1. 25 g LB 培地と 15 g バクト寒天固準備、1 L ボトルに注ぐし、1 l. オートクレーブに脱イオン水を追加します
  2. 殺菌後ボトル泡の形成を避けるためにゆっくりと 6-8 回世話を反転します。ボトル反転、1 L ソリューション全体における寒天固をホモジナイズしてください。培養皿に分注する前に 20 分の 58 ° C の水浴でボトルを配置します
  3. LB 寒天液の温度が平衡は、一度開いている培養皿に近い環境を消毒する培養皿の横に炎を準備します。採取しながら寒天の凝固を避けるために風呂の水 1 L ボトルを保持します。100 x 15 mm 培養プレートに 25 mL を追加します。1 L は 40 の培養皿が生成されます
  4. 1 つの培養プレートを脇、RT で少なくとも 1 時間固める; このプレートは宿主細胞のめっきに使用されます。ほかの 39 培養皿は、4 ° C でした店で 2 日間の固化または抗体を作るためにすぐに使用できます
  5. は、適切な菌株 (例えば ホストをストリー キングで宿主細胞をプレートします。T7 B)-80 ° c、LB 寒天培地培養プレート上に格納されたいます。環境汚染を避けるために開いた炎の横に止めた。37 ° C で一晩インキュベートします。無菌環境での作業が不可欠であるので、宿主細胞ある抗生物質耐性
  6. 無細胞反応
    注: 携帯無料 TXTL 反応は、原油 エシェリヒア属大腸菌 の抽出 (9.9 8.9 mg/mL 蛋白質) 反応バッファーとファージのゲノムで構成されています他の 67% 33% で構成されます。粗抽出物を作製し、以前説明した 15 , 16。最終的な反応条件: 9.9 8.9 mg/mL タンパク質 (粗野なエキス) から、各アミノ酸は前述の 17、および説明するエネルギー ミックス ソリューションとして準備から 3-6 mM 3-4 mM 40 〜 100 ミリメートル K-グルタミン酸塩、2-4% PEG 8000 Mg グルタミン酸以前 15 から成る 3.33 0.33 mM DTT、50 mM HEPES、1.5 mM ATP、GTP、0.9 mM CTP と utp ケーブルは、0.2 mg/mL tRNA、0.26 mM CoA、0.33 mM ナド、0.75 mM キャンプ、0.068 mM フォリン酸、1 mM スペルミジン、30 mM 3 PGA。DNA 型バクテリオファージは 0.5-10 nM のゲノムの濃度を必要とし、RNA 型ファージは、50 〜 150 nM の範囲を必要とします。最終反応濃度は合成特定のバクテリオファージに一意であり、上記の範囲内となります。反応の最適な酸素は、最終的な反応ボリューム 10-20 μ L の間する必要があります。ゲノムの分子の形に依存する反作用のプロトコルで小さなバリエーションあります。たとえば、線状ゲノム分子 recBCD 酵素粗抽出物の存在による線形 DNA 断片の消化を阻害する反応の追加コンポーネントが必要です。
    1. 完了、" 反応の詳細 " 総反応数と反応の最終巻を入力して 表 1 (PhageTXTL_JOVE) のセクション
    2. は、一定のコンポーネントと反応の可変コンポーネントを決定することによって実験をデザインします。最終反応量とサンプル数の積に一定の反応成分の合計量の比率であるマスター ミックスの小数の容積率を入力します。ストックと反応試薬の最終濃度を入力、" マスター ミックス反応レシピ " PhageTXTL_JOVE のセクション。ストックとテストする変数 reagent(s) の最終濃度を入力します
      。 注: 反応コンポーネントのボリュームが自動的に計算されますマスター ミックス ボリュームおよび個々 の反応の最終巻に基づいています
    3. チューブの必要量を削除 (に示されている、" の解凍がチューブ " PhageTXTL_JOVE.xlsx のセクション) 細胞粗抽出液、エネルギー バッファー ミックス、-20 ° C または-80 ° C と氷の融解からアミノ酸ミックス ・
      (必要な) 場合、コンポーネントと同様の複数の因数を組み合わせる注: 一度融解したもの、です
    4. 因数指定された原油量抽出、反応量の 33% 微量遠心チューブにします
    5. は、表 1 に従ってマスター ミックスを調製します。すべての下位コンポーネントを均質化 " マスター ミックス反応レシピ " ボルテックス。粗抽出物に各コンポーネントの適切なボリュームを追加します
    6. (例えば T7)、線形 DNA のゲノムとバクテリオファージを使用して場合は、反応 11 にバクテリオファージ lambda の gam 蛋白質の 1 μ M を追加します。渦ソリューションを均質化と氷上で 5 分間反応を配置します。これは粗野なエキスの内因性である複雑な recBCD によって線形 DNA 部分の消化を阻害する
    7. の表 1 に従って最後のコンポーネントを追加すると、ボルテックスによって反応を均質化します。N マイクロ遠心チューブ用にマスターの組合せを分割します
      。 注: 各分割の体積は小数のマスター ミックス ボリュームの割合の製品と反応の最終巻です。たとえば、90% の小数のマスター ミックス容積率と 12 μ L の反応量は、各分割の体積は 10.8 μ L.
    8. 追加マスター ミックス配列の可変コンポーネントの指定されたボリューム (表 1 参照)。望ましい最終的な反作用ボリュームに到達する各反応に水を追加します。ボルテックスによって各反応を均質化します。少なくとも 8 時間または一晩 29 ° C で遠心管をインキュベートします
  7. ホスト細胞の前培養
    注: 一晩前培養は希釈 50: 1 価実験に使われている宿主細胞を感染効率を高める中間ログの段階で確実にします。中間ログ細胞は 10 倍によって再度濃縮し、氷の上保存されています。
    1. 5 mL LB 3-5 健康的なホストの細胞群れ体の培養チューブに接種滅菌ピペット チップを使用しています。汚染を避けるため火気の横に作業
    2. では、16 時間または一晩 37 ° C および 250 rpm での振動のインキュベーターで培養管を孵化させなさい。セルは次の日に飽和段階に達することができる
  8. バクテリオファージの抗体の細胞文化およびサンプル準備をホスト
    1. 50 mL LB 500 mL 三角フラスコとカバーにアルミ箔を分配します。20 分の 37 ° C でフラスコを暖かい
    2. 37 ° C で 3-4 時間と 250 rpm で揺れのために予め温めておいたポンド インキュベートにホスト細胞一晩前培養分注 1 mL
    3. 遠心分離機 5,000 x g. で 10 分の 50 mL のホスト細胞培養を破棄ポンド
    4. 寒さ (4 ° C) 5 mL LB でペレットを再懸濁し、氷を離さない
    5. 価実験を開始する前に 1 時間インキュベート 37 で培養皿 ° C
      注: 各ユニークなファージ反応 (および対応する希釈倍率) 2 つのプレートが使用されます。さらに、実験コントロール (代表的な正と負のコントロールの 図 1 を参照) の 4 版をインキュベートします
    6. 上の寒天 (ステップ 2.11) の 100 mL を準備します
  9. 2.12 のセクションで説明されているように LB ソリューションと携帯無料反応の連続希釈を準備します
  10. ファージ価
    注: は、培養皿が少なくとも 1 時間インキュベートし、オートクレーブから除去した後 15 〜 20 分の 45 ° C の水浴は、上の寒天プレートを開始します。
    1. 価最終的な細胞遊離反応 LB ソリューション セクション 2 の説明に従って手順 2.14 2.16

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Representative Results

4 つの代表的な結果を示します。図 1、携帯無料 TXTL システムとファージ DNA 株式はリビングで汚染されないように否定的なコントロールのセットを提案するエシェリヒア属大腸菌のセル。我々 はそのまま大腸菌の無細胞 TXTL システムが無いことを確認 (図 1A 図 1B) の genomic DNA の void 両方非培養し、, 反応溶液をめっきを用いた細胞の汚染。携帯無料 TXTL システムは、大腸菌に汚染されていた場合、成長はプレートに祝われるでしょう。さらに、我々 は無細胞反応、したがってない任意の汚染物質の細胞が非培養と培養反応 (図 1Cファージのゲノムをメッキすることによってファージの合成のための責任でことを確認します。図 1D)。非培養反応 (図 1C) プレートが表示ゼロの歯垢培養反応 (図 1D) プレート ファージに責任があった TXTL の無細胞系を示すプラーク合成。

図 2、均一不均一なプラクの試金と比較する.図 2Bは、図 2Aのプレートの均質なプラーク密度と比較してサブ最適な培養プレート間でプラーク密度のグラデーションを示しています。観察結果トップ寒天、サンプルおよびホストの細菌細胞実験のバクテリオファージの抗体部分の中に培養プレート上に分配されるときのマスター ミックスの急速な冷却からこのソース。バクテリオファージのプラクの不均一広がりを防止するために培養皿がバクテリオファージの抗体実験を開始する前に 37 ° C に平衡します。

ファージを正しくカウントするための重要なステップは、十分にプレート (図 3) あたり 50 〜 200 のプラクの間を取得するバクテリオファージ ソリューションを希釈することです。この範囲の下真の統計情報を決定することは困難だし、この範囲の上斑が重なる、正確なカウントを防止します。TXTL で合成されたファージの数濃度塩 (カリウム ・ マグネシウム)、分子 crowders とゲノムなどの生化学的な設定によって決まります。図 4、ファージ T7 と ΦΧ174 のテストのいくつかの例を紹介します。バクテリオファージ T7 など、DNA を複製するため遵守バクテリオファージ合成細胞遊離反応の高効率化: 反応におけるゲノム分子あたり 3 つの伝染性のバクテリオファージが合成されます。1 つは、ΦΧ174 など、その DNA はレプリケートされませんバクテリオファージのため反応の低い効率を期待できる: ゲノムの分子に合成の伝染性のバクテリオファージの比は 1:5。

Figure 1
図 1:試金のプラーク コントロールと無細胞反応 (CFR) システムを使用して成功した伝染性のバクテリオファージ生産。(A) ゲノムは追加されず、CFR の培養 (培養時間、0 分) が実行されません。反応しホスト大腸菌なしメッキ。結果は、CFR の細胞汚染実行可能なホストを示していません。(B) ゲノムは追加されませんでしたと CFR は 29 ° C で 12 h を孵化しホスト大腸菌なしメッキします。結果は、CFR、孵化後も細胞汚染実行可能なホストを表示しません。(C) 1 nM ゲノム CFR (インキュベーション時間として 0 分) のない潜伏に含まれている、エシェリヒア属大腸菌のホストとメッキします。結果は、ゲノム ソリューションのバクテリオファージ汚染を示しています。(D) 1 含まれている nM ゲノムと CFR 孵化 29 ° C で 12 h・大腸菌のホストとメッキ処理。結果は、CFR で成功した伝染性のバクテリオファージ レプリケーションを表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 価実験中にファージ反応の不均一拡散対均質。37 ° C の温度にしない平衡培養皿でバクテリオファージの抗体価を実行の可能な影響文化板全体ファージ反応の不均一広がりであります。ファージ反応の均一な拡散を表示する良い結果は (A) に示すように斑がプレートの表面に等間隔します。サブ最適な結果を (B) に示すプラクが培養プレートの左下部分に集中しています。ファージ反応とホスト セルのマスターの組合せが 37 ° c. の温度では培養プレート上に分配されるトップ寒天で可能性マスター ミックスの大半が左下の地域で立体化し、均質な広がりでは不可能であります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 携帯無料ファージ反応の抗体のための適切な希釈係数を設定します。(A) このプレート プラクの合理的に数えられる番号が表示されます。実験の価部分に使用希釈倍率希釈プレートに可算の斑を残すに十分なファージ反応収量です。逆に (B) の希釈倍率は合成されたバクテリオファージの収量に関して余りにも低かったし、調整が必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4:ファージの無細胞合成の特性ΦΧ174 および T7 。(A) 数合成 ΦΧ174 と T7 ファージ (PFU/mL: plaque 形成単位ミリリットル) の関数ペグ無細胞反応で 8000 濃度として 29 ° C で 16 時間後測定(B) 細胞反応におけるマグネシウム グルタミン酸濃度の関数として数合成 ΦΧ174 と T7 ファージを 29 ° C で 16 時間後測定(C) 無料の細胞反応における ΦΧ174 DNA ゲノム濃度の関数として合成 ΦΧ174 ファージ数を 29 ° C で 16 時間後測定(D) 合成の T7 バクテリオファージ T7 DNA ゲノム細胞遊離反応濃度の関数として数が 29 ° C で 16 時間後測定表示されるすべてのエラー バーが 3 つの繰り返し試験の標準偏差です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Table 1
表 1: 反応構成しますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

次の陳の手法14 SPMC、重複感染の適切な条件を決定する際の重要なステップは達されます。最も密接にホスト株の重複感染に耐える能力を制御するパラメーターは頻繁に感染しているバクテリオファージの初期濃度です。宿主細胞は、バクテリオファージの非常に少量の初期感染前に対数増殖期でなければなりません。最終的には、バクテリオファージはまた対数増殖を達するし、急速に各ホスト セルのバクテリオファージの複数のコピーを可能にする細胞数を凌駕するバクテリオファージの数字を許可すること。これは、それは換散を起こさない準安定状態に細胞を強制します。この状態に達していない場合、セルはカスケード、合流の換散を受けるのウイルス負荷がリリースされます。重複感染は、上記の初期ウイルス濃度を使用して到達できない場合、は、後続の試行をする前に 10 の要因によって感染の初期多様性を下げます。宿主細胞は、収穫前に溶解を行う重複感染が達していない場合は、すぐに別の精製法続行します。DNase を追加 5 μ g/mL と 500 μ L CHCl3すべて細胞換散を完成させるために。さらに 5 分間旋回し、細胞の残骸を削除する 10,000 × g で遠心分離を続けます。遠心分離機のバクテリオファージをペレットと一晩 4 ° C で 1 mL 合計 1 x TM バッファーで振ることがなく再懸濁します 1 2 時間 75,000 x g で上清を捨て。重複感染細胞の少量を使用してのテスト、どれだけ近いかセル換散によってどのように迅速に彼らはときを溶解するにさらされている追加のクロロホルムを測定することが可能です。細胞溶解し解決策を明確にほぼ瞬時に、細胞壁が非常に安定して、細胞は大規模なカスケードの溶解を防ぐためにすぐに収穫する必要があります。テストは、1-3 分以内で溶かすより大きなボリュームは 2 h まで使用中の大腸菌の局所ひずみによっての有無も。セルは 5 分以内溶解しない、バクテリオファージの成長がエシェリヒア属大腸菌の成長に追いついていないし、主な潜伏を続ける必要があります。30-60 分で再度テストを実行します。

準備されたショ糖密度勾配にファージを浄化、バクテリオファージは管の下の方法の 3 分の 2 と 3 分の 1 と非常に厚い、パールのバンドとして表示されます。比較的成功した換散および細胞残骸の精製ステップを仮定すると、どれも同様の密度やサイズの他、光のバンドがあるかもしれません。大規模な不透明なバンドは、滅菌注射器と鈍カニューレで、ソリューションから削除するバクテリオファージが含まれています。

プロトコル、バクテリオファージ価と無料の細胞反応の 3 番目のセクションを開始するとき、(ステップ 3.5) からホストの細菌プレートとも (ステップ 3.21) から価分析用培養皿に新鮮な培養皿 (1 週未満) を使用することをお勧めします。これは宿主細菌およびバクテリオファージの抗体価の高い感染効率の強い成長を促進します。ファージ培養皿は、プロトコルのバクテリオファージの抗体部分を開始する前に 1 時間の最小値の 37 ° C でプレインキュベートしたする必要があります。ファージ培養皿の前培養することがなく、(合成のバクテリオファージとホストの細胞培養を含む) トップ寒天液は培養プレートの表面を渡って均一配布することはできません。代わりに、トップ寒天液を均一表面 (図 2b) に固めます。これは無料の細胞反応のバクテリオファージの収穫の過小評価を引き起こす可能性が同じ場所でローカライズする複数のファージの確率を高めます。

各プラークは、宿主細胞内で複製し、宿主細胞を溶解宿主細胞に感染する 1 つの合成のバクテリオファージのイベントを表します。プラクはファージ感染している隣人ホスト細胞初期感染イベントからから潜伏期間中にサイズが大きくなります。斑が観察される場合、プロトコル セクション 4.6 は、希釈倍率が高すぎる結果任意の合成のバクテリオファージが宿主細胞に感染する確率が低いことが可能です。この問題を解決するには、3-4 桁 (または必要に応じて) に希釈倍率を減らすし、力価の実験を繰り返します。逆に、希釈倍率はプラク培養プレートの表面全体にまたがる、バクテリオファージの収穫をカウントすることは不可能で、その結果が高すぎるかもしれない。この場合、3-4 桁 (または必要に応じて) は、希釈倍率を増やします。よ特徴付けられたバクテリオファージのため無料の細胞反応の収率は、知られ、反応点ごとの 1 つだけ希釈係数価実験のため必要となります。新しいバクテリオファージを特性評価する際可算プラークを希釈のいずれかが生成されることを確保する、反応ポイントごと 2-3 異なる希釈倍率を含めることをお勧め (プラクの可算・不可算番号違いの図 3を参照にプレート)。

バクテリオファージの抗体の希釈倍率を変更した後は、プラークが観測されない、遺伝子発現は発生しなかったという点で無料の細胞反応に失敗したこと可能性があります。これの可能な説明は、ボルテックスによる細胞反応の均質化のための試薬/バクテリオファージ DNA の構造上の損傷で可能性があります。この問題を解決するには反応を繰り返し、優しく指で 5 ~ 7 倍反応管を叩くことによって、ゆっくりとの混合反応ピペットで 5 ~ 7 倍を均質化します。

無細胞反応系に由来するエシェリヒア属大腸菌と内生ホロ酵素の主なプロモーターのコンセンサスを認識する必要を形成するために結合エシェリヒア属大腸菌の RNA ポリメラーゼとシグマ 70、シグマ要因の両方が含まれていますエシェリヒア属大腸菌の遺伝子のシーケンス。さらに、反応の無細胞系は外因シグマ 70 のプロモーターのコンセンサス配列の下で他の六つの大腸菌シグマ因子遺伝子供給することにより全体のシグマ因子の転写方式を要約することができます。これによりすべてのバクテリオファージのゲノムはエシェリヒア属大腸菌の転写/翻訳機械と互換性を合成する機能です。これはバクテリオファージ研究または活用する無細胞反応系で合成できないのサブセットを残します。

無細胞転写・翻訳プラットフォームにより印象的なレベルの制御と生体内研究の方法と比較して反応条件の柔軟性。ファージ反応の多くの生化学的および遺伝性のコンポーネントを細かく調整し、分子クラウディングの図 4に示すように 24 h 未満の効果を直接観察できます。このペグのような分子の crowders の効果、自己組織化高分子複合体のされている理論的に説明され、示される体外18,19,20。分子クラウディング エントロピー駆動大きい biomolecular 構造の協会定数を増加させる機構です。携帯無料アプローチにより、バクテリオファージ、生体内での仕事の本質的な制限なしのようなモデル システムと自己組織化の生物のような複雑な生物学的プロセスを調査する研究者です。

このプラットフォームでは、応用分野でファージの有用性の調査も可能です。バクテリオファージのゲノムのコンポーネントは再利用でき、すぐに新規ナノ構造体に結果を組み込むことの目標と無細胞反応系におけるテストします。バクテリオファージはホスト細胞感染症は、抗生物質耐性菌のための代替としてファージ療法の有用性を促進するの選択性を高めるために変更できます。

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Disclosures

著者宣言次競合金融利益のため: Noireaux 研究所は、MYcroarray、MYtxtl 無細胞タンパク質発現キットのディストリビューターから研究資金を受け取る。

Acknowledgements

この材料は (v. n.) に海軍研究所受賞番号 N00014-13-1-0074 によってサポートされる作業に基づいて、人間科学フロンティア許可番号 RGP0037/2015 (砲兵/ベトナム) と二国間の科学技術振興財団 (v. n.) に 2014400 を与えます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

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References

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