Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

Bioengineering

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Summary

Uma nova geração de plataformas de transcrição-tradução livre de célula foi projetada para construir sistemas bioquímicos em vitro através da execução de circuitos de gene. Neste artigo, descrevemos como bacteriófagos, como MS2, ΦΧ174 e T7, são sintetizados a partir de seu genoma usando um Escherichia coli célula livre todos os sistema de TXTL.

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Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

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Abstract

Uma nova geração de sistemas sem célula transcrição-tradução (TXTL), projetado para ter uma maior versatilidade e modularidade, fornecer novos recursos para executar ciências básicas e aplicadas em reações de tubo de ensaio. Na última década, sem célula TXTL tornou-se uma técnica poderosa para uma ampla gama de biologia relacionados quantitativa e sintético de pesquisa multidisciplinar romance áreas. As novas plataformas TXTL são particularmente úteis para construir e interrogar os sistemas bioquímicos através da execução de circuitos de gene sintético ou natural. In vitro TXTL provou conveniente rapidamente elementos reguladores do protótipo e redes biológicas, bem como para recapitular molecular auto-montagem mecanismos encontraram em sistemas vivos. Neste artigo, descrevemos como infecciosos bacteriófagos, tais como MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) e T7 (dsDNA), são sintetizados inteiramente do seu genoma em um pot-reações usando um todos Escherichia coli, célula livre sistema TXTL. Síntese dos três coliphages é quantificada utilizando o ensaio da chapa. Mostramos como o rendimento do fago sintetizado depende das configurações bioquímicas das reações. Apinhamento molecular, emulado por uma concentração controlada de PEG 8000, afeta a quantidade de fago sintetizado por ordens de magnitude. Descrevemos também como amplificar os fago e como purificar seus genomas. O conjunto de protocolos e resultados apresentados neste trabalho deve ser de seu interesse multidisciplinares pesquisadores envolvidos em Bioengenharia e biologia sem célula sintética.

Introduction

Na última década, a tecnologia de célula livre expressão foi projetada para aplicações de romance endereço em biologia relacionadas a sintética e quantitativos de investigação multidisciplinar emergente áreas. Originalmente usado para expressar proteínas independentes de um organismo vivo, novos sistemas TXTL sem célula foram desenvolvidos para ambas as ciências básicas e aplicadas1,2, ampliar consideravelmente o alcance desta tecnologia. A nova geração de plataformas TXTL foi projetada para ser amigável, mais eficiente (atingindo 2 mg/mL de síntese de proteínas em modo de lote3), a mais versátil a nível de transcrição4e modular para integram facilmente romance natural ou funções sintéticas expandir as capacidades existentes sistemas biológicos5,6. Em particular, sistemas TXTL sem célula tornaram-se útil para a prototipagem rápida de programas genéticos, tais como elementos reguladores ou pequenos circuitos genéticos7,8,9, reduzindo o projeto-compilação-teste a alguns dias do ciclo. Notavelmente, os novos sistemas TXTL também são capazes de processar grandes programas de DNA como a síntese completa de coliphages10,11, demonstrando forte suficiente performances para apoiar a reconstituição da genômica ativo DNA codificado entidades vivas.

Sistemas TXTL apresentam muitas vantagens técnicas em relação ao tradicional em vitro construtivo ensaios bioquímicos. TXTL sem célula vincula o processo de expressão gênica ao produto final em um ambiente aberto e reduzido, em oposição ao complexo citoplasma de uma célula viva. TXTL usa DNA para reconstruir sistemas bioquímicos em vitro, que, com modernas técnicas de montagem de DNA, é acessível e rápido além de não exigir etapas de purificação de proteínas fastidioso. Expressão sem célula fornece acesso direto a maioria dos componentes nas reações bioquímicas, permitindo assim uma dissecação mais profunda das interações moleculares12. Em uma reação TXTL, um pode alterar as configurações de bioquímicas e biofísicas à vontade, que é quase impossível em uma célula viva. Dadas essas vantagens e melhorias recentes, a tecnologia TXTL está se tornando cada vez mais popular como uma plataforma alternativa para a biologia sintética e quantitativa. Enquanto a comunidade de pesquisa usando TXTL está crescendo rapidamente e TXTL está se tornando uma tecnologia padrão em bioengenharia, é essencial para entender como usar tais plataformas a fim de desenvolver práticas adequadas relacionadas com a execução de reações TXTL e para a interpretação dos resultados.

Neste artigo, descrevemos como usar um sistema TXTL de e. coli todos para sintetizar, em um pot-reações, bacteriófagos de seu genoma11, tais como MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) e T7 (dsDNA, 40 kb). Mostramos como a quantidade do fago sintetizado as alterações em relação a algumas das configurações de bioquímica das reações (concentração de magnésio e potássio). Apinhamento molecular, emulado por uma gama de PEG 8000 concentrações, tem um efeito dramático na síntese do fago sobre várias ordens de grandeza. A realização desses grandes sistemas bioquímicos em reações de único tubo de ensaio que recapitular simultaneamente os processos de transcrição, tradução e self-assembly, é interessante para abordar questões básicas relacionadas com a biologia e biofísica 10 (regulação gênica auto-montagem), bem como para desenvolvimento de aplicações, tais como a redefinição de funções do fago para construir novas nanoestruturas13. Além de um prático em TXTL, nós fornecemos métodos para amplificação do fago, extração de genoma e purificação e quantificação do fago por ensaio da chapa. Os métodos apresentados neste manuscrito são adequados para os investigadores que utilizam sistemas de célula livre extrato com base em Escherichia coli e estão interessados em bacteriófagos.

Os protocolos apresentados neste trabalho podem ser resumidos como segue: amplificação do fago 1) (1 dia: preparar inoculação células, dia 2: única placa, o crescimento do fago, múltiplas e concentração e dia 3: purificação do fago), 2) extração de DNA dupla-hélice do genoma (extração fenol/clorofórmio) e 3) sem célula reação do fago e experimento de título (1 dia: células hospedeiras da placa e fazer placas de ágar, dia 2: reação celular livre e anfitrião de células pré-cultura e dia 3: título de cultura e do fago de célula hospedeiro).

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Protocol

Nota: as seguintes etapas de amplificação e método de extração são amplamente generalizáveis para muitos do fago de DNA dupla-hélice, por exemplo, do bacteriófago T7, enterobactérias do fago T4 ou enterobactérias do fago λ (L). Eles são predominantemente utilizados para um phage cujo genoma não está prontamente disponível para a compra de fontes comerciais.

1. amplificação do fago

Nota: A único-placa, ciclo multi fago (SPMC) produção técnica é bem descrita para o phage T4 em Chen, et al 14 a seguir amplificação do fago e DNA método de extração é uma generalização para uso com fago de DNA de dupla-hélice de Escherichia coli, por exemplo, T7, T4 ou L. O sucesso final do protocolo depende fortemente da estirpe de célula de host selecionado ' s capacidade para suportar condições de superinfeção. Se as células hospedeiras são instáveis sob superinfeção, ou superinfeção nunca é alcançada, e lise nunca é atingida durante esta fase crítica, é melhor proceder com um protocolo de Lise confluente. Isso inclui separando os restos celulares através de centrifugação de alta velocidade e do fago granulação em velocidades de ultracentrifugação. Todas as condições e parâmetros seguintes destinam-se como ponto de partida geral. As melhores condições para uma linha de celular de host local podem ser diferentes; determinar e aderir às condições adequadas.

  1. Preparar células de inoculação
    1. inocular 10 mL mídia Luria-Bertani (LB) em um tubo de cultura 15 mL com células hospedeiras de Escherichia coli, por exemplo, B ou K12.
    2. Lugar em um shaker conjunto para 250 rpm e 37 ° C. deixar durante a noite para crescer a saturação.
  2. Single-placa bacteriana, crescimento do fago ciclo multi e concentração
    1. para preparar um prato de placas competentes do fago, aquecer várias placas LB-ágar a 37 ° C, durante 1 h, ou durante a noite.
    2. Preparar várias diluições do estoque do fago (por exemplo, T7, T4 ou L) de concentração conhecida na mídia LB, apontando para 3 de 2 -10 ~ 10 fago/mL.
    3. Adicione 100 µ l de crescimento durante a noite concentrado das células do hospedeiro para cada placa.
    4. Volumes de escolha do preparado de diluições de fago correspondente a um intervalo de 10-100 do fago/placa. Adicionar o volume necessário de diluições de fagos de cada placa (por exemplo, 100 µ l de 3 do fago/10ml; isto deve produzir placas ~ 100). Incubar as placas a 37 ° C e iniciar uma contagem (+ 0 h). Incubar durante 4-5 h.
    5. Preparar a mídia de 49 mL LB em um balão de 250 mL e o lugar em agitador rotativo definido como 250 rpm e 37 ° C.
    6. Em + 2,5 h, diluir as células x 50, adicionando 1 mL de cultura celular saturada de crescimento durante a noite para um balão previamente aquecido, contendo meio de 49 mL LB. Uma vez que as células de alcançar crescimento de log (+ 4-5h), medir a absorvância a 600 nm (OD 600). Determinar a concentração de células usando a conversão OD 600 de 1.0 = 8 x 10 8 células/mL.
    7. Dilua a 2 x 10 7 células/mL usando a mídia de crescimento adicional LB. Remova a placa de ágar contendo as placas do fago da incubadora. Imediatamente use o final de uma pipeta Pasteur estéril do núcleo e remover uma placa única. Sopre as células diluídas a placa e incubar a 37 ° C para um adicional 2 h (+ 6-7 h).
    8. Teste para infecção completa retirando uma amostra de 500 µ l em um tubo de 1,5 mL, adicionar 10 µ l clorofórmio (CHCL 3) e imediatamente num Vortex em alta velocidade. Observe se clarificou a solução. Uma vez que as células são totalmente infectadas, incubar por outro 2 h (+ 8-9 h).
      Nota: Se as células são totalmente infectadas, eles serão rapidamente lyse (< 2 min) e esclarecer a solução. Outros resultados são considerados na discussão seção abaixo. As células vão ser superinfected, mas não serão lyse até este ponto. Se lise começa, a adição de DNase e colheita por centrifugação deve começar imediatamente evitar a degradação do fago.
    9. Células de DNase adicionar de 5 µ g/mL e centrifugar a 8.000 x g a 4 ° C, a pelota. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o pellet em 10 mL de 1 x TRIS de cloreto de magnésio (TM) (50 mM Tris pH 7,8, 10 mM MgCl 2) buffer com 5 µ g/mL DNase. Adicione 500 µ l de CHCL 3 e vórtice em alta velocidade para lisar as células. Esclarecer por centrifugação a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C. decantar o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mL e loja em 4 ° C.

2. Purificação do fago

Nota: purificação da sacarose é largamente dependente do tamanho do fago. Considerações para a massa do fago isolados terão de ser feitas e os ajustes para condições de gradiente feitos. Uma concentração viral final de mais de 10 13 fago/mL é facilmente atingível com este método.

  1. Preparar 12 mL de sacarose de 5% e 45% p/v em TM tampão 1x.
  2. Prepare 4 x 5-45% gradientes de sacarose por pipetagem 2,5 mL de 45% de sacarose em 4 tubos de se. Top com ~ 2,6 mL de 5% de sacarose, parando quando o líquido atinge 2 mm da borda do tubo.
    Nota: Coloque a ponta da pipeta em contacto com a superfície da solução de sacarose e dispensar muito lentamente o líquido. A solução de sacarose a mais leve flutua em cima de mais pesados, formando um limite distinto. Uma solução corretamente em camadas terá interface de ~ 1 mm se mantido contra a luz de fundo.
  3. Misture os gradientes por rotação do tubo de inclinação usando um gradiente formando o instrumento para 43 s 86 ° a 23 rpm. Se não imediatamente necessário, cubra com filme de parafina e armazene a 4 ° C.
  4. Remover 500 µ l da parte superior de cada preparado gradiente de sacarose com uma pipeta de 1 mL e equilíbrio para dentro de ± 0,002 g.
  5. Suspensões de fago piscina de todos os tubos (etapa 1.2.9). Utilizando uma pipeta de 1 mL, adicione 500 µ l da suspensão, trazendo a ponta em contacto com a superfície líquida e muito lentamente, dispensando o volume na parte superior do gradiente de sacarose, tomando cuidado para não misturar através de pipetagem rápida. Centrifugar a 70.000 x g por 20 min a 4 ° C.
    Nota: Saldo os gradientes preparados para dentro fago menor de ± 0,002 g. podem demorar até 1 h.
  6. Remover as bandas do fago, usando uma seringa estéril e cânula romba.
    Nota: Quando visto de lado, a banda do fago vai ser grossa e leitosa em comparação com os arredores, a cerca de 5 mm de altura e situado a meio caminho para baixo o tubo de centrifugação.
    1. Submergir uma cânula romba na solução até que a ponta esteja centrada na borda muito superior da banda do fago. Remover a banda desenhando-se sobre o êmbolo da seringa até que a maioria da banda do fago foi removida.
  7. Adicionar o volume de sacarose com o fago suspenso para tubos de se 3-4. Adicione a não mais de 1,5 mL/tubo. Preenchimento de ~ 3-4 mm do topo do tubo com frio 1 x TM. Cubra com filme de parafina e inverter para misturar. Lugar em um se e girar a 145.000 x g, durante 1 h a 4 ° C a pelota. Fago menor pode demorar até 2 h.
  8. , Rapidamente, decantar o sobrenadante e escorrer de cabeça para baixo em lenços descartáveis. Limpe o interior do tubo com cotonete estéril para remover o excesso sobrenadante.
  9. Dividir 200-400 µ l frio 1x TM em todas as pelotas e ressuspender a noite a 4 ° C; nenhum tremor é necessária.
    Nota: Se o sedimento não é limpo, por exemplo, Barbantinho pedaços de membrana, DNA, etc, piscina e realizar centrifugação adicional numa microcentrifuga em 17.000 g. x
  10. o dia antes de fazer títulos, preparar uma cultura de células hospedeiras de Escherichia coli em meio de crescimento de 10 mL LB e deixar em uma incubadora tremendo conjunto para 250 rpm e 37 ° C durante a noite. Incubar a quantidade adequada de placas de cultura a 37 ° C pelo menos 1h antes de fazer uma concentração de estoque o fago.
    Nota: O número de placas para incubar depende do número de diluições do estoque do fago para ser chapeado: cada diluição original de estoque do fago requer duas placas de cultura (por exemplo, quatro diferentes diluições do estoque do fago exigem oito placas de cultura).
  11. Preparar 100 mL de ágar top adicionando 2,5 g LB e 0,6 g bacto ágar para um frasco de 100 mL. Dissolva os sólidos em água desionizada, num volume de 100 mL e autoclave. Depois da autoclave, lentamente inverta o frasco 6 - 8 vezes para homogeneizar o ágar-ágar em toda a solução. Coloque o frasco num banho de água de 45 ° C por 15-20 min equilibrar a temperatura .
  12. Preparar diluição serial das existências do fago com a solução LB.
    1. µ L 990 adicionar LB-10 ações de fago µ l para uma diluição de 100 vezes. Vórtice para homogeneizar. Para um fator de diluição de 10, adicionar 100 µ l de estoque do fago para µ l 900 lb. Vortex para homogeneizar.
    2. Repetir a série de diluição acima quantas vezes for necessário para obter um número contável de placas (placas de 10-100).
      Nota: Para conseguir isso, dilua o estoque do fago 2-3 ordens de magnitude menor que o rendimento esperado do fago em termos de reação do fago/mL. Por exemplo, se um estoque particular do fago contém 11 infecciosas do fago/10ml, placa o estoque do fago em um 10 8-fold ou 10 9-dobre diluição.
  13. Preparar uma área para títulos do fago pela montagem de tubos de cultura de 14 mL (o número de tubos de cultura é igual ao número de diluições de estoque do fago para ser chapeada). Colocar as amostras de estoque do fago diluídos da etapa 2.12 e as células bacterianas hospedeiras da etapa 2.10 na Ice.
  14. Prepara uma mistura de mestre pipetando agar top de 5,25 mL (passo 2.11), 220 µ l diluídos amostras do fago (etapa 2.12), e 50 µ l bacteriana células hospedeiras (passo 2.10) para uma cultura de 14 mL tube. Tampa do tubo de cultura e o vórtice em alta velocidade.
    1. Armazenar o restante da solução do fago em 4 ° C.
  15. Recuperar duas placas de cultura (passo 2.10) da incubadora a 37 ° C. Adicione 2,5 mL de mistura de mestre lentamente para o centro da primeira placa (sem bolhas). Rode suavemente a placa manualmente para distribuir uniformemente a mistura de mestre, para que abrange a placa toda a cultura. Repita com o segundo prato. Espere 20 min para garantir a solidificação do ágar superior. Incubar as placas a 37 ° C para 4-7 h.
  16. Contar as placas e determinar a concentração do fago para cada amostra de reação.
    Nota: Placas aparecerá como círculos clara de 1-2 mm no tapete opaco das células do hospedeiro. Veja a Figura 1 para obter resultados representativos. Uma produção de sucesso do fago resultará em concentrações finais de 12 -10 13 fago/10ml.

3. Extração de DNA do genoma de dupla-hélice

Nota: diluição, tremendo, e etapas de centrifugação devem ser otimizadas para desenvolver uma camada de limite de proteína espessa, sólida entre as fases aquosas e fenol. Isso gera os genomas de pureza maiores que estão livres de contaminantes de proteína. A diluição inicial é dependente do título final do fago. Um estoque de fago concentração extremamente elevada (≥ 10 13 fago/mL) pode ser necessário uma diluição de 10-20-fold antes de extração, enquanto ações de baixo título (~ 10 10 -10 11 do fago/mL) podem precisar de apenas um 2 vezes ou nenhum. Se é difícil formar uma camada de proteína sólida em etapas subsequentes ou a suspensão aquosa é muito pegajosa para ser praticável devido a alta concentração de DNA, considere uma maior diluição das existências do fago antes de continuar a extração. Durante qualquer etapa de manipulação de genoma, é importante utilizar pontas de pipetas de largo diâmetro quando Pipetar qualquer fases aquosas. Muitos genomas do fago são bastante grandes e facilmente fragmentada através de pipeta tosquia. Além disso, qualquer utilização do Vortex deve ser expressamente evitada como isto será severamente distorcer os genomas.

  1. Diluir uma parte do estoque do fago de passo 2.9 a 400 µ l com tampão de TM em um tubo 1,5 mL 1x.
  2. Adicionar um volume igual de Tris:Phenol:Chloroform para a diluição. Agitar a mistura suavemente sobre um roqueiro de laboratório, ou à mão, por 5 min. centrifugar a emulsão resultante a 17.000 x g em uma centrífuga de bancada de 5-10 min.
    Nota: Uma camada de proteínas distintas, branco na superfície da fase de fenol subjacente está presente.
  3. Remover a fase aquosa superior para um tubo novo, tomando cuidado para não perturbar o limite de interfase.
  4. Repita etapas 3.2-3.3 adicional 2 vezes para um total de 3 extracções de fenol. Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar um volume igual de CHCl 3. Agitar e centrifugar (passo 3.2). Transferir a amostra de DNA aquosa para um tubo limpo.
  5. Estimar o volume de DNA purificado. Adicione 0,4 volumes de acetato de sódio 3M (CH 3 COONa) e 3 volumes de 95% de etanol (EtOH). Coloque no congelador-20 ° C para a precipitação durante a noite. Centrifugar a 17.000 x g em uma centrífuga de bancada de 10-15 min.
    Nota: O DNA imediatamente desidrata-se e tornar-se visível como uma massa em suspensão no tubo. O sedimento resultante adequado é branco e bem embalado contra o fundo do tubo.
  6. Remover e descartar o sobrenadante por decantação ou pipetagem. Adicionar 500 µ l 70% EtOH e agite suavemente o tubo até que o sedimento flutua livre do fundo do tubo. Centrifugar a 17.000 x g, durante 5 min. remover e descartar EtOH, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.
  7. Repeat passo 3.6. Ar seco a pelota na bancada de 30-60 min. Adicionar 50 µ l do ddH 2 O ao pellet e incubar durante 1 h no RT ou durante a noite a 4 ° C para ressuspender. Determinar a concentração de DNA usando medidas de absorção em 280 nm.
    Nota: As concentrações esperadas são 0.5-5 µ g / µ l, usando esta técnica. Dividir pelo total peso molecular genômico para determinar a concentração de genoma final.

4. Sem célula Phage reação e Phage Titer experimento

  1. preparar meio LB de 25 g e 15 g-bacto ágar sólido, despeje em uma garrafa de 1 L e adicionar água desionizada para 1 L. Autoclave.
  2. Após a esterilização, inverta o frasco lentamente de 6 - 8 vezes tendo o cuidado para evitar a formação de bolhas. A inversão da garrafa irá homogeneizar o ágar sólido em toda a solução de 1 L. Colocar o frasco em um banho de água de 58 ° C por 20 min antes do fornecimento em placas de cultura.
  3. , Uma vez que a temperatura da solução LB-ágar tem incubado, preparar uma chama junto as placas de cultura para esterilizar o ambiente de perto as placas de cultura aberta. Mantenha o frasco de 1 L o banho de água para evitar a solidificação do ágar, tornando as alíquotas. Adicione 25 mL em uma placa de cultura de 100 x 15 mm. 1 L produzirá 40 placas de cultura.
  4. Uma placa de cultura de lado e deixe solidificar durante pelo menos 1 h no RT; esta placa será usada para chapeamento as células hospedeiras. Deixe as outras placas de 39 cultura solidificam durante 2 dias na loja RT. a 4 ° C ou usá-lo imediatamente para fazer títulos.
  5. Placa as células hospedeiras por estrias a estirpe bacteriana apropriada (por exemplo, anfitrião B para T7) que foi armazenado a-80 ° C, em placa de cultura LB-ágar. Raia ao lado de uma flama aberta para evitar contaminação ambiental. Incubar durante uma noite a 37 ° C. As células hospedeiras não tem nenhuma resistência aos antibióticos por trabalhar em um ambiente estéril é essencial.
  6. Reação de célula livre
    Nota: As reações de TXTL livre de célula são compostas de 33% bruto Escherichia coli extrair (proteína 8,9-9,9 mg/mL) com os outros 67% compostos de genoma de buffer e fago de reação. O extrato cru é preparado como anteriormente descrito, 15 , 16. Condições da reação final são: proteína 8,9-9,9 mg/mL (a partir de extrato bruto), 3-6 mM Mg-glutamato, 40-100 mM K-glutamato, 2-4% PEG 8000, 3 a 4 mM de cada aminoácido, preparado como descrito anteriormente, 17 e uma solução de mistura de energia, descrito anteriormente 15, composto de 3,33-0,33 mM DTT, 50 mM HEPES, 1,5 mM de ATP e o GTP, com 0.9 mM CTP e UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, acampamento de 0,75 mM, ácido folínico de 0,068 mM, espermidina 1 mM e 30 mM 3-PGA. DNA-tipo fago exige concentrações de genoma de 0.5-10 nM e RNA-tipo fago uma faixa de 50-150 nM. As concentrações finais de reação são exclusivas para o fago particular sintetizado e cairão dentro das escalas acima descritas. Para oxigenação ideal das reações, volumes de reação final devem ser entre 10 a 20 µ l. Existem pequenas variações no protocolo de reação, que dependem da forma da molécula de genômica. Por exemplo, moléculas de genoma linear exigem um componente adicional na reação para inibir a digestão de pedaços de DNA lineares pela enzima recBCD presente no extrato bruto.
    1. Complete o " detalhes da reação " seção na tabela 1 (PhageTXTL_JOVE), digitando o número total de reações e o volume final da reação.
    2. Desenha o experimento determinando os componentes constantes e variáveis componentes da reação. Digite a porcentagem do volume fracionário da mistura mestre, qual é a relação entre o volume total dos componentes de reação constante para o produto do volume final de reação e número de amostras. Digite o estoque e as concentrações finais dos reagentes na reação a " Master Mix reação receita " seção em PhageTXTL_JOVE. Entrar no estoque e concentrações finais dos termos variáveis a ser testado.
      Nota: Os volumes dos componentes de reação serão automaticamente calculados com base no volume mestre mistura e o volume final de cada reação individual.
    3. Remover a quantidade necessária de tubos (indicado na " tubos para descongelar " seção de PhageTXTL_JOVE.xlsx) do extrato bruto de celular, mistura de reserva de energia e aminoácidos mistura de-20 ° C ou -80 ° C e degelo na Ice.
      Nota: Uma vez descongelado, combinar várias alíquotas de como componentes (se necessário).
    4. Alíquota do volume indicado do crude extrair, 33% do volume final da reação, em um tubo de microcentrifugadora.
    5. Preparar a mistura mestre conforme tabela 1. Homogeneizar todos os componentes sob " Master Mix reação receita " vortexing. Adicionar o volume apropriado de cada componente para o extrato bruto.
    6. Se trabalhando com um fago com genoma de DNA linear (por exemplo, T7), adicionar 1 µM da proteína do lambda do bacteriófago gam para a reação de 11. Vórtice para homogeneizar a solução e coloque a reação no gelo por 5 min. Isto inibe a digestão das peças DNA lineares pelo complexo, o recBCD que é endógena no extrato bruto.
    7. Depois de adicionar o último componente conforme tabela 1, homogeneizar a reação vortexing. Dividir a mistura mestre nos tubos de microcentrifuga n.
      Nota: O volume de cada divisão é o produto da porcentagem do volume de mistura mestre fracionário e o volume final da reação. Por exemplo, para uma porcentagem do volume de mistura mestre fracionária de 90% e o volume final de reação de 12 µ l, o volume de cada divisão é 10.8 µ l.
    8. Adicionar os volumes indicados dos componentes variáveis para a matriz de mistura mestre (ver tabela 1). Adicione água para cada reação para atingir o volume final de reação desejada. Homogeneizar a cada reação vortexing. Incubar os tubos microcentrifuga a 29 ° C, durante pelo menos 8 h ou durante a noite.
  7. Pré-cultura celular de host
    Nota: A pré-cultura durante a noite é diluído 50: 1 para garantir que as células hospedeiras, usadas para o experimento de título estão em fase de registro médio, que aumenta a eficiência da infecção. As células de mid log são então re-concentradas por 10-fold e armazenadas no gelo.
    1. Usando uma ponta de pipeta estéril, inocular um tubo de cultura de 5 mL LB com 3 a 5 colônias de célula hospedeiro saudável. Trabalho ao lado de uma flama aberta para evitar contaminação.
    2. Incubar o tubo de cultura numa incubadora agitando a 37 ° C e 250 rpm para 16 h ou durante a noite. Células podem chegar a fase de saturação no dia seguinte.
  8. Host celular cultura e amostra preparação para título do fago
    1. dispensar 50 mL LB em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL e cubra com papel alumínio. Aquecer o balão a 37 ° C por 20 min.
    2. Alíquota 1 mL do anfitrião durante a noite pré-cultura de células para o pré-aquecido lb. incube durante 3-4 h a 37 ° C e agitação a 250 rpm.
    3. Centrifugar a cultura de pilha de anfitrião de 50ml durante 10 minutos a 5.000 g. x descartar o lb.
    4. Resuspenda o pellet com frio (4 ° C) 5ml LB e manter na Ice.
    5. Uma hora antes de iniciar o experimento de título, incubar as placas de cultura em 37 ° C.
      Nota: Cada reação do fago exclusivo (e fator de diluição correspondente) irão utilizar duas placas. Além disso, incube 4 placas para controles experimentais (ver Figura 1 para representante controles positivos e negativos).
    6. Preparar 100 mL de ágar superior (etapa 2,11).
  9. Preparar uma diluição serial da reação com solução LB sem célula conforme descrito na secção 2.12.
  10. Título do fago
    Nota: Começar a placa depois de pratos de cultura têm incubadas durante pelo menos 1 h e o ágar superior foi num banho de água a 45 ° C por 15-20 min após a remoção do autoclave.
    1. Solução de reação-LB titer a célula final-livre conforme descrito na seção 2, passos 2.14-2.16.

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Representative Results

Vamos mostrar quatro resultados representativos. Na Figura 1, apresentamos um conjunto de controles negativos para garantir que o sistema TXTL livre de célula e as existências de ADN do fago não estão contaminadas com vivos células de Escherichia coli . Verificamos que o sistema TXTL sem célula é livre de intacto Escherichia coli célula contaminação por chapeamento uma solução não incubados e incubadas reação vazio de DNA genômico (Figura 1A e Figura 1B). Se o sistema TXTL sem célula estava contaminado com células de Escherichia coli , seria observado na placa de crescimento. Além disso, podemos verificar que a reação sem célula e, portanto, não as células de possíveis contaminantes, são responsáveis pela síntese do fago por chapeamento reações não incubados e incubadas com o genoma do fago (Figura 1C e Figura 1D). A placa com a reação não incubados (Figura 1C) mostra zero placa enquanto a placa com a reação incubada (Figura 1D) mostra a placa, indicando que o sistema TXTL sem célula foi responsável por fago síntese.

Na Figura 2, comparamos uma homogênea versus ensaio da chapa não homogênea. Figura 2 B ilustra um gradiente de densidade da placa em toda a placa de cultura, que está abaixo do ideal em comparação com uma densidade homogênea placa a placa na Figura 2. A fonte disto viu resultado da refrigeração rápida de mestre mistura de top agar, amostra e host as células bacterianas quando dispensadas em uma placa de cultura durante a parte do título do fago do experimento... Para evitar uma propagação homogênea de placas do fago, certifique-se de que as placas de cultura são incubadas a 37 ° C antes de iniciar o experimento de título do fago.

Um passo crítico para contar corretamente fago é diluir a solução do fago suficientemente para obter entre 50 e 200 placas por placa (Figura 3). Abaixo desse intervalo, é difícil determinar as estatísticas de verdadeiras, e acima desta faixa, as placas se sobrepõem, impedindo a contagem exata. O número do fago sintetizado em TXTL depende das configurações bioquímicas, tais como a concentração de sais (potássio e magnésio), de crowders moleculares e de genomas. Na Figura 4, mostramos alguns exemplos de testes para os fago T7 e ΦΧ174. Para um fago que Replica seu DNA, tais como T7, observamos uma alta eficiência de síntese do fago na reação de célula livre: três fago infeccioso é sintetizado por molécula do genoma na reação. Pode-se esperar uma menor eficiência da reação de um fago que não Replica seu DNA, tais como ΦΧ174: a relação do fago infecciosa sintetizada, a molécula do genoma é de 1:5.

Figure 1
Figura 1: Controles de ensaio de placa bacteriana e produção bem sucedida do fago infecciosas, usando um sistema de reação sem célula (CFR). (A) nenhum genoma foi adicionada e realizou-se sem incubação (0 min como tempo de incubação) do CFR. A reação foi chapeada então sem acolhimento Escherichia coli. O resultado não mostra nenhum host viável contaminação de célula de CFR. (B) nenhum genoma foi adicionada e CFR foi incubado 12 h a 29 ° C e chapeado sem acolhimento Escherichia coli. Os resultados não mostram nenhum host viável contaminação celular do CFR, mesmo após a incubação. (C) 1 nM genoma acompanha sem incubação do CFR (0 min como tempo de incubação) e chapeado com host Escherichia coli. O resultado não mostra nenhuma contaminação do fago da solução do genoma. (D) 1 genoma nM incluído e CFR incubados 12 h a 29 ° C. e chapeado com host Escherichia coli. Resultados mostram a replicação do fago infecciosas bem sucedida no CFR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Homogênea versus heterogênea propagação da reação do fago durante o experimento título. Um possível efeito da execução de um título do fago em placas de cultura não incubadas a uma temperatura de 37 ° C é a propagação não homogênea da reação do fago uma placa de cultura. Um bom resultado, exibindo uma propagação homogênea da reação do fago é mostrado em (A), onde as placas são distribuídas uniformemente em toda a superfície da placa. Um resultado sub-ótimo é mostrado em (B), onde as placas estão concentradas na parte inferior esquerda da placa de cultura. Isso pode ocorrer com o top-ágar, reação do fago e anfitrião célula mestre mix são distribuídos em uma placa de cultura que não é a uma temperatura de 37 ° C. A maioria do mestre mix solidifica-se na região inferior esquerdo, e um spread homogêneo não é possível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Definindo um factor de diluição adequada para uma concentração de uma reação do fago sem célula. (A), esta placa exibe um número razoavelmente contável de placas. O fator de diluição usado para a parte do título do experimento diluído o rendimento da reação do fago suficiente para deixar um número contável de placas na chapa. Inversamente em (B) o factor de diluição foi muito baixo em relação ao rendimento do fago sintetizado e precisa ser ajustada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Caracterização da célula livre síntese do fago ΦΧ174 e T7. (A) número de ΦΧ174 sintetizado e fago T7 (PFU/mL: plaquunidades de formação e por mililitro) como uma função de PEG 8000 concentração na reação sem célula, medido após 16 h de incubação a 29 ° C. (B) número de ΦΧ174 sintetizado e fago T7 em função da concentração de magnésio-glutamato, na reação de célula livre, medido após 16 h de incubação a 29 ° C. (C) número do fago ΦΧ174 sintetizado em função da concentração de genoma de DNA ΦΧ174 na reação sem célula, medido após 16 h de incubação a 29 ° C. (D) número de sintetizado do fago T7 em função da concentração de genoma de DNA T7 na reação sem célula, medido após 16 h de incubação a 29 ° C. Todas as barras de erro exibidas são desvios-padrão dos três ensaios repetidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Table 1
Tabela 1: composição de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Seguindo a técnica em Chen, et al 14 para SPMC, um passo crítico é atingido quando determinar condições adequadas para o superinfeção. O parâmetro que controla a capacidade de uma estirpe hospedeiro para resistir a superinfeção mais estreitamente com frequência é a concentração inicial do fago infectante. As células hospedeiras devem estar em fase de crescimento logarítmico antes da infecção inicial, com uma pequena quantidade do fago. Eventualmente, a Praga também alcançará crescimento logarítmico e o objetivo é permitir que os números do fago superar rapidamente a contagem de células, permitindo várias cópias do fago em cada célula do hospedeiro. Isto força a célula em um estado quase estável onde ele não passará por Lise. Se este estado não for atingido, as células passam por lise em cascata, confluente e liberar sua carga viral. Se superinfeção não pode ser alcançada usando as concentrações virais iniciais acima, diminuir a multiplicidade inicial da infecção por um fator de dez, antes de fazer uma tentativa subsequente. Se as células hospedeiras lyse antes da colheita e superinfeção não for atingida, imediatamente com um processo de purificação separado. Adicionar DNase I 5 µ g/mL e 500 µ l CHCl3 para finalizar a lise celular tudo. Continue a agitar por um adicional 5 min e em seguida centrifugar a 10.000 g x para remover restos celulares. Decantar e centrifugar o sobrenadante a 75.000 x g, durante 1-2 h para a praga de pelotas e ressuspender a noite no buffer de TM total 1 x 1 mL a 4 ° C, sem tremer. Durante o teste de superinfeção usando um pequeno volume de células, é possível avaliar o quão perto células são a Lise por quão rapidamente eles lyse quando expostas o adicionado clorofórmio. Se as células lyse e a solução esclarece quase instantaneamente, as paredes celulares são muito instáveis e células devem ser colhidas imediatamente para evitar a lise de cascata em grande escala. Se o teste de Lise dentro de 1-3 min, os volumes maiores podem continuar a superinfect para até 2 h, dependendo da local estirpe de e. coli em uso. Se as células não lyse dentro de 5 min, o crescimento do fago não travou para o crescimento de Escherichia coli e incubação primária deve continuar. Execute o teste novamente em 30-60 min.

Quando purificante do fago em um gradiente de sacarose preparada, o phage aparecerá como uma banda muito grossa, perolada, entre um terço e dois terços do caminho para baixo do tubo. Assumindo uma lise relativamente bem sucedida e a etapa de purificação celular remanescente, pode haver outros bandos luz mas nenhuma de tamanho ou densidade semelhante. A banda grande, opaca contém o fago e é para ser removido da solução com uma seringa estéril e cânula romba.

Quando começar a terceira seção do protocolo, a reação celular livre e título do fago, é melhor usar placas de cultura fresco (menos de uma semana de idade) para a placa de bactérias do anfitrião (da etapa 3.5) e, também, as placas de cultura, usadas para a análise do título (da etapa 3.21). Isto promoverá mais forte crescimento de células de bactérias hospedeiras e maior eficiência de infecção para o título do fago. Placas de cultura do fago devem ser pré-incubadas a 37 ° C por um período mínimo de 1 h antes de iniciar a parte do título do fago do protocolo. Sem pré-incubação das placas de cultura de fago, a solução top-ágar (contendo a cultura de pilha do fago e host sintetizada) não irá distribuir homogeneamente em toda a superfície da placa de cultura. Em vez disso, a solução top-ágar solidify homogeneamente na superfície (Figura 2b). Isto aumenta a probabilidade do fago múltiplos, localizando-se no mesmo ponto, que pode causar uma subestimativa de rendimento do fago na reação de célula livre.

Cada chapa representa o evento de um fago sintetizado infectar uma célula hospedeira, replicação dentro da célula hospedeira e lise da célula hospedeira. Placas crescem em tamanho, durante o período de incubação da prole do fago infectante vizinho células hospedeiras do evento infecção inicial. Se não há placas são observadas, é possível que o factor de diluição feito no protocolo seção 4.6 é muito alto, resultando em uma baixa probabilidade de que qualquer sintetizado fago infecta uma célula hospedeira. Para corrigir isso, diminuir o factor de diluição de 3-4 ordens de magnitude (ou, se necessário) e repetir a experiência do título. Por outro lado, o factor de diluição pode ser muito alto, resultando em placas, abrangendo toda a superfície da placa de cultura, tornando-se impossível contar o rendimento do fago. Neste caso, aumente o fator de diluição de 3-4 ordens de magnitude (ou, se necessário). Para um bem caracterizadas do fago, o rendimento da reação sem célula será conhecido e fator de único diluição por ponto de reação será necessária para o experimento de título. Quando caracterizando um novo phage, é melhor incluir fatores de diluição diferente de 2-3 por ponto de reação, garantindo que uma das diluições trará uma placa contável (consulte a Figura 3 para as diferenças entre um número contável e incontável de placas na um prato).

Se nenhuma placa for observada depois de modificar o fator de diluição do título do fago, isso pode indicar que a célula livre reação teve sucesso em que a expressão do gene não ocorreu. Uma possível explicação para isso poderia ser danos estruturais de reagentes/fagos DNA devido a homogeneização da reação sem célula vortexing. Para corrigir esse problema, repita a reação e homogeneizar suavemente tocando o tubo de reação, cinco a sete vezes com um dedo, ou misturando lentamente a reação com uma pipeta de cinco a sete vezes.

O sistema de reação sem célula se origina de e. coli e endogenamente contém RNA polimerase de e. coli e o principal fator sigma, sigma 70, que se combinam para formar a holoenzima necessária reconhecer o consenso principal promotor sequências de genes de e. coli . Além disso, o sistema de reação sem célula pode recapitular o esquema de transcrição de todo fator sigma fornecendo exogenamente seis outros genes de fator sigma de e. coli sob a sequência do consenso de promotor do sigma 70. Isso permite que a capacidade de sintetizar todos os bacteriófagos cujas genomas são compatíveis com maquinaria de transcrição e tradução de e. coli. Isto deixa de fora um subconjunto do bacteriófago que não pode ser estudado ou sintetizado com o sistema de reação sem célula utilizado aqui.

A plataforma de transcrição/tradução livre de célula permite um impressionante nível de controle e flexibilidade das condições de reação, em comparação com métodos na vivo de estudo. Podemos ajustar finamente muitos componentes bioquímicos e genéticos de uma reação do fago e observar diretamente os efeitos em menos de 24h, conforme mostrado na Figura 4 para exclusão molecular. Os efeitos de crowders moleculares, tais como PEG, diante a auto-montagem de complexos macromoleculares sido teoricamente descrito e demonstrado em vitro18,19,20. Apinhamento molecular é uma entropia conduzido mecanismo que aumenta a constante de associação de estruturas grandes biomolecular. A abordagem sem célula permite que o pesquisador a sonda complicados processos biológicos como a Biofísica de auto-montagem com sistemas modelo, como os bacteriófagos, sem as limitações intrínsecas do trabalho na vivo .

Esta plataforma também permite a investigação da utilidade do fago em campos aplicados. Componentes do genoma do fago podem ser realocados e testadas rapidamente em um sistema de reação celular-livre com o objetivo de incorporação de resultados de nanoestruturas romance. Bacteriófagos podem ser modificados a fim de aumentar a seletividade de infecção de célula de acolhimento, o que promoveria a utilidade da terapia do fago como uma alternativa para as bactérias resistentes aos antibióticos.

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Disclosures

Os autores declaram o interesse financeiro concorrentes seguintes: laboratório de Noireaux recebe fundos de pesquisa do MYcroarray, um distribuidor do kit de expressão da proteína sem célula de MYtxtl.

Acknowledgements

Este material é baseado no trabalho suportado pelo escritório de pesquisa Naval prêmio número N00014-13-1-0074 (V.N.), o programa de ciência de fronteira humana conceder número RGP0037/2015 (a V.N.), e a Fundação científica Binacional conceder 2014400 (V.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

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References

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