Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

Bioengineering

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Summary

Una nueva generación de plataformas de transcripción-traducción libre de la célula ha sido diseñada para la construcción de sistemas bioquímicos en vitro a través de la ejecución de circuitos de gene. En este artículo describimos cómo bacteriófagos como MS2, ΦΧ174 y T7, son sintetizados a partir de su genoma mediante un todo e. coli sin células TXTL sistema.

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Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

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Abstract

Una nueva generación de sistemas libres de células transcripción-traducción (TXTL), diseñado para tener una mayor versatilidad y modularidad, proporcionar nuevas capacidades para ciencias básicas y aplicadas en reacciones de tubo de ensayo. En la última década, TXTL libres de células se ha convertido en una técnica poderosa para una amplia gama de la biología relacionados con cuantitativa y sintética de áreas nuevas investigaciones multidisciplinarias. Las nuevas plataformas TXTL son particularmente útiles para construir e interrogar a sistemas bioquímicos a través de la ejecución de circuitos gen sintético o natural. In vitro TXTL ha demostrado conveniente rápidamente elementos reguladores del prototipo y redes biológicas así que recapitulemos molecular autoensamblaje mecanismos encontraron en los sistemas vivos. En este artículo describimos cómo infecciosos bacteriófagos, como el MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) y T7 (dsDNA), son sintetizados totalmente de su genoma en las reacciones de un pote con Escherichia coli, un sistema libre de células TXTL. Síntesis de los tres colífagos se cuantifican utilizando el ensayo de placa. Mostramos cómo la producción de fagos sintetizada depende de los parámetros bioquímicos de las reacciones. Hacinamiento molecular, emulado a través de una concentración controlada de PEG 8000, afecta a la cantidad de fagos sintetizadas por órdenes de magnitud. También describimos cómo amplificar los phages y purificar sus genomas. El conjunto de protocolos y resultados presentados en este trabajo debe ser de interés para los investigadores multidisciplinarios involucrados en Bioingeniería y biología sintética sin células.

Introduction

En la última década, la tecnología de libre expresión ha sido diseñada para aplicaciones novedosas de dirección en biología relacionados con sintético y cuantitativa de áreas emergentes de investigación multidisciplinar. Originalmente utilizado para expresar las proteínas de un organismo vivo, se han desarrollado nuevos sistemas acelulares de TXTL para ambas ciencias básicas y aplicadas1,2, ampliar considerablemente el alcance de esta tecnología. La nueva generación de plataformas TXTL ha sido diseñada para ser fácil de usar, más eficiente (llegar a 2 mg/mL de síntesis de proteínas en modo batch3), más versátil a nivel de transcripción4y modular para integran fácilmente novela natural o funciones sintéticas que amplían las capacidades de los sistemas biológicos5,6. En particular, sistemas TXTL libres de células se han convertido en útiles para la creación rápida de prototipos de programas genéticos, tales como elementos reguladores o pequeños circuitos genéticos7,8,9, mediante la reducción de la prueba de diseño-construcción ciclo a unos pocos días. Sorprendentemente, los nuevos sistemas TXTL también son capaces de procesar grandes programas de ADN como la síntesis completa de colífagos10,11, demostrando fuerte suficientes prestaciones para apoyar la reconstitución del activo genómica DNA codificadas entidades vivientes.

TXTL sistemas presentan muchas ventajas técnicas en comparación con el tradicional en vitro constructivo ensayos bioquímicos. Sin células TXTL vincula el proceso de la expresión génica al producto final en un ambiente reducido y abierto, en comparación con el complejo citoplasma de una célula viva. TXTL usa ADN para reconstruir sistemas bioquímicos en vitro, que, con modernas técnicas de la Asamblea de ADN, es asequible y rápido además de no requerir pasos de purificación de proteína fastidioso. Expresión libre de la célula proporciona acceso directo a la mayoría de los componentes de las reacciones bioquímicas, lo que permite una disección más profunda de las interacciones moleculares12. En una reacción TXTL, uno puede cambiar los ajustes bioquímicos y biofísicos en la voluntad, que es casi imposible en una célula viva. Teniendo en cuenta estas ventajas y mejoras recientes, la tecnología TXTL se está convirtiendo en cada vez más popular como una plataforma alternativa para la biología sintética y cuantitativa. Mientras que la comunidad de investigación usando TXTL está creciendo rápidamente y TXTL se está convirtiendo en una tecnología estándar de la bioingeniería, es esencial para entender cómo utilizar las plataformas para el desarrollo de prácticas apropiadas y relacionadas con la ejecución de reacciones TXTL y a la interpretación de los resultados.

En este artículo se describe cómo utilizar un sistema TXTL todos de e. coli para sintetizar, en una olla reacciones, bacteriófagos de su genoma11, como MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) y el T7 (dsDNA, 40 kb). Nos muestran cómo la cantidad de fagos había sintetizado cambios con respecto a algunos de los valores bioquímicos de las reacciones (concentraciones de magnesio y potasio). Hacinamiento molecular, emulado a través de una gama de PEG 8000 concentraciones, tiene un efecto dramático sobre la síntesis de fago en varios órdenes de magnitud. La realización de estos grandes sistemas bioquímicos en reacciones de simple tubo de ensayo que recapitulan simultáneamente los procesos de transcripción, traducción y uno mismo-Asamblea, es interesante para abordar preguntas básicas relacionadas con la biología y Biofísica 10 (regulación de los genes, uno mismo-Asamblea), así como para el desarrollo de aplicaciones, tales como reasignación de funciones del fago para construir nuevas nanoestructuras13. Además de un práctico en TXTL, ofrecemos métodos de amplificación de fago, extracción de genoma y purificación y cuantificación de fago por el ensayo de placa. Los métodos presentados en este manuscrito son apropiados para los investigadores que usan sistemas de sin células de e. coli extracto basado en y están interesado en bacteriófagos.

Los protocolos presentados en este trabajo se pueden resumir como sigue: amplificación 1) Phage (día 1: inoculación de preparar células, día 2: solo placa múltiple phage y concentración y el crecimiento día 3: purificación de fagos), 2) extracción de ADN de genoma Double-stranded (extracción de fenol/cloroformo) y 3) experimento de título y reacción de fagos libres de células (día 1: placa las células del huésped y hacer las placas de agar, día 2: reacción libre y anfitrión célula precultivo y día 3: título cultura y phage célula del anfitrión).

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Protocol

Nota: los pasos siguientes de la amplificación y el método de extracción son en gran medida generalizables para muchos fago de DNA de doble cadena, por ejemplo, bacteriófago T7, fago T4 de enterobacterias o enterobacterias fago λ (L). Se utilizan predominante para un fago cuyo genoma no está disponible para la compra de fuentes comerciales.

1. amplificación de fago

Nota: la técnica de elaboración de fago (SPMC) solo-placa, multi-ciclo es descrita bien por el fago T4 en Chen, et al. 14 la siguiente amplificación de phage y ADN método de extracción es una generalización para el uso con phages de ADN de doble hebra de e. coli, por ejemplo, T7, T4 o L. El éxito definitivo del protocolo depende fuertemente de la tensión de la célula anfitrión seleccionado ' capacidad para soportar condiciones de sobreinfección. Si las células hospedadoras son inestables bajo sobreinfección, nunca se llega a sobreinfección y lisis nunca se alcanza durante esta fase crítica, es mejor proceder con un protocolo de lisis confluente. Esto incluye la separación de los desechos celulares a través de centrifugación de alta velocidad y phage granulación a velocidades de ultracentrifugación. Todas las condiciones y parámetros siguientes sirven como punto de partida general. Las condiciones óptimas para una línea de celular de host local pueden ser diferentes; determinar y cumplir con las condiciones adecuadas.

  1. Preparar células de inoculación
    1. inocular 10 mL de medio Luria-Bertani (LB) en un tubo de 15 mL de cultivo con las células del huésped e. coli, p. ej., B o K12.
    2. Lugar en una coctelera a 250 rpm y 37 ° C. dejar durante la noche para alcanzar saturación.
  2. Solo-placa, fago de múltiples ciclo crecimiento y concentración
    1. para preparar un plato de placas de fagos competente, caliente varias placas de LB agar a 37 ° C durante 1 hora o toda la noche.
    2. Preparar varias diluciones del stock de fago (por ejemplo, T7, T4 o L) de concentración conocida en los medios LB, con el objetivo de ~ 10 2 -10 3 phage/mL.
    3. Agregar 100 μl de crecimiento durante la noche de las células del huésped concentrada a cada placa.
    4. Elegir volúmenes de las diluciones de phage correspondiente a un rango de 10-100 phage/placa. Añadir el volumen necesario de diluciones de fago a cada plato (por ejemplo, 100 μl del fago de 10 3/mL; esto debe producir placas de ~ 100). Incube las placas a 37 ° C y comienza un cronómetro de cuenta ascendente (+ 0 h). Incubar durante 4-5 h.
    5. Preparar los medios de comunicación 49 mL LB en un matraz de 250 mL y en agitador rotatorio a 250 rpm y 37 ° C.
    6. En + 2,5 h, diluir las células 50 x agregando 1 mL del cultivo celular saturado de crecimiento durante la noche en un matraz precalentado que contiene medio de 49 mL LB. Una vez que las células llegar a los registro de crecimiento (+ 4-5 h), medir la absorbancia a 600 nm (OD 600). Determinar la concentración de las células mediante la conversión de OD 600 de 1.0 = 8 x 10 8 células/mL.
    7. Diluido a 2 x 10 7 células/mL mediante medios de cultivo LB adicionales. Retire la placa de agar que contiene las placas de fagos de la incubadora. Inmediatamente use el extremo de una pipeta Pasteur estéril para la base y quitar una sola placa. Soplar la placa en las células diluidas e incubar a 37 ° C durante 2 h más (+ 6-7 h).
    8. Prueba para la infección por completa tomando una muestra de 500 μl a un tubo de 1,5 mL, añadir 10 μl cloroformo (CHCL 3) e inmediatamente Vortex a alta velocidad. Observar si la solución ha aclarado. Una vez que las células están totalmente infectadas, incubar durante otro 2 h (+ 8-9 h).
      Nota: Si las células están totalmente infectadas, serán rápidamente lyse (< 2 min) y aclarar la solución. Otros resultados son considerados en la discusión sección abajo. Las células se superinfección pero no se Lisan hasta este punto. Si comienza la lisis, la adición de DNasa y extracción por centrifugación debe comenzar inmediatamente evitar la degradación de fago.
    9. Agregar ADNasa a 5 μg/mL y centrifugar las células a 8.000 x g a 4 ° C a la pelotilla. Deseche el sobrenadante. Resuspender el sedimento en 10 mL de cloruro de magnesio de 1 x TRIS (TM) (50 mM Tris pH 7,8, 10 mM de MgCl 2) tampón con 5 μg/mL de DNasa. Agregar 500 μl de CHCL 3 y agitar a gran velocidad para lisar las células. Clarificar por centrifugación a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C. decantar el sobrenadante en un tubo cónico de 15 mL y conservar a 4 ° C.

2. Purificación del fago

Nota: purificación de sacarosa es en gran parte dependiente en el tamaño de los fagos. Consideraciones para la masa de los fagos a aislarse tendrá que hacerse y realizaron ajustes a las condiciones de gradiente. Son fácilmente alcanzables con este método los títulos virales finales de más de 10 13 phage/mL.

  1. Preparar 12 mL de 5% y el 45% de sacarosa w/v en 1 x buffer TM.
  2. Preparar gradientes de sacarosa de 4 x 5-45% por pipetear 2,5 mL de sacarosa al 45% en 4 tubos de ultracentrífuga. Superior con ~ 2,6 mL de sacarosa al 5%, parando cuando el líquido alcanza 2 mm desde el borde del tubo.
    Nota: Coloque la punta de la pipeta entre en contacto con la superficie de la solución de sacarosa y dosificar muy lentamente. La solución de sacarosa más ligera flotará encima de más pesados, formando un límite distinto. Una solución correctamente capa tendrá interfaz de ~ 1 mm si sostuvo contra la luz de fondo.
  3. Mezcla los gradientes por rotación de tubo en inclinar mediante un degradado formando instrumento para 43 s 86 ° 23 rpm. Si no inmediatamente necesario, cubra con película de parafina y almacenar a 4 ° C.
  4. Eliminar 500 μl de la parte superior de cada preparado gradiente de sacarosa con una pipeta de 1 mL y equilibrio dentro de ± 0,002 g.
  5. Suspensiones de fago de piscina de todos los tubos (paso 1.2.9). Con una pipeta de 1 mL, Añadir 500 μl de la suspensión de la punta en contacto con la superficie del líquido y dispensadores muy lentamente el volumen en la parte superior del gradiente de sacarosa, teniendo cuidado de no mezclar mediante pipeteo rápido. Centrifugar a 70.000 x g por 20 min a 4 ° C.
    Nota: Balance de los gradientes preparados para dentro de phages menor de ± 0,002 g. pueden tardar hasta 1 h.
  6. Retire las bandas de fago utilizando una jeringa estéril y cánula embotada.
    Nota: Cuando se mira desde el lado, la banda de fago será grueso y lechoso en comparación con el entorno, aproximadamente 5 mm de altura y situado a medio camino hacia abajo el tubo de centrífuga.
    1. Sumerja una cánula embotada en la solución hasta que la punta esté centrada en el borde muy superior de la banda de fago. Quite la cinta de dibujando en el émbolo de la jeringa hasta que se ha eliminado la mayoría del grupo phage.
  7. Añadir el volumen de sacarosa con el phage de la suspensión a 3-4 tubos de ultracentrífuga. Agregar no más de 1,5 mL/tubo. Llenado a ~ 3-4 mm de la parte superior del tubo con frío 1 x TM. Cubrir con la película de parafina e invertir para mezclar. Lugar en una ultracentrífuga y vuelta a 145.000 x g durante 1 h a 4 ° C para que sedimenten. Phages más pequeño pueden tomar hasta 2 h.
  8. Rápidamente retirar el sobrenadante y escurrir boca abajo sobre paños desechables. Para limpiar el interior del tubo con hisopo de algodón estéril para eliminar sobrenadante exceso.
  9. Dividir 200-400 μL frío 1 x TM en todas las pelotillas y suspender durante la noche a 4 ° C, agitación no se requiere.
    Nota: Si el pellet no está limpio, por ejemplo, fibrosos pedacitos de membrana, ADN, etc., de la piscina y realizar la centrifugación adicional en una microcentrífuga a 17.000 x g.
  10. El día antes de hacer títulos, preparar un cultivo de las células del huésped e. coli en medios de cultivo de 10 mL LB y dejar en un incubador de agitación establecido en 250 rpm y 37 ° C durante la noche. Incubar la cantidad apropiada de placas a 37 ° C durante al menos 1 h antes de hacer los títulos de las acciones de fago.
    Nota: El número de las placas a incubar depende del número de diluciones del stock de fago a platear: cada dilución única de acción phage requiere dos placas (p. ej., cuatro diferentes diluciones del stock de fago requieren ocho placas).
  11. Preparar 100 mL de agar superior agregando 2,5 g LB y 0,6 g de bacto-agar a una botella de 100 mL. Disolver los sólidos en agua desionizada en un volumen de 100 mL y autoclave. Después de autoclave, lentamente invierta la botella 6 - 8 veces para homogeneizar el agar a través de la solución. Coloque la botella en baño de agua de 45 ° C durante 15-20 min equilibrar la temperatura .
  12. Preparar una dilución seriada de las existencias del fago con la solución LB.
    1. Agregar 990 μl LB a 10 stock de fago μl de una dilución de 100-fold. Vortex para homogeneizar. Para un factor de dilución de 10, añada 100 μl del stock de fago a 900 μl lb Vortex para homogeneizar.
    2. Repetir la serie de dilución anterior tantas veces como sea necesario para obtener un número contable de placas (placas de 10-100).
      Nota: Para ello, diluir el stock de fago 2-3 órdenes de magnitud menos que el rendimiento de fago esperada en términos de reacción phage/mL. Por ejemplo, si una acción particular fago contiene 10 11 infecciosas phage/mL, placa del stock de fago en una 10 8-fold o 10 9-doble dilución.
  13. Preparar una zona para títulos de fago montando tubos de cultivo de 14 mL (el número de tubos de cultivo equivale al número de diluciones stock de fago a platear). Coloque las muestras stock de fago diluido del paso 2.12 y las células bacterianas de host de paso 2.10 en hielo.
  14. Prepara una mezcla principal mediante pipeteo agar superior 5,25 mL (paso 2.11), 220 μl diluir muestras del fago (paso 2.12) y 50 μl host las células bacterianas (paso 2.10) a una cultura de 14 mL del tubo. Tapa el tubo de cultivo y el vórtice de alta velocidad.
    1. Guardar la solución restante del phage a 4 ° C.
  15. Recuperar dos placas (paso 2.10) de la incubadora de 37 ° C. Añadir 2,5 mL de mezcla principal lentamente al centro de la primera placa (sin burbujas). Gire suavemente la placa con la mano para distribuir uniformemente la mezcla principal que atraviesa la placa de toda la cultura. Repita con la segunda placa. Espere 20 minutos para asegurar la solidificación del agar superior. Incube las placas a 37 ° C durante 4-7 h.
  16. Contar las placas y determinar la concentración de fagos para cada muestra reacción.
    Nota: Las placas aparecerán como círculos claro 1-2 mm en la alfombra opaco de las células del huésped. Vea la figura 1 para obtener resultados representativos. Una producción de fago éxito resultará en concentraciones finales de 12 -10 10 13 phage/mL.

3. Extracción de ADN del genoma de doble cadena

Nota: dilución, temblando, y pasos de centrifugación deben ser optimizadas para el desarrollo de una capa de límite de proteína gruesa y sólida entre las fases acuosas y fenol. Esto genera los genomas de pureza más alta que son libres de contaminantes de la proteína. La dilución inicial depende de la concentración final del fago. Un stock de fagos de muy alto título (≥ 10 13 phage/mL) pueden necesitar una 10-20-veces la dilución antes de la extracción, mientras las poblaciones título bajo (~ 10 10 -10 11 phage/mL) pueden necesitar sólo un 2 veces o ninguna. Si es difícil formar una capa de proteína sólida en los pasos posteriores o la suspensión acuosa es demasiado pegajosa para ser viable debido a la alta concentración de ADN, considera una mayor dilución de las poblaciones phage antes de continuar la extracción. Durante cualquier paso de la manipulación del genoma, es importante usar puntas de pipeta ancha cuando uso cualquier fases acuosas. Muchos genomas de fagos son bastante grandes y fácilmente fragmentados a través de la pipeta de corte. Además, cualquier Vortex deberá expresamente evitarse ya que esto distorsionar gravemente los genomas.

  1. Diluir una parte del stock de fago de paso 2.9 a 400 μL con 1 x buffer TM en un nuevo tubo 1,5 mL.
  2. Añadir un volumen igual de Tris:Phenol:Chloroform a la dilución. Agitar la mezcla suavemente en un eje de balancín de laboratorio, o a mano, para 5 min Centrifugue la emulsión resultante a 17.000 x g en una centrífuga de mesa para 5-10 minutos
    Nota: Existe una capa de proteínas distintas, blanco en la superficie de la fase de fenol subyacente.
  3. Eliminar la fase acuosa superior a un tubo nuevo con cuidado para no perturbar la frontera interfase.
  4. Repita pasos 3.2-3.3 adicionales 2 veces para un total de 3 extracciones de fenol. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo y añadir un volumen igual de CHCl 3. Agitar y centrifugar (paso 3.2). Transferir la muestra de ADN acuosa a un tubo limpio.
  5. Estimar el volumen de ADN purificado. Agregar 0,4 volúmenes de acetato de sodio de 3 M (CH 3 COONa) y 3 volúmenes de etanol al 95% (EtOH). Coloque en el congelador de-20 ° C precipitación durante la noche. Centrífuga a 17.000 x g en una centrífuga de mesa para 10-15 minutos
    Nota: El ADN inmediatamente deshidratarse y hacerse visible como una masa en suspensión en el tubo. El pellet resultante adecuado es blanco y bien lleno contra la parte inferior del tubo de.
  6. Retirar y desechar el sobrenadante por decantación o por pipeteo. Añadir 500 μl 70% EtOH y sacuda suavemente el tubo hasta que el pellet flota gratis desde el fondo del tubo. Centrifugar a 17.000 x g durante 5 minutos Retire y deseche el EtOH, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
  7. Repetir paso 3.6. Aire seca a la pelotilla en el Banco durante 30-60 minutos añadir 50 μl ddH 2 O a la pelotilla e incubar durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C para suspender de nuevo. Determinar la concentración de DNA usando medidas de absorción a 280 nm.
    Nota: Las concentraciones esperadas son 0.5-5 μg/μl utilizando esta técnica. Dividir por el total peso molecular genómico para determinar la concentración del genoma final.

4. Celular libre reacción Phage y Phage título experimento

  1. preparar medio g 25 LB y sólido de bacto-agar 15 g, vierta en una botella de 1 litro y añadir agua desionizada a 1 L. Autoclave.
  2. Después de la esterilización, invierta la botella cuidando lentamente de 6 a 8 veces para evitar la formación de burbujas. La inversión de la botella será homogeneizar el agar sólido en la solución de 1 L. Coloque la botella en un baño de agua de 58 ° C por 20 min antes de dispensar en placas de cultura.
  3. Una vez que ha equilibrado la temperatura de la solución de LB-agar, preparar un fuego al lado de las placas de cultivo para esterilizar el ambiente cerca de las placas de cultura abierta. Mantenga la botella de 1 L en el baño de agua para evitar la solidificación del agar haciendo las alícuotas. Añadir 25 mL en una placa de cultivo 100 x 15 mm. 1 L producirá 40 placas de cultura.
  4. Una placa de cultivo de lado y dejar que solidifique durante al menos 1 h a temperatura ambiente, esta placa se utilizará para las células hospedadoras de la galjanoplastia. Deja que los otros 39 placas solidifican durante 2 días en la tienda de RT. a 4 º C o utilizan de inmediato para hacer títulos.
  5. De la placa las células hospedadoras por rayar la cepa bacteriana apropiada (por ejemplo, host B para T7) que se almacenó a-80 ° C, en LB-agar-cultura. Raya al lado de una llama abierta para evitar la contaminación ambiental. Incubar durante una noche a 37 ° C. Las células hospedadoras no tienen ninguna resistencia a los antibióticos por lo que es esencial trabajar en un ambiente estéril.
  6. Libre de la reacción
    Nota: Las reacciones de TXTL sin células se componen de 33% crudo e. coli extracto (proteína 8.9 9.9 mg/mL) con el 67% de genoma de reacción tampón y fago. El extracto crudo se prepara anteriormente descrito 15 , 16. Las condiciones de la reacción final: 8.9 9.9 mg/mL proteína (extracto crudo), 3-6 mM Mg-glutamato, 40-100 mM K-glutamato, 2-4% PEG 8000, 3-4 mM de cada aminoácido, preparado como anteriormente descrito 17 y una solución de mezcla de energía, se describe previamente 15, conformada por 0.33 3.33 mM DTT, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP y GTP, 0,9 mM CTP y UTP, 0,2 mg/mL tRNA 0,26 mM CoA, NAD de 0,33 mM, campo de 0,75 mM, ácido folínico de 0,068 mM, espermidina 1 mM y 30 mM 3-PGA. Fagos DNA tipo requieren concentraciones de genoma de 0.5-10 nM y phages RNA tipo requieren una gama de 50-150 nM. Las concentraciones de la reacción final son únicas para el fago particular sintetizada y caerán dentro de los rangos descritos anteriormente. Para la oxigenación óptima de las reacciones, volúmenes de reacción final deben estar entre 10-20 μl. Hay pequeñas variaciones en el protocolo de reacción, que depende de la forma de la molécula genómica. Por ejemplo, las moléculas del genoma lineal requieren un componente adicional en la reacción para inhibir la digestión de piezas lineales de ADN por la enzima recBCD presente en el extracto crudo.
    1. Completo el " detalles de reacción " sección en el cuadro 1 (PhageTXTL_JOVE) introduciendo el número total de reacciones y volumen final de reacción.
    2. Diseño el experimento de determinación de las componentes constante y variable de la reacción. Escriba el porcentaje de volumen fraccional de la mezcla principal, que es la relación entre el volumen total de los componentes de la reacción constante al producto del volumen final de reacción y el número de muestras. Introduzca los valores y concentraciones finales de los reactivos de la reacción en el " Master Mix reacción receta " sección de PhageTXTL_JOVE. Introduzca los valores y concentraciones finales de la variable reagent(s) a probar.
      Nota: Los volúmenes de los componentes de la reacción serán automáticamente calculados basada en el volumen de la mezcla principal y el volumen final de cada reacción individual.
    3. Retire la cantidad necesaria de tubos (indicado en las " tubos para descongelar " sección de PhageTXTL_JOVE.xlsx) de extracto crudo de la célula, energía buffer mezcla y mezcla de aminoácidos de-20 ° C o -80 ° C y descongelar el hielo.
      Nota: Una vez descongelado, se combinan múltiples alícuotas de igual que los componentes (si es necesario).
    4. Extracto de alícuota el volumen indicado de crudo, 33% del volumen de reacción final, en un tubo de microcentrífuga.
    5. Preparación de la mezcla principal según la tabla 1. Homogeneizar todos los componentes bajo " Master Mix reacción receta " con un vórtex. Añadir el volumen adecuado de cada componente para el extracto crudo.
    6. Si trabaja con un fago con genoma de DNA lineal (por ejemplo, T7), añadir 1 μm de la proteína de gam del bacteriófago lambda a la reacción 11. Vortex para homogeneizar la solución y coloque la reacción en hielo por 5 min. Inhibe la digestión de las piezas lineales de ADN por el complejo recBCD que es endógena en el extracto crudo.
    7. Después de agregar el último componente según la tabla 1, homogeneizar la reacción con un vórtex. Dividir la mezcla principal en tubos de microcentrífuga de n.
      Nota: El volumen de cada partida es el producto del porcentaje de volumen fraccional mezcla principal y el volumen final de reacción. Por ejemplo, para un porcentaje de volumen fraccional principal mezcla de 90% y el volumen de reacción final de 12 μl, el volumen de cada partida es 10,8 μl.
    8. Añadir los volúmenes indicados de los componentes de la variable a la matriz de mezcla principal (ver tabla 1). Añadir agua a cada reacción para alcanzar el volumen de reacción final deseada. Homogeneizar cada reacción por Vortex. Incubar los tubos de microcentrífuga a 29 ° C por al menos 8 horas o durante la noche.
  7. Pre-cultivo de host celular
    Nota: la cultura de la noche es diluido 50: 1 para asegurar que las células de host utilizadas para el experimento de titulación en la fase de registro medio, que aumenta la eficiencia de la infección. Las células de registros medio son entonces re-concentradas por 10 veces y almacenadas en hielo.
    1. Utilizando una pipeta estéril, inocular un tubo de cultivo de 5 mL LB con colonias de células huésped sano 3-5. Trabajo al lado de una llama abierta para evitar la contaminación.
    2. Incubar el tubo de cultivo en un incubador de agitación a 37 ° C y 250 rpm para 16 h o durante la noche. Las células pueden llegar a fase de saturación en el día siguiente.
  8. Anfitrión célula cultura y muestra preparación para título de fago
    1. dispensar 50 mL LB en un matraz Erlenmeyer de 500 mL y tapa con papel de aluminio. Calentar el frasco a 37 ° C durante 20 min
    2. Alícuota 1 mL de anfitrión durante la noche pre-cultivo celular en el precalentado lb incubar durante 3-4 h a 37 ° C y agitación a 250 rpm.
    3. Centrifugar el cultivo de células de host de 50 mL durante 10 minutos a 5.000 x g. Deseche la lb
    4. Resuspender el precipitado con frío (4 ° C) 5 mL LB y mantener en hielo.
    5. Una hora antes de comenzar el experimento de titulación, incubar las placas a 37 ° C.
      Nota: Cada reacción phage único (y el correspondiente factor de dilución) utilizan dos placas. Además, Incube las 4 placas controles experimentales (ver figura 1 para representante de controles positivos y negativos).
    6. Preparar 100 mL de agar superior (paso 2.11).
  9. Preparar una dilución seriada de la reacción sin células con solución LB como se describe en la sección 2.12.
  10. Título de fago
    Nota: Empezar a placa después de platos de la cultura han incubado durante al menos 1 h y el agar superior estaba en el baño de agua de 45 ° C durante 15-20 min después de la eliminación de la autoclave.
    1. Solución de reacción-LB título el final libre de células como se describe en la sección 2, medidas 2.14-2.16.

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Representative Results

Mostramos cuatro resultados representativos. En la figura 1, presentamos un conjunto de controles negativos para asegurar que el sistema TXTL libres de células y las poblaciones de DNA de fago no estén contaminadas con vida las células de e. coli . Verificar que el sistema TXTL libre es libre de intacta e. coli contaminación de la célula por tanto una solución de reacción incubadas y no incubadas de ADN genómico (figura 1A yBde la figura 1) de la galjanoplastia. Si el sistema TXTL libre estaba contaminado con células de e. coli , se observa crecimiento en la placa. Además, verificamos que la reacción sin células y por lo tanto no cualquier célula de posibles contaminantes, es responsable de la síntesis de fago por reacciones incubadas y no incubadas con el genoma del fago (figura 1C y de la galjanoplastia Figura 1D). La placa con la reacción no incubados (figura 1C) muestra cero placa mientras que la placa con la reacción incubada (figura 1D) muestra la placa, que indica que el sistema TXTL libre fue responsable de fago síntesis.

En la figura 2, se compara un homogéneo versus análisis de placa no homogénea. Figura 2 B muestra un gradiente de densidad de la placa a través de la placa de cultivo, que es óptima en comparación con una densidad homogénea de la placa de la placa en la figura 2A. La fuente de esto observado resulta del enfriamiento rápido de master mix de top agar, muestra y anfitrión células bacterianas cuando se suministra a una placa de cultivo durante la porción del título de phage del experimento. Para evitar una propagación no homogénea de placas de fagos, asegúrese de que las placas están equilibradas a 37 ° C antes de comenzar el experimento de titulación del fago.

Un paso crítico para contar correctamente los phages es diluir la solución de fago lo suficiente como para obtener entre 50 y 200 placas por placa (figura 3). Debajo de esta gama, es difícil determinar estadísticas de verdad, y encima de este rango, las placas se superponen, prevenir la cuenta exacta. El número de fagos sintetizado en TXTL depende de los ajustes bioquímicos, tales como la concentración de sales (potasio y magnesio), de crowders moleculares y de genomas. En la figura 4, mostramos algunos ejemplos de pruebas para los fagos T7 y ΦΧ174. Por un fago que replica su ADN, como T7, observamos una alta eficiencia de síntesis de fago en la reacción sin células: tres fagos infecciosos son sintetizados por la molécula del genoma en la reacción. Se puede esperar un rendimiento más bajo de la reacción de un fago que no replican su ADN, como ΦΧ174: la relación de fagos infecciosos sintetizada a molécula del genoma es 1:5.

Figure 1
Figura 1: Controles de ensayo de placa y la producción de fagos infecciosos exitosos utilizando un sistema de reacción libre de células (CFR). (A) ningún genoma fue agregado y no se realizó incubación (0 min como tiempo de incubación) del CFR. La reacción entonces fue plateada sin huésped e. coli. Resultado de la muestra no host viable contaminación celular de CFR. (B) ningún genoma fue agregado y CFR se incubaron 12 h a 29 ° C y plateado sin huésped e. coli. Los resultados no muestran host viable contaminación celular de CFR, incluso después de la incubación. (C) 1 nM genoma incluido en ninguna incubación de CFR (0 min como tiempo de incubación) y plateado con el anfitrión e. coli. Resultado de la muestra sin contaminación phage de la solución del genoma. (D) 1 nM genoma incluido y CFR incubaron 12 h a 29 ° C. y plateado con el anfitrión e. coli. Los resultados muestran replicación exitosa fagos infecciosos en CFR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Homogéneos versus propagación no homogénea de reacción phage durante experimento título. Un posible efecto de realizar un título de fago en placas no equilibradas a una temperatura de 37 ° C es la propagación no homogénea de reacción phage en la placa de cultivo. Un buen resultado mostrando una difusión homogénea de reacción phage se muestra en (A), donde las placas se distribuyen uniformemente por toda la superficie de la placa. Un resultado óptimo se muestra en (B), donde las placas se concentran en la parte inferior izquierda de la placa de cultivo. Esto puede ocurrir con el agar superior, reacción phage y anfitrión célula master mix se suministra a una placa de cultivo que no está a una temperatura de 37 ° C. La mayoría de la mezcla principal se solidifica en la región inferior izquierda, y una difusión homogénea no es posible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Establecer un factor de dilución para los títulos de una reacción de fago libre. (A) esta placa muestra un número razonablemente contable de placas. El factor de dilución utilizado para la porción del título del experimento diluido el rendimiento de la reacción phage suficiente dejar un número contable de placas en la placa. Por el contrario en (B) el factor de dilución fue demasiado bajo con respecto a la producción de fagos sintetizado y necesita ser ajustado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Caracterización de la síntesis libre de phages ΦΧ174 y T7. (A) número de ΦΧ174 sintetizado y fagos T7 (PFU/mL: Handunidades formadoras de e por mililitro) como una función de PEG 8000 concentración en la reacción sin células, medición después de 16 h de incubación a 29 º C. (B) número de ΦΧ174 sintetizado y fagos T7 en función de la concentración de glutamato de magnesio en la reacción sin células, medida después de 16 h de incubación a 29 º C. (C) número de fagos ΦΧ174 sintetizadas en función de la concentración de genoma de ADN ΦΧ174 en la reacción sin células, medida después de 16 h de incubación a 29 º C. (D) número de sintetizado fago T7 en función de la concentración del genoma de DNA T7 en la reacción sin células, medida después de 16 h de incubación a 29 º C. Muestra todas las barras de error son las desviaciones estándar de los tres ensayos repetidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1: composición de la reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Siguiendo la técnica de Chen, et al. 14 para SPMC, un paso crítico se alcanza al determinar las condiciones adecuadas para la sobreinfección. El parámetro que mejor controla la habilidad de una cepa de host para soportar el superinfection con frecuencia es la concentración inicial de la infección phage. Las células hospedadoras deben estar en fase de crecimiento logarítmico antes de la infección inicial con una pequeña cantidad de fagos. Finalmente, los fagos también alcanzará crecimiento logarítmico y el objetivo es permitir que los números de fago superando rápidamente el recuento de células, permitiendo múltiples copias del fago en cada célula del huésped. Esto obliga a la célula en un estado cuasi-estable donde no sufrira la lisis. Si no se alcanza este estado, las células se someten a lisis en cascada, confluentes y liberar su carga viral. Si sobreinfección no se logra mediante la concentración viral inicial anterior, baje la multiplicidad inicial de la infección por un factor de diez antes de hacer un intento subsecuente. Si lyse las células del anfitrión antes de la cosecha y no se llega a superinfección, proceder de inmediato con un procedimiento de depuración independiente. Agregar ADNasa I a 5 μg/mL y μl 500 CHCl3 para finalizar la lisis celular todo. Siguen remolino un adicional 5 minutos y luego centrifugar a 10.000 x g para eliminar los desechos celulares. Decantar y centrifugar el sobrenadante a 75.000 x g durante 1-2 h para el phage de la pelotilla y noche resuspender en 1 mL x 1 total TM de tampón a 4 ° C sin agitación. Cuando superinfection con un pequeño volumen de las células, es posible medir cuán cerca células a la lisis por rapidez Lisan cuando exponen a cloroformo añadido. Si lyse las células y la solución se aclara casi al instante, las paredes celulares son muy inestables y células deben ser cosechadas inmediatamente para evitar la lisis de la cascada a gran escala. Si la prueba descompone mediante lisis dentro de 1-3 min, los volúmenes más grandes pueden continuar superinfect hasta 2 h, dependiendo de la cepa local de e. coli en uso. Si no lyse las células dentro de 5 min, crecimiento de fago no ha atrapado al crecimiento de e. coli e incubación primario debe continuar. Realice la prueba nuevamente en 30-60 minutos.

Cuando la purificación phage en un gradiente de sacarosa preparada, el fago aparecerá como una banda muy gruesa, nacarada, entre un tercio y dos tercios de la manera abajo del tubo. Asumiendo una lisis relativamente exitosa y paso de purificación celular remanente, puede haber bandas de luz, pero ninguno de densidad o tamaño similares. La banda grande, opaca contiene el fago y se saca de la solución con una jeringa estéril y una cánula Roma.

Cuando a partir de la tercera sección del Protocolo, la reacción sin células y título de fago, es mejor usar placas de cultivo fresco (menos de una semana de edad) para la placa de bacterias de acogida (de paso 3.5) y también las placas de cultivo utilizadas para el análisis del título (del paso 3.21). Esto promoverá un crecimiento más fuerte de las células del huésped bacterias y una mayor eficiencia de la infección por el título del fago. Placas phage deben previamente incubadas a 37 ° C durante un mínimo de 1 h antes de iniciar la parte de título de phage del protocolo. Sin incubación previa de las placas de cultivo de fago, la solución top agar (contiene la cultura de célula sintetizada phage y host) no distribuirá homogéneamente toda la superficie de la placa de cultivo. En cambio, la solución top agar solidificará homogéneamente en la superficie (figura 2b). Esto aumenta la probabilidad de múltiples phages de la localización en el mismo lugar, que puede causar una subestimación del rendimiento de fago en la reacción sin células.

Cada placa representa el evento de una sintetizada fago que infecta una célula huésped, replicando dentro de la célula huésped y lisis de la célula huésped. Las placas crecen en tamaño durante el período de incubación de las progenie phage infección vecino las células del huésped desde el evento inicial de la infección. Si no se observan placas, es posible que el factor de dilución en protocolo sección 4.6 es demasiado alto, dando por resultado una probabilidad baja que cualquier sintetizado fago infecta a una célula huésped. Para remediar esto, disminuir el factor de dilución en 3-4 órdenes de magnitud (o según sea necesario) y repetir el experimento de titulación. Por el contrario, el factor de dilución podría ser demasiado alto, dando por resultado las placas que abarcan toda la superficie de la placa de cultivo, lo que es imposible contar la producción de fagos. En este caso, aumentar el factor de dilución en 3-4 órdenes de magnitud (o según sea necesario). Un fago bien caracterizado, se conocerá el rendimiento de la reacción sin células y factor de dilución solamente una por cada punto de la reacción será necesario para el experimento de titulación. Al caracterizar un nuevo fago, es mejor incluir factores de dilución diferentes de 2-3 por cada punto de la reacción, asegurando que una de las diluciones producirá una placa contable (ver figura 3 diferencias entre un número de placas contable e incontable en una placa).

Si no hay placa se observa después de modificar el factor de dilución de la concentración de fagos, esto podría indicar que la reacción sin células era fracasada en expresión génica no ocurrió. Una posible explicación para esto podría ser el daño estructural de reactivos/phage DNA debido a la homogeneización de la reacción sin células con un vórtex. Para solucionar este problema, repita la reacción y homogeneizar golpeando suavemente el tubo de reacción cinco a siete veces con un dedo, o mezclando poco a poco a la reacción con una pipeta de cinco a siete veces.

El sistema de reacción sin células origina de e. coli y endógeno contiene ARN polimerasa de e. coli y el principal factor de la sigma, sigma 70, que se combinan para formar el holoenzyme necesario reconocer el consenso principal promotor secuencias de genes de e. coli . Además, el sistema libre de células puede recapitular el esquema de la transcripción de todo factor sigma por suministro exógeno de seis otros genes de factor sigma de e. coli durante la secuencia de consenso de la promotora de sigma 70. Esto permite la capacidad de sintetizar todos los bacteriófagos cuyos genomas son compatibles con la maquinaria de transcripción y traducción de e. coli. Esto deja fuera a un subconjunto de bacteriófagos que no estudió o sintetizado con el sistema de reacción sin células utilizado aquí.

La plataforma de transcripción y traducción libre de la célula permite un impresionante nivel de control y la flexibilidad de las condiciones de reacción en comparación con en vivo métodos de estudio. Podemos ajustar muchos componentes bioquímicos y genéticos de una reacción phage y observar directamente los efectos en menos de 24 h, como se muestra en la figura 4 para aglomeración molecular. Los efectos de crowders moleculares, tales como PEG, en el uno mismo-montaje de complejos macromoleculares han sido teóricamente descrito y demostrado en vitro18,19,20. Hacinamiento molecular es una entropía conducido el mecanismo que aumenta la constante de Asociación de estructuras de biomoléculas grandes. El enfoque libre permite al investigador de sonda complicados procesos biológicos como la biofísica de la uno mismo-montaje con sistemas modelo, como bacteriófagos, sin las limitaciones intrínsecas de la obra en vivo .

Esta plataforma también permite la investigación de la utilidad de phages en campos aplicados. Componentes de los genomas de fagos pueden reutilizar y probados rápidamente en un sistema de reacción celular libre con el objetivo de la incorporación de nuevas nanoestructuras los resultados. Los bacteriófagos pueden ser modificados con el fin de aumentar la selectividad de infección por célula anfitrión, que promueva la utilidad de la terapia de fagos como una alternativa para las bacterias resistentes a los antibióticos.

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Disclosures

Los autores declaran la interest(s) financiera competencia siguientes: Noireaux laboratorio recibe fondos de investigación de MYcroarray, un distribuidor del kit de expresión de proteína libre de MYtxtl.

Acknowledgements

Este material está basado en trabajo apoyado por el Oficina de investigación Naval Premio número N00014-13-1-0074 (V.N.), el programa de Ciencias humanas de frontera número RGP0037/2015 de la concesión (a V.N.) y la Fundación binacional de ciencia concede 2014400 (a V.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

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References

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