Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

Bioengineering

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Summary

Une nouvelle génération de plates-formes de transcription-traduction acellulaire a été conçue pour construire des systèmes biochimiques in vitro par le biais de l’exécution des circuits de gène. Dans cet article, nous décrivons comment bactériophages MS2, ΦΧ174 et T7, sont synthétisés à partir de leur génome en utilisant un système tous les e. coli acellulaire TXTL.

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Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

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Abstract

Une nouvelle génération de systèmes de transcription-traduction acellulaire (TXTL), machinées pour avoir une plus grande polyvalence et modularité, fournir de nouvelles capacités pour effectuer des sciences fondamentales et appliquées dans les réactions de l’éprouvette. Ces dix dernières années, TXTL acellulaire est devenu une technique puissante pour un large éventail de biologie liés à quantitative et synthétiques de zones nouvelles recherches multidisciplinaires. Les nouvelles plateformes TXTL sont particulièrement utiles à construire et à interroger les systèmes biochimiques grâce à l’exécution des circuits d’un gène synthétique ou naturelle. In vitro TXTL s’avère pratique pour rapidement les éléments de régulation prototype et réseaux biologiques aussi bien quant à rappel moléculaire auto-assemblage mécanismes trouvent dans les systèmes vivants. Dans cet article, nous décrivons comment infectieuses bactériophages, tels que MS2 (ARN), ΦΧ174 (ssDNA) et T7 (dsDNA), sont entièrement synthétisée à partir de leur génome dans les réactions d’un pot en utilisant un toutes les Escherichia coli, système TXTL acellulaire. Synthèse des trois coliphages est quantifiée à l’aide de l’essai de plaque. Nous montrons comment le rendement du phage synthétisée dépend des paramètres biochimiques des réactions. Encombrement moléculaire, imité par une concentration contrôlée de PEG 8000, détermine la quantité de phages synthétisées par ordres de grandeur. On décrit aussi comment amplifier les phages et purifier leurs génomes. L’ensemble des protocoles et des résultats présentés dans ce travail devrait être d’intérêt pour les chercheurs multidisciplinaires en bio-ingénierie et biologie synthétique acellulaire.

Introduction

Ces dix dernières années, la technologie d’expression acellulaire a été conçue pour les nouvelles applications en biologie liés à synthétique et quantitative de recherche multidisciplinaire emergent zones d’adresse. Initialement utilisé pour exprimer les protéines indépendants d’un organisme vivant, TXTL acellulaire-nouveaux systèmes ont été développés pour les deux sciences fondamentales et appliquées1,2, d’élargir considérablement la portée de cette technologie. La nouvelle génération de plates-formes TXTL a été conçue pour être facile à utiliser, plus efficace (atteignant 2 mg/mL de la synthèse protéique en batch mode3), plus polyvalent au niveau de la transcription4et modulaire afin d’intègrent facilement le roman naturel ou fonctions synthétiques qui étendent les fonctionnalités existantes des systèmes biologiques5,6. En particulier, systèmes TXTL acellulaires sont devenus très pratiques pour le prototypage rapide de programmes génétiques, tels que des éléments de régulation ou de petits circuits génétiques7,8,9, en réduisant la conception-construction-test cycle de quelques jours. Remarquablement, les nouveaux systèmes TXTL sont également capables de traiter de grands programmes de l’ADN telles que la synthèse complète de coliphages10,11, démontrant fort assez spectacles pour soutenir la reconstitution de l’actif de génomique ADN codée des entités vivantes.

TXTL systèmes présentent de nombreux avantages techniques par rapport aux traditionnels in vitro des épreuves biochimiques constructive. Acellulaire TXTL relie le processus de l’expression génique au produit final dans un environnement ouvert et réduit, par opposition à complex cytoplasme d’une cellule vivante. TXTL utilise l’ADN pour reconstruire les systèmes biochimiques in vitro, qui, avec des techniques modernes d’assemblage ADN, est abordable et rapide en plus d’étapes de purification de protéine fastidieux ne nécessitant ne pas. Acellulaire expression offre un accès direct à la plupart des composants dans les réactions biochimiques, ce qui permet une dissection plus profonde des interactions moléculaires12. Dans une réaction TXTL, on peut changer les paramètres biochimiques et biophysiques à volonté, qui est presque impossible dans une cellule vivante. Compte tenu de ces avantages et améliorations récentes, la technologie TXTL devient plus populaire comme une plateforme pour la biologie synthétique et quantitative. Alors que le milieu de la recherche à l’aide de TXTL croît rapidement et TXTL devient une technologie standard en bio-ingénierie, il est essentiel de comprendre comment utiliser ces plateformes afin de développer des pratiques adéquates relies à l’exécution des réactions TXTL et à la interprétation des résultats.

Dans cet article, nous décrivons comment utiliser un système TXTL tous les e. coli de synthétiser, dans les réactions d’un pot, bactériophages dans leur génome11, comme MS2 (ARN, 3,4 Ko), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 Ko) et T7 (dsDNA, 40 Ko). Nous montrons comment la quantité de phages synthétisé modifications par rapport à certains paramètres biochimiques des réactions (concentrations en magnésium et potassium). Un encombrement moléculaire, imité à travers une gamme de PEG 8000 des concentrations, a un effet dramatique sur la synthèse des phages sur plusieurs ordres de grandeur. La réalisation de ces grands systèmes biochimiques dans les réactions de simple tube à essai qui récapitulent en même temps les processus de transcription, traduction et autoassemblage, sont intéressant pour aborder des questions fondamentales liées à la biologie et la biophysique 10 (régulation des gènes, auto-assemblage), ainsi que pour développer des applications, telles que la réaffectation des fonctions phage pour construire de nouvelles nanostructures13. Outre une pratique sur TXTL, nous fournissent des méthodes pour l’amplification de phage, génome extraction et purification et quantification des phages par l’essai de plaque. Les méthodes présentées dans ce manuscrit sont appropriées pour les chercheurs qui utilisent des e. coli extrait basé des systèmes acellulaires et sont intéressés par les bactériophages.

Les protocoles présentés dans cet ouvrage peuvent être résumées comme suit : amplification 1) Phage (jour 1 : préparer l’inoculation de cellules, jour 2 : simple plaque, multiples phages croissance, concentration et jour 3 : purification du phage), 2) extraction d’ADN Double-brin du génome (extraction de phénol/chloroforme) et 3) réaction de phage acellulaire et expérience de titre (jour 1 : cellules hôtes sur plaque et faire des plaques d’agar, jour 2 : réaction acellulaire et host cell pré-culture et jour 3 : host cell culture et phage titre).

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Protocol

Remarque : les étapes suivantes de l’amplification et la méthode d’extraction sont largement généralisables pour nombreux phage ADN double-brin, par exemple, le bactériophage T7, phage entérobactéries T4 ou enterobacteria phage λ (L). Ils sont utilisés principalement pour un phage dont le génome n’est pas facilement disponible à l’achat de sources commerciales.

1. Amplification du phage

Remarque : la technique de production de phage (SPMC) single-plaque, plusieurs cycle est bien décrite pour le phage T4 Chen, et al. 14 la suivante amplification de phage et ADN méthode d’extraction est une généralisation pour une utilisation avec les phages d’ADN double-brin e. coli, par exemple, T7, T4 ou L. Le succès ultime du protocole dépend fortement de la souche de cellule hôte sélectionné ' capacité pour résister aux conditions de surinfection. Si les cellules de l’hôte sont instables dans la surinfection, ou surinfection n’est jamais atteint, et lyse n’est jamais atteint au cours de cette phase critique, il est préférable de procéder à un protocole de lyse confluentes. Cela inclut qui sépare les débris cellulaires par centrifugation à haute vitesse et phage granulation à des vitesses de l’ultracentrifugation. Toutes les conditions et paramètres suivants sont destinés comme point de départ général. Les conditions optimales pour une ligne de cellule hôte local peuvent être différentes ; déterminer et respecter les conditions appropriées.

  1. Préparer les cellules de l’Inoculation
    1. ensemencer 10 mL médias Luria-Bertani (LB) dans un tube à culture 15 mL avec les cellules hôtes d’e. coli, par exemple, B ou K12.
    2. Place dans un shaker, mettre à 250 tr/min et 37 ° C. laisser du jour au lendemain à saturation.
  2. Unique-plaque, la croissance de plusieurs cycles phage et concentration
    1. pour préparer une plaque de plaques phage compétente, réchauffer plusieurs LB-géloses à 37 ° C pendant 1 h, ou jusqu’au lendemain.
    2. Préparer plusieurs dilutions de stock phage (p. ex., T7, T4 ou L) de concentration connue dans les milieux LB, visant pour ~ 10 2 -10 3 phage/mL.
    3. Ajouter 100 µL de croissance durant la nuit des cellules-hôtes concentré sur chaque plaque.
    4. Dilutions de phage
    5. volumes de choisir du prêt correspondant à une gamme de 10 à 100 phage/plaque. Ajouter le volume requis de dilutions de phage pour chaque plaque (par exemple, 100 µL de phage de 3 10/mL ; cela devrait produire environ 100 plaques). Incuber les plaques à 37 ° C et commencer un minuteur (+ 0 h). Incuber pendant 4-5 h.
    6. Préparer les milieux 49 mL LB dans un flacon de 250 mL et de la place dans l’agitateur rotatif réglé sur 250 tr/min et 37 ° C.
    7. À + 2,5 h, diluer les cellules x 50 en ajoutant 1 mL de culture cellulaire saturé de croissance durant la nuit dans un flacon préchauffé contenant 49 mL LB médium. Une fois les cellules atteignent la croissance des journaux (+ 4-5 h), mesurer l’absorbance à 600 nm (OD 600). Déterminer la concentration de cellules à l’aide de la conversion de l’OD 600 de 1.0 = 8 x 10 8 cellules/mL.
    8. Diluer à 2 x 10 7 cellules/mL à l’aide d’autres milieux de culture LB. Retirez la plaque de gélose contenant les plaques phage de l’incubateur. Utiliser immédiatement la fin d’une pipette Pasteur stérile de base et enlever une plaque unique. Souffler la plaque dans les cellules dilués et incuber à 37 ° C pendant 2 h supplémentaires (+ 6-7 h).
    9. Test complet infections par prélèvement d’un échantillon de 500 µL dans un tube de 1,5 mL, ajouter 10 µL au chloroforme (CHCL 3) et immédiatement Vortex à grande vitesse. Observer si la solution a clarifié. Une fois complètement les cellules sont infectées, incuber pendant un autre 2 h (+ 8-9 h).
      Remarque : Si les cellules sont totalement infectés, ils seront rapidement lyse (< 2 min) et de clarifier la solution. Autres résultats sont examinés dans la Discussion Section ci-dessous. Les cellules vont être titre mais ne lyseront pas jusqu'à ce point. Si la lyse commence, l’ajout de DNase et récolte par centrifugation doit commencer immédiatement à prévenir la dégradation de phage.
    10. Ajouter DNase à 5 µg/mL et centrifugeuse cellules à 8 000 x g à 4 ° C pour granuler. Jeter le surnageant. Remettre le culot dans 10 mL de chlorure de magnésium 1 x TRIS (TM) (50 mM Tris à pH 7,8, 10 mM MgCl 2) tampon de 5 µg/ml de DNase. Ajouter 500 µL de CHCL 3 et vortex à grande vitesse à lyser les cellules. Préciser par centrifugation à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C. décanter le liquide surnageant dans un tube conique de 15 mL et les conserver à 4 ° C.

2. Purification du Phage

Remarque : purification de saccharose est largement tributaire de la taille du phage. Considérations relatives à la masse du phage d’isoler devra être faite et effectuer les ajustements aux conditions du gradient. Des titres viraux finales de plus de 10 13 phage/mL sont facilement réalisables avec cette méthode.

  1. Préparer 12 mL de 5 % et 45 % de sucrose w/v 1 x tampon TM.
  2. Préparer 4 x 5-45 % gradients de sucrose par pipetage 2,5 mL de 45 % de sucrose dans 4 tubes ultracentrifugeuse. Garnir de ~ 2,6 mL de 5 % de sucrose, alors que le liquide atteigne 2 mm du bord du tube.
    Remarque : Placez l’embout de la pipette en contact avec la surface de la solution de saccharose et distribuer très lentement. La solution de saccharose briquet flottera au-dessus de plus lourd, formant une limite distincte. Une solution correctement en couches a interface ~ 1 mm si retenu contre rétroéclairage.
  3. Mélanger les gradients en rotation tilt-tube à l’aide d’un gradient formant instrument pour 43 s 86 ° à 23 t/mn. Si pas immédiatement nécessaire, pellicule de paraffine et conserver à 4 ° C.
  4. Retirer 500 µL du haut de chaque prêt gradient de saccharose avec une pipette 1 mL et les équilibres à ± 0,002 g.
  5. Suspensions phage piscine de tous les tubes (étape 1.2.9). À l’aide d’une pipette 1 mL, ajouter 500 µL de la suspension en ramenant l’extrémité en contact avec la surface du liquide et de distribution très lentement le volume sur le haut de la pente de la saccharose, en veillant à ne pas mélanger par pipetage rapide. Centrifuger à 70 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
    Remarque : Équilibre les gradients préparés à dans les plus petits phages de ± 0,002 g. peuvent prendre jusqu'à 1 h.
  6. Enlever les bandes de phage à l’aide d’une seringue stérile et canule émoussée.
    Remarque : Lorsque la vue de côté, la bande de phage sera épais et laiteux par rapport à l’environnement, environ 5 mm de hauteur et situé à mi-chemin dans le tube à centrifuger.
    1. Submerge une canule émoussée dans la solution jusqu'à ce que la pointe est centrée sur la partie très supérieure de la bande de phages. Retirez la bande en tirant sur le piston de la seringue jusqu'à ce que la majorité de phage bande a été supprimée.
  7. Ajouter le volume de saccharose avec le phage suspendu à 3-4 tubes d’ultracentrifugeuse. Ajouter pas plus de 1,5 mL/tube. Remplissage à ~ 3-4 mm de l’extrémité du tube avec froid 1 x TM. Pellicule de paraffine et renverser pour mélanger. Place dans une ultracentrifugeuse et un essorage à 145 000 x g pendant 1 h à 4 ° C pour granuler. Petits phages peuvent prendre jusqu'à 2 h.
  8. Vite décanter le liquide surnageant et égoutter à l’envers sur des lingettes jetables. Essuyez l’intérieur du tube avec un coton-tige stériles pour enlever l’excès surnageant.
  9. Diviser 200-400 µL froid x 1 TM ensemble pastilles et remettre en suspension pendant la nuit à 4 ° C ; aucun secousses n’est nécessaire.
    Remarque : Si la pastille n’est pas propre, par exemple, filandreuse morceaux de membrane, ADN, etc., piscine et effectuer la centrifugation supplémentaire dans un microcentrifuge à 17 000 x g.
  10. La journée avant de faire des titres, préparer une culture de cellules hôtes e. coli dans les milieux de croissance 10 mL LB et laisser dans un incubateur à agitation valeur 250 tr/min et 37 ° C pendant la nuit. Incuber le montant approprié des plaques de culture à 37 ° C pendant au moins 1 h avant de faire des titres du stock phage.
    Remarque : Le nombre de plateaux d’incubation dépend du nombre de dilutions de stock phage à être plaqué : chaque dilution unique de stock phage nécessite deux plaques de culture (p. ex., quatre différentes dilutions de stock phage exigent huit plaques de culture).
  11. Préparer 100 mL de gélose albums en ajoutant 2,5 g LB et 0,6 g de bacto-agar dans une bouteille de 100 mL. Dissoudre les solides dans l’eau déionisée dans un volume de 100 mL et stériliser. Après autoclave, retourner lentement le flacon 6 à 8 fois pour homogénéiser l’agar tout au long de la solution. Placer le flacon au bain-marie à 45 ° C pendant 15-20 min équilibrer la température .
  12. Préparer des dilutions de stocks de phages avec la solution LB.
    1. Ajouter 990 µL LB à 10 µL phage stock pour une dilution de 100 fois. Vortex pour homogénéiser. Un facteur de dilution de 10, ajouter 100 µL de stock phage à 900 µL Vortex lb à homogénéiser.
    2. Répéter la série de dilution ci-dessus autant de fois que nécessaire pour obtenir un nombre dénombrable de plaques (plaques de 10-100).
      Remarque : Pour ce faire, diluer le stock de phage 2 à 3 ordres de grandeur moins que le rendement attendu phage en termes de réaction phage/mL. Par exemple, si un stock particulier phage contient 10 11 infectieuses phage/mL, plaque le stock de phage à une 10 8-pli ou 10 9-plier dilution.
  13. Préparer une zone pour les titres de phage en assemblant des tubes de culture de 14 mL (le nombre de tubes de culture est égal au nombre de dilutions stock phage à être plaqué). Placer les échantillons stock phage dilué de l’étape 2.12 et les cellules bactériennes de l’hôte de l’étape 2.10 sur glace
  14. Prépare un mélange maître de pipetage 5,25 mL d’agar albums (étape 2.11), 220 µL dilué échantillons phage (étape 2.12), et 50 µL hôte des cellules bactériennes (étape 2.10) à une culture de 14 mL de tube. Boucher le tube à culture et vortexer à haute vitesse.
    1. Conserver le reste de la solution phage à 4 ° C.
  15. Récupérer deux plaques de culture (étape 2.10) de l’incubateur à 37 ° C. Ajouter 2,5 mL de mélange maître lentement vers le centre de la première plaque (sans bulles). Tourner délicatement la plaque à la main pour répartir le mélange maître afin qu’il s’étend sur la plaque de toute culture. Répéter l’opération avec la deuxième plaque. Attendre 20 min pour s’assurer de solidification de l’agar en haut de la page. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 4 à 7 h.
  16. Compter les plaques et déterminer la concentration de phage pour chaque échantillon de réaction.
    NOTE : Plaques apparaîtront comme des cercles clairs 1 ou 2 mm dans le tapis opaque des cellules hôtes. Voir la Figure 1 pour les résultats représentatifs. Une production réussie phage se traduira par une concentration finale de 10 12 -10 13 phage/mL.

3. Extraction du génome de l’ADN double brin

Remarque : Dilution, secouant, et étapes de centrifugation doivent être optimisés pour développer une couche limite de protéine épais et solides entre les phases aqueuses et de phénol. Cette opération génère les génomes de pureté plus élevées qui soient exempts de contaminants de protéine. La dilution initiale repose sur le titre final phage. Un stock de phage titre extrêmement élevé (≥ 10 13 phage/mL) pouvez avoir besoin d’une dilution de 10 à 20 fois avant l’extraction, tandis que les stocks de titre faible (~ 10 10 -10 11 phage/mL) peuvent seulement besoin une 2 fois ou none. Si c’est difficile former une couche de protéines solides dans les étapes ultérieures ou la suspension aqueuse est trop collante pour être réalisable en raison de la forte concentration d’ADN, considérez une dilution plus élevée des stocks phage avant de continuer l’extraction. Au cours de n’importe quelle étape de la gestion du génome, il est important d’utiliser des pointes de pipette wide-alésage lors du pipetage tout les phases aqueuses. Plusieurs génomes phagiques sont assez grandes et facilement fragmentés par cisaillement de la pipette. En outre, toute utilisation du vortex doit être expressément évité car cela sera sévèrement cisailler les génomes.

  1. Diluer une partie du stock de phage d’étape 2,9 à 400 µL avec 1 x tampon de TM dans un tube frais de 1,5 mL.
  2. Ajouter un volume égal de Tris:Phenol:Chloroform à la dilution. Agiter le mélange doucement sur une bascule de laboratoire, ou à la main, à 5 min. Centrifuger l’émulsion résultante à 17 000 x g dans une centrifugeuse de paillasse pendant 5-10 min.
    NOTE : Une couche de protéines distinctes, blanche sur la surface de la phase de phénol sous-jacent est présente.
  3. Supprimer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube en prenant soin de ne pas pour déranger la limite de l’interphase.
  4. Répéter étapes 3.2-3.3 supplémentaires 2 fois pour un total de 3 extractions de phénol. Transférer la phase aqueuse dans un tube frais et ajouter un volume égal de CHCl 3. Agiter et centrifuger (étape 3.2). Transférer l’échantillon aqueux à ADN dans un tube propre.
  5. Estimation du volume de l’ADN purifié. Ajouter 0,4 volumes d’acétate de sodium 3M (CH 3 COONa) et 3 volumes d’éthanol (EtOH) à 95 %. Mettre au congélateur-20 ° C pour les précipitations durant la nuit. Centrifuger à 17 000 x g dans une centrifugeuse de paillasse pendant 10-15 min.
    Remarque : L’ADN va immédiatement se déshydratent et deviennent visible comme une masse en suspension dans le tube. Le bon culot qui en résulte est blanche et bien emballé contre le fond du tube.
  6. Retirer et jeter le surnageant par décantation ou par pipetage. Ajouter 500 µL 70 % EtOH et secouez légèrement le tube jusqu'à ce que le culot flotte gratuite du fond du tube. Centrifuger à 17 000 x g pendant 5 min. Retirez et jetez EtOH, en prenant soin de ne pas déranger le culot.
  7. Répéter étape 3.6. Air sec le culot sur la paillasse pendant 30-60 min. Ajouter 50 µL ddH 2 O au culot et incuber pendant 1 heure à ta ou durant la nuit à 4 ° C, pour remettre en suspension. Déterminer la concentration d’ADN à l’aide de mesures d’absorption à 280 nm.
    Remarque : Les concentrations prévues sont de 0,5 à 5 µg/µL en utilisant cette technique. Diviser par le poids moléculaire génomique total pour déterminer la concentration finale de génome.

4. Acellulaire Phage réaction et Phage titre expérience

  1. préparer le milieu g 25 LB et 15 g bacto-agar solide, versez dans une bouteille de 1 L et ajouter de l’eau désionisée à 1 L. Autoclave.
  2. Après la stérilisation, retourner le flacon lentement 6 à 8 fois en veillant à éviter la formation de bulles. L’inversion de la bouteille sera homogénéiser le solide agar tout au long de la solution 1 L. Placer le flacon dans un bain d’eau de 58 ° C pendant 20 min avant de distribuer sur des plaques de culture.
  3. Une fois que la température de la solution LB-agar a équilibrée, préparer une flamme à côté des plaques de culture pour stériliser l’environnement près des plaques de culture ouverte. Gardez la bouteille de 1 L dans l’eau du bain pour éviter la solidification de l’agar tout en rendant les aliquotes. Ajouter 25 mL dans une plaque de culture 100 x 15 mm. 1 L produira 40 plaques de culture.
  4. Infirmé une plaque de culture et laisser solidifier pendant au moins 1 h à RT ; cette plaque sera utilisée pour les cellules de l’hôte de placage. Laissez les autres plaques de 39 culture se solidifient durant 2 jours à RT. magasin à 4 ° C ou utilisent immédiatement pour faire des titres.
  5. Plaque les cellules de l’hôte par l’ensemencement de la souche bactérienne appropriée (p. ex., hôte B pour T7) qui a été stocké à-80 ° C, gélose LB-culture. Strie à côté d’une flamme nue pour éviter la contamination de l’environnement. Incuber une nuit à 37 ° C. Les cellules de l’hôte n’ont pas la résistance aux antibiotique travaillant dans un environnement stérile est donc essentiel de.
  6. Réaction acellulaire
    Remarque : Les réactions de TXTL acellulaire sont composent de 33 % brut e. coli extrait (protéine de 8,9 à 9,9 mg/mL) avec les autres 67 % composés de génome de tampon et phage de réaction. L’extrait brut est préparé comme précédemment décrit 15 , 16. Les conditions de réaction finale sont : protéines de 8,9 à 9,9 mg/mL (à partir de l’extrait brut), 3-6 mM Mg-glutamate, 40-100 mM K-glutamate, 2-4 % PEG 8000, 3-4 mM de chaque acide aminé, préparé comme décrit précédemment 17 et une solution de mélange d’énergie, décrit déjà 15, composé de 0,33-3,33 mM DTT, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP et GTP, 0,9 mM CTP et UTP, 0,2 mg/mL ARNt, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, cAMP de 0,75 mM, acide folinique 0,068 mM, la spermidine 1 mM et 30 mM 3-PGA. Phages de type ARN nécessitent des concentrations de génome de 0,5 à 10 nM et phages RNA-type nécessitent une gamme de 50 à 150 nM. Les concentrations de réaction finale sont uniques pour le phage particulière synthétisé et tomberont dans les plages décrites ci-dessus. Pour une oxygénation optimale des réactions, des volumes de réaction finale devraient être entre 10-20 µL. Il y a des petites variations dans le protocole de réaction, qui dépendent de la forme de la molécule de génomique. Par exemple, les molécules linéaires génome exigent un composant supplémentaire dans la réaction d’inhibition de la digestion des morceaux d’ADN linéaire par l’enzyme recBCD présent dans l’extrait brut.
    1. Complete le " détails de la réaction " qui figure dans le tableau 1 (PhageTXTL_JOVE) en entrant le nombre total de réactions et le volume final de la réaction.
    2. Conception de l’expérience en déterminant les éléments constants et les composantes variables de la réaction. Entrez le pourcentage de volume fractionnaire du master mix, qui est le rapport entre le volume total des composants réaction constante au produit du volume réactionnel final et nombre d’échantillons. Entrer dans le stock et les concentrations finales les réactifs de la réaction dans le " Master Mix réaction recette " article dans PhageTXTL_JOVE. Entrer dans le stock et la concentration finale du présenter variable à tester.
      Remarque : Les volumes de composants de réaction seront automatiquement calculées basée sur le volume de mélange principal et le volume final de chaque réaction individuelle.
    3. Supprimer la quantité nécessaire de tubes (indiqué dans le " Tubes pour décongeler " article de PhageTXTL_JOVE.xlsx) d’extrait cellulaire brut, mélange tampon énergétique et mélange d’acides aminés de-20 ° C ou -80 ° C et dégel sur Ice.
      Remarque : Une fois décongelé, combiner plusieurs parties aliquotes de comme composants (si nécessaire).
    4. Partie aliquote le volume de pétrole brut extrait, 33 % du volume de réaction finale, dans un tube de microcentrifuge.
    5. Préparer le mélange maître conformément au tableau 1. Homogénéiser tous les composants sous " Master Mix réaction recette " au vortex. Ajouter le volume approprié de chaque composant de l’extrait brut.
    6. Si vous travaillez avec un phage avec génome d’ADN linéaire (par exemple, T7), ajouter 1 µM de la protéine de gam du bactériophage lambda à la réaction 11. Vortex pour homogénéiser la solution et placer la réaction sur la glace pendant 5 min. Cela inhibe la digestion des pièces ADN linéaires de la recBCD complexe, qui est endogène dans l’extrait brut.
    7. Après avoir ajouté le dernier composant conformément au tableau 1, homogénéiser la réaction au vortex. Diviser le mélange maître dans des tubes de microcentrifuge de n.
      Remarque : Le volume de chaque division est le produit du pourcentage volume fractionnaire mélange principal et le volume final de la réaction. Par exemple, pour un pourcentage de volume de mélange maître fractionnaire de 90 % et le volume de réaction finale de 12 µL, le volume de chaque division est 10,8 µL.
    8. Ajouter les volumes indiqués des composantes variables à la matrice de mélange principal (voir tableau 1). Ajouter de l’eau à chaque réaction pour atteindre le volume réactionnel final désiré. Homogénéiser chaque réaction au vortex. Incuber les tubes de microcentrifuge à 29 ° C pendant au moins 8 heures ou toute la nuit.
  7. Pré-culture de la cellule hôte
    Remarque : la nuit pré-culture est dilué 50 : 1 pour s’assurer que les cellules de l’hôte utilisés pour l’expérience de titre sont dans la phase logarithmique, ce qui augmente l’efficacité de l’infection. Les cellules mi-logarithme sont ensuite re-concentrés par un facteur 10 et stockés sur la glace.
    1. à l’aide d’un embout de la pipette stérile, ensemencer un tube à culture de 5 mL LB avec 3-5 colonies de cellules hôte sain. Travaux à proximité d’une flamme nue pour éviter toute contamination.
    2. Incuber le tube de culture dans un incubateur à agitation pour 16 h ou toute une nuit à 37 ° C et 250 tr/min. Les cellules peuvent atteindre la phase de saturation dès le lendemain.
  8. Host cell culture et échantillon préparation à titre de phage
    1. distribuer 50 mL LB dans un erlenmeyer de 500 mL et recouvrir avec du papier aluminium. Chauffer le ballon à 37 ° C pendant 20 min.
    2. ML 1 aliquote l’hôte pendant la nuit avant de culture de cellules dans le pré chauffé lb incuber 3-4 h à 37 ° C et en agitant à 250 tr/min.
    3. Centrifuger la culture de cellules d’accueil 50 mL pendant 10 min à 5 000 x g. jeter la lb
    4. Resuspendre le culot avec le froid (4 ° C) 5 mL LB et conserver en Ice.
    5. Une heure avant de commencer l’expérience de titre, incuber les boîtes de culture à 37 ° C.
      Remarque : Chaque réaction unique phage (et le facteur de dilution correspondant) utilisera deux plaques. En outre, incuber 4 assiettes pour les contrôles expérimentaux (voir la Figure 1 pour des contrôles positifs et négatifs représentatifs).
    6. Préparation de 100 mL de gélose albums (étape 2.11).
  9. Préparer une dilution en série de la réaction sans cellule avec la solution LB tel que décrit dans la section 2.12.
  10. Titre de phage
    Remarque : Commencer à plaque après Pétri ont incubé pendant au moins 1 h et l’agar en haut de la page était dans le bain d’eau de 45 ° C pendant 15-20 min après le retrait de l’autoclave.
    1. Solution de réaction-LB titre la finale acellulaire tel que décrit à l’article 2, les étapes 2.14-2.16.

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Representative Results

Nous montrons quatre résultats représentatifs. Dans la Figure 1, nous présentons un ensemble de contrôles négatifs pour s’assurer que le système TXTL acellulaire et les stocks de l’ADN du phage ne soient pas contaminées avec la vie cellules d’Escherichia coli . Nous vérifions que le système TXTL acellulaire est libre d’intact e. coli cellule contamination en ensemençant les deux une solution non incubés et couvés réaction nulle de l’ADN génomique (Figure 1A etBde la Figure 1). Si le système TXTL acellulaire était contaminé par des cellules d’Escherichia coli , la croissance serait observée sur la plaque. Par ailleurs, nous vérifions que la réaction acellulaire et donc pas de cellules de contaminants possibles, sont responsables de la synthèse du phage en ensemençant des réactions non incubés et incubées avec le génome du phage (Figure 1C et Figure 1D). La plaque avec la réaction non incubés (Figure 1C) montre zéro plaque alors que la plaque avec la réaction couvée (Figure 1D) montre plaque, indiquant que le système TXTL acellulaire est responsable pour le phage synthèse.

Dans la Figure 2, nous comparons un homogène versus dosage plaque inhomogène. Figure 2 B montre un gradient de densité de la plaque dans l’ensemble de la plaque de culture, ce qui est insuffisant en comparaison avec une densité de plaque homogène de la plaque en Figure 2A. La source de cette observée résulte du refroidissement rapide du mélange principal des albums cellules bactériennes agar, échantillon et hôte lorsque distribué sur une plaque de culture au cours de la partie titre de phage de l’expérience. Pour éviter une répartition inhomogène de plaques phage, assurez-vous que les plaques de culture soient équilibrés à 37 ° C avant de commencer l’expérience de titre du phage.

Une étape cruciale pour compter correctement les phages est de diluer la solution phage suffisamment pour obtenir entre 50 et 200 plaques par plaque (Figure 3). Au-dessous de cette gamme, il est difficile de déterminer les véritables statistiques, et au-delà de cette plage, les plaques se chevauchent, empêchant les chefs d’accusation précis. Le nombre de phages synthétisé dans TXTL dépend sur les paramètres biochimiques, tels que la concentration de sels (potassium et magnésium), de crowders moléculaires et des génomes. Dans la Figure 4, nous montrons quelques exemples de tests pour les phages T7 et ΦΧ174. Pour un phage qui réplique son ADN, comme T7, nous observons un rendement élevé de synthèse phage dans la réaction acellulaire : trois phages infectieux sont synthétisés par molécule de génome dans la réaction. On peut s’attendre à une efficacité plus faible de la réaction d’un phage qui ne réplique pas son ADN, comme ΦΧ174 : le rapport du bactériophage infectieux synthétisée à la molécule de génome est de 1:5.

Figure 1
Figure 1 : Dosage plaque et la production de bactériophage infectieux avec succès en utilisant un système de réaction acellulaire (CFR). (A) aucun génome a été ajouté et sans incubation (0 min comme temps d’incubation) du CCR a été réalisée. La réaction a été ensuite plaquée sans hôte Escherichia coli. Le résultat ne montre aucun hôte viable contamination cellulaire du CFR. (B) aucun génome a été ajouté et CFR a été incubé de 12 h à 29 ° C et plaqué sans hôte Escherichia coli. Les résultats ne montrent aucun hôte viable contamination cellulaire du CFR, même après incubation. (C) 1 nM génome inclus avec aucun incubation du CFR (0 min comme temps d’incubation) et plaqué d’hôte e. coli. Le résultat ne montre aucune contamination bactériophage de la solution de génome. (D) 1 génome nM inclus et CFR incubées durant 12 h à 29 ° C. et plaqué avec hôte Escherichia coli. Les résultats montrent la réplication réussie bactériophage infectieux CFR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Homogène versus inhomogène propagation de la réaction de phage au cours de l’expérience de titre. Un effet possible de réaliser un titre phage sur plaques de culture ne s’équilibrés ne pas à une température de 37 ° C est la propagation non homogène de réaction phage à travers la plaque de culture. Un bon résultat affiche une diffusion homogène de la réaction du phage est montré en (A), où les plaques sont réparties uniformément sur toute la surface de la plaque. Le résultat optimal est affiché (B), où les plaques sont concentrés dans la partie en bas à gauche de la plaque de culture. Cela peut se produire avec le haut-agar, réaction de phage et mélange principal de cellule hôte sont dispensés sur une plaque de culture qui n’est pas à une température de 37 ° C. La majorité des master mix se solidifie dans la région en bas à gauche, et une diffusion homogène n’est pas possible. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Définir un facteur de dilution appropriée pour les titres d’une réaction de phage acellulaire. (A) cette plaque affiche un nombre dénombrable raisonnablement des plaques. Le facteur de dilution pour la portion de titre de l’expérience dilué le rendement de la réaction de phage assez de laisser un nombre dénombrable de plaques sur la plaque. À l’inverse dans (B) le facteur de dilution était trop faible en ce qui concerne le rendement du phage synthétisée et doit être ajustée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Caractérisation de la synthèse acellulaire des phages ΦΧ174 et T7. (A) nombre de ΦΧ174 synthétisés et T7 phages (UFP/mL : plaquettee formant unités par millilitre) comme une fonction de PEG 8000 concentration dans la réaction acellulaire, mesurée après 16 h d’incubation à 29 ° C. (B) le nombre de ΦΧ174 synthétisés et T7 phages en fonction de la concentration de magnésium-glutamate dans la réaction acellulaire, mesurée après 16 h d’incubation à 29 ° C. (C) nombre de phages ΦΧ174 synthétisés en fonction de la concentration du génome d’ADN ΦΧ174 dans la réaction acellulaire, mesurée après 16 h d’incubation à 29 ° C. (D) nombre de synthèse phage T7 en fonction de la concentration du génome ADN T7 dans la réaction acellulaire, mesurée après 16 h d’incubation à 29 ° C. Toutes les barres d’erreur affichés sont des écarts-types des trois essais répétés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Table 1
Tableau 1 : composition de la réaction. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Selon la technique de Chen, et al. 14 pour SPMC, une étape essentielle est atteinte lorsqu’il détermine les conditions appropriées pour la surinfection. Le paramètre qui contrôle plus étroitement les capacité de souche hôte de résister à une surinfection est fréquemment la concentration initiale du phage infectant. Les cellules de l’hôte doivent être en phase de croissance logarithmique avant l’infection initiale avec une très petite quantité du phage. Finalement, le phage atteindra également la croissance logarithmique et le but est de permettre les numéros phage de dépasser rapidement le nombre de cellules, permettant de multiples copies du bactériophage dans chaque cellule de l’hôte. Cela force la cellule dans un état quasi stable où il ne subira pas de lyse. Si cet État n’est pas atteint, les cellules subissent une lyse en cascade, anastomosée et libérer leur charge virale. Si surinfection ne peut être atteint en utilisant la concentration virale initiale ci-dessus, abaisser la multiplicité initiale de l’infection par un facteur de dix avant de faire une tentative ultérieure. Si les cellules hôtes lyse avant la récolte et la surinfection n’est pas atteint, procéder immédiatement à une procédure de purification distinct. Ajouter DNase I à 5 µg/mL et 500 µL CHCl3 afin de finaliser la lyse cellulaire tout. Continuer à agiter pendant un 5 min supplémentaire et puis centrifuger à 10 000 g pour enlever les débris cellulaires. Décanter et centrifuger le surnageant à 75 000 x g pendant 1-2 h pour le phage de granule et remettre en suspension pendant la nuit dans 1 mL de tampon de TM total de 1 x à 4 ° C sans agitation. Lors du test d’une surinfection à l’aide d’un petit volume de cellules, il est possible de mesurer comment fermer cellules sont à la lyse par la vitesse à laquelle ils lyse lorsque exposées à du chloroforme ajouté. Si la lyse des cellules et la solution précise presque instantanément, les parois cellulaires sont très instables et cellules doivent être récoltées immédiatement pour éviter la lyse de la cascade à grande échelle. Si le test de lyse dans les 1-3 min, les plus gros volumes peuvent continuer à superinfect jusqu'à 2 h, selon la souche locale d’e. coli en cours d’utilisation. Si les cellules lyse pas moins de 5 min, croissance du phage n’a pas rattrapé à la croissance d’e. coli et incubation primaire devrait continuer. Réexécutez le test en 30-60 min.

Quand purifier phage sur un gradient de saccharose préparés, le phage apparaîtra comme une bande très épaisse, nacrée entre un tiers et deux tiers de la voie sur le tube. En supposant une lyse relativement réussie et l’étape de purification cellulaire reste, il peut y avoir des bandes autres, légers mais rien de similaire de densité ou de taille. La bande large, opaque contient le phage et doit être supprimé de la solution avec une seringue stérile et canule émoussée.

Lors du démarrage de la troisième partie du protocole, la réaction acellulaire et le titre de phage, il est préférable d’utiliser des plaques de culture fraîche (moins d’une semaine) pour la plaque de bactéries hôtes (de l’étape 3.5) et aussi les plaques de culture utilisés pour l’analyse de titre (de l’étape 3.21). Cela favorisera une croissance plus forte des cellules de bactéries hôtes et une plus grande efficacité d’infection pour le titre de phages. Plaques de culture de phage doivent être préalablement incubées à 37 ° C pendant au moins 1 h avant de commencer la partie titre de phage du protocole. Sans la pré-incubation des plaques culture phage, la solution haut-agar (contenant la culture de cellule phage et hôte synthétisée) va distribuer pas homogène sur toute la surface de la plaque de culture. Au lieu de cela, la solution haut-agar consolidera homogène sur la surface (Figure 2b). Cela augmente la probabilité de multiples phages localisation au même endroit, qui peut entraîner une sous-estimation du phage rendement dans la réaction acellulaire.

Chaque plaque représente l’événement d’un phage synthétisée infectant une cellule hôte, répliquant au sein de la cellule hôte et lyse de la cellule hôte. Plaques grandissent en taille au cours de la période d’incubation de progéniture phages infectant voisin cellules hôtes de l’événement de l’infection initiale. Si aucune plaques ne sont observées, il est possible que le facteur de dilution fait au Protocole article 4.6 est trop élevé, d'où une faible probabilité que toute synthèse phage infecte une cellule hôte. Pour résoudre ce problème, diminuer le facteur de dilution de 3 à 4 ordres de grandeur (ou si nécessaire) et répéter l’expérience de titre. À l’inverse, le facteur de dilution pourrait être trop élevé résultant dans les plaques s’étendant sur toute la surface de la plaque de culture, il est impossible de compter le rendement du phage. Dans ce cas, augmenter le facteur de dilution de 3 à 4 ordres de grandeur (ou si nécessaire). Pour un phage bien caractérisé, le rendement de la réaction acellulaire sera connu et facteur de dilution qu’un seul par point de réaction sera nécessaire pour l’expérience de titre. Lorsque caractérisant un phage de nouveau, il est préférable d’inclure des facteurs de dilution différent de 2-3 par point de réaction, en veillant à ce que l’un des dilutions donneront une plaque dénombrable (voir la Figure 3 les différences entre plusieurs plaques dénombrables et indénombrables sur une plaque).

Si aucune plaque n’est observée après avoir modifié le facteur de dilution de la titre de phage, cela pourrait indiquer que la réaction acellulaire a échoué car l’expression des gènes ne bougèrent pas. Une explication possible à cela pourrait être des dommages structurels de réactifs/phage ADN en raison de l’homogénéisation de la réaction acellulaire au vortex. Pour remédier à ce problème, répétez la réaction et homogénéiser en tapotant doucement le tube de réaction cinq à sept fois avec un doigt, ou en mélangeant doucement à la réaction d’une pipette de cinq à sept fois.

Le système de réaction acellulaire est originaire d’e. coli et endogène contient des ARN polymérase d’Escherichia coli et le principal facteur sigma, sigma 70, qui se combinent pour former l’holoenzyme nécessaire de reconnaître le consensus principal promoteur séquences des gènes d’e. coli . En outre, le système de réaction acellulaire peut récapituler le système de transcription de tout facteur sigma en fournissant exogène six autres gènes du facteur sigma d’e. coli au titre de la séquence consensus de sigma 70. Ceci permet la capacité de synthétiser tous les bactériophages dont les génomes sont compatibles avec les machines de transcription/traduction de e. coli. Cela laisse un sous-ensemble du bactériophage qui ne peut pas être étudié ou synthétisé avec le système de réaction acellulaire utilisé ici.

La plate-forme de transcription/traduction acellulaire permet un impressionnant niveau de contrôle et de la flexibilité des conditions de la réaction par rapport aux méthodes in vivo de l’étude. Nous pouvons régler finement les nombreux composants biochimiques et génétiques d’une réaction de phage et observer directement les effets en moins de 24h, comme illustré à la Figure 4 pour un encombrement moléculaire. Les effets de crowders moléculaires, tels que le PEG, sur l’auto-assemblage des complexes macromoléculaires ont été théoriquement décrit et a démontré le in vitro18,19,,20. Un encombrement moléculaire est une entropie conduit le mécanisme qui augmente la constante d’association de structures biomoléculaires grand. L’approche acellulaire permet au chercheur de sonder les processus biologiques complexes comme la biophysique d’auto-assemblage avec systèmes de modèles, comme les bactériophages, sans les limitations intrinsèques de in vivo de travail.

Cette plateforme permet également l’enquête de l’utilité des phages dans des champs appliqués. Composants du génome du phage peuvent être réaffectés et rapidement mis à l’essai dans un système sans cellule de réaction dans le but d’intégrer les résultats de nanostructures roman. Bactériophages peuvent être modifiés afin d’accroître la sélectivité de l’infection de cellule hôte, ce qui permettrait de promouvoir l’utilité de la thérapie par les phages comme alternative pour les bactéries résistantes aux antibiotiques.

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Disclosures

Les auteurs déclarent les intérêts financiers concurrents suivants : Noireaux laboratoire reçoit des fonds de recherche du MYcroarray, un distributeur de la trousse d’expression de protéine acellulaire MYtxtl.

Acknowledgements

Ce matériel est basé sur le travail pris en charge par l’Office of Naval Research award nombre de N00014-13-1-0074 (V.N.), le Human Frontier Science Program grant nombre RGP0037/2015 (à V.N.), et la Science Binational Foundation accorde 2014400 (à V.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

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References

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