अतिव्यापी पेप्टाइड लाइब्रेरी एक प्रोटीन में क्यूए-1 Epitopes नक्शा करने के लिए

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

क्यूए-1 (मानव में एचएलए ई) गैर शास्त्रीय प्रमुख histocompatibility परिसर 1b अणुओं के एक समूह के अंतर्गत आता है । क्यूए-1-बाध्यकारी epitopes के साथ प्रतिरक्षण ऊतक-विशिष्ट प्रतिरक्षा विनियमन बढ़ाने और कई स्व-प्रतिरक्षित रोगों उंनति करने के लिए दिखाया गया है । इस के साथ साथ हम एक प्रोटीन में गुणवत्ता आश्वासन-1 epitopes की पहचान के लिए एक अतिव्यापी पेप्टाइड पुस्तकालय रणनीति का वर्णन ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

क्यूए-1 (मानव में एचएलए-ए) गैर-शास्त्रीय प्रमुख histocompatibility परिसर 1b (MHC-आईबी) अणुओं के एक समूह से संबंधित है । हाल के आंकड़ों का सुझाव है कि गुणवत्ता आश्वासन-1 अणु संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता के लिए कोशिकाओं के सर्वेक्षण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, प्रतिरक्षा विनियमन उत्प्रेरण, और वायरल संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं सीमित । इसके अतिरिक्त, गुणवत्ता आश्वासन के कार्यात्मक वृद्धि-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं epitope प्रतिरक्षण के माध्यम से कई स्व-प्रतिरक्षित रोग पशु मॉडल में उपचारात्मक प्रभाव दिखाया गया है, जैसे प्रयोगात्मक एलर्जी encephalomyelitis, कोलेजन प्रेरित गठिया, और गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह. इसलिए, वहां एक विधि है कि कुशलतापूर्वक और जल्दी से एक प्रोटीन में कार्यात्मक क्यूए-1 epitopes की पहचान कर सकते है के लिए एक तत्काल जरूरत है । यहाँ, हम एक प्रोटीन में क्यूए-1 epitopes निर्धारित करने के लिए एक अतिव्यापी पेप्टाइड (OLP) पुस्तकालय के लिए विशेष गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित सीडी+ T सेल लाइनों का उपयोग करता है एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस OLP पुस्तकालय 15 मेर अतिव्यापी पेप्टाइड कि एक प्रोटीन की पूरी लंबाई को कवर किया है, और आसंन पेप्टाइड्स 11 अमीनो एसिड से ओवरलैप होते हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने हाल ही में एक 9-मेर क्यूए-1 epitope myelin oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (मोग) में पहचान की । इस नए मैप मोग क्यूए-1 epitope epitope-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं है कि बढ़ाया myelin-विशिष्ट प्रतिरक्षा विनियमन प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था । इसलिए, इस प्रोटोकॉल उपंयास लक्ष्यों और गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं के कार्यों के भविष्य की जांच के लिए उपयोगी है ।

Introduction

क्यूए-1 चूहों में गैर-शास्त्रीय प्रमुख histocompatibility परिसर 1b (MHC-आईबी) अणुओं के एक समूह के अंतर्गत आता है । इसका मानव homolog एचएलए-ए है. पिछले सबूत दिखा दिया है कि क्यूए-1 अणुओं महत्वपूर्ण जैविक कार्य किया है । सबसे पहले, क्यूए-1 अणु संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता के लिए कोशिकाओं के सर्वेक्षण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस संबंध में, क्यूए-1 अणुओं एक सेल के सामांय कार्य की निगरानी करने के लिए कई रणनीतियों विकसित किया है । एक ऐसी रणनीति क्यूए-1 अणु एक प्रसंस्कृत नेता पेप्टाइड (epitope), अर्थात् क्यूए-1 निर्धारक संशोधक (Qdm) है कि शास्त्रीय MHC-Ia अणुओं से संसाधित है endoplasmic जालिका1के साथ परिसरों के रूप में सक्षम बनाता है । ये क्यूए-1/Qdm परिसरों बाद में एक सेल की सतह पर प्रदर्शन और NK कोशिकाओं पर NKG2A रिसेप्टर्स निरोधात्मक करने के लिए बाँध NK हत्या गतिविधि को बाधित करने के लिए2. यदि MHC-Ia अणुओं की अभिव्यक्ति खो दिया है, एक सेल (उदाहरण के लिए एक घातक सेल) NK की हत्या के लिए संवेदनशील हो जाता है2। अंय रणनीति गुणवत्ता आश्वासन-1 अणुओं के लिए एक सेल की सतह पर नए क्यूए-1/epitope परिसरों के रूप में सक्षम बनाता है कि नल में कमी है (ट्रांसपोर्टर प्रतिजन प्रसंस्करण के साथ जुड़े)3 और/या ERAAP (endoplasmic जालिका aminopeptidase से जुड़े antigen प्रसंस्करण)4 (दोनों की कमी अक्सर घातक कोशिकाओं में होती है) । इन नए क्यूएस-1/epitope परिसरों को अभिव्यक्त करने वाले कक्ष को epitope-विशिष्ट क्यूएस-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं द्वारा पहचाना और समाप्त किया जा सकता है । दूसरे, क्यूए-1 अणु प्रतिरक्षा विनियमन5प्रेरित । इस संबंध में, क्यूए-1/epitope परिसरों में सीडी+ विनियामक टी (Treg) कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए दिखाया गया है जो स्व-ऊतकों की प्रतिरक्षा-मध्यस्थता क्षति की रोकथाम के लिए महत्वपूर्ण हैं6,7,8 ,9,10. तीसरे, क्यूए-1-प्रतिबंधित सीडी+ Treg कोशिकाओं वायरल संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सीमित करने के लिए दिखाया गया है11.

इसलिए, epitope के विशिष्ट वृद्धि-विशिष्ट क्यूए-1-restrictred सीडी+ टी कोशिकाओं असामांय कोशिकाओं के उंमूलन के लिए एक संभावित आशाजनक रणनीति है, प्रतिरक्षा विनियमन की वृद्धि के लिए, और के परिमाण के नियंत्रण के लिए वायरस प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं । हालांकि यह निर्धारित नहीं किया गया है कि epitope की वृद्धि-विशिष्ट क्यूए-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं प्रतिरक्षा निगरानी और सीमा वायरस प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने कर सकते हैं, हमारी प्रयोगशालाओं और दूसरों को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया है कि गुणवत्ता आश्वासन-1 epitopes के साथ प्रतिरक्षण क्यूए-1-प्रतिबंधित सीडी+ Treg कोशिकाओं रोगजनक स्व-प्रतिरक्षित सीडी+ टी कोशिकाओं के लिए विशिष्ट, सीडी+ टी कोशिका के कुशल नियंत्रण के लिए अग्रणी के समारोह में वृद्धि कर सकते है एक में मध्यस्थता स्व-प्रतिरक्षित रोग ऐसे प्रयोगात्मक एलर्जी encephalomyelitis के रूप में पशु मॉडलों की विविधता (मानव एकाधिक स्केलेरोसिस के एक पशु मॉडल)6,10, कोलेजन प्रेरित गठिया (मानव रुमेटी गठिया के एक जानवर मॉडल)7, और गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (मानव प्रकार के एक पशु मॉडल 1 मधुमेह)8. इसके अतिरिक्त, हम एक ऊतक के साथ प्रतिरक्षण की खोज की है-विशिष्ट क्यूए-1 epitope सीडी+ Treg कोशिकाओं12की वृद्धि के माध्यम से है कि ऊतक में प्रतिरक्षा मध्यस्थता सूजन के विशिष्ट नियंत्रण की ओर जाता है. पूर्व नैदानिक अध्ययन के ऊपर की सफलता गुणवत्ता आश्वासन-1 epitope प्रतिरक्षण के ऊतक के उपचार के लिए एक पूर्ण मूल्यांकन की आवश्यकता से संकेत मिलता है-विशिष्ट प्रतिरक्षा मध्यस्थता रोगों और संभावित नल में कमियों के साथ जुड़े अन्य रोगों की चिकित्सा के लिए और ERAAP ।

तदनुसार, एक तकनीक है कि मज़बूती से और जल्दी से एक प्रोटीन में क्यूए-1 epitopes का विश्लेषण कर सकते है के लिए एक मांग है । इस संबंध में, जैविक रूप से महत्वपूर्ण क्यूएस-1 epitopes की एक सीमित संख्या बताई गई है । इन क्यूए-1 epitopes के अधिकांश जीवाणुओं को सीडी+ टी सेल प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के दौरान serendipitously की पहचान की गई13,3नल में कमी कोशिकाओं, ERAAP4में कमी कोशिकाओं, और कोशिकाओं है कि EAE6कारण, 9. इसलिए, एक उच्च प्रवाह तकनीक एक परिभाषित प्रोटीन में जैविक रूप से महत्वपूर्ण क्यूए-1 epitopes की पहचान के लिए वांछनीय है । निम्न में, हम एक प्रोटीन के OLP पूल (OLP_pool) के लिए विशेष गुणवत्ता आश्वासन-1-resrticted सीडी+ टी सेल लाइनों का उपयोग कर एक प्रोटीन में कार्यात्मक क्यूए-1 epitopes नक्शे एक अतिव्यापी पेप्टाइड (OLP) पुस्तकालय रणनीति का वर्णन ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रयोगों के एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग के साथ अनुपालन में किया गया प्रोटोकॉल पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित एल Paso और लोमा लिंडा विश्वविद्यालय में टेक्सास विश्वविद्यालय में ।

1. एक OLP एक प्रोटीन की पूरी लंबाई को कवर पुस्तकालय की पीढ़ी

  1. एक OLP पुस्तकालय जिसमें सभी पेप्टाइड्स 15-मेर लंबाई में हैं, और आसंन पेप्टाइड्स 11 अमीनो एसिड द्वारा ओवरलैप डिज़ाइन करें ।
    नोट: मोग OLP अध्ययन में, मोग प्रणेता [मस musculus] के अनुक्रम NCBI प्रोटीन डाटाबेस से इस लिंक का पालन करके प्राप्त किया गया था: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944 । मोग के प्रणेता (२४७ अमीनो एसिड), जिसमें सिग्नल और परिपक्व पेप्टाइड दोनों शामिल थे, का उपयोग किया गया क्योंकि अधिकांश रिपोर्ट क्यूएस-1 (एचएलए-E) epitopes सिग्नल पेप्टाइड्स (उदा. Qdm1) में स्थित थे । इसकी N-टर्मिनस में शुरुआत, 15-मेर पेप्टाइड्स के अनुक्रम ऐसी पहचान की गई कि दो आसंन पेप्टाइड 11 एमिनो एसिड (चित्रा 1) द्वारा छा । अत: २४७ अमीनो अम्ल मोग प्रणेता में ठीक ५९ OLPs की पहचान की गई । हालांकि, पिछले OLP 12 से 15-मेर प्रोटीन की लंबाई के आधार पर रेंज कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, हम 15-मेर पुस्तकालय का चयन क्योंकि हम और दूसरों को पता चला है कि 15-मेर पेप्टाइड्स, जब वृक्ष कोशिकाओं में जोड़ा (dc) या मैक्रोफेज, कुशलतापूर्वक epitopes में सीडी द्वारा मांयता के लिए संसाधित किया जा सकता है+ टी कोशिकाओं14,15 .
  2. प्रत्येक व्यक्ति पेप्टाइड व्यावसायिक रूप से खरीद । 5 प्रति पेप्टाइड मिलीग्राम स्क्रीनिंग के लिए पर्याप्त होना चाहिए । OLPs और कटा हुआ पेप्टाइड्स (चरण ६.१) किया जा सकता है पेप्टाइड्स (शुद्धता लगभग ५०-७०%) । tetramer की पीढ़ी के लिए और भविष्य के जैविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि इष्टतम पेप्टाइड (चरण ६.२) की शुद्धता & #62; ९०% होना चाहिए । बाँझ हालत के तहत पेप्टाइड्स का पुनर्गठन.
  3. १००% DMSO में ५० मिलीग्राम/एमएल व्यक्तिगत पेप्टाइड स्टॉक्स बनाओ । प्रत्येक पेप्टाइड के 5 मिलीग्राम के लिए, प्रत्येक ट्यूब, मिश्रण में DMSO के १०० μL जोड़ें, और-20 डिग्री सेल्सियस पर पेप्टाइड्स की दुकान. इन स्टॉक्स का इस्तेमाल सीडी की जनरेशन के लिए एक OLP_pool शेयर बनाने के लिए किया जाएगा+ टी सेल लाइंस OLP_pool को रिएक्टिव । इसके अलावा, इन शेयरों में भी एक OLP_pool-प्रतिक्रियाशील सीडी+ टी सेल लाइन में एक गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित प्रतिक्रिया को उत्तेजित करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति पेप्टाइड की क्षमता का निर्धारण करने के लिए 10 मिलीग्राम/एमएल व्यक्तिगत पेप्टाइड शेयरों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  4. एक ताजा ट्यूब में प्रत्येक पेप्टाइड के एक बराबर मात्रा जोड़कर OLP_pool शेयर बनाओ । इस OLP_pool शेयर में १००% DMSO हैं । मोग OLP अध्ययन में ५९ OLPs12थे । इसलिए, OLP_pool में प्रत्येक पेप्टाइड की एकाग्रता ८४७.४६ μg/एमएल (५० मिलीग्राम/एमएल ÷ ५९) था ।
  5. कमजोर द्वारा 10 मिलीग्राम/एमएल व्यक्तिगत पेप्टाइड स्टॉक्स (5x) ५० मिलीग्राम/एमएल स्टॉक में बाँझ H2में एक वी नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली (इस शेयर 20% DMSO शामिल हैं) । एक ९६-अच्छी तरह से थाली में इन शेयरों बनाएं क्योंकि गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रत्येक व्यक्ति पेप्टाइड के सीमित प्रतिक्रिया का निर्धारण एक ९६ में प्रदर्शन किया जाएगा-अच्छी तरह से एक 8 या 12 चैनल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर प्लेट ।
    नोट: सभी पेप्टाइड्स, OLPs और कटा हुआ पेप्टाइड्स सहित, या तो एक V-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट या एक ९६-अच्छी तरह से नमूना 1 मिलीलीटर ट्यूबों के साथ भरा रैक के बाद से पेप्टाइड पुस्तकालय स्क्रीनिंग ९६ में किया जाता है के बाद से पतला किया जाना चाहिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर प्लेटें । यदि यह एक पेप्टाइड को पतला करने के लिए मुश्किल है, जोड़ें 1 N NaOH ड्रॉप बुद्धिमान पेप्टाइड भंग करने में मदद करने के लिए.

2. kb-/- db-/- सीडी+ टी कोशिकाओं के साथ OLP_pool-स्पंदित kb-/ db-/- वृक्ष कोशिकाओं (dc) का भड़काना.

नोट: इसमें दो प्रमुख क्यु-1 alleles हैं: एक है क्यु-1है, और दूसरा है क्यु-1बी। के बाद से जानवरों आमतौर पर अकादमिक अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया, जैसे C57BL/6 और बालब/सी चूहों, कैर्री क्यूए-1बी, इस प्रोटोकॉल के लिए एक प्रोटीन में क्यूए-1बी epitopes मानचित्रण के लिए प्रक्रिया का वर्णन । सीडी+ टी कोशिकाओं इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया Kb-/Dबी-/ चूहों (C57BL/6 पृष्ठभूमि) जिसमें सीडी+ टी कोशिकाओं ज्यादातर गैर-शास्त्रीय MHC-आईबी द्वारा क्यूए-1 सहित अणुओं के द्वारा प्रतिबंधित कर रहे है शुद्ध कर रहे हैं ।

  1. पहले वर्णित के रूप में अस्थि मज्जा-व्युत्पंन dc उत्पादन12
    1. संक्षेप में, संस्कृति अस्थि मज्जा एकल सेल सस्पेंशन (1 x 106 कोशिकाओं/एमएल) RPMI-10 मध्यम (RPMI १६४० में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, ५.५ एक्स 10-5 एम 2-mercaptoethanol, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और ०.१ mm अनावश्यक अमीनो एसिड) जिसमें 10 यू/एमएल आईएल-4 और १०० यू/एमएल जीएम-सीएसएफ एक 6-well प्लेट में (4 मिलीलीटर/३७ ° c, 5% सह में/
    2. दो दिन बाद, गैर-अनुयाई कक्षों को सावधानीपूर्वक निकालें और ताज़ा मीडिया और साइटोकिंस जोड़ें.
    3. एक और दो दिनों के लिए कोशिकाओं संवर्धन के बाद, एक नया 6-खैर प्लेट में ताजा मीडिया और साइटोकिंस युक्त गैर अनुयाई कोशिकाओं को हस्तांतरण ।
    4. संस्कृति एक और दो दिनों के लिए कोशिकाओं और ताजा मीडिया और एलपीएस (०.१ µ जी/एमएल) युक्त साइटोकिंस के साथ मंगाया dc को सक्रिय करने के लिए ।
    5. 24 h बाद में, प्रयोगों के लिए dc एकत्रित करें ।
  2. ३००० राड के साथ dc को विकीर्ण ।
    1. वैकल्पिक रूप से, 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में मीतोमयसीं सी (५० μg/एमएल) के साथ dc (5 x 107 सेल/एमएल) का इलाज । RPMI जोड़ें-0 (RPMI सीरम के बिना १६४०) ट्यूब (~ 12 मिलीलीटर) को भरने के लिए और एक मेज में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन-शीर्ष ३०० x g पर केंद्रापसारक छोड़ें supernatants और repea टी वाशिंग प्रक्रिया दो बार । इन तीन बहाकर महत्वपूर्ण है क्योंकि मीतोमयसीं C का कोई ट्रेस मात्रा DC-t सेल सह-संस्कृति के दौरान सीडी+ t कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को बाधित कर सकते हैं ।
  3. एक सीरम मुक्त माध्यम में 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल के लिए डीसी एकाग्रता समायोजित करें (AIM-V सीरम मुक्त मध्यम ५.५ x 10-5 एम 2-mercaptoethanol, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और ०.१ mm अनावश्यक अमीनो एसिड) के साथ पूरक ।
  4. OLP_pool स्टॉक समाधान जोड़ें, जिसमें १००% DMSO, dc के लिए ऐसे अंतिम DMSO एकाग्रता ०.५% (200x) हो जाएगा । मोग OLP अध्ययन में, OLP_pool में प्रत्येक OLP की एकाग्रता ८४७.४६ μg/एमएल था; इसलिए डीसी संस्कृति में प्रत्येक OLP की अंतिम एकाग्रता ४.२ μg/एमएल (८४७.४६ μg/एमएल ÷ २००) था ।
हालांकि, इस एकाग्रता को १०० μg/एमएल तक स्केल किया जा सकता है जब तक कोशिका संस्कृति में DMSO एकाग्रता 1% से कम रहती है ।
  • 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर dc मशीन और धीरे हर 15 मिनट कोशिकाओं को हिला ।
  • इस मशीन अवधि के दौरान, सीडी + टी कोशिकाओं को एक वाणिज्यिक सीडी+ टी सेल शोधन किट का उपयोग कर, कश्मीर केबी-/-----/-------------/ सीरम मुक्त माध्यम से ५० यू/एमएल interleukin 2 (आईएल-2) और १०० यू/एमएल आईएल-7 के ।
  • अब, सीडी+ टी कोशिकाओं को ४८-well प्लेट में जोड़ें ०.५ एमएल/अच्छी तरह के रूप में (के बाद ०.५ मिलीलीटर/अच्छी तरह से चरण २.८ में OLP_pool-स्पंदित dc के अलावा, सीडी+ टी कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल) हो जाएगा ।
    नोट: सीडी+ माउस तिल्ली और लिम्फ नोड्स से टी कोशिकाओं निर्माता द्वारा प्रदान की अनुदेश का पालन करके सीडी सकारात्मक अलगाव किट का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है । सीडी+ टी प्राप्त कोशिकाओं मोतियों से मुक्त कर रहे हैं ।
  • OLP_pool-स्पंदित dc (३०० x g नीचे स्पिन, 10 min) पर RT. OLP_pool-स्पंदित dc को 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल सीरम-मुक्त माध्यम में और जोड़ने के लिए ४८-अच्छी थाली है कि सीडी+ टी कोशिकाओं में शामिल है (अंतिम एकाग्रता के OLP _pool-स्पंदित dc 1 x 106 कक्षों/सीडी+ टी कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल, आईएल-2 के अंतिम एकाग्रता है 25 u/एमएल, और il-7 के अंतिम एकाग्रता है ५० u/एमएल) । संस्कृति ३७ ° c और 5% CO2पर कक्षों ।
  • 4 दिन पर, निकालें और संस्कृति माध्यम के बारे में ४०० μL त्याग और ताजा सीरम से मुक्त माध्यम के ५०० μL जोड़ने १०० यू/एमएल आईएल-2 और एक अच्छी तरह से il-7 के 100U/एमएल । ३७ ° c और 5% CO2पर कक्षों की मशीन ।
  • दिन पर 7 या 8, OLP_pool के साथ OLP_pool-primeed सीडी+ टी कोशिकाओं को फिर से उत्तेजित.
  • 3. OLP_pool के साथ स्पंदित मैक्रोफेज के साथ प्रधान सीडी+ टी कोशिकाओं की उत्तेजना

    1. चार दिन पहले पुनः उत्तेजना से OLP_pool-प्रधानमन्त्री सीडी+ टी कोशिकाओं, 2% तैयार (v/v) polyacrylamide मनका समाधान: polyacrylamide मोती के 2 जी दो बार 20 मिलीलीटर endotoxin में-मुक्त एच2ओ या पंजाबियों धो लो । 5 मिनट के लिए (४०० एक्स जी) केंद्रापसारक द्वारा polyacrylamide मोती गोली और पंजाब के १०० मिलीलीटर में reसस्पेंड । कमरे के तापमान पर 20 मिनट की दुकान के लिए 15 पौंड आटोक्लेव/
    2. चूहों 1 मिलीलीटर के साथ intraperitoneally सुई/2% polyacrylamide मनका समाधान के प्रवास को आकर्षित करने के लिए monocytes/मैक्रोफेज में पेरिटोनियल गुहा16
    3. चार दिन बाद,2 अधिक मात्रा में सह द्वारा जानवरों की बलि ।
      1. बाँझ शर्तों के तहत, पेट के केंद्र में एक छोटे से खोलने में कटौती ऐसी है कि उद्घाटन बस एक 5 मिलीलीटर हस्तांतरण पिपेट गुजर के लिए पर्याप्त है । RPMI-0 के साथ हस्तांतरण पिपेट भरें और खोलने के माध्यम से पेट गुहा में पिपेट डालें ।
      2. pipetting द्वारा पेट गुहा कुल्ला । एक बाँझ ट्यूब में पेट गुहा से संभव के रूप में ज्यादा तरल के रूप में बाहर पिपेट (ये पेरिटोनियल मैक्रोफेज हैं). कुल्ला चरण 4-5 बार दोहराएं ।
    4. विकीर्ण ने पेरिटोनियल मैक्रोफेज के साथ ३००० राड ।
      1. वैकल्पिक रूप से, मीतोमयसीं C के साथ पेरिटोनियल मैक्रोफेज का इलाज (चरण २.२ में वर्णित कार्यविधि का पालन करें) ।
    5. पेरिटोनियल मैक्रोफेज की एकाग्रता को समायोजित करने के लिए सीरम मुक्त माध्यम में 5 x 106 कोशिकाओं/ जोड़ें OLP_pool स्टॉक (अंतिम DMSO एकाग्रता से कम है 1%) और एम-सीएसएफ (अंतिम एकाग्रता = 100 U/एमएल) ।
      नोट: इस मोग OLP अध्ययन में, हम ०.५% DMSO का उपयोग किया । इस प्रकार, मोग OLP_pool शेयर पतला था 200x (जैसे 1 μL के मोग OLP_pool शेयर १९९ μL के पेरिटोनियल मैक्रोफेज में जोड़ा गया था) । इसलिए, प्रत्येक OLP की अंतिम एकाग्रता ४.२ μg/एमएल) था ।
    6. जोड़ें २०० μL/well (1 x 106 कोशिकाओं को एक ४८-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में/और 4 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
    7. गैर-अनुयाई कोशिकाओं को निकालें और कोमल धोने के द्वारा polyacrylamide मोतियों को पहले से गर्म RPMI-0 के २०० μL/
    8. लीजिए और कदम २.१० से OLP_pool प्राइमेड सीडी+ टी कोशिकाओं पूल. OLP_pool प्राइमेड सीडी+ टी सेल एकाग्रता को 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल में सीरम-मुक्त मध्यम जिसमें 25 यू/एमएल आईएल-2 और ५० यू/एमएल-7 के लिए समायोजित करें । ४८-well थाली जिसमें OLP_pool-स्पंदित पेरिटोनियल मैक्रोफेज है 1 मिलीलीटर/
    9. चार दिन बाद, ४८ में मध्यम अच्छी तरह से थाली मंगाया । निकालें और ४८-well कल्चर प्लेट्स में संस्कृति माध्यम के बारे में ४०० μL त्यागें । एक अच्छी तरह से १०० यू/एमएल आईएल-2 और १०० u/एमएल-7 के एक अच्छे रूप में शामिल ताजा सीरम मुक्त माध्यम के ५०० μL जोड़ें । संस्कृति ३७ ° c और 5% CO2पर कक्षों ।
    10. तीन या चार दिनों के बाद, OLP_pool-reसीडी+ टी कोशिकाओं OLP_pool-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-एंजाइम से जुड़े immunospot परख (ELISPOT) द्वारा प्रतिबंधित प्रतिक्रिया के लिए जांच करें । इस बिंदु के बाद, पुन: उत्तेजित सीडी+ T कोशिकाओं को हर 7-10 दिन ।
      नोट: मैक्रोफेज OLP_pool के पुनः उत्तेजना के लिए पसंद कर रहे है प्रधानमंत्री सीडी+ टी कोशिकाओं । हमने देखा है कि सीडी+ टी कोशिकाओं पुनः macrophage द्वारा उत्तेजित इन विट्रो मेंdc से बेहतर वृद्धि हुई है ।

    4. OLP_pool का निर्धारण-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-एक OLP_pool-reउत्तेजित सीडी+ टी सेल लाइन में प्रतिबंधित प्रतिक्रिया

    नोट: OLP_pool-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-एक OLP_pool-reउत्तेजित सीडी में प्रतिबंधित प्रतिक्रिया+ टी सेल लाइन OLP_pool या C1R की उपस्थिति में C1R द्वारा उत्तेजना के बाद IFNγ स्राव द्वारा निर्धारित किया जाता है । क्यूए-1बी एक IFNγ ELISPOT परख का उपयोग कर कोशिकाओं । C1R कोशिकाओं को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया जा सकता है । C1R । क्यूएस-1बी कोशिकाओं को क्यूएस-1 lentiviral वेक्टर के साथ C1R कोशिकाओं को transducing करके जेनरेट किया जा सकता है ।

    1. एक ELISPOT प्लेट के कुओं में कोटिंग बफर (पंजाब) में पतला एक कब्जा विरोधी IFN-γ एंटीबॉडी के १०० μL/
    सील और 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में थाली गर्मी ।
  • दूसरे दिन पर, कब्जा विरोधी IFN-γ एंटीबॉडी युक्त कोटिंग बफर को त्यागें और २०० μL/अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान (सीरम मुक्त माध्यम) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए थाली मशीन ।
  • विकीर्ण को C1R और C1R । क्यूएस-1बी सेल विथ ९,६०० राड.
    1. वैकल्पिक रूप से, C1R और C1R का इलाज । क्यूएस-1बी कोशिकाओं मीतोमयसीं सी के साथ चरण २.२ में वर्णित के रूप में सिवाय इसके कि उपचार के समय 30 मिनट हो जाएगा ।
  • C1R और C1R को एडजस्ट करें । क्यूएस-1बी कोशिकाओं सीरम मुक्त मध्यम करने के लिए 4 x 106 कोशिकाओं/
  • प्लेट में अवरोधक समाधान छोड़ें और C1R और C1R जोड़ें । क्यूएस-1बी सेल में ५० μL/well (२००,००० cells/well) और मिश्रण ।
  • जोड़ें ५० μL/100x पतला OLP_pool स्टॉक (सीरम मुक्त माध्यम में) और अच्छी तरह से मिश्रण । 2-3 एच के लिए कमरे के तापमान पर थाली मशीन ।
  • OLP_pool-reसीडी+ टी कोशिकाओं को समायोजित करने के लिए 1-2 x10 6 कोशिकाओं/एमएल के १५० यू/एमएल-7 से युक्त सीरम मुक्त मध्यम में और जोड़ें ५० μL/well (५०,०००-१००,००० कक्ष/ 5 मिनट के लिए प्लेट (५८ एक्स जी) केंद्रापसारक ।
  • ३७ ° c और 5% CO2 रातोंरात पर थाली मशीन ।
  • महाप्राण सेल सस्पेंशन. वेल्स धो 2 बार के साथ (DI) पानी (२५० μL/ कुओं प्रत्येक धोने कदम पर 5 मिनट के लिए भिगोने की अनुमति दें ।
  • धो कुओं धो बफर के साथ 3 बार मैं (०.०५% Tween20 युक्त पंजाब) । कुओं प्रत्येक धोने कदम पर 1 मिनट के लिए भिगोने की अनुमति दें । वाश बफ़र छोड़ें ।
  • १०० μL का पता लगाने के एक कमजोर पड़ने बफर में पतला एंटीबॉडी जोड़ें (10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त पंजाबियों) ।
  • 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें मशीन ।
  • डिटेक्शन एंटीबॉडी समाधान छोड़ें । धो कुओं 3 बार के साथ २५० µ l/अच्छी तरह से धो बफर मैं कुओं प्रत्येक धोने कदम पर 1 मिनट के लिए भिगोने के लिए अनुमति देते हैं ।
  • जोड़ें १०० μL/well of एंजाइम संयुग्म (Streptavidin-एचआरपी) पतला कमजोर पड़ने बफर में 1:100 कमजोर पड़ने पर ।
  • कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्लेटें ।
  • एंजाइम संयुग्म समाधान त्यागें । धो कुओं 4 बार के साथ २५० µ l/अच्छी तरह से धो बफर मैं कुओं प्रत्येक धोने कदम पर 1 मिनट के लिए भिगोने के लिए अनुमति देते हैं ।
  • धो कुओं 2 बार २५० µ एल के साथ/अच्छी तरह से धो बफर द्वितीय (पंजाब) ।
  • जोड़ें १०० µ सब्सट्रेट समाधान की l (मिश्रण 1 ड्रॉप = 20 µ l के एईसी Chromogen के साथ 1 मिलीलीटर की एईसी सब्सट्रेट) प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए. 5 से ६० मिनट के लिए स्थान विकास की निगरानी ।
  • जब वांछित परिणाम प्रकट करने के लिए शुरू, आसुत जल के साथ कुओं धोने से सब्सट्रेट प्रतिक्रिया बंद करो ।
  • एयर-2 ज या रात भर के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें सूखी जब तक यह पूरी तरह से शुष्क है । प्लेटों के नीचे प्लास्टिक की ट्रे को हटाने से सुखाने में सुविधा होगी । अंधेरे में एक सील प्लास्टिक बैग में प्लेटों की दुकान जब तक यह विश्लेषण किया है ।
  • एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत निरीक्षण करके या एक ELISPOT प्लेट रीडर का उपयोग करके स्वयं स्पॉट की गणना । चित्र 2में प्रतिनिधि परिणाम देखें ।
  • 5. OLP_pool में व्यक्तिगत पेप्टाइड्स का निर्धारण जो गुणवत्ता आश्वासन-1 प्रतिबंधित IFN-γ स्राव में एक OLP_pool-विशिष्ट सीडी+ टी सेल लाइन के लिए उत्तेजित

    1. व्यक्तिगत पेप्टाइड्स कि OLP_pool-विशिष्ट उत्तेजित, गुणवत्ता आश्वासन-1-restrictred IFN-γ स्राव एक OLP_pool-विशिष्ट सीडी+ टी सेल लाइन में उपर्युक्त IFN-γ ELISPOT परख का उपयोग कर निर्धारित (प्रत्येक व्यक्ति पेप्टाइड का अंतिम एकाग्रता इस्तेमाल किया ELISOPT परख के लिए 10 μg/एमएल) है । चित्रा 3में प्रतिनिधि परिणाम देखें.
      नोट: एक OLP-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-restircted प्रतिक्रिया C1R की उपस्थिति में प्रतिक्रिया के कम से तीन बार है एक प्रतिक्रिया के रूप में परिभाषित किया गया है । क्यूए-1b कक्ष लेकिन बिना OLP के । मोग OLP अध्ययन में OLP68, OLP96, और OLP105 सभी को यह कसौटी मिले. इसलिए, सभी तीन OLPs संभावित क्यूए-1 epitopes12 (चित्रा 3) होते हैं । हालांकि, OLP105 लगातार मजबूत प्रतिक्रिया दी; हम इसलिए OLP105 (चित्रा 4 और चित्रा 5)12का एक विस्तृत विश्लेषण किया ।

    6. एक 15-मेर OLP में इष्टतम क्यूए-1 Epitope की पहचान जो एक OLP_pool-विशिष्ट सीडी में Epitope-विशिष्ट, क्यूए-1-प्रतिबंधित प्रतिसाद को उत्तेजित करता है+ T कक्ष रेखा

    1. एक 15-मेर OLP के संश्लेषण सी और एन-टर्मिनली काट पेप्टाइड्स के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है ।
    2. एक OLP-विशिष्ट सीडी+ टी सेल लाइन में IFN-γ स्राव की जांच करें सीडी या OLP की उपस्थिति में छोटा कर दिया पेप्टाइड के साथ ही माता पिता 15-मेर C1R के प्रत्येक के साथ+ टी कोशिकाओं उत्तेजक । क्यूएस-1बी कोशिकाओं के ऊपर वर्णित IFN-γ ELISPOT परख का उपयोग कर । ELISPOT परख के लिए इस्तेमाल प्रत्येक व्यक्ति पेप्टाइड के अंतिम एकाग्रता 10 μg/एमएल है । एक पेप्टाइड इष्टतम क्यूए-1 epitope के रूप में परिभाषित किया गया है अगर पेप्टाइड: 1) लगातार समान या मजबूत IFN-γ प्रतिक्रिया देता है, के रूप में मूल 15-मेर पेप्टाइड की तुलना में, C1R की उपस्थिति में. क्यूएस-1बी सेल; 2) के बीच है 8-10-मेर (9 मेर पेप्टाइड पसंदीदा) जो पेप्टाइड लंबाई MHC करने के लिए बाध्य कर रहे हैं-मैं15अणुओं, 17. चित्रा 5में प्रतिनिधि परिणाम देखें.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    एक OLP एक प्रोटीन की पूरी लंबाई को कवर पुस्तकालय के डिजाइन

    N-एक प्रोटीन की टर्मिनस में शुरुआत, प्रत्येक पेप्टाइड 15 अमीनो एसिड (15-मेर) है । इसलिए, पहला पेप्टाइड स्थिति 15 स्थिति के लिए 1 तक फैला है । N-टर्मिनस के दूसरे पेप्टाइड के साथ ओवरलैप के पहले पेप्टाइड के C-टर्मिनस से 11 अमीनो अम्ल. इसलिए, दूसरा पेप्टाइड स्थिति 5 स्थान के लिए 19 तक विस्तृत है । सी के अंत में पेप्टाइड्स के बाकी डिजाइन-प्रोटीन के टर्मिनस (चित्र 1) । हम 15-मेर पुस्तकालय चुना है क्योंकि हम और दूसरों को पता चला है कि 15 मेर पेप्टाइड्स, जब वृक्ष कोशिकाओं में जोड़ा (dc) या मैक्रोफेज, कुशलतापूर्वक epitopes में सीडी+ टी कोशिकाओं14,15द्वारा मांयता के लिए संसाधित किया जा सकता है । एक पुस्तकालय में OLPs की संख्या एक प्रोटीन की लंबाई पर निर्भर करता है । इसके अतिरिक्त, पिछले OLP 12 से 15-मेर प्रोटीन की लंबाई के आधार पर रेंज कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, myelin oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (मोग) में २४७ अमीनो एसिड की लंबाई है । मोग OLP लाइब्रेरी में ५९ OLPs12हैं । इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम मोग OLP पुस्तकालय के विश्लेषण से हैं ।

    OLP_pool का निर्धारण-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-एक OLP_pool-उत्तेजित सीडी में प्रतिबंधित प्रतिक्रिया+ टी सेल लाइन

    हम एक सीडी+ टी सेल लाइन है कि कश्मीरबी-/डीबी-/ मोग के साथ स्पंदित dc द्वारा प्रधानमंत्री था उत्पंन OLP_pool (MOG_pool) और MOG_pool द्वारा उत्तेजित-स्पंदित Kख-/Db-/ पेरिटोनियल मैक्रोफेज में वर्णित के रूप में aforementioned प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल 1, 2, और 3) । संभावित MOG_pool-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित प्रतिक्रिया इस सीडी+ t कक्ष पंक्ति में निर्धारित करने के लिए, हम या तो C1R या C1R की उपस्थिति में MOG_pool करने के लिए इस सीडी+ टी सेल लाइन के जवाब की जांच की । क्यूए-1बी IFN-γ ELISPOT परख (चित्रा 2) (प्रोटोकॉल चरण 4) का उपयोग कर कोशिकाओं । हमारे डेटा से पता चला है कि MOG_pool-उत्तेजित सीडी+ टी सेल लाइन C1R की उपस्थिति में IFN-γ के एक निंन स्तर स्रावित । क्यूएस-1बी सेल (३२ स्थान बनाने वाली कोशिकाएं या एसएफसी) लेकिन नहीं C1R कोशिकाओं (2 एसएफसी) की उपस्थिति का सुझाव देते हुए सीडी+ टी कोशिकाओं जो क्यूएस-1-बाइंडिंग epitopes C1R कोशिकाओं से व्युत्पंन का जवाब (C1R कोशिकाओं मानव बी lymphoblastoid कोशिकाओं रहे हैं) । एसएफसी तब बढ़ गई जब MOG_pool में जोड़ा गया जिसमें C1R कक्ष (७८ एसएफसी) शामिल थे, सीडी+ टी कोशिकाओं की उपस्थिति का सुझाव देते हुए जो गैर क्यूए-1 epitopes का जवाब दिया । एसएफसी नाटकीय रूप से बढ़ गया जब MOG_pool में जोड़ा गया था कि C1R निहित । गुणवत्ता आश्वासन-1बी कोशिकाओं (३२० एसएफसी), सीडी+ टी कोशिकाओं की उपस्थिति का सुझाव है जो गुणवत्ता आश्वासन-1-बाध्यकारी पेप्टाइड्स का जवाब दिया । डेटा भी प्रदर्शित करता है कि MOG_pool क्यूए-1-बाइंडिंग epitope (s) शामिल हैं ।

    OLP_pool में व्यक्तिगत पेप्टाइड्स का निर्धारण जो गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित IFN-γ स्राव में एक OLP_pool-प्रतिक्रियाशील सीडी+ टी सेल लाइन में योगदान

    OLP_pool जो गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित IFN-γ स्राव में एक MOG_pool-प्रतिक्रियाशील सीडी+ टी सेल लाइन में पेप्टाइड्स निर्धारित करने के लिए, हम MOG_pool-प्रतिक्रियाशील सीडी+ टी कोशिकाओं के साथ व्यक्तिगत ५९ OLPs की उपस्थिति में उत्तेजित C1R या C1R. क्यूए-1बी कोशिकाओं (चित्रा 3) (प्रोटोकॉल चरण 5) । हमारे आंकड़ों से पता चला है कि कुछ एसएफसी कुओं कि C1R कोशिकाओं और OLPs में निहित में मनाया गया । इसके विपरीत एसएफसी ने सभी कुओं में C1R को समाहित कर दिया । क्यूएस-1बी कोशिकाओं और OLPs । चित्रा 2से, हम C1R की उपस्थिति में है कि सीडी+ टी कोशिकाओं सीखा. क्यूएस-1बी अकेले भी एसएफसी का गठन किया । अतः अधिकांश कुओं में बढ़ा हुआ एसएफसी गैर-विशिष्ट उत्तेजना के कारण हो सकता है क्यु-१ के अणुओं द्वारा C1R कोशिकाओं में intracellular प्रोटीन से प्राप्त क्यूए-१ epitopes की प्रस्तुति के फलस्वरूप । हालांकि, OLPs में 3 फंसा हुआ कुएं में चित्रा 3 (B8, D12, और E9), जो चित्रा 3 ए (OLP68, OLP96, और OLP105), एक OLP-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित IFN-γ प्रतिक्रिया के रूप में परिभाषित करने के लिए कसौटी से मुलाकात में ३ नाट OLPs मिलान प्रोटोकॉल चरण ५.१12में वर्णन किया गया । डेटा का सुझाव है कि 3 OLPs में क्यूएस-1 epitope (s) शामिल है । के बाद से OLP105 लगातार उच्चतम प्रतिक्रिया का उत्पादन किया, हम OLP105 के विस्तृत विश्लेषण प्रदर्शन12

    एक 15-मेर OLP के लिए एक छोटा पेप्टाइड पुस्तकालय के डिजाइन

    एक 15-मेर OLP, जो OLP_pool-प्रतिक्रियाशील सीडी+ टी सेल लाइन में क्यूए-1-प्रतिबंधित IFN-γ स्राव को उत्तेजित करने के लिए निर्धारित किया गया है, एक छोटा पेप्टाइड लाइब्रेरी का उपयोग कर इष्टतम epitope के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए । इस तरह कटा हुआ पेप्टाइड पुस्तकालय उत्तरोत्तर अपने N पर 1 एमिनो एसिड द्वारा 15-मेर OLP कटने से डिज़ाइन किया गया है-और सी-टर्मिनी (चित्रा 4) । अंय MHC वर्ग मैं अणु, क्यूए-1 अणुओं के समान मुख्य रूप से 8-10-मेर पेप्टाइड्स के लिए बाध्य । इसलिए, हम अनुशंसा करते है कि कम छोटा पेप्टाइड है 6-मेर लंबाई में ।

    एक 15-मेर OLP जो क्यूए-1-प्रतिबंधित IFN-γ स्राव में एक OLP_pool-प्रतिक्रियाशील सीडी+ टी सेल लाइन में उत्तेजित करता है के इष्टतम क्यूए-1 epitope की पहचान

    इसके बाद के संस्करण N-और सी-टर्मिनली काट पेप्टाइड्स उत्तेजक में ताकत के लिए परीक्षण कर रहे हैं IFN-γ स्राव में एक सीडी+ टी सेल लाइन विशिष्ट OLP_pool या 15 मेर OLP का उपयोग कर IFN-γ ऊपर वर्णित ELISPOT. मोग12में क्यूएस-1 epitopes के अध्ययन में हमने एक सीडी+ टी सेल लाइन जेनरेट की जो कि मोग OLP105 (फिगर 5 ए) के लिए विशिष्ट थी । इसके अलावा विश्लेषण प्रदर्शन किया है कि एन टर्मिनली काट 9-मेर पेप्टाइड एक इष्टतम epitope के लिए दो मानदंडों के रूप में प्रोटोकॉल चरण ६.२ (चित्रा 5B) में वर्णित मिले । इसलिए, हम निष्कर्ष निकाला कि एन टर्मिनली 9 काट-मेर पेप्टाइड इष्टतम क्यूए-1 epitope था ।

    Figure 1
    चित्रा 1: एक OLP पुस्तकालय के डिजाइन एक प्रोटीन की पूरी लंबाई को कवर । N-टर्मिनस में शुरुआत, 15 एमिनो एसिड की पेप्टाइड्स (15 मेर) की लंबाई की पहचान की गई ।N-प्रत्येक पेप्टाइड के पहले पेप्टाइड के अलावा, की सी के साथ छा-टर्मिनस पिछले पेप्टाइड के 11 अमीनो एसिड द्वारा टर्मिनस.

    Figure 2
    चित्रा 2: MOG_pool उत्तेजित सीडी+ टी कोशिकाओं को आंशिक रूप से विशिष्ट MOG_pool और क्यूए-1-प्रतिबंधित12थे । इन विट्रो सीडी+ टी मोग OLP_pool (MOG_pool) द्वारा उत्तेजित कोशिकाओं या तो MOG_pool या C1R की उपस्थिति में C1R के जवाब के लिए जांच की गई । क्यूए-1बी कोशिकाओं के रूप में एक IFN-γ ELISPOT परख का उपयोग कर कोशिकाओं को पेश प्रतिजन । प्रतिनिधि ELISPOT छवियां दिखाई जाती हैं । स्थान बनाने वाले कक्षों की संख्या (एसएफसी) प्रत्येक कुआं के ऊपरी बाएँ कोनों पर दिखाई जाती हैं. सीडी+ टी कोशिकाओं: ५०,००० कोशिकाओं/ C1R या C1R । क्यूएस-1b कक्ष: २००,००० कक्ष/

    Figure 3
    चित्रा 3: MOG_pool में OLPs का विश्लेषण जो गुणवत्ता आश्वासन-1 प्रतिबंधित प्रतिक्रिया के लिए जिंमेदार थे । V-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट कि 10 मिलीग्राम/एमएल व्यक्तिगत मोग OLPs शामिल की (A) लेआउट । कुओं में संख्या OLP आईडी का प्रतिनिधित्व किया । हाइलाइट किए गए 3 कुओं में OLPs प्रोटोकॉल चरण ५.१12में वर्णित के रूप में एक OLP-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित IFN-γ प्रतिसाद के लिए मापदंड से मुलाकात की । (ख) प्रत्येक कुआं में प्रतिनिधि एसएफसी जिसमें एक OLP निहित हो (अंतिम एकाग्रता = ४.२ μg/OLP ID मेल खाती है कि "A"), MOG_pool-प्रतिक्रियाशील सीडी+ T कक्ष (५०,००० कक्ष/well), और C1R कक्ष (२००,००० कक्ष/well) । (ग) प्रत्येक कुआं में प्रतिनिधि एसएफसी जिसमें एक OLP (अंतिम एकाग्रता = ४.२ μg/एमएल, OLP आईडी मिलान कि "A"), MOG_pool-प्रतिक्रियाशील सीडी+ T कक्ष (५०,००० कक्ष/well), और C1R शामिल हैं । क्यूएस-1b कक्ष (२००,००० कक्ष/ 3 फंसाया कुओं OLPs कि एक OLP-विशिष्ट, गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित IFN-γ प्रतिक्रिया12के लिए कसौटी से मुलाकात निहित । आंकड़ा12संदर्भ से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्र 4: एक 15-मेर पेप्टाइड के कटा हुआ पेप्टाइड्स के डिजाइन । एक 15-मेर पेप्टाइड उत्तरोत्तर अपने N पर काट दिया गया था और सी-टर्मिनी द्वारा 1 एमिनो एसिड से 6-मेर । 15 मेर और उसके छोटे पेप्टाइड्स फिर संश्लेषित किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्रा 5: OLP105 में इष्टतम क्यूए-1 epitope का विश्लेषण । (क) एक OLP105-उत्तेजित सीडी+ टी सेल लाइन के जवाब के लिए जांच की गई थी OLP68, OLP96, और OLP105 या C1R की उपस्थिति । क्यूए-1बी कोशिकाओं एक IFN-γ ELISPOT परख का उपयोग कर । प्रतिनिधि IFN-γ एसएफसी (ऊपरी बाएँ कोनों पर संख्याएँ) दिखाए जाते हैं. (ख) OLP105-विशिष्ट सीडी+ टी सेल लाइन, के रूप में (क) में दिखाया गया है, व्यक्तिगत एन और सी-टर्मिनली छोटे पेप्टाइड्स के जवाब के लिए जांच की थी, के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया, C1R की उपस्थिति में. क्यूए-1बी कोशिकाओं IFN-γ ELISPOT परख का उपयोग कर । OLP105: एक १५-मेर OLP. N6-14: N-टर्मिनली कटा हुआ OLP105 पेप्टाइड्स । सी 6-14: C-टर्मिनली कटा हुआ OLP105 पेप्टाइड्स । सीडी+ टी कोशिकाओं: ५०,००० कोशिकाओं/ C1R । क्यूएस-1b कक्ष: २००,००० कक्ष/ ऊपरी बाएँ कोनों पर संख्या ५०,००० सीडी+ टी कोशिकाओं के प्रति एसएफसी थी. लाल आयत अच्छी तरह से चिह्नित है कि प्रोटोकॉल चरण ६.२ में वर्णित के रूप में एक OLP में इष्टतम क्यूए-1 epitope परिभाषित करने के लिए मानदंड से मुलाकात की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    यहां, हम एक प्रोटीन में क्यूए-1 epitopes का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । इस प्रोटोकॉल के संबंध में, कई अंय रणनीतियों पहले भी बताया गया था । सबसे पहले, allogeneic सीडी+ टी सेल लाइनों और क्लोन Qdm1की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया । दूसरा, Qdm के विश्लेषण से एक ख्यात क्यूए-1-बाध्यकारी आकृति HSP60p216-224 और एक tcrbv 8.1 epitope9,18की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया था । तीसरा, एक प्रोटीन से व्यक्तिगत अतिव्यापी पेप्टाइड्स छुटकारा जानवरों के लिए इस्तेमाल किया गया । बाद में, सीडी+ टी कोशिकाओं प्रतिरक्षित जानवरों से अलग tcrbv 8.2 पेप्टाइड p42-50 जो बाद में गुणवत्ता आश्वासन-16,10,19के लिए बाध्यकारी के लिए पुष्टि की थी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया । सीडीएनए प्रदर्शन पुस्तकालय के साथ संयोजन में चौथे, कार्यात्मक सीडी+ टी सेल लाइनों FL9 क्यूए-1 epitope4की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया ।

    पिछले तकनीकों के संदर्भ में, allogeneic सीडी+ T सेल लाइनों और क्लोनों का उपयोग क्यूए-1 epitopes है कि शारीरिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के दौरान प्रस्तुत कर रहे है विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । साथ ही, डेटा संचित सुझाव है कि पहले वर्णित बाइंडिंग आकृति केवल आंशिक रूप से गुणवत्ता आश्वासन-1 अणुओं की पेप्टाइड-बाइंडिंग क्षमता का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । इसलिए, सटीक क्यूए-1-बाइंडिंग आकृति अभी भी4ज्ञात नहीं है । इसके अलावा, गुणवत्ता आश्वासन-1 epitopes की पहचान के लिए व्यक्तिगत पेप्टाइड के साथ प्रतिरक्षण श्रमसाध्य है । अंत में, सीडीएनए प्रदर्शन पुस्तकालय रणनीति कई वैक्टर कि सेल अभिकर्मक के लिए अलग पेप्टाइड लंबाई ले के निर्माण शामिल है । इसके विपरीत, OLP पुस्तकालय रणनीति यहाँ वर्णित सरल है, और मैप किए गए पेप्टाइड्स क्यूए-1-प्रतिबंधित सीडी+ T कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए जाना जाता है । इसलिए, हमारी रणनीति का एक अनूठा फायदा है ।

    रणनीति यहां वर्णित OLP_pool-विशिष्ट सीडी+ टी कोशिकाओं है जो इन विट्रो भड़काना और उत्तेजना द्वारा उत्पंन कर रहे है का उपयोग करता है । सीडी+ टी कोशिकाओं का एक वैकल्पिक स्रोत एक kb-/Db-/ माउस है कि स्रोत प्रोटीन20के साथ प्रतिरक्षित है लिम्फ नोड्स draining से हो सकता है । ऐसी प्रतिरक्षा सीडी+ T कोशिकाओं फिर गुणवत्ता आश्वासन-1 epitopes की पहचान के लिए OLPs और काट दिया पेप्टाइड के लिए IFN-γ प्रतिक्रियाओं के लिए जांच की जा सकती है । सैद्धांतिक रूप से, vivo में प्रतिरक्षा सीडी+ t कोशिकाओं से शारीरिक स्थिति के करीब है इन विट्रो उत्पन्न सीडी+ टी कोशिकाओं. हालांकि, हमने पाया है कि प्रतिरक्षा सीडी+ टी सीधे प्रतिरक्षित चूहों से शुद्ध कोशिकाओं की प्रतिक्रिया कमजोर और अक्सर इन विट्रो में एक संतोषजनक पेप्टाइड स्क्रीनिंग परिणाम के लिए उत्तेजना की आवश्यकता थी । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल भविष्य के अनुवाद के लिए एचएलए-E epitopes के मानव अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया है जिसमें vivo प्रतिरक्षण में व्यावहारिक नहीं है ।

    तकनीकी रूप से, इस प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण भाग सीडी+ T कक्ष रेखाओं की जनरेशन है जो OLP_pool या किसी व्यक्तिगत OLP के लिए विशिष्ट हैं । के बाद से क्यूए-1/पेप्टाइड परिसरों की तुलना में अस्थिर कर रहे है शास्त्रीय MHC-I/पेप्टाइड परिसर21, के बाद प्रतिजन कोशिकाओं OLPs या एक पेप्टाइड के साथ स्पंदित कर रहे हैं, स्पंदित कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर धोया नहीं जाना चाहिए । हमने पाया है कि पेप्टाइड-स्पंदित कोशिकाओं, अगर बड़े पैमाने पर धोया, खो या काफी सीडी को उत्तेजित करने की क्षमता को कम+ टी कोशिकाओं । इसलिए, हम एक बार तुरंत पहले वे सीडी+ T कक्षों के साथ सह-कल्चरित है पेप्टाइड-स्पंदित antigen प्रस्तुत कक्षों को धोने की सलाह देते हैं ।

    इसके अलावा, गुणवत्ता आश्वासन-1/पेप्टाइड परिसरों की अस्थिरता के कारण, हम एक सीरम-मुक्त माध्यम के पेप्टाइड स्पंदन और सीडी की उत्तेजना के लिए उपयोग की सिफारिश+ टी कोशिकाओं । इसके अतिरिक्त, हम नियमित रूप से IFN-γ ELISPOT परख के दौरान सीडी+ टी सेल संस्कृति के दौरान के रूप में अच्छी तरह से IL-7 के ५० U/ IL-7 का उद्देश्य सीडी+ टी कोशिकाओं की व्यवहार्यता और कार्य को बनाए रखने के लिए है । IL-7 खुद के द्वारा सीडी+ टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए IFN-γ उत्पादन नहीं करता है ।

    सभी रणनीतियों के लिए इसी तरह, क्यूए-1 इस रणनीति के द्वारा मैप epitopes भी जैविक महत्व के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, एक महत्वपूर्ण सवाल यह है कि क्या मैप किए गए epitope को शारीरिक रूप से प्रस्तुत किया जा सकता है । इस प्रश्न का समाधान करने के लिए, dc एक lentiviral वेक्टर के साथ transduced जा सकता है जो epitope स्रोत प्रोटीन (उदा. मोग मोग OLP स्टडी) को अभिव्यक्त करता है । बाद में, transduced dc के लिए epitope-विशिष्ट सीडी+ T कक्षों का प्रतिसाद जांचा जाता है । एक सकारात्मक प्रतिक्रिया पता चलता है कि epitope शारीरिक रूप से संसाधित किया जा सकता है और dc द्वारा प्रस्तुत । इसके अलावा, सीडी+ टी कोशिकाओं द्वारा epitope मान्यता का एक परिणाम के रूप में कार्यात्मक परिणाम आगे की जांच की जानी चाहिए । इस संबंध में, Qdm और FL9 क्यूए के विश्लेषण-1 epitopes निष्कर्ष है कि क्यूए-1 अणुओं प्रतिरक्षा निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है1,4के लिए नेतृत्व किया है । इसके अतिरिक्त, HSP60p216, tcrbv 8.1 पेप्टाइड, और p42-50 के अध्ययन निष्कर्ष है कि गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं को लक्षित रोगजनक सीडी+ टी कोशिकाओं के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए नेतृत्व किया है 6,7 ,9,19. इसके अलावा, मोग१९६ के अध्ययन के लिए पहली बार पता चला है कि गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं को सीधे एक ऊतक लक्ष्यीकरण द्वारा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित सकता है संभावित रोगजनक स्व-प्रतिरक्षित कोशिकाओं12 द्वारा नुकसान से रोकने के लिए . अंत में, एक epitope-विशिष्ट, क्यूए-1-प्रतिबंधित सीडी+ T सेल के कार्यात्मक विश्लेषण tetramer द्वारा सहायता प्रदान की जा सकती है । ऐसे tetramer को NIH tetramer कोर फैसिलिटी (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) या किसी कंपनी में उत्पादित किया जा सकता है । tetramer की जनरेशन का अनुरोध करने के लिए, एक गुणवत्ता आश्वासन-1 tetramer की पीढ़ी के लिए उनके अनुमोदन के लिए क्यूए-1 प्रोटीन के लिए नए मैप किए गए इष्टतम क्यूएस-1 epitope की बाइंडिंग का समर्थन करने वाले कार्यात्मक डेटा भेज सकते हैं ।

    अंत में, पिछले अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि गुणवत्ता आश्वासन-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं12के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस संबंध में, ऊतक नुकसान एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि सीधे ऊतक लक्ष्य के कारण हो सकता है । इसके अतिरिक्त, संपार्श्विक क्षति एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि एक हमलावर रोगज़नक़ लक्ष्य के कारण हो सकता है । इसलिए, इन दो अलग ऊतक नुकसान में क्यूए-1-प्रतिबंधित सीडी+ टी कोशिकाओं की भूमिका को समझना उनके नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है ।इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, गुणवत्ता आश्वासन-1 epitopes का एक आत्म-ऊतक या एक हमलावर रोगज़नक़ में एक गहन विश्लेषण आवश्यक है । यह प्रोटोकॉल इन विश्लेषणों के लिए उपयुक्त होगा ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    लेखकों के हितों के टकराव नहीं की घोषणा ।

    Acknowledgements

    हम उसे तकनीकी सहायता और इस पांडुलिपि की तैयारी के लिए पेनेलोप गार्सिया धंयवाद । इस काम को लोमा लिंडा यूनिवर्सिटी (681205-2967) में मेडिसिन विभाग से एक रिसर्च इनोवेशन ग्रांट (रिग) द्वारा सपोर्ट किया गया और नेशनल मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसाइटी (PP1685) से मिस्टर को एक पायलट अनुदान दिया गया ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79, (4), 649-658 (1994).
    2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188, (10), 1841-1848 (1998).
    3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207, (1), 207-221 (2010).
    4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13, (6), 579-586 (2012).
    5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5, (5), 516-523 (2004).
    6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177, (11), 7645-7655 (2006).
    7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123, (3), 1382-1389 (2013).
    8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 534-539 (2009).
    9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113, (8), 1218-1224 (2004).
    10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178, (10), 6043-6050 (2007).
    11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (52), 21089-21094 (2013).
    12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
    13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72, (5), 2843-2849 (2004).
    14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8, (3), e59210 (2013).
    15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350, (6320), 703-706 (1991).
    16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
    17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360, (6402), 364-366 (1992).
    18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3, (14-15), 1249-1259 (2001).
    19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182, (11), 6959-6968 (2009).
    20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
    21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172, (3), 1661-1669 (2004).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics