Перекрывающиеся пептид библиотека для сопоставления Qa-1 Epitopes в протеине

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

QA-1 (HLA-E в человека) принадлежит к группе неклассических гистосовместимости 1b сложных молекул. Иммунизации с КК-1-привязки epitopes было показано для укрепления тканей специфические иммунные регулирования и улучшения несколько аутоиммунных заболеваний. Здесь мы описываем перекрывающихся пептид библиотека стратегии для идентификации Qa-1 epitopes в протеине.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

QA-1 (HLA-E в человека) принадлежит к группе комплекс 1В неклассических гистосовместимости (MHC-Ib) молекул. Последние данные показывают, что КК-1 молекулы играют важную роль в съемки клетки для структурной и функциональной целостности, вызывая иммунную регулирование и ограничение иммунного ответа к вирусным инфекциям. Кроме того функциональные увеличения Qa-1-ограничено CD8+ T-клеток через epitope иммунизации показал терапевтические эффекты в несколько аутоиммунных заболеваний животных моделей, например экспериментально аллергический энцефаломиелит, Коллаген индуцированной артрит и не страдающих ожирением диабетом. Таким образом существует настоятельная необходимость для метода, который можно быстро и эффективно выявлять функциональных эпитопов Qa-1 в протеине. Здесь мы описываем протокол, который использует Qa-1-ограничено CD8+ Т-клеток линии конкретных перекрывающихся библиотеки пептида (OLP) для определения Qa-1 epitopes в протеине. Это OLP библиотека содержит 15-mer перекрывающихся пептиды, которые охватывают всю длину белка, и перекрывать прилегающие пептиды по 11 аминокислоты. Используя этот протокол, мы недавно выявленных epitope Qa-1 9-mer в миелина Олигодендроциты гликопротеина (мог). Это вновь сопоставленного epitope MOG Qa-1 был показан побудить эпитопа специфики, Qa-1-ограничено CD8 клетки+ T что расширенной миелина специфические иммунные регулирование. Таким образом, этот протокол является полезным для будущего расследования новых целей и функций Qa-1-ограничено CD8+ T клетки.

Introduction

QA-1 принадлежит к группе неклассических гистосовместимости комплекс 1В (MHC-Ib) молекул в мышах. Его человеческие гомолога является HLA-E. Предыдущие доказательства свидетельствуют, что КК-1 молекулы имеют важные биологические функции. Во-первых Qa-1 молекулы играют важную роль в обследовании клетки для структурной и функциональной целостности. В этой связи Qa-1 молекулы развивались несколько стратегий для наблюдения за нормальное функционирование клетки. Одна такая стратегия позволяет Qa-1 молекул образует комплексы с обработанной лидер пептид (epitope), т.е. КК-1 определяющим модификатор (Qdm), который обрабатывается от классической молекул MHC-Ia в эндоплазматический ретикулум1. Эти комплексы Qa-1/Qdm позднее отображения на поверхности клетки и привязку к тормозной NKG2A рецепторов на клетки подавляют НК убийство деятельности2. Если выражение молекул MHC-Ia теряется, ячейки (например злокачественных клеток) становится чувствительным к НК убийство2. Эта стратегия позволяет Qa-1 молекулы для формирования новых комплексов Qa-1/epitope на поверхности клеток, что является несовершенным в TAP (транспортер, связанные с обработкой антигена)3 и/или ERAAP (aminopeptidase эндоплазматического ретикулума, связанные с антиген обработка)4 (оба недостатки часто происходят в злокачественных клеток). Ячейка, которая выражает эти новые комплексы Qa-1/epitope можно затем признал и устраняется epitope специфичные Qa-1-ограничено CD8+ T клетки. Во-вторых Qa-1 молекулы побудить иммунной правила5. В этой связи Qa-1/epitope комплексов было показано, чтобы стимулировать CD8+ регулирования T (Treg) клетки, которые имеют важное значение для предотвращения иммунной опосредованного ущерба self ткани6,,78 ,9,10. В-третьих Qa-1-ограничено CD8 Treg клеток было показано ограничение иммунного ответа против вирусной инфекции11+ .

Таким образом конкретные увеличения CD8 эпитопа специфики Qa-1-restrictred+ T клетки является потенциально перспективной стратегией для ликвидации аномальных клеток, для повышения иммунной регуляции и контроля за масштабами вирус индуцированной иммунных реакций. Хотя он не был определен ли увеличение epitope конкретных Qa-1-ограничено CD8+ T клетки могут повысить иммунной наблюдения и ограничить вирус индуцированной иммунных реакций, наши лаборатории и другие четко показали, что иммунизации с epitopes Qa-1 можно дополнить функции Qa-1-ограничено CD8+ Treg для патогенных аутоиммунные CD4 клеток конкретных+ T клеток, приводит к эффективного контроля над CD4+ Т клеток опосредованной аутоиммунных заболеваний в разнообразие животных моделей таких экспериментальных аллергический энцефаломиелит (животной модели человеческого рассеянный склероз)6,10,7-индуцированной коллагена артрит (животной модели человеческого ревматоидный артрит), и 8-ожирением диабетом (животной модели человеческого типа 1 диабетом). Кроме того, мы обнаружили, что иммунизации с epitope Qa-1 ткани конкретных приводит к конкретным контроля иммунной опосредованного воспаления в этой ткани путем увеличения CD8 клетки+ Treg12. Выше успехи доклинические исследования указывают на необходимость всесторонней оценки Qa-1 epitope иммунизации для лечения иммунной системы заболеваний тканей конкретным и потенциально для лечения других заболеваний, связанных с недостатками в водопроводной и ERAAP.

Соответственно существует спрос на технологию, которая может быстро и надежно анализировать Qa-1 epitopes в протеине. В этой связи был описан ограниченное количество биологически важных epitopes Qa-1. Большинство этих epitopes Qa-1 были определены интуитивно во время изучения CD8+ T мобильных ответы на бактерии13, дефицит крана3клетки, клетки в ERAAP4и клетки, которые вызывают ЕАЕ6, 9. Таким образом высокая пропускная способность технику желательно для идентификации биологически важных epitopes Qa-1 в определенных белков. Ниже мы описываем перекрывающихся пептида (OLP) библиотека стратегию, которая сопоставляет функциональных эпитопов Qa-1 в протеине с помощью Qa-1-ограниченной CD8+ Т-клеток линии для OLP бассейн (OLP_pool) белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с институциональный уход животных и использования протоколом, утвержденным животное уход и использование Комитета Техасского университета в Эль-Пасо и университете Loma Linda.

1. поколение OLP библиотеки, охватывающих всю длину белка

  1. Дизайн OLP Библиотека, в которой все пептиды 15-mer в длину, и перекрывать прилегающие пептиды по 11 аминокислоты.
    Примечание: В исследовании MOG OLP, последовательность MOG прекурсоров [Mus musculus] извлекалась из базы данных NCBI белка, следуя этой ссылке: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. MOG прекурсоров (247 аминокислоты), который содержал сигнал и зрелые пептиды, был использован потому что большинство сообщенных epitopes Qa-1 (HLA-E) были расположены в сигнал пептидов (например Qdm1). Начало в его N-отель terminus, последовательности 15-mer пептиды были определены таким образом, что два соседних пептиды перекрывается 11 аминокислоты (рис. 1). Следовательно именно 59 УПСО были определены в 247 аминокислоты MOG прекурсоров. Однако последний OLP может варьироваться от 12 до 15-mer в зависимости от длины белка. Кроме того, мы выбираем 15-mer библиотеки, потому что мы и другие показали, что 15-mer пептиды, при добавлении в дендритные клетки (DCs) или макрофаги, могут быть эффективно обработаны в epitopes для распознавания CD8+ T клетки14,15 .
  2. Покупка каждого индивидуального пептид коммерчески. 5 мг в пептидной должно быть достаточно для проверки. УПСО и усеченные пептиды (шаг 6.1) может быть обессоленной пептидов (Чистота составляет примерно 50-70%). Чистоту оптимального пептида (шаг 6.2), который будет использоваться для генерации Тетрамер и для будущих биологические анализы должны быть > 90%. Воссоздать пептидов в стерильных условиях.
  3. Сделайте индивидуальный пептид запасов 50 мг/мл в 100% ДМСО. 5 мг каждый пептид, добавить 100 мкл ДМСО в каждую пробирку, смешать и хранить пептидов при-20 ° C. Эти запасы будут использоваться сделать фондовая OLP_pool для генерации CD8 линии реактивной OLP_pool+ Т-клеток. Кроме того, эти запасы будут также использоваться для сделать 10 мг/мл отдельные пептиды запасов для определения каждого индивидуального пептид способностью стимулировать Qa-1-ограниченный ответ в OLP_pool реактивной CD8+ Т-клеток линии.
  4. Сделать OLP_pool складе, добавляя равный объем каждого пептида в свежий трубку. Этот запас OLP_pool содержит 100% ДМСО. В исследовании MOG OLP насчитывалось 59 УПСО12. Следовательно концентрация каждого пептида в OLP_pool был 847.46 мкг/мл (50 мг/мл ÷ 59).
  5. Сделать 10 мг/мл отдельные пептиды запасов путем разбавления (5 x) 50 мг/мл складе в стерильных H2O в V-дно 96-луночных пластине (этот запас содержит 20% ДМСО). Сделать эти запасы в плиту 96-хорошо, потому что определение Qa-1-ограниченный ответ каждого индивидуального пептида будет выполняться в 96-луночных пластине с помощью 8 - или 12-канальный многоканальные пипетки.
    Примечание: Все пептиды, включая УПСО и усеченные пептиды, следует разбавить в блюдо V-дно 96-луночных или 96-луночных образца стойки заполнены с 1 мл пробирок, так как пептид библиотека скрининг проводится в 96-луночных пластины с помощью многоканальных дозаторов. Если это трудно развести пептид, добавьте 1 каплю N NaOH, мудрым, чтобы помочь распустить пептида.

2. грунтовка Kb-/- Db-/- CD8+ Т-клеток с OLP_pool импульсного Kb-/- Db-/- дендритных клеток (DCs).

Примечание: Существует два основных аллели Qa-1: один Qa-1, и другой – Qa-1b. Начиная с животных, обычно используемые для научных исследований, например C57BL/6 и мышей Balb/c, нести Qa-1b, этот протокол описывает процедуру для сопоставления Qa-1b epitopes в протеине. CD8+ T клетки, используемые в настоящем Протоколе очищаются от Kb-/-Db-/- мышей (фон C57BL/6), в котором CD8+ T клетки в основном ограничены неклассических молекул MHC-Ib, включая Qa-1.

  1. DCs костного мозга-производные продукты как описано12.
    1. Вкратце культура костного одноклеточного суспензий (1 х 106 клеток/мл) в среде RPMI-10 (RPMI 1640 с 10% плода бычьим сывороточным, 5.5 x 10-5 M 2-меркаптоэтанол, пируват натрия 1 мм и заменимая аминокислота 0,1 мм) содержащие 10 Ил-4 ед/мл и 100 ед/мл GM-CSF в пластине 6-хорошо (4 мл/хорошо) при 37 ° C, 5% CO2.
    2. Два дня спустя, тщательно удалить ячейки non сторонник и добавить свежие СМИ и цитокинов.
    3. После культивирования клеток еще два дня, передачи не сторонник клетки, содержащие свежий СМИ и цитокинов в новом 6-ну плиту.
    4. Культура клетки еще двух дней и пополняется свежей СМИ и цитокинов, содержащие ПЛАСТИНОК (0,1 мкг/мл) для того чтобы активировать DCs.
    5. 24 часа спустя, собирать DCs для экспериментов.
  2. Облучить DCs с 3000 заявках.
    1. Кроме того, лечить РС (5 x 10-7 клеток/мл) с митомицин C (50 мкг/мл) в PBS при 37 ° C 20 мин добавить RPMI-0 (RPMI 1640 без сыворотки) для заполнения трубки (~ 12 мл) и спина клетки для 10 мин в центрифугу столешница 300 x g. отменить supernatants и Перегорошина t Стиральная процедуру еще два раза. Эти три автомойки важны потому, что любой след количество митомицин C может тормозить ответ CD8+ T клетки во время совместного культуры клеток DC-T.
  3. Настройка DC концентрации 5 х 106 клеток/мл в сыворотки свободной среде (AIM-V сыворотки бесплатно средний дополнена 5.5 x 10-5 M 2-меркаптоэтанол, пируват натрия 1 мм и заменимая аминокислота 0,1 мм).
  4. Добавьте OLP_pool раствор, который содержит 100% ДМСО, ДКС, таким образом, что конечная концентрация ДМСО будет 0,5% (200 x). В исследовании MOG OLP концентрация каждого OLP в OLP_pool был 847.46 мкг/мл; Поэтому конечная концентрация каждого OLP в культуре DC был 4.2 мкг/мл (847.46 мкг/мл ÷ 200).
Однако такая концентрация может масштабироваться до 100 мкг/мл до тех пор, как концентрации ДМСО в культуре клеток остается менее 1%.
  • Инкубировать DCs при комнатной температуре 3 h и слегка встряхните клетки каждые 15 мин.
  • В этот период инкубации, очищают CD8+ T-клеток от собранного селезенки или лимфатические узлы Kb-/-Db-/- мышей с использованием коммерческих CD8+ T мобильных комплект очистки, регулировка концентрации клеток до 10 x 106 клеток/мл в Сыворотка свободной среде, содержащей 50 ед/мл интерлейкина 2 (IL-2) и 100 ед/мл IL-7.
  • Теперь добавьте CD8 клетки+ T в 48-ну плиту 0,5 мл/также (после добавления 0,5 мл/хорошо OLP_pool импульсного DCs в шаг 2.8, конечная концентрация CD8+ T клетки будет 5 х 106 клеток/мл).
    Примечание: CD8+ T клетки мыши селезенки и лимфатических узлов может быть очищен с помощью CD8 положительные изоляции Kit, следуя инструкции, предоставляемые производителем. CD8+ T клетки получены бесплатно из бисера.
  • Спин вниз OLP_pool импульсного DCs (300 x g, 10 мин) на RT. воссоздания OLP_pool импульсного DCs 2 x 106 клеток/мл в средне-сыворотка бесплатно и добавить 0,5 мл/колодец в пластину 48-Ну, содержащий CD8+ Т-клеток (конечная концентрация OLP _pool импульсного РСУ-1 х 106 клеток/мл, конечная концентрация CD8+ T клетки 5 х 106 клеток/мл, конечной концентрации ИЛ-2 является 25 ед/мл, и конечная концентрация IL-7 50 ед/мл). Культура клетки при 37 ° C и 5% CO2.
  • На 4 день удалить и сбросить около 400 мкл питательной среды и добавьте 500 мкл свежей сыворотки свободный носитель, содержащий 100 ед/мл IL-2 и 100У/мл IL-7 для каждой скважины. Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO2.
  • День 7 или 8, вновь стимулировать CD8 загрунтовать OLP_pool+ T-клеток с OLP_pool.
  • 3. рестимуляции загрунтовать CD8+ T клетки с макрофаги пульсирующий с OLP_pool

    1. Четыре дня до повторной стимуляции CD8 загрунтовать OLP_pool+ T клетки, подготовить раствор 2% (v/v) полиакриламида шарик: мыть 2 g полиакриламида бисера дважды в 20 мл бесплатно эндотоксина H2O или PBS. Пелле полиакриламида бусины центрифугированием (400 x g) за 5 мин и Ресуспензируйте в 100 мл ФСБ. Автоклав на 15 фунтов/м 20 мин хранить при комнатной температуре.
    2. Придать внутрибрюшинно мышей с 1 мл стерильного раствора 2% полиакриламида шарик для привлечения миграцию моноцитов/макрофагов в брюшной полости16мыши.
    3. Четыре дня спустя, жертву животных на CO2 передозировки.
      1. В стерильных условиях, вырезать небольшой открытия в центре живота, таким образом, чтобы открытие просто достаточно для передачи пипетки передачи 5 мл. Заполните передачи пипетку с RPMI-0 и вставьте дозатор в полость живота через отверстие.
      2. Промывайте полость живота, закупорить. Пипетка, столько жидкости из полости живота как можно в стерильную пробирку (это перитонеальных макрофагов). Повторите шаг полоскания 4 - 5 раз.
    4. Облучить перитонеальных макрофагов с 3000 заявках.
      1. Кроме того лечить перитонеальных макрофагов с митомицин C (следуйте процедуре, описанной в шаге 2.2).
    5. Отрегулируйте концентрацию перитонеальных макрофагов в 5 х 106 клеток/мл в среде сыворотки бесплатно. Добавить OLP_pool акций (конечная концентрация ДМСО составляет менее 1%) и M-CSF (конечная концентрация = 100 ед/мл).
      Примечание: В этом исследовании MOG OLP, мы использовали 0,5% ДМСО. Таким образом MOG OLP_pool складе был разбавленным 200 x (например 1 мкл MOG OLP_Pool складе была добавлена в 199 мкл перитонеальных макрофагов). Таким образом конечная концентрация каждого OLP был 4.2 мкг/мл).
    6. Добавить 200 мкл/хорошо (1 х 106 клеток/а) в 48-ну тканевые культуры пластине и инкубировать пластины при 37 ° C в течение 4 ч.
    7. Удалите ячейки non сторонник и бусы полиакриламида, нежной стирки с 200 мкл/хорошо подогретым RPMI-0.
    8. Бассейн OLP_pool и сбора заливают CD8 клетки+ T от 2.10 шаг. Отрегулируйте OLP_pool заливают CD8+ концентрация Т-клеток до 1 x 106 клеток/мл в сыворотке свободной среде, содержащей 25 ед/мл IL-2 и 50 ед/мл IL-7. Добавьте 1 mL/хорошо пластину 48-Ну, содержащий OLP_pool импульсного перитонеальных макрофагов.
    9. Четыре дня спустя, пополните среднего в 48-ну пластины. Снимите и выбросьте около 400 мкл питательной среды в 48-ну культуры пластин. Добавьте 500 мкл свежей сыворотки бесплатно средних содержащие 100 ед/мл IL-2 и 100 ед/мл IL-7 в каждой скважине. Культура клетки при 37 ° C и 5% CO2.
    10. Три или четыре дня спустя, изучить OLP_pool рестимулирован CD8+ T клетки для OLP_pool конкретных, Qa-1-ограниченный отклик на immunospot энзим соединенный assay (ELISPOT). После этой точки, стимулирования CD8 клетки+ T каждые 7-10 дней.
      Примечание: Макрофаги являются предпочтительными для повторной стимуляции CD8 загрунтовать OLP_pool+ T клетки. Мы заметили, что CD8+ T клетки повторно стимулируется макрофагов росла лучше, чем DCs в пробирке.

    4. Определение OLP_pool конкретных, Qa-1-ограниченный ответ в OLP_pool рестимулирован CD8 линия клетки T+

    Примечание: OLP_pool конкретным, Qa-1-ограниченный ответ в OLP_pool рестимулирован CD8+ Т-клеток линии определяется IFNγ секрецию после стимуляции, OLP_pool в присутствии C1R или C1R. QA-1b клеток с помощью IFNγ ELISPOT assay. C1R клетки могут быть получены коммерчески. C1R. QA-1b клетки может быть порождена преобразователя C1R клетки с вектором лентивирусные Qa-1.

    1. Добавьте 100 мкл/хорошо антитела анти IFN-γ захвата разводят в буфер покрытия (PBS) в скважины ELISPOT пластины.
    Печать и инкубировать пластину на 4 ° C на ночь.
  • На второй день отбросить покрытие буфер, содержащий антитела анти IFN-γ захвата и добавить 200 мкл/хорошо-blocking решение (сыворотка бесплатно средний) и инкубировать пластину для 2 ч при комнатной температуре.
  • Облучить C1R и C1R. QA-1b клетки с 9600 заявках.
    1. В качестве альтернативы лечения C1R и C1R. QA-1b клетки с митомицин C, как описано в шаге 2.2, за исключением того, что время лечения будет 30 мин.
  • Отрегулируйте C1R и C1R. QA-1b клеток в сыворотке свободный средне 4 х 106 клеток/мл.
  • Отказаться от блокирования решения в пластине и добавить C1R и C1R. QA-1b клетки на 50 мкл/хорошо (200 000 клеток/а) и перемешать.
  • Добавьте 50 мкл/скважина 100 x разбавленным OLP_pool запасов (в средстве сыворотки бесплатные) и mix правильно. Инкубируйте пластины при комнатной температуре на 2-3 ч.
  • Отрегулируйте OLP_pool рестимулирован CD8+ T клеток в 1-2 х 106 клеток/мл в сыворотке свободной среде, содержащей 150 ед/мл IL-7 и добавьте 50 мкл в колодец (50000-100000 клеток/а) к пластине. Центрифуга пластину (58 x g) за 5 мин.
  • Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO2 на ночь.
  • Аспирационная суспензию клеток. Промойте скважин 2 раза с дейонизированной водой (DI) (250 мкл/хорошо). Разрешить скважин впитать в течение 5 мин на каждом этапе стирки.
  • Промыть скважин 3 раза с мыть буфера я (PBS, содержащие 0,05% Tween20). Разрешить скважин впитать в течение 1 мин на каждом этапе стирки. Выбросите мыть буфера.
  • Добавьте 100 мкл обнаружения антител, разводили буфером для разбавления проб (PBS, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС)).
  • Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 2 ч.
  • Слейте раствор обнаружения антител. Промойте скважин 3 раза с 250 мкл/хорошо мыть буфера I. позволяют скважин, чтобы впитать в течение 1 мин на каждом этапе стирки.
  • Добавьте 100 мкл/колодец фермента конъюгата (стрептавидина-ПХ) разводят в буфере разрежения в разведении 1: 100.
  • Инкубируйте пластины для 1 ч при комнатной температуре.
  • Слейте раствор конъюгата фермента. Промойте скважин 4 раза с 250 мкл/хорошо мыть буфера I. позволяют скважин, чтобы впитать в течение 1 мин на каждом этапе стирки.
  • Промойте скважин 2 раза с 250 мкл/хорошо вымыть буфера II (PBS).
  • 100 мкл раствора субстрата (микс 1 капля = 20 мкл AEC хромогена с 1 мл раствора субстрата АЭС), для каждой скважины. Следить за местом развития для 5 до 60 мин.
  • Когда желаемые результаты начинают появляться, остановите субстрата реакции промывки скважин с дистиллированной водой.
  • Просушите пластины при комнатной температуре в течение 2 ч, или на ночь до тех пор, пока она полностью высохнет. Удаление пластиковый лоток под плитами облегчит сушки. Хранить пластины в запечатанный пластиковый пакет в темноте до тех пор, пока он анализируется.
  • Перечисление пятен вручную проверки под микроскопом рассечения или с помощью читатель ELISPOT пластины. Смотрите представитель результат на рисунке 2.
  • 5. определение отдельных пептидов в OLP_pool, которые стимулируют к ограниченным Qa-1 секрецию ИФН γ в OLP_pool конкретных CD8 линия клетки T+

    1. Определить отдельные пептиды, которые стимулируют OLP_pool конкретным, Qa-1-restrictred ИФН γ секреции в OLP_pool конкретных CD8+ Т-клеток линии с использованием выше описанных ИФН γ ELISPOT проба (конечная концентрация каждого индивидуального пептида используется для ELISOPT проба-10 мкг/мл). Представитель результаты на рисунке 3.
      Примечание: OLP-конкретным, Qa-1-restircted ответ определяется как ответ, что по крайней мере три раза ответа в присутствии C1R. QA-1b клетки, но без OLP. В исследовании MOG OLP, OLP68, OLP96 и OLP105 все соответствуют этому критерию. Таким образом все три УПСО потенциально содержат Qa-1 epitopes12 (рис. 3). Однако OLP105 последовательно дал сильнейших ответ; Поэтому мы провели подробный анализ OLP105 (рис. 4 и 5)12.

    6. Определение оптимальной Epitope Qa-1 в 15-mer OLP, который стимулирует эпитопа специфики, Qa-1-ограниченный ответ в OLP_pool конкретных CD8 линия клетки T+

    1. Синтезировать C - и N-неизлечимо усечено пептиды 15-mer OLP, как показано на рисунке 4.
    2. Изучить Секреция ИФН γ в OLP-конкретных CD8 линии Т-клеток, стимулируя CD8+ + T-клеток с каждым из усеченного пептиды, а также родителей 15-mer OLP присутствии C1R или C1R. QA-1b клеток с использованием выше описал ИФН γ ELISPOT assay. Конечная концентрация каждого индивидуального пептид, используемых для ELISPOT assay — 10 мкг/мл. Пептид определяется как оптимальный epitope Qa-1, если пептида: 1) последовательно дает ответ ИФН γ аналогичные или более, по сравнению с оригинальной 15-mer пептида, в присутствии C1R. QA-1b клетки; 2) составляет 8 - 10-mer (9-mer пептид предпочитали) которые являются длины пептид, привязан к MHC-я молекул15,17. Смотрите Результаты представитель на рисунке 5.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Дизайн библиотеки OLP, охватывающих всю длину белка

    Начиная с N-го белка, каждый пептид-15 аминокислот (15-mer). Следовательно первый пептидный охватывает позиции 1 – 15. N-окончание второго пептида перекрывается с C-конечная первый пептидный 11 аминокислоты. Следовательно второй пептид охватывает позиции 5 – 19. Дизайн-остальная часть пептидов в конце C-конечная белка (рис. 1). Мы выбрали 15-mer библиотеки, потому что мы и другие показали, что 15-mer пептиды, при добавлении в дендритные клетки (DCs) или макрофаги, могут быть эффективно обработаны в epitopes для распознавания CD8+ T клетки14,15. Количество УПСО в библиотеке зависит от длины белка. Кроме того последний OLP может варьироваться от 12 до 15-mer в зависимости от длины белка. К примеру миелина Олигодендроциты гликопротеина (MOG) имеет длину 247 аминокислот. MOG OLP библиотека содержит 59 УПСО12. Представитель результаты, представленные в этой рукописи являются от анализа MOG OLP библиотеки.

    Определение OLP_pool конкретным, Qa-1-ограниченный ответ в OLP_pool стимулирует CD8 линия клетки T+

    Мы создали CD8+ Т-клеток линии, который был инициирован Kb-/-Db-/- DCs пульсирующий с MOG OLP_pool (MOG_pool) и рестимулирован, пульсирующий MOG_pool Kb-/-Db-/- перитонеальных макрофагов, как описано в вышеупомянутый Протокол (1, 2 и 3). Для определения потенциальных MOG_pool конкретным, Qa-1-ограниченный ответ в этом CD8+ Т-клеток линии, мы изучили ответ этой CD8+ Т-клеток линии MOG_pool в присутствии C1R или C1R. QA-1b клеток с использованием ИФН γ ELISPOT пробу (рис. 2) (протокол шаг 4). Наши данные показывают, что MOG_pool стимулирует CD8+ Т-клеток линии выделяется низкий уровень ИФН γ в присутствии C1R. QA-1b клетки (32 место формирования клеток или SFCs), но не C1R клетки (2 SFCs), указывающей на присутствие CD8+ T клетки, который ответил на epitopes Qa-1-привязки, производный от C1R клеток (клетки C1R лимфобластоидных клеток человека B). SFCs были увеличены, когда MOG_pool был добавлен в колодец, который содержал C1R клетки (78 SFCs), указывающей на присутствие CD8+ T клетки, который ответил на не Qa-1 epitopes. SFCs были резко возросло, когда MOG_pool был добавлен в колодец, который содержал C1R. QA-1b клеток (320 SFCs), указывающей на присутствие CD8+ T клетки, который ответил на пептиды Qa-1-привязки. Данные также показывают, что MOG_pool содержит epitope(s) КК-1-привязки.

    Определение отдельных пептидов в OLP_pool, которые способствуют секреции Qa-1-ограничено ИФН γ в OLP_pool реактивной CD8 линия клетки T+

    Чтобы определить пептидов в OLP_pool, который стимулирует секрецию Qa-1-ограничено ИФН γ в MOG_pool реактивной CD8+ Т-клеток линии, мы стимулировали MOG_pool реактивной CD8+ T-клеток с отдельными 59 УПСО присутствии либо C1R или C1R. QA-1b клеток (рис. 3) (протокол шаг 5). Наши данные показали, что несколько SFCs были замечены в скважинах, которые содержали C1R клеток и УПСО. В отличие от SFCs увеличилась на всех скважинах, которые содержали C1R. QA-1b клетки и УПСО. Рисунок 2, мы узнали, что CD8 клетки+ T в присутствии C1R. QA-1b только также образуется SFCs. Таким образом увеличение SFCs в большинстве скважин может быть вызвано неспецифической стимуляции в результате представления epitopes Qa-1, производный от внутриклеточных белков в клетках C1R молекул, Qa-1. Однако УПСО в 3 подставил скважины в рисунке 3 c (B8, D12 и E9), который соответствует 3 выделены УПСО на рисунке 3A (OLP68, OLP96 и OLP105), встретился с критерием для определения OLP-конкретным, Qa-1-ограничено ИФН γ ответ как описанные в шаге 5.1 протокола12. Данные показывают, что 3 УПСО содержат Qa-1 epitope(s). Поскольку OLP105 последовательно производства высоким ответ, мы провели подробный анализ OLP10512.

    Дизайн библиотеки усеченного пептид для 15-mer OLP

    15-mer OLP, который был определен для стимулируют секрецию Qa-1-ограничено ИФН γ в OLP_pool реактивной CD8+ Т-клеток линии, необходимо проанализировать для оптимального эпитоп, с использованием библиотеки усеченного пептид. Такие усеченные пептид Библиотека разработана округляя постепенно 15-mer OLP 1 амино кислоты на ее N - и C-Термини (рис. 4). Похож на другие гистосовместимости молекул, молекулы Qa-1 главным образом связать 8 - 10-mer пептиды. Таким образом мы рекомендуем, что кратчайший усеченного пептида является 6-mer в длину.

    Определение оптимального epitope Qa-1 в 15-mer OLP, который стимулирует секрецию Qa-1-ограничено ИФН γ в OLP_pool реактивной CD8 линия клетки T+

    Выше N - и C-неизлечимо усечено пептиды проверяются на прочность в стимулировании Секреция ИФН γ в CD8+ Т-клеток линии для OLP_pool или 15-mer OLP, используя ELISPOT ИФН γ, описанных выше. В исследовании Qa-1 epitopes в MOG12, мы создали CD8+ Т-клеток линии, которая была для MOG OLP105 (Рисунок 5A). Дальнейший анализ показал, что N-неизлечимо усеченного 9-mer пептид встретились два критерия для оптимального epitope как описано в шаге протокол 6.2 (Рисунок 5B). Таким образом, мы пришли к выводу, что N-неизлечимо усечено 9-mer пептид был оптимальный epitope Qa-1.

    Figure 1
    Рисунок 1: дизайн библиотеки OLP, охватывающих всю длину белка. Начиная с N-го, пептиды, аминокислоты (15-mer) протяженностью 15 были определены.N-конечная Каждый пептид, за исключением первого пептид, перекрывается с C-конечная предыдущих пептид 11 аминокислоты.

    Figure 2
    Рисунок 2: MOG_pool стимулирует CD8+ T клетки были частично MOG_pool конкретные и Qa-1-ограничено12. В пробирке CD8+ T клетки стимулируется MOG OLP_pool (MOG_pool) были рассмотрены для реагирования на MOG_pool в присутствии C1R или C1R. QA-1b клетки как антиген представляющих клеток, используя assay ELISPOT ИФН γ. Представитель ELISPOT изображения отображаются. Количество спот формирование клеток (SFCs) отображаются в верхней левом углах каждой скважины. CD8+ T клетки: 50000 клеток/хорошо. C1R или C1R. QA-1b клетки: 200.000 клеток/хорошо.

    Figure 3
    Рисунок 3: анализ УПСО в MOG_pool, которые несут ответственность за обеспечение качества-1 ограничена ответ. (A) макет V-дно 96-луночных пластина, которая содержит 10 мг/мл отдельных УПСО MOG. Номера в скважинах представлял OLP идентификаторы. Выделенные 3 скважины содержал УРПО, которые соответствуют критерию для ответа ИФН γ OLP-конкретным, Qa-1-ограничено как описано в шаге 5.1 протокола12. (B) представитель SFCs в каждой скважине, который содержал OLP (конечная концентрация = 4.2 мкг/мл, OLP ID соответствует, в «A»), MOG_pool реактивной CD8+ T клетки (50 000 клеток/хорошо) и C1R клетки (200 000 клеток/хорошо). (C) представитель SFCs в каждой скважине, который содержал OLP (конечная концентрация = 4.2 мкг/мл, OLP ID соответствует, в «A»), MOG_pool реактивной CD8+ T клетки (50 000 клеток/хорошо) и C1R. QA-1b клетки (200 000 клеток/хорошо). 3 подставил скважины содержал УРПО, которые удовлетворяют критерию OLP-конкретным, Qa-1-ограничено ИФН γ ответ12. Этот показатель был адаптирован от ссылка12Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 4
    Рисунок 4: дизайн усеченного пептидов 15-mer пептид. 15-mer пептид постепенно был урезан на его N - и C-Термини с 1 аминокислоты в 6-mer. 15-mer и его усеченной пептиды затем были синтезированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 5
    Рисунок 5: анализ оптимального epitope Qa-1 в OLP105. (A) OLP105-стимулирует CD8+ Т-клеток линии был рассмотрен для реагирования на OLP68, OLP96 и OLP105 в присутствии C1R или C1R. QA-1b клеток с помощью ИФН γ ELISPOT assay. Представитель ИФН γ SFCs (номера на верхних углах левой) показываются. (B) OLP105-конкретных CD8+ Т-клеток линии, как показано на (A), был рассмотрен для реагирования на отдельные N - и C-неизлечимо усечено пептидов, как показано на рисунке 4, в присутствии C1R. QA-1b клеток с использованием ИФН γ ELISPOT assay. OLP105: 15-mer OLP. N6-14: N-неизлечимо усечены OLP105 пептидов. C6-14: C-неизлечимо усечены OLP105 пептидов. CD8+ T клетки: 50000 клеток/хорошо. C1R. QA-1b клетки: 200.000 клеток/хорошо. Номера в верхней левой углы были SFCs за 50000 CD8+ Т-клеток. Красный прямоугольник отмечен хорошо, что отвечает критериям для определения оптимального epitope Qa-1 в OLP, как описано в шаге протокол 6.2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Здесь мы описали протокол для анализа Qa-1 epitopes в протеине. В отношении настоящего протокола ряд других стратегий также сообщалось ранее. Во-первых, аллогенной CD8+ Т-клеточных линий и клоны были использованы для идентификации Qdm1. Во-вторых предполагаемый мотив Qa-1-привязки из анализа Qdm использовался для идентификации HSP60p216-224 и epitope9,TCRBV8.118. Третьих, отдельных перекрывающихся пептиды от белков были использованы для иммунизации животных. Впоследствии, CD8+ T клетки изолированы от привитых животных были использованы для определения TCRBV8.2 пептид p42-50 которая впоследствии была подтверждена для привязки к Qa-16,10,19. В-четвертых, функциональных CD8+ линии в сочетании с cDNA отображения библиотеки использовались для выявления FL9 КК-1 epitope4Т-клеток.

    Со ссылкой на предыдущие методы, использование аллогенной CD8+ Т-клеток линии и клоны мая не пригодны для анализа epitopes Qa-1, которые представлены во время физиологической иммунной реакции. Кроме того накапливая данные позволяют предположить, что ранее описанных привязки мотив может лишь частично представляют пептид связывающая способность молекул Qa-1. Таким образом точные мотив Qa-1-привязки до сих пор не известно4. Кроме того иммунизации с отдельными пептидные для выявления epitopes Qa-1 является трудоемким. Наконец cDNA отображения библиотеки стратегия предполагает строительство многих векторов, которые несут различные пептид длины для transfection клетки. В отличие от этого, стратегия библиотеки OLP, описанные здесь проста, и сопоставленных пептидов, как известно, стимулировать Qa-1-ограничено CD8+ T клетки. Таким образом наша стратегия имеет уникальное преимущество.

    Стратегия, в описанный здесь использует OLP_pool конкретных CD8+ T клеток, которые генерируются в vitro грунтовки и рестимуляции. Альтернативный источник CD8+ T клетки может быть от дренаж лимфатических узлов kb-/-Db-/- мышь, что прививки с источник белка20. Такой иммунитет CD8+ T клетки могут быть проанализированы для ИФН γ ответы УПСО и усеченные пептиды для идентификации epitopes Qa-1. Теоретически, в естественных условиях иммунные CD8+ T ближе к физиологического состояния, чем в пробирке создан CD8 клетки+ T клетки. Однако, мы обнаружили, что ответ иммунной CD8+ T клетки непосредственно очищенного от иммунизированная мышь была слабой и часто требуется в пробирке рестимуляцию для удовлетворительного пептид, результаты обследования. Кроме того этот протокол разработан для будущих перевод человека учиться epitopes HLA-E, котором в vivo иммунизации не является практичным.

    Технически, важной частью настоящего протокола это поколение CD8+ Т-клеток линии, которые являются специфическими для OLP_pool или отдельных OLP. Так как Qa-1/пептидных комплексов являются неустойчивыми по сравнению с классической MHC/пептидных комплексов21, после того, как антиген представляющих клеток пульсирующий с УПСО или пептид, пульсирующий клетки не следует мыть широко. Мы обнаружили, что пептид импульсного клетки, если мыть широко, потерять или значительно уменьшить способность стимулировать CD8+ T клетки. Поэтому, мы рекомендуем мытья пептид импульсного антиген представляющих клеток раз сразу прежде чем они совместно культивируемых с CD8+ T клетки.

    Кроме того, из-за нестабильности Qa-1/пептидных комплексов, мы рекомендуем использование сыворотки свободной среды для импульсной пептида и стимуляции CD8+ T клетки. Кроме того, мы регулярно добавлять 50 ед/мл IL-7 во время CD8+ T клеточные культуры, а также в ходе ИФН γ ELISPOT проба. IL-7 предназначен для поддержания жизнеспособности и функции CD8+ T клетки. IL-7 сама по себе не стимулируют CD8 клетки+ T производить ИФН γ.

    Аналогично все стратегии, epitopes Qa-1, сопоставленные этой стратегии также требуют дальнейшего расследования биологическое значение. Например один из важных вопросов является ли сопоставленный epitope могут представляться физиологически. Для решения этого вопроса, DCs может преобразованы с лентивирусные вектор, который выражает epitope источника белка (например, MOG в MOG OLP исследование). Впоследствии, ответ CD8 эпитоп специфических+ T клетки в transduced ДКС рассматривается. Положительный ответ предполагает, что epitope может физиологически обработаны и представлены DCs. Кроме того, функциональные последствия в результате epitope признание CD8+ T клетки следует провести дальнейшее расследование. В этой связи анализ Qdm и FL9 КК-1 epitopes привели к выводу, что КК-1 молекулы имеют важное значение для иммунной наблюдения1,4. Кроме того, исследования HSP60p216, TCRBV8.1 пептид, и p42-50 привели к выводу, что КК-1-ограничено CD8+ T клетки регулируют иммунные реакции путем целенаправленного патогенных CD4 клеток+ T 6,7 ,9,19. Кроме того, исследование MOG196 имеет для в первый раз показал, что КК-1-ограничено CD8+ T клетки могут регулировать иммунные реакции, непосредственно на ткани, чтобы предотвратить его от повреждений потенциально патогенные клетками аутоиммунных12 . Наконец функциональный анализ конкретных эпитопу, Qa-1-ограничено CD8+ Т-клеток могут быть помощь Тетрамер. Такие Тетрамер могут быть произведены в низ Тетрамер основного фонда (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) или компании. Просить поколения Тетрамер, одно может послать функциональные данные, которые поддерживают связывание вновь сопоставленного оптимального epitope Qa-1 для Qa-1 белок для их утверждения для поколения Тетрамер Qa-1.

    В заключение, предыдущие исследования показали, что КК-1-ограничено CD8+ T клетки играют важную роль в регуляции12местных иммунных реакций. В этой связи ущерб ткани может быть вызвано иммунный ответ, непосредственно предназначенное для ткани. Кроме того сопутствующего ущерба может быть вызвано иммунный ответ, ориентированном вторжение патогенов. Таким образом, понимание роли Qa-1-ограничено CD8 клетки+ T в этих двух различных тканей ущерба имеет важное значение для их клинического применения.Для достижения этой цели необходим тщательный анализ Qa-1 epitopes в self ткани или вторжение патогенов. Этот протокол будет подходящим для проведения этих анализов.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

    Acknowledgements

    Мы благодарим Пенелопа Гарсия за ее технической помощи и подготовки этой рукописи. Эта работа была поддержана исследований инноваций Грант (Рог) от Департамента медицины в университете Loma Linda (681205-2967) и экспериментального грант от Национальное общество рассеянного склероза (PP1685) до XT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79, (4), 649-658 (1994).
    2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188, (10), 1841-1848 (1998).
    3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207, (1), 207-221 (2010).
    4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13, (6), 579-586 (2012).
    5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5, (5), 516-523 (2004).
    6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177, (11), 7645-7655 (2006).
    7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123, (3), 1382-1389 (2013).
    8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 534-539 (2009).
    9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113, (8), 1218-1224 (2004).
    10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178, (10), 6043-6050 (2007).
    11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (52), 21089-21094 (2013).
    12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
    13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72, (5), 2843-2849 (2004).
    14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8, (3), e59210 (2013).
    15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350, (6320), 703-706 (1991).
    16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
    17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360, (6402), 364-366 (1992).
    18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3, (14-15), 1249-1259 (2001).
    19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182, (11), 6959-6968 (2009).
    20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
    21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172, (3), 1661-1669 (2004).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics