离心淘洗制备不同细胞周期的原发性急性淋巴细胞白血病细胞

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

本议定书描述了使用离心淘洗分离原发性急性淋巴细胞白血病细胞到不同的细胞周期阶段。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Delgado, M., Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation. J. Vis. Exp. (129), e56418, doi:10.3791/56418 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

同步细胞的能力一直是促进我们对细胞周期调节的理解的中心。常用的技术包括血清剥夺;在不同的细胞周期阶段逮捕细胞的化学物质;或使用有丝分裂 shake-off, 利用其减少粘附。然而, 所有这些都有缺点。例如, 血清饥饿对正常细胞很有效, 但对于因癌基因活化或肿瘤抑制丧失而受损的细胞周期检查点的肿瘤细胞来说, 效果却不那么好。同样地, 经过化学处理的细胞群可以产生药物引起的损伤, 并显示与压力相关的改变。绕过这些问题的一种技术是逆流离心淘洗 (CCE), 在这里, 细胞受到两种相反的作用力, 离心力和流体速度, 导致细胞在大小和密度的基础上分离。由于细胞通过周期的推进通常会扩大, CCE 可用于将细胞分离成不同的细胞周期阶段。我们将此技术应用于原发性急性淋巴细胞白血病细胞。在最佳条件下, G1 期细胞的基本纯种群和 G2/M 期细胞的高富集率可获得优良的产量。这些细胞的数量非常适合研究抗癌药物和其他应用的细胞周期依赖性机制。我们还展示了对标准过程的修改如何导致次优的性能, 并讨论了技术的局限性。所提出的详细方法应有助于对其他类型的细胞进行技术的应用和探索。

Introduction

培养细胞通常以异步方式生长, 而单个细胞则存在于细胞周期的不同阶段。有些有机体自然地陈列同步细胞周期或可以由具体生理刺激同步。例如, 在粘液霉菌的巨型疟原虫中的细胞核,多头多头在高度同步的方式下进行了1, 绿藻的细胞Desmodesmus quadricauda可以通过交替的光和暗来同步期间2。虽然这些生物体提供了独特的实验特性, 但它们没有充分地模拟哺乳动物细胞的复杂性。人工同步哺乳动物细胞的能力一直是促进我们对细胞周期调节和细胞周期检查点的分子基础的理解的中心。常见的方法包括血清剥夺, 化学阻滞和释放, 或利用物理特性3,4。血清的提取经常导致细胞进入平静, 并且血清的 re-addition 促进细胞周期再入进入 G1 阶段5。化学抑制剂包括诸如过多的胸苷或羟基的药物, 这些因子阻断了 G1/S 边界的细胞, 或通常在 M 阶段34中逮捕细胞的微管抑制剂。利用物理特性的方法包括有丝分裂 shake-off, 它可以用来丰富有丝分裂细胞, 因为它们比相间细胞的黏附性小6。然而, 所有这些技术都有潜在的缺点。例如, 并非所有的细胞类型在缺乏血清或化学抑制剂存在的情况下都保持生存能力, 有丝分裂 shake-off 后细胞的收率是有限的, 不需要事先与有丝分裂抑制剂同步。

除了早期的胚胎细胞周期, 当细胞分裂为7时, 它们的大小逐渐减小, 但大多数细胞在循环中前进, 经历了生长阶段, 变得更大。此属性在逆流离心淘洗 (CCE) 技术中被利用, 它可用于分隔大小不同的单元格, 从而在单元周期阶段8,9中分离。在 CCE 期间, 细胞受到两种相反的作用力的影响: 离心力, 它驱动细胞远离自转轴, 流体速度 (逆流), 它驱动细胞朝向旋转轴 (图 1)。在淘洗室的细胞达到平衡的位置, 这些力量是平等的。支配平衡位置的关键因素是细胞直径和密度。随着缓冲液流速的增加, 逆流阻力大于离心力, 建立了新的平衡, 引起腔内细胞位置的变化。所有的细胞都被转移到腔室的出口, 导致较小的单元先离开腔室, 而较大的细胞则留在腔室内, 直到逆流率增加, 以促进其退出。淘洗室逃逸的细胞, 连续增加逆流率, 可以收集在特定的分数和每个分数包含按顺序增加大小的细胞。随着逆流速率的增加, 离心速度的下降会导致离心力的连续下降, 而不是淘洗。淘洗的过程需要根据细胞类型、使用的淘洗缓冲器和所用的特定仪器进行优化。在这些条件下, 细胞沉淀的速率最好用斯托克斯定律描述: sv = [d2pm)/18η]. ω2r, 其中 sv = 沉淀速度;d = 微粒的直径;ρp = 粒子的密度;ρm = 缓冲区的密度;η = 缓冲器的粘度;ω = 转子的角速度;和 r = 粒子的径向位置。因此, SV 与细胞直径和密度成正比, 因为直径被提高到第二个功率, 它的贡献比密度通常是通过细胞周期常数。

CCE 的一个重要优点是, 细胞不受化学治疗或营养缺乏的苛刻条件的影响, 可以在良好的产量中恢复, 基本上是泰然自若的。一个要求是, 当它们遍历细胞周期时, 所讨论的细胞直径会显著增加, 至少有30%。主要缺点是专用离心机、转子和附件的成本。尽管如此, 通过 CCE 培养细胞在特定细胞周期阶段富集的能力, 极大地促进了细胞周期研究从酵母到哺乳动物细胞9,10。此外, 最近的进展是扩大用于分离的细胞从健康与癌组织, 分离不同的细胞类型在异构混合物, 并生产特定的细胞类型的免疫治疗的9

我们的主要兴趣是了解微管靶向剂 (mta) 的作用机制, 如长春生物碱和紫杉。这些药物被认为完全是在有丝分裂, 阻断纺锤微管功能11,12, 但最近的证据表明它们也可能靶向界面微管13,14。我们最近报告说, 原发性急性淋巴细胞白血病 (所有) 细胞在 G1 期或 M 期发生死亡时, 以长春新碱和其他 mta 的细胞周期依赖性的方式处理15。通过 CCE 将所有细胞分离成不同的细胞周期阶段的能力有助于达到这个结论。在本文中, 我们描述的技术细节, 并提供实用的技巧, CCE 的应用, 以准备在不同的细胞周期阶段的主所有细胞。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol


注意: 此协议已针对主要 B-所有单元格进行了优化, 其直径范围从大约8和 #181; m (G1 阶段) 到13和 #181; m (G2/M 阶段)。因此, 具体的离心机速度和泵流量可能不适用于不同尺寸范围的电池。然而, 利用沉降速率方程可以估计适当的淘洗参数。细胞在一个被定义的无血清培养基被培养, 如描述的 16 在优选的密度 1-3 x 10 6 细胞/毫升。除4和 #176 所进行的馏分的收集外; c 使用冰冷管, 所有步骤都在室温下进行, 离心机设置在20和 #176; c 的最大值为24和 #176; c.

1. 准备淘洗缓冲和材料

  1. 为了减少细胞的结块, 准备一个淘洗的缓冲液和 #39 的平衡盐水溶液 (HBSS) 与酚红补充2% 胎牛血清 (FBS), 保护细胞免受机械应力在淘洗过程中, 和1.6 克/升的 2-萘酚-68 二磺酸二钾盐 (NDA), 这使得细胞的外部负电荷和减少结块。
    1. 向50毫升锥形管添加1.6 克 NDA.
    2. 在无菌条件下, 将35毫升的 HBSS 从1升瓶中添加到包含 NDA 的50毫升圆锥管中。漩涡管, 直到 NDA 已解散.
    3. 使用0.2 和 #181; m 过滤器, 将溶解的 NDA 转移到新的无菌50毫升锥形管中。然后将 NDA 添加到其余的 HBSS 1 L.
    4. 最后, 向 HBSS 添加21毫升 FBS, 以获得最终浓度为 2% (v/v).
      注: 淘洗缓冲器可以准备和存储在4和 #176; C 直到截止日期在 HBSS 或直到有一个主要的变化, 在 pH 值表明, 由指示染料泛黄.
  2. 标签50毫升锥形管收集的分数, 使有管标记洗涤1和 2 (W1 和 W2), 分数 1-20 (F1 和 #160;-F20), 并停止。
    1. 在收集分数之前先在冰上冷却这些管子.

2。淘洗系统的程序集

  1. 首先, 将频闪组件安装到离心机中, 使电源线通过左侧的端口送入会议厅。确保闪光灯闪灯在房间的前面, 这样当离心机关闭时, 它会与观察窗口排成一线。
    1. 将两个梅花头螺钉拧紧到每个托架顶部的两个孔中, 然后拧紧每个托架底部的螺钉, 以确保固定组件的安全.
    2. 将电源线插入离心机背面的频闪电源端口.
  2. 下一步, 将转子垂直向下设置到离心机驱动器集线器上, 并使用 T 型手柄的六角扳手进行安全处理.
    注: 如果离心机不需要为 non-elutriation 目的, 闸门组件和转子可以保持在离心机之间的运行.
  3. 一旦转子是固定的, 放置的快速释放组件包含淘洗室, 计数器平衡, 旋转密封组件, 和安装板进入转子。
    1. 用一只手在淘洗腔上均匀向下推, 另一只手放在计数器的天平上, 直到转子上的螺栓进入安装板上的孔.
    2. 最后, 通过将电缆一侧的针脚放入旋转密封组件的孔中, 并将电缆的另一侧的 eyehole 固定在左侧托架上的一个十字头螺钉 (2.1.1 中提到) 上, 从而连接锚定电缆。f 会议厅.
  4. 下一步, 使用变速泵和油管组装流系统, 将缓冲器泵入淘洗腔, 并在淘洗室流出时收集缓冲器。
    1. 将大小为16的输入管插入来自变速泵, 通过在离心室左上方的端口, 使其进入会议厅.
    2. 将管接头连接到输入管的自由端, 并将管件插入旋转密封组件一侧的输入孔中.
    3. 通过端口插入尺寸为16的输出管, 并将其连接到旋转密封组件顶部的传输管上.
      注: 流系统还可以在淘洗运行之间保持组装.
  5. 最后, 打开离心机并设置实验所需的规格。
    1. 更改转子 ID.
    2. 如果离心机需要时间输入, 则设置为2小时, 这足以完成淘洗运行.
    3. 将温度设置为20和 #176; c 的最大 temp 为24和 #176; c.
    4. 设置最大加速度和减速速度.
    5. 最后, 将速度设置为 867 x g.

3。淘洗系统的启动

  1. 首先为了对淘洗系统进行消毒, 将储油管放入500毫升的塑料瓶中, 其中含有5% 漂白剂, 并将输出管放入一个空的 1 L 塑料废物瓶中。
    1. 打开泵并将速度设置为25毫升/分钟, 并允许5% 漂白剂流经淘洗系统, 直到它从输出管泵出到垃圾桶中为止.
    2. 打开离心机, 使其达到最大指定速度 (867 x g), 以释放气泡和反压.
    3. 停止离心机。一旦转子停止旋转, 打开盖子和检查室的任何泄漏.
    4. 如果没有泄漏, 让漂白剂溶液流经系统至少5分钟.
  2. 下一步, 用蒸压水冲洗系统, 因为漂白剂可以导致从淘洗缓冲中形成沉淀物, 这可能导致细胞结块, 并对细胞造成伤害。
    1. 将储油管管放入一瓶1升的蒸压水中, 并允许其冲洗至少10分钟.
  3. 用水冲洗后, 将淘洗缓冲区引入系统。使用一个150毫升的玻璃瓶, 已被蒸压, 以创建一个水库的淘洗缓冲和细胞。
    1. 将100毫升的淘洗缓冲液添加到瓶子中, 并将储油管移到玻璃瓶中, 使管道处于最底部.
    2. 启动离心机并允许缓冲区流经系统以冲洗水.
    3. 一旦储气瓶几乎是空的, 并且水从系统中完全冲出, 将输出管从废物瓶移到蓄水池, 以便通过系统回收缓冲液.
  4. 最后, 调整查看窗口, 以便在当前速度下可以看到淘洗室。
    1. 按离心机外部的频闪灯电源按钮, 使灯打开。转淘洗 k也在离心机的外部, 一路向左.
    2. 在查看窗口时, 慢慢地将旋钮向右转, 直到淘洗室进入视野, 并且闪光灯与转子的旋转时间有关.
      注意: 淘洗系统可以保留在此状态, 直到单元格准备就绪.

4。制备细胞样本

  1. 将生长培养基中的细胞数和分300到 4亿, 放入几个50毫升的锥形管中。旋转 1210 x g 的细胞3分钟.
  2. 在25毫升的淘洗缓冲液中, 通过移轻轻地向上和向下吸出生长培养基和重细胞.
  3. 为了减少细胞结块, 通过一个25口径的针通过两次细胞。
    1. 使用10毫升注射器绘制单元格, 然后连接25针, 并将电池通过到无菌50毫升锥形管的内侧壁。重复这一点, 直到所有25毫升通过针.
    2. 获得一个新的针头和注射器, 并重复上述过程一次.
      注意: 注射器针应该放在锋利的容器里.
      注意: 在将细胞引入淘洗系统之前, 必须立即通过针头, 使细胞聚集到最小.

5。将细胞样本引入淘洗系统和分数的收集

  1. 通过将单元格样本注入到具有剩余淘洗缓冲区回收的储罐中, 将单元格引入淘洗系统中.
    1. 让单元格进入系统并在淘洗腔内达到平衡.
      注意: 这一过程大约需要5分钟, 通过观察窗口进入会议厅, 可以跟踪这些细胞的进展情况。为了确保所有的细胞都在室内, 采取一滴淋洗, 放置在一个玻璃幻灯片, 并在显微镜下查看。如果样品没有完整的细胞, 这证实了它们在腔室中的滞留.
  2. 开始收集分数一旦所有的细胞进入会议厅, 并有一个明确的边界, 在最广泛的部分, 其中细胞处于平衡。
    1. 首先将输出管移动到标记为 W1 的 50 mL 圆锥管上。收集50毫升的淘洗缓冲区的这一分数, 确保保持一个眼睛的油箱和补充淘洗缓冲必要时.
      注: 为了确保所有的细胞都进入了系统, 让储罐在第一次充注水库之前变得几乎是空的。第一次灌装后, 将不必等待水库变得几乎空。此外, 永远不要让坦克变成空, 因为这将产生气泡和背部压力在系统中.
    2. 一旦50毫升已收集 W1, 同时改变速度到 821 x g 和移动输出管的锥形管标记 W2 和收集50毫升以上的速度.
    3. 继续更改速度和收集分数, 如表1所示。确保储罐中有介质, 并始终保持锥形管在冰上。最后, 当速度减小时, 通过缓慢地将旋钮向右旋转来调整查看窗口.
    4. 一旦所有20分数被收集, 停止离心机和收集50毫升在锥形管标记停止.

6。淘洗系统的冲洗

  1. 在离心机停止完全冲洗系统后, 将蓄水池管放在1升的蒸压水中, 并将输出管放回废瓶中。
    1. 将泵速提高到50毫升/分钟, 并允许水通过系统运行, 直到耗尽为止.
  2. 关闭泵, 从快速释放组件中卸下输入和输出软管, 然后从锚索拔下针脚。
    1. 从转子上卸下快速释放组件.
      注: 根据离心机的用途, 淘洗系统现在可以离开了。否则, 整个程序集可以按上述顺序进行相反的排序。淘洗室可从快速释放组件中取出, 并在使用超声波水浴的运行之间进行清洗。这将清除可能对以后运行产生负面影响的腔壁上的碎片和污染物.

7。分析 G1 或 G2/M 池的分数和集合.

注意: 为了证明淘洗的有效性, 每个分数都被分析为细胞计数、细胞直径和 DNA 含量, 而池是在 G1 或 G2/M 阶段为免疫分析创建的细胞, 如代表性的结果。本协议部分将介绍如何创建这些池并准备它们以供实验使用.

  1. 将每个分数在 2000 x g 处旋转5分钟, 在4和 #176; C 和吸气淘洗缓冲.
  2. 将分数组合在一起以获得 G1 相池和 G2/M 阶段池。
    1. 对于 G1 相池, 重的分数在 788 x g 到 661 x g (F1-F5) 的速度范围内收集, 总共1毫升磷酸盐缓冲盐水溶液 (PBS), 并转移到15毫升锥形管。对于 G2/M 相池, 在 387 x g 和 333 x g (F17-F20) 的速度范围内收集的重分数.
    2. 在4和 #176 上向下旋转 2000 x g 处的单元格, 并从 PBS 中抽离.
  3. 在10毫升的生长介质中重单元格并进行单元格计数.
  4. 从每个池中提取一个分, 通过碘碘化染色和流细胞分析来分析 DNA 含量 15 .
    注: 每个池的剩余部分可用于进一步的实验.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

主所有单元格 (3-4 x 108) 受离心淘洗, 并收集到两个洗涤分数和二十主要分数, 如协议中所述。表1显示了代表性的数据, 其中每一个部分的细胞总数, 以及相应的转子速度提出。总体产量一般在80% 以上。单个分数中细胞直径的测量证实了细胞直径随推进淘洗而增加 (图 2)。这些结果代表了两个独立确定的平均值, 反映了数据重现性高的程度。分数是下一个受碘碘化染色和流式细胞仪测定 DNA 含量 (图 3)。早期组分 (F1-F5) 包含几乎完全细胞以2N 脱氧核糖核酸内容代表 G1 阶段。在中间馏分 (F6-F9) 中观察到 G1 相和 S 相的细胞混合物, 从 F10 开始观察 4N DNA 含量的细胞。后来的分数主要有 4N DNA 含量代表 G2/M 相的细胞。这些数据连同图 2的结果确认了单元格大小和单元周期阶段之间的关系。

根据这些结果, 分数 F1-F5 被结合在一起创建一个细胞池在 G1 阶段, 和分数 F17 F20 被结合在一起创建一个细胞池 G2/M 阶段。G1 相池中 2N dna 含量的细胞比例通常为 99%, 而 G2/M 池中 4N dna 含量的细胞比例通常为 85%, 由碘碘染色和流式细胞仪确定。在异步条件下, 60-70% 的主所有单元格处于 G1 阶段, 15-20% 处于 G2/M 阶段15, 因此在淘洗后获得的值反映了高度的富集程度。为了进一步验证两个池的细胞周期阶段, 每个提取物都受到免疫的标记, 无论是 G1 或 G2/M 阶段。首先, 我们使用了一种磷特异的抗体, 它可以识别视网膜母细胞瘤 (rb) 蛋白磷酸化的 Ser-807 或 Ser-811, 因为它是公认的 Rb 日益磷酸化, 通过细胞周期17.如图 4所示, G2/M 池中的磷和 G1 相池中的单元格的级别要高得多, 与预期一致。我们还探讨了细胞周期蛋白 B1, 这是最高的表达在 G2/M 相单元, 和细胞周期蛋白 D1, 这是最高度表达的 G1 相细胞18 (图 4)。G2/M 池有更高水平的细胞周期蛋白 B1 比 G1 池, 符合预期。细胞周期蛋白 D1 在这些准备中只给出微弱的信号, 但在 G1 池中却能检测到, 在 G2/M 池中是无法探测到的。GAPDH 被用来确定相同的蛋白质负荷。

对标准协议进行了修改, 以评估其效果并为最佳性能建立条件。首先, 从标准二十到仅三, 收集的分数减少了, 使用表1中确定的速度来表示 G1、S 或 G2/M 阶段的单元格集合的终端点, 如表2所示。F1 和 F3 的 DNA 含量的分析显示在图 5A中。分数1包含在 G1 阶段 (95%) 中高度丰富的细胞, 因此与标准条件 (图 3) 中获得的纯度相同。然而, 分数 3, 表面上的细胞高度丰富的 G2/M 阶段, 给了混合人口, 细胞在 G1 和 S 阶段也存在。在标准条件下, G2/M 细胞仅占总数的 51%, 而85%。这些结果表明, 试图通过减少分数的数量来简化程序, 从而降低了样本质量。接下来, 我们测试了减少馏分体积的效果, 作为降低试剂消耗的手段。一个标准的淘洗执行, 除了40毫升, 而不是50毫升的分数收集。分析了 F1 和 F20 的 DNA 含量。如图 5B所示, 分数 F1 是高度丰富的 G1 相细胞 (98%), 类似于在标准条件下获得的。然而, 分数 F20 包含所有三阶段的细胞, 在 G2/M 阶段的细胞只代表64% 的总, 而标准条件下的85%。这些结果表明, 降低馏分体积也会损害样品质量。

Figure 1
图 1.逆流离心淘洗的原理。
请注意, 淘洗的细胞可以通过增加逆流的速率, 如此处所示, 或通过降低转子转速。根据麦克米伦出版商有限公司的许可改编: [自然协议] (Ref 8), 版权所有 (2008)8请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.主所有单元格的直径随淘洗分数的增加而增大.
平均直径是确定每一个分数使用的细胞分析仪, 记录数据从 500-4500 的单个细胞每个样本。从两个独立实验中显示的数据均为±法令。注意, 许多点的误差线比符号小, 并且为清晰起见省略了。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.DNA 含量的分析证实了在不同的细胞周期中, 主要细胞的分离是成功的。
10毫升的每一个部分是固定在70% 乙醇, 染色碘碘化物和流式细胞仪分析, 如描述的15。碘碘化综合强度 (x 轴) 的绘制与细胞计数 (y-axis), 以确定在每个阶段的细胞部分, 其中 2N dna 含量表明 G1 相和 4N dna 含量指示细胞在 G2 或 M 阶段。所显示的数据是从一个代表性的实验和基本相同的结果得到了四重复。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.池内细胞周期相关蛋白的免疫分析分数.
按照一个标准的淘洗的主要所有细胞, 分数 F1-F5 组合, 以创建一个 G1 相池和分数 F17 F20 被合并, 以创建一个 G2/M 相池。提取物的制备和40µg/车道受免疫分析, 如前所述的15, 与抗体磷 Rb (Ser807/811), 细胞周期蛋白 B1, 或细胞周期蛋白 D1, 所有使用在 1:2, 000 稀释。GAPDH (1:10,000) 被用作加载控制。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5.从次优 elutriations 的图解数据。
A) 减少所收集的分数的影响。只有三主要分数 (F1-F3), 而不是标准二十, 每100毫升, 收集, 以速度如表2所示。分析了 F1 和 F3 的 DNA 含量, 如图 3所示。B) 降低馏分体积的效果。在与表1相同的条件下收集了二十个分数, 但只有40毫升的淘洗缓冲, 而不是标准的50毫升用于每个。分析了 F1 和 F20 的 DNA 含量, 如图 3所示。请单击此处查看此图的较大版本.

分数 转速 (rpm) G 力 总细胞 (x 10 ^ 6)
W1 3000 867 x g 17.75
W2 2920 821 x g 7.00
F1 2860 788 x g 4.60
F2 2800 755 x g 10.75
F3 2740 723 x g 15.25
F4 2680 692 x g 22.50
F5 2620 661 x g 26.75
F6 2560 631 x g 25.00
F7 2500 602 x g 22.75
F8 2440 573 x g 18.00
F9 2380 546 x g 14.00
F10 2320 518 x g 10.75
F11 2260 492 x g 7.43
F12 2200 466 x g 8.63
F13 2140 441 x g 6.63
F14 2100 425 x g 4.98
F15 2060 409 x g 3.46
F16 2020 393 x g 3.43
F17 1980 378 x g 2.63
F18 1940 363 x g 3.17
F19 1900 248 x g 2.78
F20 1860 333 x g 1.66
停止 0 0 x g 5.19
总收率 245.06
产量百分比 81.69

表1。每个分数的电池产量和相应的转子转速。
单元格计数是使用自动单元计数器确定的。总收率是由单个分数与输入 (3 x 108单元格) 的总和决定的。数据是两个代表性实验的平均值。给出了离心力和相应的转子转速。

分数 转速 (rpm) G 力
W1 3000 867 x g
W2 2920 821 x g
F1 2620 661 x g
F2 2020 393 x g
F3 1860 333 x g
停止 0 0 x g

表2。次优淘洗的速度参数。
显示的是离心力和相应的转子速度为洗涤和三分数收集在一个压缩次优淘洗。有关详细信息, 请参见图 5A以获取相应的 DNA 内容和文本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

我们描述了使用 CCE 在细胞周期的不同阶段获得主所有细胞的方法。在最佳条件下, G1 相中的细胞的基本纯种群和 G2/M 期细胞的高度丰富的种群可以很容易地获得优良的产量, 如果需要的话, 在 S 相中高度丰富的细胞也可以得到。这里提出的结果是使用一个主要的所有文化 (特别是, ALL-5), 并取得了基本上相同的结果, 与独立的文化, ALL-215。另外, 所有其他主要的所有文化在异步增长期间都有相似的密度范围, 并且在受到 CCE 时也有类似的表现。我们先前的研究还表明, 其他白血病细胞系, 包括 HL60 和 K562, 可以用 CCE19,20将其分成不同的细胞周期阶段。过程中的关键步骤包括确保单元格在运行开始时是单分散的, 而不是成群的。逆流速率和转子转速条件的优化;确保系统的部件干净无杂物;避免在气流中引入气泡。当细胞在细胞周期中向前推进时, CCE 的效果最好。对于悬浮细胞中的特定种群, 可以通过检测 DNA 含量与侧散射之间的关系来建立, 后者依赖于细胞大小。碘碘化染色后的流式细胞仪可以同时测量两个参数, 如我们所描述的15。侧散射和 DNA 含量之间的线性关系提供了信心, 细胞大小随着细胞周期的推进而增加, 因此 CCE 有可能根据细胞周期阶段分离细胞。

如我们所示 (图 5), 从优化过程中产生的偏差会导致样本质量受损, 特别是对 G2/M 阶段的单元格。然而, 分数或分数体积的减少并没有明显地影响 G1 阶段细胞的纯度 (图 5)。因此, 如果只需要纯化的 G1 相细胞, 就可以耐受过程的捷径。虽然 CCE 很容易受悬浮细胞培养, 但也可以应用于亚单位分数。例如, 小鼠前 B 细胞的细胞核已成功地用 CCE8进行了大小分离。黏附细胞类型造成潜在的问题, 由于他们的倾向结块和可能的粘附在油管和淘洗室的表面, 因此应该谨慎调查。

CCE 的主要限制是设备的成本;一个可能的解决方案是与拥有必要仪器的实验室合作。但请注意, 虽然转子是一个专用的仪器, 离心机可以用于一般离心目的, 从而减少了成本只投资于 CCE。另一个限制是, 与其他方法 (如血清饥饿或化学同步) 的灵活性相比, 实验的时间安排更成问题。淘洗运行通常需要 5-6 小时, 如果随后获得的细胞需要短期或多点实验, 这可能会导致日程安排的不便。最大的优势是, 这种方法获得的细胞是不受干扰的, 可以培养许多天没有任何痛苦的迹象, 因为我们已经显示15。这与细胞同步的化学手段, 可能是药物引起的损害形成对比。最近的一项研究, 使用 NB4 细胞从急性髓系白血病爆炸, 直接比较 CCE 和其他方法, 包括逮捕与血清饥饿, 羟基, 或治疗与细胞周期蛋白依赖性激酶1抑制剂, RO-330621。Elutriated 细胞和细胞在可比较的阶段被拘捕在脱氧核糖核酸内容和周期蛋白表达方面似乎相似。然而, 当研究蛋白质组时, 在被拘捕的细胞中观察到蛋白丰度的主要变化, 特别是与压力相关的和特定于逮捕的蛋白质, 而不是在细胞大小位置的 elutriated 细胞。这些结果突出了 CCE 用于生产不受干扰的细胞的效用, 并强调在用其他方法同步的单元格中解释数据时应谨慎使用。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

妮米隆·科塔里目前在 St. 裘德儿童研究医院的细胞和分子生物学系。

Acknowledgments

这项工作得到了 NIH CA109821 的支持。我们感谢贝克曼-库尔特慷慨提供资金, 以支付出版费用和在淘洗系统的设置和运作方面的技术援助。我们感谢 Dr. 弗雷德 Falkenburg 提供初始的主要的所有文化。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks' balanced salt solution Lonza 10-508Q 1 L bottle
Fetal Plus bovine serum Atlas Biologicals FP-0500-A 500 mL bottle
2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt Acros Organics 212-672-4 100 g powder
50 mL concial tubes Denville Scientifics C1062-P 500/case
PES Membrane 0.22 µm filter unit Millipore SLGP033RB 250/pack
Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V Beckman Coulter B14544 centrifuge compatible with elutriation system
JE 5.0 elutriator rotor kit Beckman Coulter 356900 rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly
Chamber, standard, 4-mL, "A" Beckman Coulter 356943 standard elutriation chamber 
Masterflex L/S Easy-Load pump head Cole-Parmer EW-07518-10
Masterflex L/S Variable-Speed Drive Cole-Parmer EW-07528-10
Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 Cole-Parmer EW-96420-16
25 G x 1.5 Precision Glide needle BD 305127 sterile, single-use needles
10 mL Luer-Lok syringe BD 309604 sterile, single-use syringes
Vi-Cell XR Beckman Coulter 383556
PI/RNase staining buffer BD Pharmingen 550825 propidium iodide/RNase staining buffer
cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-245
cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 8516s
GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 2118s
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6516
Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
  2. Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
  3. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
  4. Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
  5. Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
  6. Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
  7. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
  8. Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
  9. Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
  10. Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
  11. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
  12. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
  13. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
  14. Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
  15. Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
  16. Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
  17. Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
  18. Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
  19. Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
  20. Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
  21. Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics