Beredning av primär akut lymfatisk leukemiceller i olika cellcykelns faser av Centrifugal Elutriation

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Det här protokollet beskriver användningen av centrifugal elutriation att skilja primär akut lymfatisk leukemiceller i olika cellcykelns faser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Delgado, M., Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation. J. Vis. Exp. (129), e56418, doi:10.3791/56418 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Förmågan att synkronisera celler har varit centralt för avancerad vår förståelse av cellcykeln förordning. Vanliga tekniker inkluderar serum deprivation; kemikalier som arrestera celler på olika cellcykelns faser; eller användning av mitotiska shake-off som utnyttjar deras nedsatt följsamhet. Alla dessa har dock nackdelar. Till exempel fungerar serum svält bra för normala celler, men mindre väl för tumörceller med komprometterad cellcykeln kontrollpunkter på grund av onkogen aktivering eller tumör suppressor förlust. Likaså kan kemiskt behandlat cellpopulationer harbor läkemedelsinducerad skador och Visa stress-relaterade förändringar. En teknik som kringgår dessa problem är hydromassagefunktion centrifugal elutriation (CCE), där celler utsätts för två motpoler, centrifugalkraft och vätska hastighet, vilket resulterar i separation av celler på grundval av storlek och täthet. Eftersom celler framåt genom cykeln vanligtvis förstora, kan CCE användas för att separera celler i olika cellcykelns faser. Här tillämpar vi denna teknik till primär akut lymfatisk leukemiceller. Under optimala förhållanden, kan en i huvudsak ren population av celler i G1-fasen och en höganrikat population av celler i G2/M faser erhållas i utmärkt avkastning. Dessa cellpopulationer är idealiska för att studera cellcykeln-beroende verkningsmekanismer av cytostatika och andra applikationer. Vi också visa hur ändringar till standardförfarandet kan leda till suboptimalt prestanda och diskutera begränsningarna av tekniken. Den detaljerade metod presenteras bör underlätta tillämpningen och utforskning av tekniken till andra typer av celler.

Introduction

Odlade celler växer vanligtvis asynkront och enskilda celler är närvarande i olika faser av cellcykeln. Vissa organismer uppvisar naturligt synkron cell cykler eller kan synkroniseras av specifika fysiologiska stimuli. Till exempel atomkärnor inom giant plasmodia av slem mögel Physarum polycephalum dela upp i en mycket synkron mode1och celler av gröna alger Desmodesmus quadricauda kan synkroniseras av omväxlande ljusa och mörka perioderna2. Medan sådana organismer erbjuder unik experimental attribut, modell de otillräckligt komplexiteten i däggdjursceller. Förmågan att artificiellt synkronisera däggdjursceller populationer har varit centralt för vår förståelse av cellcykeln förordning och den molekylära basen för cellcykeln kontrollpunkter. Gemensamma metoder inkluderar serum deprivation, kemiska block och utgåva eller utnyttja fysiska egenskaper3,4. Återkallande av serum orsakar ofta celler att ange rofylld och nytt tillägg av serum främjar cellcykeln reentryen in i G1 fas5. Kemiska hämmare inkluderar ämnen såsom överflödig tymidin eller hydroxiurea som blockerar celler vid G1/S gränsen eller mikrotubulära hämmare som vanligtvis gripa celler i M fas3,4. Metoder som utnyttjar fysiska egenskaper inkluderar mitotiska shake-off som kan användas för att berika för mitotiska celler eftersom de är mindre vidhäftande än interphase celler6. Alla dessa tekniker har dock eventuella nackdelar. Exempelvis upprätthålla inte alla celltyper livskraften i avsaknad av serum eller förekomsten av kemiska hämmare och avkastningen av celler efter mitotiska shake-off är begränsad utan föregående synkronisering med mitotiska hämmare.

Med undantag för tidig embryonal cell cykler, där cellerna minskar successivt i storlek, när de delar7, de flesta celler framåt genom cykeln genomgå tillväxtfaser och bli större. Detta boende är utnyttjas i tekniken med hydromassagefunktion centrifugal elutriation (CCE), som kan användas för att separera celler skiljer sig i storlek och därmed i cellcykeln fas8,9. Under CCE, cellerna är under inflytande av två motpoler: centrifugalkraft, som driver cellerna från axeln av rotation, och vätska hastighet (hydromassagefunktion), som driver cellerna mot axeln av rotation (figur 1). Celler i elutriation kammaren nå en equilibrium placerar där dessa krafter är lika. De huvudfaktorer som dikterar det equilibrium placerar var cell diameter och densitet. Som flödet klassar av buffertlösningen ökas och hydromassagefunktion drar kraften uppväger centrifugalkraften, ett nytt jämviktsläge är etablerat, orsakar en förändring i position av celler inne i kammaren. Alla celler är skiftat mot avfarten kammare, vilket resulterar i mindre företag lämna kammaren först, medan de större cellerna bo i kammaren tills hydromassagefunktion är ökat tillräckligt för att främja deras utgång. Cellerna flyr elutriation kammaren med på varandra följande höjningar hydromassagefunktion ränta kan samlas i särskilda fraktioner och respektive fraktion innehåller celler med sekventiellt öka storlekar. Istället för att genomföra elutriation med en stegvis ökning hydromassagefunktion rate, kommer sekventiell minskningar av centrifugalkraft genom att minska centrifugeringsvarvtal åstadkomma samma resultat. Elutriation kräver optimering beroende på celltyp, elutriation buffert anställd och den specifika apparat som används. Graden av sedimentering av celler under dessa förhållanden bäst beskrivs av Stokes lag: SV = [d2p- ρm) / 18η] .ω2r, där SV = sedimentering hastighet; d = diameter på partikeln; Ρp = densiteten av partikeln; Ρm = densiteten av bufferten; Η = viskositet av bufferten; Ω = vinkelhastigheten rotorns; och r = radiell position av partikeln. Således, SV är proportionell mot cell diameter och täthet, och eftersom diameter är upphöjt till andra, det bidrar mer påtagligt än densitet som är allmänt konstant genom cellcykeln.

En viktig fördel med CCE är att cellerna inte utsätts för hårda förhållanden av kemisk behandling eller näringsmässiga frihetsberövande och kan återvinnas i utmärkt avkastning i huvudsak ostörda. Ett krav är att cellerna i fråga genomgår en betydande ökning i diameter, av minst 30%, som de korsa cellcykeln. Den största nackdelen är kostnaden för den specialiserade centrifug, rotor och tillbehör. Förmågan att förbereda celler berikas i specifika cellcykelns faser av CCE har dock underlättat cellcykeln forskning i organismer från jäst till däggdjursceller9,10. Dessutom utökar senaste framstegen användningsområdena till avskiljandet av celler från friska kontra cancervävnaden, separation av olika celltyper i heterogena blandningar, och att produktionen av specifika celltyper för immunterapi9.

Vårt stora intresse har varit att förstå verkningsmekanismen av mikrotubuli inriktning ämnen (MTA) såsom vincaalkaloider och taxaner. Dessa droger var tänkt att handla uteslutande i Mitos, blockerar spindeln mikrotubulära funktion11,12, men nyligen tyder de kan också inriktas på interphase mikrotubuli13,14. Vi rapporterade nyligen att primär akut lymfatisk leukemi (ALL) celler genomgå död i antingen den G1-fasen eller i M fas när de behandlas med vinkristin och andra MTAs i cellcykeln-beroende sätt15. Förmågan att separera alla celler i olika cellcykelns faser av CCE bidrog att nå denna slutsats. I denna artikel, vi beskriva de tekniska detaljerna och erbjuder praktiska tips för tillämpningen av CCE till utarbetandet av primära alla celler i olika cellcykelns faser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol


Obs: detta protokoll har optimerats för primära B-ALL celler som sträcker sig i diameter från cirka 8 µm (G1-fasen) till 13 µm (G2/M faser). Således, den specifika centrifug hastigheter och pump flöden kanske inte tillämpliga på celler med olika intervall. Dock kan lämpliga elutriation parametrar uppskattas med hjälp av sedimentering takt ekvation. Celler odlas i en definierad serumfritt medium som beskrivs 16 på en optimal täthet av 1-3 x 10 6 celler/mL. Med undantag för insamling av fraktioner som bedrivs vid 4 ° C med hjälp av iskylda rör, alla steg utförs vid rumstemperatur och centrifugen vid 20 ° C med högst 24 ° C.

1. förberedelse av Elutriation buffert och material

  1. för att minska klumpar av celler, förbereda en elutriation buffert av Hank ' s balanserad saltlösning (HBSS) med fenolrött kompletteras med 2% fetalt bovint serum ( (FBS), att skydda celler från mekanisk stress under elutriation processen och 1,6 g/L 2-naftol-6,8-disulfonic acid dikaliumvätefosfat salt (NDA), som återger det cell yttre negativt laddade och minskar klumpar.
    1. Lägg 1,6 g NDA till en 50 mL konisk tub.
    2. Under sterila förhållanden och tillsätt 35 mL HBSS från en 1 L flaska 50 mL koniska röret som innehåller NDA. Sväng röret tills NDA har upplöst.
    3. Med ett 0,2 µm filter, överföra upplöst NDA in i en ny steril 50 mL koniska rör. Lägg sedan till Kärnavvecklingsbyrån till de återstående 1 L av HBSS.
    4. Slutligen lägga till 21 mL FBS att HBSS att erhålla en slutlig koncentration på 2% (v/v).
      Obs: Elutriation bufferten kan förberedas och lagras vid 4 ° C tills utgångsdatumet på HBSS eller tills det finns en stor förändring i pH som indikeras av en gulfärgning av indikator färgen.
  2. Märka 50 mL koniska rör för insamling av fraktioner så att det finns rör märkt tvätta 1 och 2 (W1 och W2), bråk 1-20 (F1 - F20) och stoppa.
    1. Pre chill dessa rör på is innan du samlar in fraktioner.

2. Montering av systemet Elutriation

  1. Installera först strobe församlingen in i centrifugen så att kabeln matas ut från kammaren genom porten på vänster sida. Garantera att strobe flash lampan på framsidan av kammaren så det kommer att radas upp med visningsfönstret när centrifugen är stängd.
    1. Säker montering på plats av första åtstramning två Phillips-skruvar i de två hålen på toppen av varje fästet och sedan åtdragning av skruvarna längst ned på varje fäste.
    2. Anslut nätsladden till strömporten på baksidan av centrifugen strobe.
  2. Därefter ställa rotorn rakt ner på centrifug driva navet och säkra med en T-handtag insexnyckel.
    Obs: Om centrifugen inte behövs för icke-elutriation ändamål, strobe församlingen och rotorn kan förvaras i centrifugen mellan körningarna.
  3. När rotorn är säkrad, placera snabbkopplingen församlingen som innehåller de elutriation avdelningen counter balans, roterande tätning montering och en monteringsplattan i rotorn.
    1. Tryck jämnt med ena handen på elutriation kammaren och den andra handen på counter balansen tills bultarna i rotorn i hålen på monteringsplattan.
    2. Slutligen fast ankring kabeln genom att placera stiftet på ena sidan av kabeln i hål på den roterande tätning församlingen och säkra eyehole på andra sidan av kabeln med en av Phillips-head skruvarna (som nämns i punkt 2.1.1) på fästet på vänster sida o f i kammaren.
  4. Därefter montera flödessystem använder en variabel hastighet pump och slang till pumpen buffert i elutriation avdelningen och samla buffert som rinner ut från elutriation-kammaren.
    1. Infoga storlek 16 ingång slangen kommer från variabel hastighet pumpen via porten längst till vänster på centrifug kammaren så att den träder in i kammaren.
    2. Bifoga en passande till den fria änden av den ingående slangen och in montering i ingången hålet på sidan av den roterande tätning församlingen.
    3. Infoga storlek 16 utgång slangar genom porten och bifoga det till överföringsröret längst upp i den roterande tätning montering.
      Obs: Systemets flöde kan också vara monterade mellan elutriation körningar.
  5. Slutligen aktivera centrifugen och ange specifikationerna för experimentet.
    1. Ändra rotorn ID.
    2. Om centrifugen kräver en tid, ställa in för 2 h, vilket är mer än tillräckligt för att slutföra en elutriation köra.
    3. Ställa in temperaturen till 20 ° C med en max temp 24 ° C.
    4. Inställd för max acceleration och retardation för långsamt.
    5. Slutligen, ange hastigheten till 867 x g.

3. Primerbehandling av systemets Elutriation

  1. först för att sterilisera elutriation systemet, placera behållaren slangen till en 500 mL plastflaska innehållande 5% blekmedel och placera produktionen slangen in i en tom plast avfall 1 L flaska.
    1. Aktivera pumpen och inställd hastighet på 25 mL/min och tillåta 5% blekmedel strömma hela vägen genom det elutriation systemet tills det pumpas ur utgående röret in avfallsflaskan.
    2. Aktivera centrifugen och gör det möjligt att komma till den maximala designerat hastighet (867 x g) för att frigöra bubblor och mottrycket.
    3. Stoppa centrifugen. När rotorn har stannat, öppna locket och inspektera kammaren för läckor.
    4. Om det inte finns några läckor, Låt blekmedel lösningen flöde genom systemet för minst 5 min.
  2. Nästa, spola systemet med Ånghärdad vatten som blekmedel kan leda till bildandet av fällningar från elutriation bufferten vilket kan leda till klumpar av celler, samt att skada cellerna.
    1. Plats reservoar slangen i en 1 L flaska Ånghärdad vatten och gör det möjligt att spola igenom i minst 10 min.
  3. Efter spolning med vatten, införa elutriation buffert i systemet. Använd en 150 mL glasflaska som varit Ånghärdad att skapa en reservoar för elutriation buffert och celler.
    1. Tillsätt 100 mL elutriation buffert till flaskan och flytta den reservoar slangar till glasflaska så att röret är i botten.
    2. Startar centrifugen och låta bufferten att strömma genom systemet att spola ut vattnet.
    3. När behållaren burken är nästan tom och vattnet är helt spolas ur systemet, flytta den utdata luftslangen från avfallsflaskan till reservoaren så att bufferten återvinns via systemets.
  4. Slutligen justera visningsfönstret så att elutriation kammaren kan ses på den aktuella hastigheten.
    1. Press strobe lampa strömbrytare på utsidan av centrifugen så att lampan slås. Slå på elutriation kNOB också på utsidan av centrifugen hela vägen till vänster.
    2. Samtidigt tittar genom visningsfönstret långsamt sväng ratten till höger tills elutriation kammaren kommer in i Visa och strobe ljus är i gång med rotation av rotorn.
      Obs: Elutriation systemet kan vara kvar i detta tillstånd tills cellerna är prepped.

4. Beredning av Cell provet

  1. räkna celler och alikvotens 300 till 400 miljoner i odlingsmedium i flera 50 mL koniska rör. Snurra ner cellerna vid 1210 x g i 3 min.
  2. Aspirera ut tillväxt medier och resuspendera cellerna i 25 mL elutriation buffert genom att försiktigt upp och ned med.
  3. För att minska cellen klumpar, passera celler två gånger genom en 25 gauge nål.
    1. Med en 10 mL spruta rita upp cellerna och sedan bifoga 25 gauge nål och passera cellerna genom på insidan väggen i en steril 50 mL koniska tub. Upprepa detta tills alla 25 mL har passerat genom nålen.
    2. Få en ny nål och spruta och upprepa processen ovan när.
      Försiktighet: Spruta nålar placeras i sharps containers.
      Obs: Det är viktigt att cellerna skjuts genom nålen omedelbart före att introducera dem till elutriation systemet att hålla cell klumpar till ett minimum.

5. Införandet av Cell provet i det Elutriation systemet och samling av fraktioner

  1. införa cell provet i elutriation systemet genom att hälla cell provet i bromsoljebehållaren som har återstående elutriation bufferten återvinning genom .
    1. Låt cellerna komma in i systemet och nå jämvikt i elutriation kammaren.
      Not: Denna process tar ca 5 min och framsteg kan spåras genom att titta på cellerna när de kommer in i kammaren via visningsfönstret. För att säkerställa alla celler är i kammaren, ta en droppe av eluenten, placera på en glasskiva och Visa under ett mikroskop. Om provet är gratis intakta celler, bekräftar deras kvarhållande i kammaren.
  2. Börja samla bråk när alla celler har ingått i kammaren och det finns en distinkt gräns vid den bredaste delen av kammaren där cellerna är i jämvikt.
    1. Börja genom att flytta produktionen röret till 50 mL koniska röret märkt W1. Samla 50 mL elutriation buffert för denna fraktion, se till att hålla ett öga på bromsoljebehållaren och fylla på med elutriation buffert vid behov.
      Obs: För att se till att alla celler har ingått systemet, så att reservoaren tanken att bli nästan tom innan påfyllning reservoaren första gången. Efter första påfyllningen kommer det inte vara nödvändigt att vänta på reservoaren att bli nästan tom. Också, inte någonsin tillåta behållaren bli tom som detta kommer att skapa bubblor och mottryck i systemet.
    2. När 50 mL har samlats för W1, samtidigt ändra hastigheten till 821 x g och flytta produktionen röret till konisk röret W2 och samla 50 mL mer med denna hastighet.
    3. Fortsätta ändra hastighet och samla fraktioner som anges i tabell 1. Kontrollera att det finns media i reservoaren tank och hålla det koniska rören på isen hela tiden. Slutligen, justera visningsfönstret genom att långsamt vrida ratten till höger eftersom hastigheten minskar.
    4. När alla 20 fraktioner har samlats in, stoppa centrifugen och samla in 50 mL i koniska röret STOP.

6. Flushing i systemet Elutriation

  1. efter centrifugen har stannat helt spola systemet genom att sätta reservoar röret i 1 L flaska Ånghärdad vatten och utdata röret tillbaka i avfallsflaskan.
    1. Slå pumpens varvtal upp till 50 mL/min och tillåter vattnet att köra genom systemet tills den är förbrukad.
  2. Slå av pumpen, ta bort ingångs- och slangen från snabbkopplingen församling och dra ut stiftet från linbanan ankring.
    1. Ta bort snabbkopplingen församlingen från rotorn.
      Obs: Beroende på vad centrifugen ska användas för, elutriation systemet kan nu lämnas som är. Hela församlingen kan annars tas ner i motsatt ordning som beskrivs ovan. Elutriation kammaren kan tas bort från snabbkopplingen församling och rengöras mellan löprundor med en Ultraljuds vattenbad. Detta tar bort skräp och föroreningar från kammaren väggen vilket kan påverka senare körningar.

7. Analys av fraktioner och samling av G1 eller G2/M pool.

Obs: för att demonstrera effektiviteten av elutriation, varje fraktion analyseras för cellantal, cell diameter och DNA-innehåll och pooler skapas av celler i G1 eller G2/M faser för immunoblot analyser, som beskrivs i Representativa resultat. Detta protokoll avsnitt beskriver hur du skapar dessa pooler och förbereda dem för experimentell användning.

  1. Snurra varje fraktion vid 2000 x g i 5 min vid 4 ° C och aspirera off elutriation buffert.
  2. Kombinera fraktioner tillsammans för att få både en G1 fas pool och en G2/M faser pool.
    1. För the G1 fas pool, Återsuspendera fraktioner som samlades i hastighetsområdet 788 x g-661 x g (F1 - F5) i totalt 1 mL fosfatbuffertlösning saltlösning (PBS) och överför till en 15 mL koniska rör. För G2/M faser poolen, Omsuspendera fraktioner som samlades i hastighetsområdet 387 x g och 333 x g (F17 - F20).
    2. Snurra ner cellerna vid 2000 x g i 5 min vid 4 ° C och aspirera av PBS.
  3. Omsuspendera cellerna i 10 mL av tillväxtmassmedia och ta en cell sammanräkning.
  4. Ta en alikvot från varje pool ska analyseras för DNA innehåll via propidium jodid färgning och flow flödescytometrisk analys 15.
    Obs: Resten av varje pool kan användas för ytterligare experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Primära alla celler (3-4 x 108) utsattes för centrifugal elutriation och samlas i två tvätta fraktioner och tjugo huvudsakliga fraktioner, som beskrivs i protokollet. Tabell 1 visar representativa uppgifter där det totala antalet celler i varje del samt motsvarande rotorns varvtal presenteras. Totala var avkastningen vanligtvis över 80%. Mätning av cell diameter i enskilda fraktioner bekräftade det cell diametern ökade med stigande elutriation (figur 2). Resultaten avser genomsnitt av två oberoende analyser och återspeglar den höga graden av data reproducerbarhet. Fraktioner utsattes nästa för propidium jodid färgning och flödescytometri för att bestämma DNA-innehåll (figur 3). Tidiga fraktioner (F1 - F5) innehöll nästan uteslutande celler med 2N DNA-innehåll som representerar G1 fas. En blandning av celler i G1 och S fas observerades i mellanliggande fraktioner (F6 - F9) och celler med 4N DNA-innehåll var observerade start i F10. Senare fraktioner hade främst celler med 4N DNA-innehåll som representerar G2/M faser. Dessa uppgifter tillsammans med resultaten av figur 2 bekräftade en relation mellan Cellstorlek och cellcykeln fas.

Baserat på dessa resultat fraktioner F1 - F5 kombineras för att skapa en pool av celler i G1-fasen och fraktioner F17 - F20 kombineras för att skapa en pool av celler i G2/M fas. Andelen av celler med 2N DNA-innehåll i G1 fas poolen var vanligtvis 99%, och andelen celler med 4N DNA-innehåll i G2/M pool var vanligtvis 85%, som bestäms av propidium jodid färgning och flödescytometri. Asynkron villkor är 60-70% av primära alla celler är i G1-fasen och 15-20% i G2/M faser15, således de värden som erhålls efter elutriation återspeglar höga nivåer av berikning. För att ytterligare verifiera de två poolerna med avseende på cellcykelns fas, utsattes extrakt från varje för immunoblotting med markörer av antingen G1 eller G2/M faser. Först utnyttjade vi en phospho-specifik antikropp som känner igen retinoblastom (Rb) protein fosforyleras på antingen Ser-807 eller Ser-811, eftersom det är väletablerat att Rb blir alltmer fosforyleras som celler förväg genom cellcykeln17 . I figur 4visas nivåer av phospho-Rb var mycket högre i celler i G2/M pool jämfört med G1 fas poolen, överensstämmer med förväntningarna. Vi har också sökt för cyklin B1, som uttrycks mest högt i G2/M fas celler, och cyklin D1, som är mest högt uttryckt i G1 fas celler18 (figur 4). G2/M poolen hade mycket högre nivåer av cyklin B1 jämfört med G1 poolen, överensstämmer med förväntningarna. Cyklin D1 gav endast en svag signal i dessa preparat, men ändå var detekterbart i G1 poolen och omätbara i G2/M pool. GAPDH användes en kontroll för att bekräfta lika protein lastning.

Ändringar av standardprotokollet utfördes för att bedöma deras effekter och fastställa villkor för optimal prestanda. Först, fraktioner insamlade var minskade antalet, från de standard tjugo till endast tre, med hastigheter som fastställs enligt tabell 1 för att representera de terminal punkterna för samling celler i G1, G2/M eller S faser, som visas i tabell 2. Analys av DNA innehållet av fraktioner F1 och F3 visas i figur 5A. Fraktion 1 innehöll celler höganrikat i G1-fasen (95%) och var således av motsvarande renhetsgrad som erhölls under standart villkorar (figur 3). Dock bråkdel 3, skenbart celler höganrikat i G2/M fas, gav en blandad befolkning, med celler i G1 och S faser också närvarande. G2/M celler representerade endast 51% av totalen, jämfört med 85% under normala förhållanden. Dessa resultat indikerar att försök att förenkla förfarandet genom att minska antalet fraktioner kompromisser prov kvalitet. Nästa, vi testade minskar bråkdel volym, som ett sätt att minska reagens. En standard elutriation utfördes förutom att 40 mL istället för 50 mL fraktioner samlades. Fraktioner F1 och F20 analyserades för DNA-innehåll. Som visas i figur 5B, var bråkdel F1 höganrikat i G1 fas celler (98%), liknande som erhölls under standart villkorar. Dock bråkdel F20 innehöll celler i alla tre faser, med celler i G2/M fas som endast motsvarar 64% av totalen, jämfört med 85% under normala förhållanden. Dessa resultat indikerar att minska bråk volym också äventyrar provets kvalitet.

Figure 1
Figur 1 . Principen om hydromassagefunktion centrifugal elutriation.
Observera att elutriation av celler kan uppnås antingen genom att öka andelen hydromassagefunktion som anges här eller genom att minska rotorns varvtal. Anpassad med tillstånd av Macmillan Publishers Ltd: [natur protokoll] (Ref 8.), upphovsrätt (2008)8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Diameter primära all celler ökar med elutriation bråkdel.
Den genomsnittliga diametern fastställdes för varje fraktion som använder en cell analyzer som registrerar data från 500-4 500 enskilda celler per prov. De data som visas är medelvärde ± S.D. från två oberoende experiment. Observera att felstaplar för många punkter är mindre än symbolen och utelämnades för tydlighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Analys av DNA-innehåll bekräftar framgångsrika separering av primära alla celler i olika cellcykelns faser.
10 mL varje bråkdel var fast i 70% EtOH, målat i propidium jodid och analyseras med flödescytometri, som beskrev15. Propidium jodid integrerade intensitet (x-axeln) var plottade kontra celltal (y-axeln) att fastställa del av celler i varje fas, där 2N DNA-innehåll anger G1 fas och 4N DNA-innehåll anger celler i antingen G2 eller M faser. De data som visas är från ett representativt experiment och väsentliga identiska resultat har uppnåtts i fyra repetitioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Immunoblot analys av cellcykeln-relaterade proteiner i pooladefraktioner.
Efter en vanlig elutriation av primära alla celler, fraktioner F1 - F5 kombineras för att skapa en G1 fas pool och fraktioner F17 - kombinerades F20 skapa en G2/M fas pool. Extrakt var beredda och 40 µg/lane utsätts för immunoblot analys, som beskrivs tidigare15, med antikroppar mot phospho-Rb (Ser807/811), cyklin B1 eller cyklin D1, alla används på 1:2,000 utspädning. GAPDH (1:10 000) användes som en lastning kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Belysande data från suboptimala elutriations.
(A) i form av minskat antalet fraktioner samlas in. Endast tre huvudsakliga fraktioner (F1 - F3), i stället för standard tjugo, 100 ml, samlades, i hastigheter som anges i tabell 2. Fraktioner F1 och F3 analyserades för DNA-innehåll enligt figur 3. (B) effekten av att minska bråk. Tjugo fraktioner samlades, på samma villkor som i tabell 1, men endast 40 mL elutriation buffert istället för de vanliga 50 mL användes för varje. Fraktioner F1 och F20 analyserades för DNA-innehåll enligt figur 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Fraktion Varvtal (rpm) G-Force Totalt celler (x 10 ^ 6)
W1 3000 867 x g 17,75
W2 2920 821 x g 7.00
F1 2860 788 x g 4.60
F2 2800 755 x g 10,75
F3 2740 723 x g 15.25
F4 2680 692 x g 22,50
F5 2620 661 x g 26,75
F6 2560 631 x g 25.00
F7 2500 602 x g 22,75
F8 2440 573 x g 18.00
F9 2380 546 x g 14.00
F10 2320 518 x g 10,75
F11 2260 492 x g 7,43
F12 2200 466 x g 8,63
F13 2140 441 x g 6.63
F14 2100 425 x g 4,98
F15 2060 409 x g 3.46
F16 2020 393 x g 3.43
F17 1980 378 x g 2,63
F18 1940 363 x g 3.17
F19 1900 248 x g 2,78
F20 1860 333 x g 1.66
Stanna 0 0 x g 5.19
Totala avkastningen 245.06
Procent avkastning 81.69

Tabell 1. Cell avkastning och motsvarande rotorns varvtal för respektive fraktion.
Celltal bestämdes med hjälp av en automatiserad cell räknare. Totala avkastningen bestämdes av summan av individuella fraktioner kontra input (3 x 108 celler). Data är ett genomsnitt av två representativa experiment. Centrifugalkraft och motsvarande rotorns varvtal ges.

Fraktion Varvtal (rpm) G Force
W1 3000 867 x g
W2 2920 821 x g
F1 2620 661 x g
F2 2020 393 x g
F3 1860 333 x g
Stanna 0 0 x g

Tabell 2. Hastighet parametrar för suboptimala elutriation.
Visas är centrifugalkraften och motsvarande rotor hastigheter för tvättarna och tre fraktioner samlas i en komprimerad suboptimala elutriation. Se figur 5A för motsvarande DNA-innehåll och text för detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrivit en metod för att erhålla primära alla celler i olika faser av cellcykeln använder CCE. Under optimala förhållanden en i huvudsak ren population av celler i G1-fasen och en höganrikat population av celler i G2/M faser kan lätt erhållas i utmärkt avkastning och celler höganrikat i S fas kan även erhållas om så önskas. Resultaten presenteras här erhölls med en primär alla kultur (särskilt ALL-5), och i huvudsak identiska resultat har erhållits med en oberoende kultur, ALL-215. Dessutom utför alla andra primära alla kulturer undersökt hittills har liknande densitet spänner under asynkron tillväxt, och kommer sannolikt på samma sätt när de utsätts för CCE. Våra tidigare studier har också visat att andra leukemi cellinjer, inklusive HL60 och K562, kan delas in i olika cellcykelns faser med CCE19,20. Kritiska steg i förfarandet är att cellerna är mono spridda och inte klampade i början av loppet; optimering av villkoren för hydromassagefunktion ränta och rotorns hastighet; att säkerställa komponenterna i systemet är rena och fria från skräp; och undvika införandet av luftbubblor i flödeslinjer. CCE fungerar bäst med celler som avsevärt ökar i Cellstorlek som de avancerar genom cellcykeln. För en given population av celler i suspension, kan detta fastställas initialt och enkelt genom att undersöka förhållandet mellan DNA-innehåll och side-scatter, det sistnämnda beroende på Cellstorlek. Båda parametrarna kan mätas samtidigt med flödescytometri efter propidium jodid färgning, som vi har beskrivit15. Ett linjärt samband mellan side-scatter och DNA-innehåll ger förtroende att Cellstorlek ökar med cellcykeln förväg och således att CCE har potential att separera celler baserat på cellcykelns fas.

Vi har visat (figur 5), leda avvikelser från optimerad förfarandet komprometterad prov kvalitet, särskilt för celler i G2/M faser. Minskning av antalet fraktioner eller bråkdel volym påverkade inte märkbart emellertid renheten av celler i G1-fasen (figur 5). Genvägar till förfarandet kan således tolereras om bara renat G1 fas celler behövs. CCE är lätt mottagliga för suspension cellkulturer, kan det också tillämpas på subcellulär fraktioner. Till exempel har kärnor från murina pre-B-cellerna varit framgångsrikt storlek-separerade använder CCE8. Vidhäftande celltyper innebära potentiella problem på grund av deras benägenhet för grupp och möjliga efterlevnad av ytbehandlar av slangar och elutriation kammaren och därför bör utredas med försiktighet.

Den största begränsningen av CCE är kostnaden för utrustningen. en möjlig lösning är att samarbeta med ett labb som har den nödvändiga utrustningen. Observera dock att även rotorn är ett särskilt instrument, centrifugen kan användas för allmänna centrifugering ändamål, vilket minskar kostnaden investerat enbart i CCE. En annan begränsning är att planeringen av experiment är mer problematiska jämfört flexibiliteten i andra metoder såsom serum svält eller kemiska synkronisering. Elutriation körs tar normalt 5-6 timmar, och om de celler som erhållits därefter behövs för kortsiktiga eller flera tid punkt experiment, detta kan resultera i schemaläggning olägenheter. Den största fördelen är att celler som erhålls med denna metod är oberörd och kan vara odlade i många dagar utan några tecken på ångest, som vi har visat15. Detta kontrasterar mot celler synkroniseras med kemiska medel som kan hysa läkemedelsinducerad skador. En färsk studie, använder NB4 celler från akut myeloisk leukemi Blaster, direkt jämfört CCE och andra metoder, inklusive gripande med serum svält, hydroxyurea eller behandling med en cyklin-beroende kinase 1-hämmare, RO-330621. Elutriated celler och celler som gripits på jämförbara faser verkade liknande med avseende på DNA-innehåll och cyklin uttryck. Men när proteomet undersöktes, stora förändringar i protein överflöd, särskilt stress-relaterade och gripande-specifika proteiner, observerades i de arresterade cellerna och inte i de elutriated cellerna i motsvarande cell storlek positioner. Dessa resultat belysa nyttan av CCE för produktion av ostörda celler och betona att försiktighet bör iakttas när tolka data från cellerna synkroniseras med andra medel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Anisha Kothari är för närvarande vid Institutionen för Cell- och molekylärbiologi vid St. Jude Children's Research Hospital.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIH CA109821 (till TCC). Vi tackar Beckman-Coulter för att generöst tillhandahålla medel för att täcka kostnader för publikation och tekniskt bistånd i set-up och driften av elutriation systemet. Vi tackar Dr. Fred Falkenburg för att ge inledande primära alla kulturer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks' balanced salt solution Lonza 10-508Q 1 L bottle
Fetal Plus bovine serum Atlas Biologicals FP-0500-A 500 mL bottle
2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt Acros Organics 212-672-4 100 g powder
50 mL concial tubes Denville Scientifics C1062-P 500/case
PES Membrane 0.22 µm filter unit Millipore SLGP033RB 250/pack
Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V Beckman Coulter B14544 centrifuge compatible with elutriation system
JE 5.0 elutriator rotor kit Beckman Coulter 356900 rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly
Chamber, standard, 4-mL, "A" Beckman Coulter 356943 standard elutriation chamber 
Masterflex L/S Easy-Load pump head Cole-Parmer EW-07518-10
Masterflex L/S Variable-Speed Drive Cole-Parmer EW-07528-10
Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 Cole-Parmer EW-96420-16
25 G x 1.5 Precision Glide needle BD 305127 sterile, single-use needles
10 mL Luer-Lok syringe BD 309604 sterile, single-use syringes
Vi-Cell XR Beckman Coulter 383556
PI/RNase staining buffer BD Pharmingen 550825 propidium iodide/RNase staining buffer
cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-245
cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 8516s
GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody Cell Signaling Technology 2118s
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6516
Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate BioRad 170-6515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
  2. Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
  3. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
  4. Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
  5. Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
  6. Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
  7. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
  8. Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
  9. Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
  10. Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
  11. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
  12. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
  13. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
  14. Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
  15. Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
  16. Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
  17. Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
  18. Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
  19. Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
  20. Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
  21. Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics