Сочетание митотическая клеток синхронизации и конфокальная микроскопия высокого разрешения для изучения роли многофункциональный клеточного цикла белков во время митоза

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Мы представляем протокол для двойной тимидина синхронизации клеток HeLa, следуют анализ с использованием конфокальная микроскопия высокого разрешения. Этот метод является ключом к получению большое количество клеток, что синхронно с S-фазе митоза, позволяя исследования митотическая роли многофункциональный белков, которые также обладают функциями межфазной.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Amin, M. A., Varma, D. Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis. J. Vis. Exp. (130), e56513, doi:10.3791/56513 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Изучение различных нормативных событий в зависимости от фазы клеточного цикла обеспечивает четкое понимание о деление и рост клеток. Было установлено, что синхронизация клеточных популяций на определенных стадиях клеточного цикла будет весьма полезным в таких экспериментальных начинаниях. Над использованием фармакологических ингибирующих наркотиков для изучения событий последующего клеточного цикла и для получения конкретных обогащения отдельных этапов митотическая синхронизации клеток по обращению с химическими веществами, которые являются относительно менее токсичные может быть выгодным. Здесь мы описываем протокол для синхронизации клеток человека на разных этапах клетки цикла, включая как в S фаза и фаза M с блоком двойной тимидин и освободить процедуры для изучения функциональность митотическая белков в хромосоме выравнивания и сегрегации. Этот протокол был чрезвычайно полезным для изучения митотическая роли многофункциональный белков, которые обладают установленным межфазной функций. В нашем случае митотическая роль Cdt1, белок, критических для репликации происхождения лицензирования в фазе G1, могут изучаться эффективно только тогда, когда G2/M-конкретных Cdt1 может быть исчерпана. Мы описываем подробный протокол для истощения G2/M-конкретных Cdt1 с помощью двойной тимидина синхронизации. Мы также объяснить протокол фиксации клеток и живой клетки изображений с помощью конфокальная микроскопия высокого разрешения после выпуска тимидина. Этот метод также полезен для анализа функции митотическая белков как физиологические, так и возмущенных условиях как для Hec1, компонент Ndc80 комплекс, поскольку он позволяет получить большой выборки митотическая клеток для фиксированной и живой клетки анализ как мы показываем здесь.

Introduction

В клеточный цикл клетки проходят серию жестко регулируемых и височно контролируемых событий для точного дублирования их геном и распространения. В млекопитающих клеточный цикл состоит из межфазной и M-фазы. В интерфазе, который состоит из трех этапов - G1, S, и G2, ячейка дублирует его генома и подвергается роста, который необходим для нормального клеточного цикла прогрессии1,2. В M-фаза, которая состоит из цитокинез и митоз (профаза, Прометафаза, метафаза, анафазе и Телофаза), родительские ячейки производит две генетически идентичных клеток дочи. В митозе, сестра chromatids дублированный генома, конденсированной (профаза) и на их kinetochores, захвачен микротрубочек собрал митотического веретена (Прометафаза), что заставляет их выравнивание на пластину метафазы (метафаза), следуют их равных сегрегации, когда сестра chromatids Сплит сторону и перевезены в противоположный шпиндель мачты (анафазе). 2 клетки дочи физически отделены деятельности на основе актина сократительной кольца (Телофаза и цитокинез). Кинетохор — это специализированный белковых структура, которая собирает в регионе прицентромерного chromatids и служить в качестве вложения сайты для шпинделя микротрубочек. Его основная функция заключается в диск хромосома захвата, выравнивание и помощь в коррекции неправильного шпинделя микротрубочек вложения, при посреднической шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускной пункт сохранить верность хромосома сегрегации3,4.

Метод синхронизации клетки служит идеальным инструментом для понимания молекулярных и структурных мероприятий, участвующих в прогрессии клеточного цикла. Этот подход использовался для обогащения клеточных популяций на конкретных этапах для различных видов анализа, включая профилирование экспрессии генов, анализ клеточных биохимических процессов и выявления локализации внутриклеточных белков. Синхронизированные mammalian клеток может использоваться не только для изучения отдельных генов продуктов, но и для подходов, включающих анализ всего геномов, включая анализ microarray ген выражение5, Мирна выражение модели6, Переводческая правила7и протеомного анализа белка модификации8. Синхронизации может также использоваться для изучения последствий экспрессии генов и белков нокдаун или нокаут-, или химических веществ на клеточный цикл прогрессии.

Клетки могут быть синхронизированы на различных стадиях клеточного цикла. Физические и химические методы широко используется для синхронизации клеток. Наиболее важными критериями для синхронизации клеток являются, что синхронизация должна быть noncytotoxic и обратимым. Ввиду возможных негативных последствий сотовой синхронизации клетки фармакологическими агентами химико зависимые методы может быть выгодным для изучения ключевых клеточного цикла событий. К примеру гидроксимочевина, amphidicolin, mimosine и Ловастатин, может использоваться для синхронизации клеток в фазе G1/S но, из-за их влияния на биохимические пути, который они подавляют, они активировать клеточный цикл контрольно-пропускной пункт механизмов и убить является важным часть клетки9,10. С другой стороны обратной связи торможение репликации ДНК, добавив тимидина к росту СМИ, известный как «тимидина блок», могут арестовать клеточного цикла в определенные точки11,12,13. Клетки также могут быть синхронизированы на этапе G2/M, рассматривая с Нокодазол и RO-33069,14. Нокодазол, который предотвращает сборки микротрубочек, имеет относительно высокий цитотоксичности. Кроме того арестован Нокодазол клетки могут вернуться к межфазное благосклонностью, митотическая проскальзывания. Двойной тимидина блок арест клетки в фазе G1/S и после выхода из блока, клетки находятся синхронно продолжить через G2 и в митозе. Обычной прогрессии клеточного цикла для ячеек, освобождены от тимидина блока можно наблюдать под конфокальная микроскопия высокого разрешения ячейки фиксации или живой изображений. Эффект возмущений митотическая белков могут быть изучены, специально когда клетки ввести и перейти через митоз после освобождения от двойной тимидина блока. Cdt1, многофункциональный белков, участвует в ДНК репликации лицензирования происхождения в фазе G1 и требуется также для Кинетохор микротрубочки вложений во время митоза15. Чтобы изучить функции Cdt1 во время митоза, необходимо принять метод, который позволяет избежать эффекта его истощения на репликации лицензирования во время фазы G1, хотя в то же время осуществление его истощении, специально во время фазы G2/М только. Здесь мы представляем подробные протоколы, основанные на блоке двойной тимидина изучение митотического роль белков, выполняет несколько функций в различных стадиях клеточного цикла, как фиксированной, так и клеток изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. двойной блок тимидин и выпуска: Подготовка реагента

  1. Сделать 500 мл Дульбекко изменения среднего среднего (DMEM) орел с 10% FBS, пенициллина и стрептомицина.
  2. Сделать 100 мм запас тимидин в стерильной водой и хранить в аликвоты-80 ° c.

2. протокол для фиксированной ячейки изображений митотическая прогрессии (рис. 1A)

  1. День 1, семя ~ 2 x 105 НеЬа клетки в скважины 6-ну пластины с крышки выскальзования (стерилизованное с 70% этанола и УФ-облучения) и 2 мл DMEM среды. Рост клеток в увлажненные инкубатор для 24 ч при 37 ° C и 5% CO2.
  2. 1st тимидина блок: на 2 день, тщательно смешать необходимое количество тимидин в свежих DMEM СМИ (100 мм штока, 2 mM концентрации выпускных экзаменов).
  3. Добавить 2 мл, содержащих тимидина СМИ для ячеек в каждой скважине 6-ну пластины и проинкубируйте 18 h.
  4. На третий день аспирационная среднего и вымыть клетки дважды с 2 мл ПБС и один раз с свежими подогретую DMEM; рост клеток в свежих подогретую среде DMEM для 9 h освободить клетки от блока.
  5. блок тимидина 2nd : снова добавить 2 мл, содержащих тимидина СМИ (2 mM концентрации выпускных экзаменов) в ячейки в каждой скважине пластину 6-хорошо.
  6. Инкубируйте еще 18 h.
  7. На 4 день аспирационная среднего и вымыть клетки дважды с 2 мл ПБС и один раз с свежими подогретую DMEM.
  8. Разбавить малые интерферирующие РНК (контроль и Cdt1) и трансфекции реагента в сыворотке свободный рост среднего отдельно на 10 мин смешать их вместе и проинкубируйте втечение 20 мин на RT. Конечная концентрация siRNA, используемых в каждом transfection была 100 Нм. Добавьте смесь реакции клетки, которые были вымыты из тимидина.
  9. Инкубировать клетки при 37 ° C для 9-10 ч для освобождения от блокирования и исправить клетки на обложке скользит с 4% PFA для 20 мин на RT.
    Предупреждение: PFA токсичных, носить соответствующую защиту.
  10. Имунноконтраст клетки, после permeabilizing с 0,5% (v/v) моющее средство для 10 мин на RT и мойки клетки дважды с ПБС втечение 5 мин.
    1. Заблокировать ячейки с 1% BSA (w/v) в ПБС за 1 час на RT, следуют лечении клетки с 50 мкл первичного антитела (антитела анти α-тубулина мыши разводят 1:1, 000, кролик антитела анти Zwint1 разводят в 1: 400 и мыши, анти фосфо ɣ H2AX разводят в 1: 300) в 1% (w/v) BSA в однократном ПБС втечение 1 ч при 37 oC.
    2. После мытья вне клетки с ПБС трижды, лечить клетки с 50 мкл вторичных антител для каждого покрытия стекла (Alexa 488 и родамин красный в разведениях 1: 250 в 1% (w/v) BSA в ПБС) за 1 ч на RT.
    3. После мытья клетки с ПБС дважды за 5 мин, лечить клетки с DAPI (0.1µg / мл в однократном ПБС) за 5 мин на RT.
    4. После мытья клетки с ПБС дважды за 5 мин, поместите крышку скольжения, стоящих перед клетки в соответствующие крепления СМИ на слайде ясно микроскопические.
  11. Монтированным клетки для immunostained белки с 60 X или 100 X 1.4 NA план-Apochromatic ДВС масло погружения цель на Перевернутый высоким разрешением Конфокальный микроскоп, оснащенный соответствующей камерой как необходимые для качества изображения требуется.
  12. Получение изображений при комнатной температуре, как z стеки толщиной 0,2 мкм, используя программное обеспечение подходит для микроскопа.

3. протокол для живых клеток изображений митотическая прогрессии (рис. 3A)

  1. На 1 день семян около 0,5-1 х 105 НеЬа клетки стабильно выражения mCherry-H2B и GFP-α-тубулина (слегка переменная на основе типа клеток и белков, которые они выражают) в 35 мм стекла дно блюда с 1,5 мл DMEM среды и вырастить их в увлажненный Инкубатор для 24 h на 37 oC и 5% CO2.
  2. 1st тимидина блок: на 2 день, добавить 1,5 мл тимидин содержащих СМИ к ячейкам в блюдо (тимидина 100 мм, 2 mM концентрации выпускных экзаменов,).
  3. Инкубируйте 18 h.
  4. На 3 день аспирационная носитель, содержащий тимидин и вымыть клетки трижды, дважды с 2 мл ПБС и один раз с свежими подогретую DMEM.
  5. Разбавить малые интерферирующие РНК (контроль и Hec1) и трансфекции реагента с сыворотка свободный рост среднего отдельно на 10 мин смешать их вместе и проинкубируйте втечение 20 мин на RT. Конечная концентрация siRNA, используемых в каждом transfection была 100 Нм. Добавьте смесь реакции клетки, которые были вымыты из тимидина.
  6. Рост клеток в 1,5 мл свежего подогретую DMEM среды для 8 h освободить клетки от блока.
  7. блок тимидина 2nd : добавить 1,5 мл тимидин содержащих СМИ (2 mM концентрации выпускных экзаменов) в ячейки в блюдо.
  8. Инкубируйте еще 18 h.
  9. На 4 день аспирационная среднего и вымыть клетки трижды, дважды с 2 мл ПБС и один раз с свежими подогретую DMEM. Затем рост клеток в свежих подогретую Лейбовиц (L-15) средний дополнена 10% FBS и 20 мм HEPES при pH 7.0 для 8 h освободить клетки от блока.
  10. Поместите блюдо в камере контроля температуры в Конфокальный микроскоп высокого разрешения, который уже перешел на по крайней мере 30 минут до начала изображений для стабилизации температуры на сцене и экспериментальных.
  11. Фокус в светлые области с 60 x целей до тех пор, пока клетки являются видимыми, а затем вручную просеять на сцене в область выбора.
  12. Настройка света и мощности лазерного воздействия, параметров получения изображений и продолжительность эксперимента с использованием программного обеспечения приобретения изображения микроскопа выбора. Используйте фильтры для GFP (488 возбуждения; 385 Нм выбросов) и mCherry (561 Нм возбуждения и 385 Нм выбросов) для получения изображений.
  13. Выполнять покадровый эксперимент, отдельно приобретать импульсного света и флуоресценции изображения каждые 10 мин на период до 16 ч.
  14. Получение изображений, как двенадцать 1.0 мкм отделенный z самолеты в 9 ч после освобождения от двойной тимидина блока с помощью программного обеспечения необходимости микроскоп.
  15. Анализ изображений, отслеживание отдельных ячеек для митотическая прогрессии и окончательно собрать соответствующие фильм с исходным кодом Фиджи/ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изучение митотического прогрессии и стабильности микротрубочек в клетках исправлена после освобождения от двойной тимидина блок
Cdt1 участвует в лицензировании происхождение репликации ДНК в фазе G1. Он разлагается во время фазы S, но повторно накапливается в фазе G2/М. Для изучения его роль в митозе, эндогенного Cdt1 необходимо истощены специально на этапе Г/М, методом, наиболее подходящим клеток синхронизации, двойной тимидина блока15. Клетки были transfected с малые интерферирующие РНК сразу же после выхода из блока тимидина 2nd , когда клетки в S фазе и к этому времени лицензирование происхождение репликации в G1, который также требует Cdt1 функции, давно было завершено. Истощение Cdt1 после 9 h siCdt1 transfection и двойной тимидина блок релиз был подтвержден Западный blotting (рис. 1B). Фиксация клеток 9 h после выхода из блока двойной тимидина показывает, что большинство клеток на стадии метафазы как управления, так и Cdt1 siRNA transfected клеток. Однако фиксация клеток 10 h после выхода из блока двойной тимидина показывает, что большинство клеток малых интерферирующих РНК лечение Cdt1 по-прежнему арестован в конце Прометафаза стадии в то время как клетки управления введите анафазе и обычно отделить их хромосомы как ожидаемый (Рисунок 1 c ). Чтобы понять влияние истощения Cdt1 на стабильность Кинетохор микротрубочек (kMT), клетки были исправлены в 9 ч после освобождения от двойной блок тимидина следуют холодной лечения, который сохраняет только стабильные Кинетохор микротрубочек (КМЦ). КМЦ обедненного Cdt1 клетки устойчивы относительно менее после холодной лечения, по сравнению с контролем клеток (рис. 1 d). Таким образом используя этот подход, прогрессирование нормальных митотическая клеток после возмущения функции митотическая белки интереса могут изучаться эффективно, даже без использования изображений живой клетки.

Рисунок 2 показывает, что лицензирование происхождения репликации ДНК не возмущенных, когда клетки истощаются из Cdt1 во время фазы G2/М, с помощью нашего протокола, который наблюдался также в ячейках элемента управления. Клетки, обедненного Cdt1 во время фазы G2/М не стимулировать накопление фосфорилированных ɣH2AX, маркер для повреждения ДНК, на последующем этапе G2; в то время как siRNA трансфекции асинхронных культур к разрушающим Cdt1 индуцированных накопление очагов фосфо ɣH2AX-позитивных, возможно из-за повреждения ДНК, вызванные неправильным ДНК репликации лицензирования.

Изучение митотического прогрессии в клетках после освобождения от двойной тимидина блок живых клеток
После пробоя ядерная оболочка (нос) нормальные клетки (в отсутствие возмущений функционального митотическая белка) введите митоз и проходят анафазе начала выхода из митоз в течение около 30-60 мин (рис. 3B). Но опосредованного системой РНК-интерференции нокдаун Hec1, ключевой Кинетохор белок, необходимый для формирования надежной kMT вложение, встречается задержать нормальный митотическая прогрессии. В этом случае большинство клеток введите митоз после НЭБ, но не пройти анафазе начала или выхода из митоз даже после нескольких часов задержки митоз (рис. 3 c). Аналогично эффект опосредованного системой РНК-интерференции нокдаун любого белка, которая локализуется в kinetochores или имеющие функцию во время митоза может таким образом наблюдаться эффективно с помощью изображений живой клетки после освобождения от двойной тимидина блоков. Помимо изучения природы митотическая прогрессии, задержки и ареста, некоторые из других ключевых митотическая явлений, которые могут быть assayed с помощью этого метода включают выравнивание хромосоме, формирование митотического шпинделя и позиционирование активации и глушителей из шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускной пункт.

Figure 1
Рисунок 1: анализ митотическая прогрессии и стабильности Кинетохор микротрубочек в фиксированных клеток после двойной тимидина синхронизации. (A) A схематическое представление ячейки синхронизации, фиксации и иммунофлюоресценции. (B) западную помарку для нокдаун Cdt1 после 9 h освобождения от 2 тимидина блока. (C) микроскопии иммунофлуоресценции Показать митотическая клетки фиксированной 9 и 10 h после освобождения от двойной тимидина блока и обработки с siRNA Cdt1 (внизу) или управления (сверху). Α-тубулина пятнать красного, ДНК находится в зеленой, как клетки Экспресс GFP-гистона H2B. Шкалы бар = 10 мкм. Prometaphase и метафаза клетки обозначаются желтые и белые стрелки соответственно. (D) НеЬа клетки после обработки с siRNA управления (Верхняя панель) и после истощения (Нижняя панель) Cdt1 за 9 h после освобождения от двойной блок тимидина следуют обращения с ледяной Лейбовиц (L-15) средний и фиксации. Клетки иммунной витражи для шпинделя MT (зеленый) и маркер Кинетохор, Zwint1 (красный) и DAPI ДНК в черном и белом. Шкалы бар = 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Cdt1-истощение во время фазы G2/М не возмущают репликации лицензирования. Асинхронные НеЬа клетки лечат управления Люцифераза (Верхняя панель) или cdt1 малые интерферирующие РНК (средняя группа) или двойной тимидина синхронизированы НеЬа клетки лечат cdt1 siRNA во время 2-й тимидина вымывания следуют фиксации в 10 h После выпуска (Нижняя панель) окрашивали DAPI (псевдо-зеленый) и антитела анти фосфо ɣH2AX (красный). Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: анализ митотическая прогрессии живых клеток, изображений в синхронизации клеток. (A) A схематическое представление ячейки синхронизации и живых клеток. НеЬа клетки, стабильно выражая гистона mCherry H2B и GFP-α-тубулина были освобождены от двойной тимидина блок для 8 h позволить им перейти к этапу G2/M от S фазу ареста. Живой изображений проводилось с использованием Конфокальный микроскоп высокого разрешения, начиная 8 ч после освобождения клетки от блока тимидин и продолжается до 16 h от этой точки. Здесь изображены неподвижных изображений из видео, снятое каждые 10 мин для управления клетки без возмущения любой митотическая белка (B) или клетки, обедненного Hec1 Субблок Ndc80 комплекс (C). Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наиболее важным преимуществом двойной тимидина синхронизации является, что она обеспечивает увеличения размера выборки митотическая клеток в окне короткое время со многими из этих клеток, введя митоз в унисон, позволяя также анализ хромосом выравнивание, биполярный шпинделя формирования и хромосомы сегрегации с гораздо более высокой эффективности.

Многие нормативные белковых комплексов и сигнальных путей посвящены обеспечению нормальных прогрессии через митоз и дерегулирование этого процесса может привело к tumorigenesis. Живой клетки изображений клеток HeLa стабильно выражения mCherry-H2B и GFP-тубулина и освобожден от двойной тимидина блок показывает, что большинство клеток контроля отделить их хромосом в анафазе в течение приблизительно 60 мин после НЭБ (рис. 3B). С другой стороны живой клетки изображений клеток HeLa, возмущенных с Hec1, функция показывает, что большинство клеток оставаться в стадии митотического для длительного периода с разрегулированные хромосом, следуют анафазе начала или apoptosis (рис. 3 c).

Избыток тимидина ингибирует синтез ДНК в S-фазе, таким образом блокирует клетки в фазе G1/S11. Хотя двойной тимидина блок синхронизации является наиболее часто используемый метод в изучении клеточного цикла и митотического прогрессии, нужно быть критическим некоторых из недостатков этого метода. Важно отметить, что необходимо обеспечить, что химическое вещество было промыть тщательно (для 7-8 ч) так что эффект является полностью обратимым и клетки могут действовать обычно через остальную часть клеточного цикла. В противном случае клетки не могут вступать второй цикл, вызывая неправильное прогрессии хотя, митоз. Доля синхронизированных клеток не может быть достаточно высокой с блоком одного тимидин и двойной тимидина блок может быть необходимо увеличить количество синхронизированных клеток, особенно если кто-то заинтересован в изучении конкретной стадии митоза. Продолжительность лечения тимидина должна быть оптимизирована за счет разной чувствительностью среди типов клеток в зависимости от времени поколения. Например хомячка клетки имеют 16 h время генерации и лечатся тимидина для 11 h для оптимальной синхронизации17. В этом исследовании мы относились НеЬа клетки для 16-18 ч с тимидина. Кроме того избыток тимидина не только предотвращает синтез ДНК, но также может убить важные фракций клетки11,12,18 и закрыть внимание необходимо уделять следить за эту потерю. Стоковый раствор тимидина, используемые в данном исследовании должен быть подготовлен в стерильной дистиллированной воде и должна быть тщательно перемешивают в СМИ культуры клеток после его добавления в СМИ siRNA transfected клеток во избежание ее осадков, а также обеспечить ее однородной распределение вокруг культивируемых клеток.

Для изучения функции целевого митотическая белка во время митотическая прогрессии, клетки идеально будет относиться с малых интерферирующих РНК в нокдаун уровни протеина интереса в блоке тимидина 1st или освобожденное от 1-го блок тимидина, зависящ на время, необходимое для получения эффективного белков нокдаун19,,2021. С другой стороны для изучения роли многофункциональный белков, таких как Cdt1 во время митоза, это необходимо для лечения клетки с siCdt1 во время выхода из блока тимидина 2nd для получения конкретных истощения G2/М. Cdt1 — критический игрок в лицензировании репликации ДНК происхождение15. Чтобы понять свою роль в специализированных во время митоза без мешать с ее ролью в вопросах лицензирования, Cdt1 необходимо быть истощенным специально на этапе G2/M, который может эффективно достигается двойной тимидина синхронизации, таким образом избежать необходимости прибегать к другой митоз конкретных возмущений подходы, которые трудно выполнить. Истощение Cdt1 в асинхронных культур побудить ДНК повреждения ответ из-за прерывания лицензирование происхождение репликации ДНК, которые в свою очередь запутаны анализ возможных функций этого белка в процессе митоза. Таким образом метод синхронизации двойной тимидина предлагает уникальный экспериментальный подход к генерации клеток, которые прошли в нормальной G1 и S фазу, но не хватало Cdt1 функция во время фазы G2 и M. Особое значение нашей протокол синхронизации лежит в его ингибирование многофункциональный белков на конкретной стадии (G2/М) для изучения их новых функций в процессе митоза. Таким образом этот метод будет полезным не только для того изучить роль белков, которые имеют несколько функций этапах различных клеточного цикла, но и что любой митотическая белка в процессе выравнивания хромосомы, kMT вложения и хромосомы сегрегации.

Для изображений живых клеток, после выхода из блока двойной тимидина клетки должны инкубировали в подогретым Лейбовиц (L-15) средний дополнена FBS 10-20% до начала обработки изображений. Ячейки введите митоз в точках переменной времени после освобождения от тимидина блока в зависимости от типа ячейки. Время начала захвата изображения или фиксации необходимо быть оптимизированы в зависимости от типа ячейки. Для живых клеток изображений, использование обычных confocal микроскопии может привести к Фотообесцвечивание во время долгосрочное изображений. С другой стороны высокое разрешение confocal микрофильм дает четкие и с высоким разрешением изображения с наименьшей мере Фотообесцвечивание эффектов.

Важнейшие шаги в этом протоколе являются продолжительность лечения тимидина, надлежащего размыва тимидина, сроков трансфекции siRNA и сроков начала изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие финансового интереса.

Acknowledgements

Мы благодарны д-р Козо Танака Университета Тохоку, Япония для обмена клетки HeLa, стабильно выражая гистона mCherry H2B и GFP-α-тубулина. Эта работа была поддержку NCI Грант для DV (R00CA178188) и начальных средств от северо-западного университета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (1x) Life Technologies 11965-092 Store at 4 °C
DPBS (1x) Life Technologies 14190-144 Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium Life Technologies 21083-027 Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM) Life Technologies 319-85-070 Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin Life Technologies 15070-063 (Pen Strep) 1:1,000 dilution
Dharmafect2 GE Dharmacon T-2002-02 Store at 4 °C
Thymidine MP Biomedicals LLC 103056 Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA Life Technologies Ref 10
Hec1 siRNA Life Technologies Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich Corporation F8775 Toxic, needs caution
DAPI Sigma-Aldrich Corporation D9542 Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin Santa Cruz Biotechnology Sc32293 1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1 Bethyl A300-781A 1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) Upstate Biotechnology 05-626, clone JBW301 1:300 dilution
Alexa 488 Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
Rodamine Red-X Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
BioLite 6 well multidish Thermo Fisher Scientific 130184
35 mm Glass bottom dish MatTek Corporation P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope Nikon Instruments
Spinning disc for confocal Yokagawa CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera Andor iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes Tokai Hit TIZB
NIS-elements software Nikon Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182, (4652), 1788-1790 (1958).
  2. Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
  3. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28, (17), 2511-2531 (2009).
  4. Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6, (1), E5 (2017).
  5. Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21, (12), 1934-1942 (2002).
  6. Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42, (9), 593-598 (2009).
  7. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52, (4), 574-582 (2013).
  8. Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285, (10), 7197-7207 (2010).
  9. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8, (3), 602-626 (2013).
  10. Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72, (11), 1396-1404 (2006).
  11. Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
  12. Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60, (6), 1099-1106 (2003).
  13. Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13, (6), 1977-2000 (2002).
  14. Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (28), 10660-10665 (2006).
  15. Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14, (6), 593-603 (2012).
  16. Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116, (2), 297-301 (1981).
  17. Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68, (1), 163-168 (1971).
  18. Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
  19. Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12, (4), e0174819 (2017).
  20. Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), E4546-E4555 (2015).
  21. Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196, (5), 563-571 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics