שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לסינכרון תימידין כפול של תאים הלה ואחריו ניתוח באמצעות קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו היא המפתח להשגת מספר גדול של תאים, כי המשך באופן סינכרוני שלב S מיטוזה, המאפשר לימודים mitotic התפקידים של חלבונים רב תכליתי אשר גם בעלי פונקציות לאטמוספרה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Amin, M. A., Varma, D. Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis. J. Vis. Exp. (130), e56513, doi:10.3791/56513 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

חקר האירועים הרגולציה השונים של מחזור התא באופן תלוי-שלב מספק הבנה ברורה לגבי צמיחת תאים וחלוקה. הסינכרון של אוכלוסיות תאים בשלבים מסוימים של מחזור התא כבר מצאו להיות מאוד שימושי לנסיונות ניסיוני כאלה. סינכרון של תאים על ידי טיפול בכימיקלים רעילים יחסית פחות יכול להיות יתרון על השימוש בתרופות מעכבות תרופתי לחקר אירועי מחזור התא הסוגר וכדי להשיג העשרה ספציפי של שלבים mitotic שנבחרו. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור סינכרון תאים אנושיים בשלבים שונים של התא מחזור, כולל שני ב S שלב ושלב מ' עם בלוק תימידין זוגי ולשחרר את נוהל לומד את הפונקציונליות של חלבונים mitotic במערך כרומוזום סגרגציה. פרוטוקול זה היה שימושי ביותר ללמוד את התפקידים mitotic של חלבונים רב תכליתי אשר בעלי פונקציות הוקמה לאטמוספרה. במקרה שלנו, התפקיד mitotic של Cdt1, חלבון קריטי עבור שכפול מקור רישוי בשלב G1, ניתן יהיה ללמוד בצורה יעילה רק כאשר Cdt1 G2/M-ספציפי יכול להיות מרוקנים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור דלדול של Cdt1 G2/M-ספציפי באמצעות סינכרון תימידין כפול. אנחנו גם להסביר את הפרוטוקול של קיבוע תא, ולחיות תא הדמיה באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית לאחר שחרורו תימידין. השיטה היא שימושית גם עבור ניתוח תפקידו של חלבונים mitotic בתנאים פיסיולוגיים והן מודאג כגון עבור Hec1, מרכיב Ndc80 מורכבים, כמו זה, המאפשר לקבל גודל מדגם גדול של תאים mitotic תא קבוע ולחיות ניתוח כפי שנראה כאן.

Introduction

במחזור התא, התאים עוברים סדרה של אירועים מאוד מוסדר ומבוקר חנותם עבור שכפול מדויק הגנום שלהם והתפשטות. ביונקים, מחזור התא מורכב לאטמוספרה, M-פאזי. ב. לאטמוספרה, אשר כוללת שלושה שלבים - G1, S, ו G2, התא משכפלת את הגנום שלו עובר הצמיחה כי הוא הכרחי עבור מחזור תא נורמלי התקדמות1,2. בשלב ז-, אשר מורכב של מיטוזה (prophase prometaphase, מפה של, "אנאפאזה", אשהה) וציטוקינזה, תא הורים מייצרת שני תאים זהים גנטית בת. ב מיטוזה, אחותי chromatids של הגנום המשוכפלת מרוכז (prophase) הינם בשבי ב שלהם kinetochores על ידי microtubules בכישור mitotic שהורכב (prometaphase), שמניע את היישור שלהן למשטח מפה של (כל) ואחריו שלהם שווה סגרגציה כאשר אחותי chromatids פיצול לכיוון והועברו לאתר פלך מול הפולנים ("אנאפאזה"). שני התאים הבת מופרדים פיזית באמצעות הפעילות של מבוססי אקטין כויץ טבעת (אשהה וציטוקינזה). קינטוכור מבנה proteinaceous מיוחדים אשר מרכיבה על האזור centromeric של chromatids, לשמש אתרי מצורף עבור ציר microtubules. הפונקציה העיקרית היא לנהוג כרומוזום לכידת, יישור, וסיוע בתיקון מצורף microtubule פלך פסולים, בעוד תיווכה במחסום מכלול ציר כדי לשמור על אמינות של כרומוזום סגרגציה3,4.

הטכניקה של סינכרון תא משמש כלי אידיאלי להבנת האירועים מבניים המולקולריים המעורבים בהתקדמות מחזור התא. גישה זו שימש כדי להעשיר את אוכלוסיות תאים-שלבים ספציפיים עבור סוגים שונים של ניתוחים, כולל בניית פרופיל של ביטוי גנים, ניתוח של תהליכים ביוכימיים הסלולר, וזיהוי של לוקליזציה subcellular של חלבונים. תאים בתרבית של מסונכרן יכול לשמש לא רק לצורך המחקר של מוצרים גנים בודדים, אלא גם עבור גישות הכוללים ניתוח של הגנום כולו כולל ניתוח microarray של ביטוי גנים5, דפוסי ביטוי miRNA6, translational בתקנה7, וניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון שינויים8. סינכרון יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של ביטוי גנים או חלבון דפיקה למטה או הנוק-אאוט, או של כימיקלים על התקדמות מחזור התא.

ניתן לסנכרן תאים בשלבים שונים של מחזור התא. השיטות הפיסיקליות והכימיות נמצאים בשימוש נרחב עבור תא סינכרון. הקריטריונים החשובים ביותר עבור סינכרון תא הם כי סינכרון צריך להיות noncytotoxic ולא הפיך. בגלל תופעות לוואי הסלולר ההשלכה הפוטנציאלית של סינכרון תאים על ידי סוכנים תרופתי, שיטות תלויי-כימי יכול להיות יתרון ללימוד אירועי מפתח מחזור התא. לדוגמה, הידרוקסיוראה, amphidicolin, mimosine ו- lovastatin, יכול לשמש עבור סינכרון תא בשלב G1/S אבל, בגלל השפעתם על המסלולים הביוכימי שמונעים, הם להפעיל מנגנוני הביקורת מחזור התא להרוג חשובה שבר של תאי ה-9,10. מצד שני, משוב עיכוב של שכפול ה-DNA על-ידי הוספת תימידין התקשורת צמיחה, המכונה "תימידין בלוק", יכולים לעצור את מחזור התא בגיל12,11,13מסוימים נקודות. תאים גם ניתן לסנכרן בשלב G2/M על-ידי טיפול עם nocodazole,9,RO-330614. Nocodazole, אשר מונע microtubule הרכבה, כולל של cytotoxicity גבוה יחסית. יתר על כן, נעצר nocodazole תאים באפשרותך לחזור לאטמוספרה precociously על ידי גלישה mitotic. כפול תימידין בלוק מעצר תאים בשלב G1/S, לאחר שחרורו מן הרחוב, נמצאו תאים כדי להמשיך באופן סינכרוני דרך G2 ולתוך מיטוזה. התקדמות נורמלי של מחזור התא עבור תאים שוחררו תימידין בלוק יכול להיות שנצפו תחת קונפוקלית ברזולוציה גבוהה על ידי קיבוע תאים או הדמיה בשידור חי. ניתן יהיה ללמוד את השפעת ההפרעות של חלבונים mitotic במיוחד כאשר תאים הזן והמשך דרך מיטוזה לאחר שחרורו של תימידין זוגי בלוק. Cdt1, חלבון רב תכליתיים, מעורב מקור שכפול ה-DNA רישוי בשלב G1 ויש גם צורך קינטוכור microtubule מצורפים במהלך מיטוזה15. ללמוד את הפונקציה של Cdt1 במהלך מיטוזה, אחד צריך לאמץ שיטה זה מונע את השפעת המחסור שלה על שכפול רישוי במהלך שלב G1, בזמן בו זמנית שמצריכות שלה דלדול במיוחד במהלך שלב G2/M בלבד. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורט המבוסס על הבלוק תימידין זוגי ללמוד את התפקיד mitotic של חלבונים ביצוע פונקציות מרובות בשלבים שונים של מחזור התא על ידי הדמיה קבוע והן לחיות תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. כפול תימידין בלוק ושחרור: ריאגנט ההכנות

  1. להפוך 500 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS פניצילין, סטרפטומיצין.
  2. להכין מלאי 100 מ מ של תימידין במים סטריליים, בחנות aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.

2. פרוטוקול עבור תא קבוע הדמיה של התקדמות Mitotic (איור 1 א')

  1. יום 1, זרע ~ 2 x 10 תאים הלה5 לתוך הבארות של צלחת 6-ובכן עם מכסה (עיקור עם 70% אתנול וביו -הקרנת UV) ו- 2 מ של DMEM בינונית. לצמוח התאים חממה humidified במשך 24 שעות ביממה-CO 37 ° C ו-5%2.
  2. רחוב אחד של תימידיןst : ביום 2, ביסודיות מערבבים את אמצעי האחסון הדרושים של תימידין בתקשורת DMEM טרי (100 מ מ מניות, 2 מ מ הסופי ריכוז).
  3. להוסיף 2 מ של תימידין המכילות תאים כל טוב של הבאר-6 צלחת ומדיה תקופת דגירה של 18 h.
  4. יום 3, תשאף המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ של 1 x PBS ופעם עם טרי DMEM prewarmed; לגדל תאים טרי בינוני DMEM prewarmed עבור h 9 לשחרר תאים בבלוק.
  5. בלוק 2 של תימידיןnd : שוב להוסיף 2 מ של תימידין המכילות מדיה (ריכוז סופי 2 מ מ) על התאים היטב כל צלחת 6-. טוב.
  6. תקופת דגירה של עוד 18 h.
  7. יום 4, תשאף המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ של 1 x PBS ופעם DMEM prewarmed טריים.
  8. שתדללו siRNAs (שליטה ו- Cdt1), תרביות תאים ריאגנט בסרום מדיום הגידול ללא תשלום בנפרד עבור 10 דקות מערבבים אותם ביחד, תקופת דגירה של 20 דקות ב- RT. הריכוז הסופי של siRNA בשימוש כל תרביות תאים היה 100 ננומטר. להוסיף את התערובת תגובת התאים נשטפו החוצה תימידין.
  9. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 9-10 h כדי לשחרר מחסימת ולתקן את התאים על שער גולשת עם 4% מחברים עבור 20 דקות ב- RT.
    התראה: PFA רעיל, לענוד הגנה הולמת.
  10. תאים Immunostain, לאחר permeabilizing עם חומר ניקוי 0.5% (v/v) למשך 10 דקות ב RT ושטיפת התאים פעמיים עם 1 x PBS למשך 5 דקות.
    1. לחסום תאים עם 1% BSA (w/v) ב- PBS x 1 על 1 h ב- RT ואחריו טיפול תאים עם 50 µL של ראשי נוגדנים (העכבר אנטי-α-טובולין נוגדן מדולל ב- 1:1, 000, נוגדן anti-Zwint1 הארנב מדולל ב 1:400, ועכבר אנטי-פוספו-ɣ H2AX מדולל ב 1:300) 1% (w/v) BSA ב- PBS 1 x עבור h 1-37 oC.
    2. לאחר הכביסה החוצה את התאים עם 1 x PBS שלוש פעמים, לטפל תאים עם 50 µL של נוגדנים משניים עבור כל כוס כיסוי (אלקסה 488 ואדום Rhodamine-1:250 דילולים 1% (w/v) BSA ב- 1 x PBS) עבור h 1-RT.
    3. לאחר שטיפת התאים עם PBS 1 x פעמיים במשך 5 דקות, יטפל בתאים עם דאפי (0.1µg / מ ל 1 x PBS) עבור 5 דקות ב- RT.
    4. לאחר שטיפת התאים עם PBS 1 x פעמיים במשך 5 דקות, מקום בתגית כיסוי מול לתאים התקשורת המתאימה הרכבה בשקופית ברור מיקרוסקופיים.
  11. תמונת התאים של החלבונים immunostained עם 60 X או 100 X 1.4 נה DIC תוכנית-Apochromatic שמן טבילה המטרה רכוב על מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה הפוכה מצויד עם מצלמה המתאים לפי הצורך עבור איכות התמונות הנדרשות.
  12. לרכוש תמונות בטמפרטורת החדר כמו z-ערימות של 0.2 µm עובי באמצעות תוכנה מתאים של המיקרוסקופ.

3. פרוטוקול עבור תא חי הדמיה של התקדמות Mitotic (איור 3 א)

  1. יום 1, זרע כ 0.5-1 x 105 הלה תאים stably לבטא mCherry-ויזת עבודה H2B ו- GFP-α-טובולין (מעט משתנה לפי סוג התא ואת החלבונים שהם מבטאים) 35 מ מ זכוכית התחתון מנות עם 1.5 מ של DMEM בינוני, לגדל אותם בבית humidified החממה במשך 24 שעות ביממה-37 oC ו- 5% CO2.
  2. רחוב אחד של תימידיןst : ביום 2, להוסיף 1.5 מ של תימידין המכילות מדיה על התאים בצלחת (100 מ מ תימידין, ריכוז סופי 2 מ מ,).
  3. תקופת דגירה של 18 h.
  4. ביום 3, תשאף המדיום המכיל תימידין ולשטוף את התאים שלוש פעמים, פעמיים עם 2 מ ל 1 x PBS ופעם אחת עם DMEM prewarmed טריים.
  5. שתדללו siRNAs (שליטה ו- Hec1), תרביות תאים מגיב עם סרום מדיום הגידול ללא תשלום בנפרד עבור 10 דקות מערבבים אותם ביחד, תקופת דגירה של 20 דקות ב- RT. הריכוז הסופי של siRNA בשימוש כל תרביות תאים היה 100 ננומטר. להוסיף את התערובת תגובת התאים נשטפו החוצה תימידין.
  6. לגדל תאים ב- 1.5 מ של טרי prewarmed בינוני DMEM עבור 8 שעות לשחרר תאים בבלוק.
  7. בלוק 2 של תימידיןnd : להוסיף 1.5 מ של תימידין המכילות מדיה (ריכוז סופי 2 מ מ) על התאים בצלחת.
  8. תקופת דגירה של עוד 18 h.
  9. ביום 4, תשאף המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים, פעמיים עם 2 מ ל 1 x PBS ופעם אחת עם DMEM prewarmed טריים. ואז לגדל תאים בליבוביץ prewarmed טריים של בינוני (L-15) בתוספת 10% FBS ו 20 מ מ HEPES ב- pH 7.0 עבור 8 שעות לשחרר תאים מהגוש.
  10. מקם את המנה בבית הבליעה בקרת הטמפרטורה להגדיר במיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה אשר החליף כבר לפחות 30 דקות לפני תחילת ההדמיה לייצב את הטמפרטורות על הבמה ו ניסיוני.
  11. להתרכז בתחום בהיר עם המטרה 60 x עד תאים גלויים, ואז באופן ידני לנפות את הבמה לאזור של הבחירה.
  12. להגדיר את האור ואת כוח/חשיפה ללייזר, פרמטרים רכישת התמונה ומשך של הניסוי באמצעות התוכנה רכישת תמונת מיקרוסקופ של בחירה. השתמש במסננים GFP (עירור 488; פליטת nm 385), mCherry (561 עירור nm ו פליטה nm 385) כדי לרכוש תמונות.
  13. לבצע את הניסוי בצילום מואץ על ידי בנפרד רכישת פעמו המשודרת זריחה ואור תמונות כל 10 דקות במשך תקופה של עד 16 שעות.
  14. לרכוש תמונות כפי 1.0 12 מיקרומטר מופרדים z מטוסים ב h 9 לאחר שחרורו מן הרחוב תימידין כפול באמצעות תוכנה מתאימה כדי המיקרוסקופ.
  15. לנתח את התמונות לאתר תאים בודדים עבור התקדמות mitotic ולהרכיב בסופו של דבר את הסרט המתאים בתוכנת ה-מקור פיג ' י/ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר של התקדמות mitotic ויציבות microtubule בתאים קבוע לאחר שחרור כפול תימידין בלוק
Cdt1 מעורב רישוי ממוצא שכפול ה-DNA בשלב G1. זה יורד במהלך שלב S אבל מצטברת בשלב G2/M. כדי ללמוד תפקידה מיטוזה, Cdt1 אנדוגני צריכה להיות דלה במיוחד בשלב G/M בטכניקה המתאימה ביותר תא סינכרון, בלוק תימידין כפול15. התאים היו transfected עם siRNAs מיד לאחר שחרורו מן הרחוב תימידין 2nd , כאשר התאים נמצאים ה-S תלת פאזי, שבו זמן רישוי של שכפול מקורו ב- G1, הדורש גם פונקציה Cdt1, זמן הושלמה. דלדול של Cdt1 לאחר 9 שעות של תרביות תאים siCdt1 ושחרור כפול תימידין בלוק אומתה על ידי המערב סופג (איור 1B). קיבוע של תאים h 9 לאחר שחרורו מן הרחוב תימידין כפול מראה כי רוב התאים הם בשלב מפה של שליטה והן Cdt1 siRNA transfected תאים. אבל קיבוע של תאים 10 h לאחר שחרורו מן הרחוב תימידין כפול מראה כי רוב Cdt1 שטופלו siRNA התאים עדיין נעצרים בשלב מאוחר prometaphase תאים שליטה הזן "אנאפאזה", בדרך כלל הפרדת כרומוזומים שלהם כמו הצפוי (איור 1C ). כדי להבין את השפעת המחסור Cdt1 על יציבות קינטוכור-microtubule (מפלגת העם הלאומית), התאים תוקנו ב 9 h לאחר שחרור כפול תימידין בלוק ואחריו טיפול קר, אשר רק שומר קינטוכור יציב-microtubules (kMTs). KMTs של תאים מדולדל Cdt1 הם פחות חזקות יחסית לאחר הטיפול קר לעומת זו של תאים שליטה (איור 1D). לכן, באמצעות גישה זו, ההתקדמות של תאים נורמליים mitotic לאחר ההפרעות של הפונקציה של protein(s) mitotic עניין שניתן ללמוד באופן יעיל, גם ללא השימוש של תא חי הדמיה.

איור 2 מציג כי רישוי ממוצא שכפול ה-DNA הוא לא מוטרד כאשר תאים דלה של Cdt1 במהלך שלב G2/M באמצעות פרוטוקול שלנו, אשר נצפתה גם בתאים שליטה. תאים מדולדל של Cdt1 במהלך שלב G2/M אל תגרום / הצטברות של ɣH2AX phosphorylated, סמן נזק לדנ א, במהלך שלב G2 הבאים; ואילו siRNA תקנים של תרבויות אסינכרוני כדי לרוקן Cdt1 המושרה הצטברות של מוקדים פוספו-ɣH2AX-חיובי, כנראה עקב נזק לדנ א המושרה על ידי שכפול ה-DNA לא תקין רישוי.

מחקר של התקדמות mitotic בתאים לאחר שחרורו של תימידין זוגי חסום על ידי הדמיה תא חי
לאחר קריסת מעטפת הגרעין (נב), תאים נורמליים (בהיעדר ההפרעות על ידי חלבון mitotic תפקודית) הזן מיטוזה ומבצעת תחילת "אנאפאזה" כדי לצאת ממיטוזה בתוך כ 30-60 דקות (איור 3B). אבל מציאה RNAi בתיווך נוקאאוט של Hec1, חלבון מפתח קינטוכור הנדרשת עבור היווצרות מצורף חזקים מפלגת העם הלאומית, הוא נמצא כדי לעכב את התקדמות mitotic נורמלי. בתרחיש זה, רוב התאים הזן מיטוזה לאחר ישהה בביירות, אבל לא עוברים "אנאפאזה" תחילת או יציאה ממיטוזה אפילו לאחר מספר שעות של עיכוב מיטוזה (איור 3C). באופן דומה, ההשפעה של מציאה RNAi בתיווך נוקאאוט של כל חלבון אחרים. רגישה kinetochores או שיש פונקציה במהלך מיטוזה ובכך ניתן לראות באופן יעיל באמצעות הדמיה תא חי לאחר שחרורו מבלוקים תימידין כפול. בנוסף למדתי את אופי התקדמות mitotic עיכוב, מעצר, חלק אחר מפתח mitotic אותן תופעות ניתן לבדיקה באמצעות שיטה זו כוללות כרומוזום יישור, היווצרות mitotic פלך, ואת מיקום ההפעלה והשתקה, פלך הרכבה במחסום.

Figure 1
איור 1: ניתוח של התקדמות mitotic ויציבות קינטוכור microtubules בתאים קבוע לאחר הסינכרון תימידין כפול. (א) A ייצוג סכמטי של התא סינכרון, קיבוע immunofluorescence. (B) תספיג עבור נוקאאוט של Cdt1 לאחר 9 h של שחרור מן 2 בלוק תימידין. (ג) Immunofluorescence micrographs כדי להראות את התאים mitotic קבוע 9 ו- 10 שעות לאחר שחרורו מן בלוק תימידין זוגי וטיפול עם שליטה (למעלה) או Cdt1 siRNA (למטה). Α-טובולין מכתים הוא אדום, הדנ א הוא בצבע ירוק כמו תאים אקספרס ויזת עבודה H2B GFP-היסטון. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. Prometaphase מפה של תאים מסומנים באמצעות צהוב ולבן ראשי חץ בהתאמה. הלה (D) תאים לאחר הטיפול עם שליטה siRNA (לוח העליון), לאחר Cdt1 דלדול (פאנל התחתונה) עבור 9 שעות לאחר שחרור כפול תימידין בלוק ואחריו טיפול עם קרח ליבוביץ של (L-15) בינונית, קיבעון. התאים היו שהוכתמו החיסון פלך MT (ירוק), סמן קינטוכור, Zwint1 (אדום) ודאפי לדנ א בשחור-לבן. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Cdt1-דלדול בשלב G2/M לא perturb שכפול רישוי- אסינכרוני הלה תאים שטופלו שליטה לוציפראז (החלונית העליונה) או cdt1 siRNAs (לוח האמצעי) או זוגי תימידין מסונכרנים הלה תאים שטופלו cdt1 siRNA 2nd תימידין שטיפת-מחוץ ואחריו קיבוע ב 10 h לאחר שחרורו (פאנל התחתונה) היו מוכתמים דאפי (מדומים בצבע ירוק), נוגדן anti-פוספו-ɣH2AX (אדום). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ניתוח של התקדמות mitotic לתא חי דימות in מסונכרנים תאים. (א) A ייצוג סכמטי של סינכרון תא והדמיה תא חי. הלה תאים stably לבטא ויזת עבודה H2B mCherry-היסטון, GFP-α-טובולין שוחררו מבית בלוק תימידין כפול עבור 8 שעות לתת להם להמשיך לשלב G2/M ממעצרו שלב S. הדמיה חיה התבצע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה החל 8 שעות לאחר שחרור תאי תימידין בבלוק, והמשיכו עד עד 16 שעות מאותה הנקודה. המוצגות כאן הן תמונות סטילס מהווידאו כבשו כל 10 דקות עבור תאים שליטה ללא ההפרעות של כל חלבון mitotic (B) או תאים את Hec1 יחידת משנה של Ndc80 מורכבים (C). סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היתרון הקריטי ביותר של תימידין זוגי הסינכרון הוא שהיא מספקת גודל המדגם מוגברת של תאים mitotic בחלון זמן קצר עם רבים של תאים אלו נכנסים מיטוזה שבסיר, ובכך מאפשר גם ניתוחים של כרומוזום יישור, הפרעה דו קוטבית ציר היווצרות, סגרגציה כרומוזום עם הרבה יעילות גבוהה יותר.

רבים מתחמי חלבון תקינה, איתות המסלולים מוקדשים להבטחת התקדמות נורמלי באמצעות מיטוזה והוביל ורשות של תהליך זה עשוי tumorigenesis. חיים תא הדמיה של תאים הלה stably לבטא mCherry-ויזת עבודה H2B ו- GFP-טובולין ושוחררה מהצגות בלוק תימידין זוגי רוב התאים בקרה הפרדת כרומוזומים שלהם-"אנאפאזה" בתוך כ- 60 דקות לאחר נב (איור 3B). מצד שני, חיים תא הדמיה של הלה תאים באמת מדאיג Hec1 פונקציה מראה כי רוב התאים להישאר בשלב mitotic במשך תקופה ארוכה עם כרומוזומים לא מיושרים ואחריו "אנאפאזה" תחילת או אפופטוזיס (איור 3C).

תימידין עודף מעכב סינתזת ה-DNA במהלך שלב S, ובכך חוסם תאים ב- G1/S שלב11. למרות תימידין זוגי בלוק הסינכרון הוא הכי נפוץ שיטת המחקר של מחזור התא, התקדמות mitotic, אחד צריך להיות ביקורת על חלק מהמגבלות של שיטה זו. חשוב, זה צריך להיות הבטיחו כי החומר הכימי יש כבר דהוי ביסודיות (במשך 7-8 h) כך האפקט הוא הפיך לחלוטין ולא התאים יכולים להמשיך בדרך כלל השאר של מחזור התא. תאים אחרת לא תוכל להיכנס המחזור השני גורם התקדמות לא תקין למרות מיטוזה. היחס של תאים מסונכרן לא יכול להיות גבוה מספיק עם בלוק תימידין יחיד, בלוק תימידין זוגי ייתכן שיהיה צורך להגדיל את מספר התאים מסונכרן, במיוחד אם אחד שמעוניין ללמוד שלב מסוים של מיטוזה. משך הטיפול תימידין חייב להיות מוטבת עקב רגישות שונה בין סוגי תאים העשל הדור. לדוגמה, תאים האוגרים יש 16 h של משך דור ומטופלים עם תימידין עבור ה 11 עבור סינכרון אופטימלית17. במחקר זה, התייחסנו הלה תאים עבור 16-18 h עם תימידין. יתר על כן, תימידין עודף לא רק מונע לסינתזת DNA אבל גם עלול להרוג חשוב שברי תאים11,12,18 וסגור תשומת לב לצרכים לשלם כדי לפקח על האובדן. הפתרון מניות תימידין המשמש במחקר זה צריך להיות מוכן במים מזוקקים סטריליים, צריך להיות מעורב באופן יסודי בתקשורת התרבות התא כדי למנוע את המשקעים שלה לאחר הוספתו למדיה של siRNA transfected תאים וגם כדי להבטיח את הומוגנית התפלגות סביב התאים בתרבית.

ללמוד את הפונקציה של חלבון mitotic היעד במהלך התקדמות mitotic, התאים יהיה אידיאלי שטופלו siRNA כדי נוקאאוט רמות החלבון עניין במהלך הרחוב תימידין 1סנט או במהלך השחרור שלבראשון בלוק תימידין, בהתאם הזמן הנדרש כדי לקבל חלבון יעיל תמונות ציפורים19,20,21. מצד שני, ללמוד את התפקיד של חלבונים רב תכליתיים כגון Cdt1 במהלך מיטוזה, זה הכרחי לטפל התאים עם siCdt1 במהלך שחרור מהגוש תימידין 2nd להשיג דלדול מסוים G2/M. Cdt1 הוא נגן קריטי ברישוי של מקורות שכפול ה-DNA15. כדי להבין את תפקידו מיוחדים במהלך מיטוזה ללא הפרעה עם תפקידה רישוי, Cdt1 צריכה להיות דלה במיוחד בשלב G2/M, אשר יכולה להיות מושגת ביעילות על ידי כפול תימידין סינכרון, וכך למנוע את הצורך להזדקק לזה גישות ספציפיות מיטוזה ההפרעות קשה לבצע. דלדול של Cdt1 בתרבויות אסינכרוני זירוז התגובה DNA נזק בשל ההפרעה של רישיון ממוצא שכפול ה-DNA, אשר הייתי בתורו מתמהמהת הניתוח של פונקציה אפשרית של חלבון זה במהלך מיטוזה. לפיכך, הטכניקה סינכרון תימידין זוגי מציע גישה ניסויית ייחודית ליצירת תאים עברה שלב G1 ו- S נורמלי, אך חסרה פונקציית Cdt1 במהלך שלב G2 ו- M. משמעות מיוחדת של פרוטוקול סינכרון שלנו טמון שלה עיכוב של חלבונים רב תכליתיים בשלב מסוים (G2/M) ללמוד פונקציות הרומן שלהם במהלך מיטוזה. לכן, בשיטה זו יהיה שימושי לא רק ללמוד את התפקיד של חלבונים בעלי פונקציות מרובות בשלבים שונים של מחזור התא אלא גם של כל חלבון mitotic בתהליך יישור כרומוזום מצורפים מפלגת העם הלאומית, כרומוזום סגרגציה.

עבור הדמיה תא חי, לאחר שחרורו מן הרחוב תימידין כפול, תאים צריך להיות מודגרות ב מראש ומחוממת ליבוביץ של (L-15) בינוני בתוספת 10-20% FBS עד תחילת הדמיה. התאים הזן מיטוזה בנקודות זמן משתנה לאחר שחרורו של תימידין בלוק בהתאם לסוג התא. שעת ההתחלה של לכידת התמונה או קיבוע צריך להיות מותאם בהתאם לסוג התא. עבור הדמיה תא חי, הניצול של קונפוקלית קונבנציונלי עלול לגרום photobleaching במהלך דימות לטווח ארוך. מצד שני, microcopy וידאו ברזולוציה גבוהה נותן תמונה ברזולוציה גבוהה וברורה עם היקף לפחות תופעות photobleaching.

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם משך הטיפול תימידין, שטיפה נאותה של תימידין את העיתוי של siRNA תרביות תאים, העיתוי התחלה של הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם שום עניין פיננסי מתחרות.

Acknowledgements

אנחנו אסירי תודה ד ר טנקה Kozo של אוניברסיטת Tohoku, יפן לשיתוף הלה תאים stably לבטא mCherry-היסטון ויזת עבודה H2B ו- GFP-α-טובולין. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NCI DV (R00CA178188) ועל ידי ראשונית מאוניברסיטת נורת'ווסטרן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (1x) Life Technologies 11965-092 Store at 4 °C
DPBS (1x) Life Technologies 14190-144 Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium Life Technologies 21083-027 Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM) Life Technologies 319-85-070 Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin Life Technologies 15070-063 (Pen Strep) 1:1,000 dilution
Dharmafect2 GE Dharmacon T-2002-02 Store at 4 °C
Thymidine MP Biomedicals LLC 103056 Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA Life Technologies Ref 10
Hec1 siRNA Life Technologies Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich Corporation F8775 Toxic, needs caution
DAPI Sigma-Aldrich Corporation D9542 Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin Santa Cruz Biotechnology Sc32293 1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1 Bethyl A300-781A 1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) Upstate Biotechnology 05-626, clone JBW301 1:300 dilution
Alexa 488 Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
Rodamine Red-X Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
BioLite 6 well multidish Thermo Fisher Scientific 130184
35 mm Glass bottom dish MatTek Corporation P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope Nikon Instruments
Spinning disc for confocal Yokagawa CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera Andor iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes Tokai Hit TIZB
NIS-elements software Nikon Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182, (4652), 1788-1790 (1958).
  2. Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
  3. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28, (17), 2511-2531 (2009).
  4. Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6, (1), E5 (2017).
  5. Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21, (12), 1934-1942 (2002).
  6. Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42, (9), 593-598 (2009).
  7. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52, (4), 574-582 (2013).
  8. Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285, (10), 7197-7207 (2010).
  9. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8, (3), 602-626 (2013).
  10. Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72, (11), 1396-1404 (2006).
  11. Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
  12. Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60, (6), 1099-1106 (2003).
  13. Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13, (6), 1977-2000 (2002).
  14. Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (28), 10660-10665 (2006).
  15. Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14, (6), 593-603 (2012).
  16. Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116, (2), 297-301 (1981).
  17. Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68, (1), 163-168 (1971).
  18. Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
  19. Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12, (4), e0174819 (2017).
  20. Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), E4546-E4555 (2015).
  21. Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196, (5), 563-571 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics