유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

Biology

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Summary

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

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Amin, M. A., Varma, D. Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis. J. Vis. Exp. (130), e56513, doi:10.3791/56513 (2017).

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Abstract

연구 단계에 종속적으로 세포 주기의 다양 한 규제 이벤트의 세포 성장 및 부문에 대 한 명확한 이해를 제공합니다. 세포 인구 세포 사이클의 특정 단계에서 동기화 실험적인 노력에 매우 유용 하 게 발견 되었습니다. 치료는 상대적으로 덜 독성 화학 물질에 의해 세포의 동기화 연구 결과 세포 주기 이벤트 하 고 선택한 mitotic 단계의 특정 농축을 위한 약리 억제 약물의 사용을 통해 유리한 수 있습니다. 동기화 인간의 세포는 세포의 여러 단계에서 S 단계 및 이중 티 미 딘 블록와 M 단계 모두를 포함 하 여 주기 고 염색체 정렬에 mitotic 단백질의 기능을 공부에 대 한 절차를 공개 프로토콜 설명 하는 여기, 그리고 분리입니다. 이 프로토콜 설립된 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할을 공부 하는 데 매우 유용 했습니다. 우리의 경우에서 Cdt1, 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 대 한 중요 한 단백질의 mitotic 역할 수 수 공부 효과적으로 g 2/M-특정 Cdt1 고갈 될 수 있는 경우에. 우리는 더블 티 미 딘 동기화를 사용 하 여 g 2/M-특정 Cdt1의 고갈에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 셀 고정, 프로토콜을 설명 하 고 라이브 셀 이미징 티 미 딘 릴리스 후 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여. 방법은 하나 고정 및 라이브 셀 mitotic 세포의 큰 샘플 크기를 수 있습니다 Hec1, 복잡 한, Ndc80의 구성 요소와 같은 생리 적 및 교란 조건에서 mitotic 단백질의 기능을 분석 하는 데 유용도 분석으로 우리가 여기에 표시.

Introduction

세포 주기에서 세포 그들의 게놈 및 확산의 정확한 복제에 대 한 높은 규제 하 고 일시적으로 제어 이벤트의 시리즈를 받 다. 포유류에서 세포 주기 interphase 및 M으로 구성 됩니다. Interphase에 구성 된 3 단계-G1, S, 및 g 2 셀 그것의 게놈을 복제 하 고 정상적인 세포 주기 진행1,2에 필요한 증가 겪 습. M-단계에서 이루어진 유사 분열 (의향, prometaphase, 분열, anaphase, 및 telophase) cytokinesis, 부모의 셀 두 유전으로 동일한 딸 세포를 생성 합니다. 그 뒤 분열 중 기 격판덮개 (분열)에 그들의 정렬 드라이브 유사 분열, 중복 된 게놈의 chromatids 압축된 (의향) 이며 조립된 mitotic 스핀 들 (prometaphase)의 microtubules 잡혀 자신의 kinetochores에 자매 들 자매 chromatids는으로 분할 하 고 반대 스핀 들 이송 기둥 (anaphase) 분리를 동등한. 2 개의 딸 세포는 걸 기반으로 수축 성 반지 (telophase 및 cytokinesis)의 활동에 의해 물리적으로 구분 됩니다. kinetochore chromatids의 centromeric 지역에서 조립 전문된 배치할 구조 이며 스핀 들 microtubules에 대 한 첨부 파일 사이트 역할. 그것의 주요 기능은 염색체 캡처, 맞춤, 운전 하 여 염색체 분리3,4의 충실도 유지 하기 위해 스핀 들 어셈블리 검사점을 중재 하는 동안 부적 절 한 스핀 들 microtubule 첨부 파일 수정에 도움이입니다.

셀 동기화의 기술은 세포 주기 진행에 관련 된 분자 구조 이벤트를 이해 하기 위한 이상적인 도구 역할을 합니다. 이 접근은 다양 한 형태의 분석, 유전자 발현의 프로 파일링을 포함 하 여 세포질 생화학 과정의 분석 및 단백질의 subcellular 지 방화의 검출에 대 한 특정 단계에서 세포 인구를 풍부 하 게 사용 되었습니다. 개별 유전자 제품의 연구 뿐만 아니라 전체 게놈 유전자 식5, 미르 식 패턴6, microarray 분석 등의 분석을 포함 하는 방법에 대 한 동기화 된 포유류 세포를 사용할 수 있습니다. 변환 규칙7, 그리고 단백질 수정8의 proteomic 분석. 동기화는 또한 세포 주기 진행에 유전자 발현 이나 단백질 노크 다운 또는 노크-아웃, 또는 화학 물질의 효과 연구에 사용할 수 있습니다.

세포 세포 주기의 여러 단계에서 동기화 할 수 있습니다. 물리적, 화학적 방법은 널리 셀 동기화에 사용 됩니다. 셀 동기화에 대 한 가장 중요 한 기준은 동기화 되도록 noncytotoxic 하 고 되돌릴 수 있습니다. 동기화 약리학 대리인에 의해 세포의 잠재적인 불리 한 세포 결과, 때문에 화학 종속 방법을 공부 하는 주요 세포 주기 이벤트에 대 한 유리한 수 있습니다. 예를 들어 hydroxyurea, amphidicolin, mimosine, 그리고로 바 스타 틴, G1/S 단계에서 셀 동기화에 사용할 수 있습니다 하지만, 그들이 억제 생화학 경로에 그들의 효력 때문에 그들은 세포 주기 검문소 메커니즘을 활성화 하 고 중요 한 죽 셀9,10일부 다른 한편으로, "티 미 딘 블록"로 알려진 성장 매체에 티 미 딘을 추가 하 여 DNA 복제의 피드백 저해 특정 포인트11,,1213에 세포 주기를 체포 수 있습니다. 또한 nocodazole와로-33069,14처리 하 여 셀 G2/M 단계에 동기화 수 있습니다. Nocodazole, microtubule 어셈블리를 방지 하는 상대적으로 높은 세포 독성. 또한, nocodazole 체포 셀 interphase 조 mitotic 미끄럼으로 돌아갈 수 있습니다. 이중 티 미 딘 블록 체포 셀 g 1/S 단계에서 블록에서 출시 후, 셀 통해 G2 및 유사 분열으로 동시 진행을 찾을 수 있습니다. 티 미 딘 블록에서 발표 하는 세포의 세포 주기의 정상적인 진행 셀 고정 또는 라이브 영상으로 높은 해상도 confocal 현미경에서 관찰할 수 있습니다. 셀 입력 하 고 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 유사 분열을 통해 진행 하는 경우에 특히 mitotic 단백질의 섭 동 효과 공부 될 수 있다. Cdt1, 다기능 단백질 DNA 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 관련 된 이며, 유사 분열15중 kinetochore microtubule 첨부 파일에 대 한 필요 이기도. 유사 분열 동안 Cdt1의 기능을 공부 하나는 복제 라이센스만 G2/M 단계 동안 특히 그것의 소모를 초래 하는 동시에 g 1 단계에 고갈의 효과 방지 하는 방법을 채택 해야 합니다. 여기, 우리는 고정 및 라이브 셀 이미징에 의해 이중 티 미 딘 블록 세포 주기의 다른 단계 동안 여러 기능을 수행 하는 단백질의 mitotic 역할을 연구 하기에 따라 상세한 프로토콜 제시.

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Protocol

1. 더블 티 미 딘 블록 및 릴리스: 시 약 준비

  1. 500 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 매체와 10 %FBS, 페니실린, 스 보충을 확인 합니다.
  2. 살 균 물과 aliquots-80 ° c.에 있는 매장에서 티 미 딘 100 m m 재고 확인

2. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 1A)의 고정된 셀 이미징에 대 한

  1. 6 잘 플레이트 커버 슬립 (70% 에탄올과 UV 방사선 살 균)과 DMEM 매체의 2 mL의 우물으로 하루 1, 105 HeLa 세포 x 씨 ~ 2. 37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한 습도 인큐베이터에서 세포 성장.
  2. 1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 철저 하 게 신선한 DMEM 미디어 (100 m m 재고, 2mm 최종 농도)에 티 미 딘의 필요한 볼륨을 혼합.
  3. 티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 셀 6-우물의 각 음에 미디어 접시 및 18h에 품 어.
  4. 3 일에 매체를 발음 하 고 씻고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀과 신선한 prewarmed DMEM; 한 번 9 h 블록에서 셀 출시를 위한 신선한 prewarmed DMEM 매체에서 세포를 성장 한다.
  5. 2 티 미 딘 블록: 다시 티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 미디어 (2mm 최종 농도) 셀 6 잘 플레이트의 각 음에.
  6. 또 다른 18 h에 대 한 품 어.
  7. 4 일에 매체를 발음 하 고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀 및 신선한 prewarmed DMEM 한 번 씻어.
  8. (제어 및 Cdt1) 희석 siRNAs와 transfection 시 약 10 분에 대해 별도로 혈 청 무료 성장 매체에 혼합 그들이 함께 실시간에 20 분 동안 품 어 각 transfection에 사용 되는 siRNA의 최종 농도 100 nM. 티 미 딘에서 세탁 셀에 반응 혼합물을 추가 합니다.
  9. 차단 해제 4% 커버 슬립에 셀을 수정 하 9-10 h 37 ° C에서 세포를 품 어 PFA 실시간에서 20 분
    주의: PFA는 독성, 적절 한 보호를 착용.
  10. Immunostain 셀, RT에서 10 분 동안 0.5% (v/v) 세제 permeabilizing 및 5 분의 1 x PBS로 두 번 셀을 세척 후.
    1. 1 시간 뒤에 1% (w/v)에 1 차 항 체 (마우스 안티-α-tubulin 항 체 1:1, 000, 토끼 안티-Zwint1 항 체 희석 1:400, 및 안티-인-ɣ H2AX 희석 1:300에서 마우스에 희석)의 50 µ L로 세포를 치료 하는 RT에 대 한 1 x PBS에서 1 %BSA (w/v)으로 세포를 차단 1 x 1 h 37 oc.에 대 한 PBS에 BSA
    2. 씻은 후 1 x PBS로 세포 밖으로 몇 번이 고, 실시간에 1 시간에 50 µ L의 각 커버 유리 (알 렉 사 488와 1% (w/v) BSA 1 x PBS에서 1: 250 희석에 Rhodamine 빨간색)에 대 한 2 차 항 체와 세포 치료
    3. 씻은 후 5 분 동안 두 번 1 x PBS와 셀, DAPI와 세포 치료 (0.1µg / mL 1 x PBS에) 실시간에서 5 분
    4. 씻은 후 5 분 동안 두 번 1 x PBS와 셀, 셀 분명 현미경 슬라이드에 적절 한 설치 미디어를 직면 하 고 커버 슬립을 놓습니다.
  11. 60 X 100 X 1.4 나 계획 Apochromatic DIC 기름 침수 목표와 immunostained 단백질에 대 한 셀 필요한 이미지의 품질에 대 한 필요에 따라 적절 한 카메라를 장착 하는 거꾸로 높은 해상도 confocal 현미경에 장착 된 이미지.
  12. Z-스택 소프트웨어를 사용 하 여 0.2 µ m 두께의 현미경에 적합으로 실 온에서 이미지를 취득 합니다.

3. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 3A)의 라이브 셀 이미징에 대 한

  1. 하루에 1, 씨앗 약 0.5-1 x 105 HeLa 세포 안정적 DMEM 매체의 1.5 mL와 35 m m 유리 하단 요리에 mCherry H2B GFP-α-tubulin (약간 세포 유형 및 표현 하는 단백질을 기준으로 변수) 표현 하 고는 습도에 그들을 성장합니다 37 oC, 5% CO2에서 24 h에 대 한 보육.
  2. 1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 포함 하는 티 미 딘 1.5 mL를 추가 셀 접시 (100 m m 티 미 딘, 2mm 최종 농도)에 미디어.
  3. 18 h에 품 어.
  4. 3 일에 티 미 딘을 포함 하는 매체를 발음 하 고 몇 번이 고, 두 번 1 x PBS의 2 mL와 함께 한 번 신선한 prewarmed DMEM 세포를 씻어.
  5. (제어 및 Hec1) 희석 siRNAs와 transfection 시 약 10 분에 대해 별도로 혈 청 무료 성장 매체와 함께 그들을 혼합 실시간에 20 분 동안 품 어 각 transfection에 사용 되는 siRNA의 최종 농도 100 nM. 티 미 딘에서 세탁 셀에 반응 혼합물을 추가 합니다.
  6. 8 h 블록에서 셀 출시를 위한 신선한 prewarmed DMEM 매체의 1.5 ml에서 세포 성장.
  7. 2 티 미 딘 블록: 포함 하는 티 미 딘 1.5 mL를 추가 미디어 (2mm 최종 농도) 접시에 셀.
  8. 또 다른 18 h에 대 한 품 어.
  9. 하루에 4, 매체를 발음 하 고 몇 번이 고, 두 번 1 x PBS의 2 mL와 함께 한 번 신선한 prewarmed DMEM 세포를 씻어. 그런 다음 셀을 성장에서 신선한 prewarmed Leibovitz의 (L-15) 중간 보충 10 %FBS 20 mM HEPES 8 h 블록에서 셀 출시를 위한 pH 7.0에서.
  10. 이미 무대와 실험 온도 안정 시키기 위해 이미징 시작 하기 전에 적어도 30 분에 전환 했다는 고해상도 confocal 현미경에 설정 온도 제어 챔버에 접시를 놓습니다.
  11. 셀 표시 될 때까지 60 x 목적으로 밝은 분야에 초점을 맞춥니다 다음 수동으로 선택의 영역에는 무대를 구별 합니다.
  12. 빛과 레이저 전원/노출, 이미지 수집 매개 변수 및 선택의 현미경 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 실험 기간을 설정 합니다. GFP (488 여기; 385 nm 방출) 및 mCherry (561 nm 여기 및 385 nm 방출) 이미지에 대 한 필터를 사용 합니다.
  13. 별도로 최대 16 h 동안 펄스 전송된 빛과 형광 이미지 마다 10 분을 획득 하 여 시간 경과 실험을 수행 합니다.
  14. 현미경에 적합 한 소프트웨어를 사용 하 여 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 9 h는 12 1.0 µ m 구분 된 z 비행기로 이미지를 취득 합니다.
  15. Mitotic 진행에 대 한 개별 셀을 추적 하는 이미지를 분석 하 고 마지막으로 소스 소프트웨어 피지/ImageJ 해당 영화를 조립.

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Representative Results

Mitotic 진행 및 셀에서 microtubule 안정성의 연구에서 출시 후 두 티 미 딘 블록 고정
Cdt1 g 1 단계에서 DNA 복제 근원의 라이선스에 포함 된다. 그것은 S 단계 저하 하지만 다시 G2/M 단계에 축적. 공부 하 고 유사 분열에서의 역할, 생 Cdt1를 사용 하 여 가장 적합 한 셀 동기화 기법, 더블 티 미 딘 블록15G/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 필요가 있다. 셀에에서 있을 때 셀 S 단계 및 시간에 의해 또한 Cdt1 기능 필요, g 1에서 복제 근원의 라이선스 오래 완료 2nd 티 미 딘 블록에서 출시 직후 siRNAs와 페 했다. 9 h siCdt1 transfection와 더블 티 미 딘 블록 출시 후 Cdt1 고갈 부 럽 (그림 1B)에 의해 검증 되었다. 고정 셀 9 h 이중 티 미 딘 블록에서 릴리스 보여줍니다 대부분 세포 분열 단계에서 제어 및 Cdt1 siRNA는 후의 transfected 세포. 그러나 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 셀 10 h의 고정 제어 셀 anaphase 입력 하 고 정상적으로 예상된 (그림 1C로 그들의 염색체를 분리 하는 동안 대부분 Cdt1 siRNA 치료 셀 prometaphase 단계에서 체포 여전히는 보여준다 ). Kinetochore-microtubule (kMT) 안정성에 Cdt1 고갈의 영향을 이해 하 셀 고정 했다 9 h에서 출시 후 더블 티 미 딘 블록 뒤에 감기 치료만 안정적인 kinetochore-microtubules (kMTs)를 유지. Cdt1 고갈 세포의 kMTs는 제어 셀 (그림 1D)에 비해 감기 치료 후 상대적으로 덜 강력한. 따라서,이 방법을 사용 하 여, 관심의 mitotic protein(s)의 함수의 섭 동 후 정상적인 mitotic 세포의 진행 수 수 공부 효과적으로, 라이브 셀 이미징의 사용 없이.

그림 2 는 DNA 복제 근원의 라이선스는 하지 불안정 세포는 또한 제어 셀에서 관찰 되었다 우리의 프로토콜을 사용 하 여 G2/M 단계 Cdt1 고갈 하는 경우를 보여 줍니다. 셀 g 2/M 단계 Cdt1의 고갈; 후속 g 2 단계 phosphorylated ɣH2AX, DNA 손상에 대 한 표시자의 축적을 유도 하지 않았다 반면 비동기 문화 Cdt1 고갈의 siRNA transfection 부적절 한 DNA 복제 라이센스에 의해 유도 된 DNA 손상으로 인해 인 ɣH2AX 양성 foci의 축적을 유도 한다.

라이브 셀 이미징에 의해 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 셀에 mitotic 진행의 연구
핵 붕괴 (코), 후 (기능 mitotic 단백질에 의해 섭 동 부재)에 정상 세포 유사 분열을 입력 하 고 약 30-60 분 (그림 3B) 내에서 유사 분열에서 종료 하려면 anaphase 발병을 받 다. 하지만 RNAi 중재 최저 Hec1, 강력한 kMT 첨부 형성에 필요한 키 kinetochore 단백질의 정상적인 mitotic 진행 지연 발견 된다. 이 시나리오에서 대부분 셀 코, 후 유사 분열을 입력 하지만 anaphase 발병을 받아야 하거나 마십시오 지연 유사 분열 (그림 3C)의 몇 시간 후에 유사 분열에서 종료. 마찬가지로, localizes kinetochores 또는 함수 유사 분열 동안에 다른 단백질의 최저 RNAi 중재의 효과 이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 라이브 셀 이미징 사용 하 여 효과적으로 관찰 수 있다 따라서. Mitotic 진행, 지연 및 체포의 자연 공부, 함께이 메서드를 사용 하 여 분석 될 수 있는 다른 주요 mitotic 현상의 일부 염색체 정렬, mitotic 스핀 들 형성 및 활성화 위치 및의 입을 포함는 스핀 들 어셈블리 검사점입니다.

Figure 1
그림 1: mitotic 진행과 더블 티 미 딘 동기화 후 고정된 셀에 kinetochore microtubules의 안정성의 분석. (A) A 셀 동기화, 고정, 및 면역 형광의 도식 적인 표현입니다. (B) 2 티 미 딘 블록에서 방출의 9 h 후 Cdt1의 최저에 대 한 서쪽 오 점. (C) 표시 mitotic 세포 면역 형광 현미경 더블 티 미 딘 블록 및 제어 (위) 또는 Cdt1 siRNA (아래) 치료에서 출시 후 9, 10 h 고정. 빨간색에서은 α-tubulin 얼룩, DNA는 그린 셀 GFP 히스톤 H2B 익스프레스. 눈금 막대 = 10 µ m. Prometaphase 및 분열 세포 노란색을 사용 하 여 표시 됩니다 및 화살촉을 각각 화이트. (D) 헬러 세포 제어 siRNA (상단 패널)과 치료 후과에서 출시 후 9 h Cdt1 고갈 (하단 패널) 후 두 티 미 딘 블록 뒤에 얼음 처럼 차가운 Leibovitz (L-15) 치료 매체 및 고정. 세포 면역-스핀 들 MT (녹색) 및 Zwint1 (빨간색)와 흑인과 백인 dna DAPI kinetochore 마커 얼룩이 있었다. 눈금 막대 = 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: G2/M 단계 Cdt1 고갈 복제 라이센스 교란 하지 않습니다. 비동기 HeLa 세포 제어 luciferase (상단 패널)로 치료 또는 cdt1 siRNAs (중간 패널) 또는 더블 티 미 딘 동기화 HeLa 세포는 2nd 티 미 딘 워시 아웃 뒤에 10 h에 고정 하는 동안 cdt1 siRNA로 치료 릴리스 (하단 패널) 후 DAPI (의사 색된 녹색)와 안티-인-ɣH2AX 항 체 (레드) 얼룩이 있었다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 라이브 셀 이미징에 의해 mitotic 진행의 분석 동기화 셀. (A) A 셀 동기화 및 라이브 셀 이미징의 도식 적인 표현입니다. 헬러 세포를 안정적으로 mCherry-히스톤 H2B 표현 그리고 GFP-α-tubulin 8 h S 단계 체포에서 G2/M 단계로 진행을 위한 이중 티 미 딘 블록에서 발표 했다. 라이브 이미지는 티 미 딘 블록에서 셀을 공개 하 고 그 시점에서 최대 16 시간 계속 후 8 h를 시작 하는 높은 해상도 confocal 현미경을 사용 하 여 실시 되었다. 여기은 캡처한 모든 mitotic 단백질 (B)의 섭 동 없이 제어 세포 또는 세포는 Hec1 소 단위 복잡 한 Ndc80의 (C)의 고갈에 대 한 모든 10 분 비디오에서 스틸 이미지입니다. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이중 티 미 딘 동기화의 가장 중요 한 장점은 이러한 세포 유사 분열 염색체 맞춤, 양극의 분석 또한 활성화 한 마음으로 입력의 많은 짧은 시간 창에 mitotic 세포의 증가 샘플 크기 제공 훨씬 더 높은 효율성과 형성과 염색체 분리를 주축.

많은 규제 단백질 복합물 및 신호 통로 유사 분열을 통해 정상적인 진행을 보장에 헌신 하는 고이 과정의 규제 완화 수 있습니다 tumorigenesis. 라이브 셀 이미징 HeLa 세포 안정적으로 mCherry H2B와 GFP tubulin 그리고 대부분 제어 셀 코 (그림 3B) 후 anaphase 약 60 분 이내에 그들의 염색체 분리 이중 티 미 딘 블록 쇼에서 발표의. 다른 한편으로, Hec1 기능을 보여줍니다 대부분 셀 고르지 염색체 anaphase 발병 또는 apoptosis (그림 3C)와 오랜 기간 동안 mitotic 단계에 머물와 교란된 HeLa 세포의 세포 이미징 라이브.

초과 티 미 딘 따라서 G1/S 단계11에서 세포를 차단 S 단계에서 DNA 합성 억제. 이중 티 미 딘 블록 동기화는 가장 일반적으로 사용 되는 방법 세포 주기 및 mitotic 진행의 연구에서 하나이 방법의 제한 사항 중 일부의 중요 한 필요 합니다. 중요 한 것은, 그것은 그 화학 물질은 씻 겨 밖으로 철저 하 게 (h를 위한 7-8) 효과 되돌릴 하 고 세포를 세포 주기의 나머지 부분을 통해 정상적으로 진행 하는 것을 보장 될 필요가 있다. 셀 수 있습니다 그렇지 않으면 부적절 한 진행 하지만 유사 분열 일으키는 두 번째 주기를 입력 하지. 동기화 된 셀의 비율 단일 티 미 딘 블록으로 충분히 높은 되지 않을 수 있습니다 그리고 하나는 유사 분열의 특정 단계를 공부에 관심이 있는 경우에 특히 이중 티 미 딘 블록 동기화 된 셀의 수를 증가 하는 데 필요한 수 있습니다. 티 미 딘 치료 기간 셀 형식 생성 시간에 따라 다른 감도 때문에 낙관 되어야 한다. 예를 들어 햄스터 세포의 생성 시간 16 h 있고 최적의 동기화1711 h 티 미 딘으로 취급 됩니다. 이 연구에서 우리는 HeLa 세포에 티 미 딘과 16-18 h에 대 한 치료. 또한, 초과 티 미 딘 뿐만 아니라 DNA 종합을 방지 하지만 또한 고 수 있습니다 셀11,,1218 의 중요 한 부분을 죽 일이 손실 모니터를 지불 될 필요가 관심을 닫습니다. 이 연구에 사용 된 티 미 딘 재고 솔루션 멸 균 증류수에 준비 되어야 한다 고 세포 배양 세포 페 siRNA의 미디어를 추가 후 그것의 강 수를 방지 하 고 또한 그것의 균질 성 보장에 철저 하 게 혼합 한다 배양된 세포 주위 분포입니다.

Mitotic 진행 하는 동안 대상 mitotic 단백질의 기능을 공부, 셀 이상적으로 것으로 치료 siRNA 최저에 관심사의 단백질의 레벨 1st 티 미 딘 블록 또는 1st에서 출시 하는 동안 티 미 딘 블록, 효율적인 단백질 최저19,20,21을 얻을 하는 데 필요한 시간에 따라. 다른 한편으로, 유사 분열 동안 Cdt1 등 다기능 단백질의 역할을 연구, 그것은 G2/M 특정 소모를 2nd 티 미 딘 블록에서 출시 하는 동안 siCdt1 가진 세포를 치료 하는 데 필요한. Cdt1는 DNA 복제 기원15의 라이선스에서 중요 한 선수 이다. 라이선스의 역할을 방해 하지 않고 유사 분열 동안 그것의 전문화 된 역할을 이해, Cdt1 해야 효율적으로 더블 티 미 딘 동기화를 통해 달성 될 수 있다, G2/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 다른 리조트 필요가 피 실행 하기 어려운 유사 분열 전용 섭 동 접근. 비동기 문화에서 Cdt1의 고갈 것 차례로 muddled이 단백질에 대 한 가능한 함수의 분석 유사 분열 동안 DNA 복제 근원의 라이센스의 중단으로 인해 DNA 손상 응답 유도. 따라서, 이중 티 미 딘 동기화 기술은 정상적인 g 1과 S 단계 수술 하지만 g 2와 M 단계 Cdt1 기능 부족 셀 생성 하 독특한 실험 방식을 제공 합니다. 우리의 동기화 프로토콜의 특별 한 의미 (G2/M) 유사 분열 동안 그들의 소설 기능을 공부 하는 특정 단계에서 다기능 단백질의 그것의 억제에 있다. 따라서,이 방법은 뿐만 아니라 단백질 기능을가지고 여러 다른 세포 주기 단계 뿐만 아니라 염색체 정렬, kMT 첨부 파일, 및 염색체 분리 과정 mitotic 단백질 어떤의 그의 역할을 연구 하기 유용할 것 이다.

이중 티 미 딘 블록에서 출시 후 라이브 셀 이미징에 대 한 미리 따뜻하게 Leibovitz (L-15)에서 세포를 incubated 매체 화상의 시작까지 10-20 %FBS 보충. 셀 셀 유형에 따라 티 미 딘 블록에서 출시 후 가변 시간 지점에서 유사 분열을 입력합니다. 이미지 캡처 또는 고정 시작 시간 셀 유형에 따라 최적화가 필요 합니다. 라이브 셀 이미징에 대 한 전통적인 confocal 현미경 검사 법의 활용 장기 이미징 동안 photobleaching를 발생할 수 있습니다. 다른 한편으로, 높은 해상도 confocal microcopy photobleaching 효과의 최소 범위를 명확 하 고 고해상도 이미지를 제공합니다.

이 프로토콜의 중요 한 단계는 티 미 딘 치료 기간에 티 미 딘, siRNA transfection의 타이밍 그리고 영상의 시작 타이밍의 적절 한 유실.

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Disclosures

저자 들은 경쟁 금융 관심 선언 합니다.

Acknowledgements

우리는 안정적으로 mCherry-히스톤 H2B GFP-α-tubulin 표현 HeLa 세포를 공유 하기 위한 동북 대학, 일본의 박사 고조 다나카에 감사. 이 작품은 DV (R00CA178188)에 NCI 그랜트와 노스웨스턴 대학에서 창업 자금 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (1x) Life Technologies 11965-092 Store at 4 °C
DPBS (1x) Life Technologies 14190-144 Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium Life Technologies 21083-027 Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM) Life Technologies 319-85-070 Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin Life Technologies 15070-063 (Pen Strep) 1:1,000 dilution
Dharmafect2 GE Dharmacon T-2002-02 Store at 4 °C
Thymidine MP Biomedicals LLC 103056 Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA Life Technologies Ref 10
Hec1 siRNA Life Technologies Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich Corporation F8775 Toxic, needs caution
DAPI Sigma-Aldrich Corporation D9542 Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin Santa Cruz Biotechnology Sc32293 1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1 Bethyl A300-781A 1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) Upstate Biotechnology 05-626, clone JBW301 1:300 dilution
Alexa 488 Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
Rodamine Red-X Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
BioLite 6 well multidish Thermo Fisher Scientific 130184
35 mm Glass bottom dish MatTek Corporation P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope Nikon Instruments
Spinning disc for confocal Yokagawa CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera Andor iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes Tokai Hit TIZB
NIS-elements software Nikon Instruments

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References

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