Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Biology

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Summary

Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.

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Amin, M. A., Varma, D. Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis. J. Vis. Exp. (130), e56513, doi:10.3791/56513 (2017).

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Abstract

Estudo dos vários eventos reguladoras do ciclo celular de uma forma dependente da fase fornece um entendimento claro sobre o crescimento celular e divisão. A sincronização de populações de células em estágios específicos do ciclo celular foi encontrada para ser muito útil em tais esforços experimentais. Sincronização de células por tratamento com produtos químicos que são relativamente menos tóxicos pode ser vantajosa sobre o uso de drogas inibidoras farmacológicas para o estudo de eventos consequente ciclo celular e obter enriquecimento específico das fases mitóticas selecionados. Aqui, descrevemos o protocolo para Sincronizando pilhas humanas em diferentes fases da célula o ciclo, incluindo ambos na fase S e fase de M com um bloco de timidina duplo e liberar o procedimento para estudar a funcionalidade das proteínas mitóticas em alinhamento de cromossomo e segregação. Este protocolo tem sido extremamente útil para estudar as funções mitóticas das proteínas multifunctional que possuem funções de interfase estabelecida. No nosso caso, o papel mitótico da Cdt1, uma proteína essencial para o licenciamento de origem de replicação na fase G1, pode ser estudado efetivamente somente quando Cdt1 G2/M-específico pode ser esgotado. Descrevemos o protocolo detalhado para esgotamento de Cdt1 G2/M-específicos usando a sincronização de timidina duplo. Nós também explicar o protocolo de fixação da pilha e viver a imagem latente da pilha usando microscopia confocal de alta resolução após lançamento de timidina. O método também é útil para analisar a função das proteínas mitóticas em condições fisiológicas e perturbadas como para Hec1, um componente do complexo, o Ndc80, que permite um para obter os tamanhos de amostra grande de células mitóticas para celular fixo e ao vivo análise como mostramos aqui.

Introduction

No ciclo celular, as células sofrem uma série de eventos altamente regulamentados e temporalmente controlados para a duplicação exata do seu genoma e proliferação. Nos mamíferos, o ciclo celular consiste em interfase e fase M. Na interfase, que consiste em três fases - G1, S, e G2, a célula duplica seu genoma e sofre o crescimento que é necessário para o ciclo celular normal progressão1,2. Na fase M, que consiste de mitose (prófase, prometafase, metáfase, anáfase e telófase) e citocinese, uma célula parental produz duas células-filhas geneticamente idênticas. Em mitose, irmã cromátides irmãs de duplicação do genoma são condensado (prófase) e são capturados em seus cinetócoros por microtúbulos do fuso mitótico montado (prometafase), que dirige o seu alinhamento na placa metafásica (metáfase) seguida por seus igual a segregação quando irmã cromátides irmãs são divididos em direção e transportados para eixo oposto polos (anáfase). As duas células-filhas são fisicamente separadas pela atividade de um anel contrátil actina-baseado (telófase e citocinese). O cinetócoro é uma estrutura especializada proteicas que monta na região centromérica de cromátides irmãs e servem como locais de fixação para os microtúbulos do fuso. Sua principal função é conduzir a captura do cromossomo, alinhamento, e ajuda na correção de acessório do microtubule imprópria do eixo, enquanto mediando o checkpoint de montagem do eixo para manter a fidelidade do cromossoma segregação3,4.

A técnica de sincronização do celular serve como uma ferramenta ideal para compreender os eventos moleculares e estruturais envolvidos na progressão do ciclo celular. Esta abordagem tem sido usada para enriquecer as populações de células em fases específicas para vários tipos de análises, incluindo a criação de perfil de expressão gênica, análises de processos bioquímicos celulares e detecção de Localização subcellular das proteínas. Células de mamíferos sincronizadas podem ser usadas não só para o estudo de produtos de genes individuais, mas também para abordagens envolvendo análise de genomas inteira, incluindo análise de microarray de gene expressão5, miRNA expressão padrões6, Regulamento de translação7e análise proteômica de proteína modificações8. Sincronização também pode ser usada para estudar os efeitos da expressão do gene ou a proteína knock-down ou mata-mata, ou de produtos químicos na progressão do ciclo celular.

As células podem ser sincronizadas em diferentes fases do ciclo celular. Métodos físicos e químicos são amplamente utilizados para sincronização do celular. Os critérios mais importantes para a sincronização de célula são que a sincronização deve ser fotoefeito e reversível. Devido as potenciais consequências celulares adversas de Sincronizando pilhas por agentes farmacológicos, métodos químico-dependente podem ser vantajosos para estudar eventos chave ciclo celular. Por exemplo, Hidroxiureia, amphidicolin, mimosine e lovastatina, podem ser usados para sincronização de célula na fase G1/S, mas, por causa de seu efeito sobre as vias bioquímicas que eles inibem, eles ativar mecanismos de ponto de verificação do ciclo celular e matar um importante fração das células9,10. Por outro lado, feedback inibição da replicação do DNA pela adição de timidina para a mídia de crescimento, conhecida como "bloco" de timidina, pode prender o ciclo celular em certos pontos11,12,13. As células também podem ser sincronizadas na fase G2/M, tratando com nocodazole e RO-33069,14. Nocodazole, que impede a montagem de microtúbulos, tem uma relativamente elevada citotoxicidade. Além disso, as células nocodazole-preso podem retornar para interphase precocemente por deslizamento mitótico. Dupla timidina bloco prisão células na fase G1/S e após o lançamento do bloco, as células encontram-se proceder de forma síncrona G2 e mitose. A normal progressão do ciclo celular por células liberado do bloco de timidina pode ser observada sob microscopia confocal de alta resolução por fixação da pilha ou imagens ao vivo. O efeito da perturbação das proteínas mitóticas pode ser estudado especificamente quando células entram e prosseguir através de mitose, após o lançamento do bloco de timidina duplo. Cdt1, uma proteína multifuncional, está envolvido em licenciamento de origem de replicação do DNA na fase G1 e também é necessária para anexos do microtubule cinetócoro durante a mitose15. Para estudar a função de Cdt1 durante a mitose, é necessário adoptar um método que evita o efeito de sua redução na replicação de licenciamento durante a fase G1, enquanto ao mesmo tempo efetuar sua redução especificamente na fase G2/M apenas. Aqui, apresentamos protocolos detalhados baseados no bloco de timidina duplo para estudar o papel mitótico das proteínas executar múltiplas funções durante as diferentes fases do ciclo celular de imagens fixas e viver-pilha.

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Protocol

1. double bloco de timidina e lançamento: preparações de reagente

  1. Fazer 500 mL que Dulbecco modificado suplementado com 10% FBS, penicilina e estreptomicina médio (DMEM) águia.
  2. Fazer estoque de 100 mM do thymidine em água estéril e loja em alíquotas a-80 ° C.

2. protocolo para a imagem latente de célula fixa de progressão mitótica (figura 1A)

  1. No dia 1, semente ~ 2 x 105 células de HeLa em poços de uma placa de 6 com uma lamela (esterilizados com 70% de etanol e irradiação UV) e 2 mL do meio DMEM. Crescem as células em uma incubadora umidificada por 24 h a 37 ° C e 5% de CO2.
  2. 1 bloco de timidinast : no dia 2, misture bem o volume necessário de timidina midiático DMEM fresco (100mm estoque, 2mm concentração final).
  3. Adicionar 2 mL de timidina-contendo mídia para as células em cada poço do poço 6-placa e incubar por 18 h.
  4. No dia 3, Aspire o meio e lavar as células duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco; desenvolvem-se células em meio fresco de DMEM escaldado para 9h às células do bloco de lançamento.
  5. 2nd timidina bloco: novamente, adicione 2 mL de timidina-contendo mídia (concentração final de 2 mM) para as células em cada poço da placa de 6-poços.
  6. Encube por outro 18 h.
  7. No dia 4, Aspire o meio e lavar as células duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco.
  8. SiRNAs diluído (controle e Cdt1) e reagente de transfeccao em meio de crescimento livre de soro separadamente durante 10 min. misturam-os e incubam durante 20 min em RT A concentração final de siRNA usada em cada transfeccao foi 100 nM. Adicione a mistura de reação para as células que foram lavadas fora do Thymidine.
  9. Incubar as células a 37 ° C para 9-10 h para liberação de bloqueio e fixe as células sobre as lamínulas com 4% PFA por 20 min no RT
    Cuidado: PFA é tóxica, use proteção adequada.
  10. Células de delgados, depois permeabilizing com detergente de 0,5% (v/v) durante 10 minutos a RT e lavar as células duas vezes com PBS 1x por 5 min cada.
    1. Bloquear células com BSA 1% (p/v) em 1X PBS por 1h no RT, seguido por tratamento de células com 50 µ l de anticorpos primários (anticorpo anti-α-tubulina rato diluído a 1:1, 000, anticorpo anti-Zwint1 diluído a 1: 400 e mouse antifosfo-ɣ H2AX diluído a 1: 300) em 1% (p/v) BSA em PBS 1x por 1h em 37 oC.
    2. Depois de lavar as células com 1X PBS três vezes, tratar as células com 50 µ l de anticorpos secundários para cada vidro de tampa (Alexa 488 e vermelho rodamina em diluições de 1: 250 em 1% (p/v) BSA em 1X PBS) por 1h no RT
    3. Depois de lavar as células com PBS 1x, duas vezes por 5 min cada, tratar as células com DAPI (0.1µg / mL de 1X PBS) durante 5 min à RT
    4. Depois de lavar as células com PBS 1x, duas vezes por 5 min cada, coloque a lamínula enfrentando as células para a mídia de montagem apropriado em um slide clara microscópica.
  11. Imagem das células para as proteínas immunostained com 60 X ou 100 objectivo de imersão de óleo X 1.4 at plano-apocromático DIC montadas em um microscópio confocal invertido de alta resolução, equipado com uma câmera apropriada conforme necessário para a qualidade das imagens necessárias.
  12. Adquira imagens em temperatura ambiente como z-pilhas de 0,2 µm de espessura utilizando software apropriado para o microscópio.

3. protocolo para a imagem latente de célula viva de progressão mitótica (Figura 3A)

  1. No dia 1, cerca de 0,5-1 x 105 células de HeLa estàvel expressando mCherry-H2B e GFP-α-tubulina (ligeiramente variável com base no tipo de célula e as proteínas que eles expressam) em pratos de fundo de vidro de 35 milímetros com 1,5 mL de DMEM meio de sementes e cultivá-las em um umidificado incubadora para 24 h a 37 oC e 5% de CO2.
  2. 1 bloco de timidinast : no dia 2, adicionar 1,5 mL de timidina-contendo mídia às células no prato (timidina 100mm, concentração final de 2 mM,).
  3. Incube por 18 h.
  4. No dia 3, Aspire o meio contendo timidina e lavar as células três vezes, duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco.
  5. SiRNAs diluído (controle e Hec1) e reagente de transfeccao, com média de crescimento livre de soro separadamente durante 10 min. misturam-os e incubam durante 20 min em RT A concentração final de siRNA usada em cada transfeccao foi 100 nM. Adicione a mistura de reação para as células que foram lavadas fora do Thymidine.
  6. Desenvolvem-se células em 1,5 mL de meio fresco de DMEM escaldado para 8h às células do bloco de lançamento.
  7. bloco de timidinand 2: adicionar 1,5 mL de timidina-contendo mídia (concentração final de 2 mM) para as células no prato.
  8. Encube por outro 18 h.
  9. No dia 4, Aspire o meio e lavar as células três vezes, duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco. Desenvolvem-se células em fresca escaldada Leibovitz é (L-15) meio suplementado com 10% FBS e 20 mM HEPES pH 7.0 para 8h às células do bloco de lançamento.
  10. Coloca o prato na câmara de controle de temperatura definida na alta resolução do microscópio confocal que já tem ligado pelo menos 30 min antes de iniciar a geração de imagens para estabilizar as temperaturas no palco e experimentais.
  11. Concentre-se em campo claro, com o objectivo de 60 x até que as células são visíveis e, em seguida, manualmente, Peneire o palco para a região de escolha.
  12. Configure a luz e energia/exposição do laser, parâmetros de aquisição de imagem e duração do experimento usando o software de aquisição de imagem do microscópio de escolha. Use filtros de GFP (488 excitação; 385 emissão nm) e mCherry (561 excitação nm e 385 nm de emissão) para adquirir imagens.
  13. Realizar o experimento de lapso de tempo adquirindo separadamente a transmissão da luz pulsada e fluorescência imagens cada 10 min por um período até 16 h.
  14. Adquira imagens como doze 1.0 separada µm z-aviões às 9 horas após o lançamento do bloco duplo timidina usando o software apropriado para o microscópio.
  15. Analisar as imagens de rastreamento células individuais para progressão mitótica e finalmente montar o filme correspondente com o software de fonte Fiji/ImageJ.

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Representative Results

Estudo de progressão mitótica e estabilidade de microtúbulos nas células fixo após o lançamento do bloco de timidina dobro
Cdt1 está envolvido no licenciamento das origens de replicação do DNA na fase G1. Ela é degradada durante a fase S, mas re-acumula-se na fase G2/M. Para estudar o seu papel na mitose, o Cdt1 endógeno precisa estar esgotado especificamente na fase de G/M, usando a técnica de sincronização de célula mais adequada, o dobro de timidina bloco15. As células foram transfectadas com siRNAs imediatamente após o lançamento do bloco 2nd timidina, quando as células são no S fase e época em que o licenciamento das origens de replicação no G1, que também requer a função de Cdt1, há muito tempo foi concluído. A depleção de Cdt1 após 9 h de Transfeccao de siCdt1 e duplo lançamento de bloco de timidina foi validada pela mancha ocidental (figura 1B). Fixação de células 9 h após o lançamento do bloco duplo timidina mostra que a maioria das células estão na fase de metáfase em controle e Cdt1 siRNA transfectadas células. Mas a fixação das células 10h após o lançamento do bloco duplo timidina mostra que siRNA-Tratado de Cdt1 maioria das células são ainda preso na fase tardia prometafase enquanto células controle digite anáfase e normalmente segregam os cromossomas como esperado (Figura 1 ). Para entender o efeito de depleção de Cdt1 na estabilidade do cinetócoro-microtubule (kMT), células foram fixadas às 9 horas após o lançamento do bloco de timidina dobro seguido de tratamento pelo frio, que apenas mantém estáveis cinetócoro-microtúbulos (kMTs). Os kMTs de células Cdt1 empobrecido são relativamente menos robustos após tratamento pelo frio comparado com a de células de controle (Figura 1). Assim, usando essa abordagem, a progressão das células mitóticas normais após a perturbação da função de somáticas mitóticas de interesse pode ser estudada efetivamente, mesmo sem o uso de imagens de células vivas.

A Figura 2 mostra que licenciamento de origem de replicação do DNA não é perturbado quando as células estão esgotadas de Cdt1 na fase G2/M usando nosso protocolo, que também foi observado em células de controle. Células empobrecidas de Cdt1 na fase G2/M não induz a acumulação de ɣH2AX fosforilada, um marcador de dano do ADN, durante a fase G2 subsequente; Considerando que a transfeccao siRNA de culturas assíncronos para esgotar Cdt1 induzidas pelo acúmulo de focos de fosfo-ɣH2AX-positivos, possivelmente devido a danos no DNA induzidos pelo licenciamento de replicação de DNA impróprio.

Estudo de progressão mitótica nas células após o lançamento do bloco duplo timidina por imagens de células vivas
Após o colapso do envelope nuclear (NEB), as células normais (na ausência de perturbação por uma proteína funcional mitótica) digite mitose e passam por início da anáfase para sair da mitose dentro de cerca de 30-60 min (Figura 3B). Mas encontra-se mediada por RNAi nocaute de Hec1, uma proteína chave cinetócoro que é necessária para a formação de apego de kMT robusto, para atrasar a progressão mitótica normal. Nesse cenário, a maioria das células entrar mitose após o NEB, mas não se submeter a início da anáfase ou sair da mitose mesmo após várias horas de atraso na mitose (Figura 3). Da mesma forma, o efeito do knockdown RNAi-mediada de qualquer outra proteína que localiza aos cinetócoros ou tendo uma função durante a mitose, portanto, observam efetivamente usando imagens de células vivas após lançamento de blocos de timidina duplo. Além de estudar a natureza da progressão mitótica, atraso e prisão, alguns dos outros principais mitóticos fenômenos que podem ser analisados usando este método incluem cromossomo alinhamento, formação do fuso mitótico e a ativação de posicionamento e silenciamento do posto de montagem do eixo.

Figure 1
Figura 1: análise de progressão mitótica e a estabilidade dos microtúbulos cinetócoro nas células fixas após a sincronização de timidina dobro. (A), A representação esquemática de imunofluorescência, fixação e sincronização de célula. (B) borrão ocidental para derrubada de Cdt1 após 9 h de lançamento do 2º bloco de timidina. (C) micrografias de imunofluorescência para mostrar as células mitóticas fixo 9 e 10 h após a liberação do bloco duplo timidina e tratamento com controle (topo) ou Cdt1 siRNA (parte inferior). Α-tubulina coloração em vermelho, DNA está em verde, como células expressam GFP-histona H2B. Barra de escala = 10 µm. células Prometaphase e metáfase são indicadas usando amarelo e branco pontas de seta, respectivamente. (D) HeLa células após tratamento com controle siRNA (painel superior) e depleção de Cdt1 (painel inferior) para 9 h após a saída da dupla bloco de timidina seguido por tratamento com Leibovitz gelada (L-15) médio e fixação. As células foram manchadas imunológico para eixo MT (verde) e um marcador do cinetócoro, Zwint1 (vermelho) e DAPI para DNA em preto e branco. Barra de escala = 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Cdt1-esgotamento durante a fase G2/M não está no caminho da replicação licenciamento. Cdt1 siRNAs (painel central) ou dupla timidina sincronizado células HeLa tratadas com siRNA cdt1 durante a lavagem de timidina 2nd -out seguida de fixação às 10 h ou assíncronas células HeLa tratadocom com controle do luciferase (painel superior) após o lançamento (painel inferior) foram corados com DAPI (pseudo cor verde) e anticorpo antifosfo-ɣH2AX (vermelho). Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: análise de progressão mitótica por célula viva imagem em sincronizado células. (A), A representação esquemática da sincronização de célula e imagens de células vivas. Células de HeLa estàvel expressando mCherry-histona H2B e GFP-α-tubulina foram liberados de bloco de timidina duplo para 8 h para deixá-los continuar em fase G2/M, de detenção de fase S. Imagem ao vivo foi realizada usando um microscópio confocal de alta resolução, começando 8 h após a liberação das células do bloco de timidina e continuando para até 16 h a partir desse ponto. Aqui são mostrados as imagens estáticas do vídeo capturado a cada 10 min para células de controle sem perturbação de qualquer proteína mitótica (B) ou células empobrecidas de subunidade Hec1 do Ndc80 complex (C). Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A vantagem mais crítica da sincronização de timidina duplo é que fornece um tamanho de amostra maior das células mitóticas em uma janela de tempo curto com muitas dessas células entrando em mitose em uníssono, permitindo assim também análises de alinhamento de cromossomo, bipolar eixo de formação e de segregação de cromossomas com eficiência muito maior.

Muitos complexos de proteína reguladora e vias de sinalização dedicam-se a garantir a progressão normal através de mitose e desregulamentação deste processo pode ser conduzido a tumorigênese. Viva a imagem latente da pilha de células HeLa estàvel expressando mCherry-H2B e GFP-tubulina e libertado o bloco de timidina duplo mostra que a maioria das células de controle segregar seus cromossomos na anáfase dentro de aproximadamente 60 min depois NEB (Figura 3B). Por outro lado, viva a imagem latente da pilha de pilhas HeLa perturbadas com Hec1 função mostra que a maioria das células permanecer na fase mitótica durante um longo período com cromossomos desalinhados, seguidos pelo início da anáfase ou apoptose (Figura 3).

Timidina excesso inibe a síntese de DNA durante a fase S, bloqueando as células em fase de G1/S11. Apesar de sincronização do bloco de timidina duplo é o método mais usado no estudo do ciclo celular e progressão mitótica, um precisa ser crítica de algumas das limitações deste método. Importante, deve ser assegurado que o produto químico foi lavado cuidadosamente (para 7-8 h) para que o efeito é completamente reversível e células podem prosseguir normalmente pelo resto do ciclo celular. Células não caso contrário podem entrar no segundo ciclo causando progressão imprópria embora mitose. A proporção de células sincronizadas pode não ser suficientemente elevada com um bloco único de timidina e um bloco de timidina duplo pode ser necessário aumentar o número de células sincronizados, especialmente se um está interessado em estudar a um estágio específico da mitose. A duração do tratamento timidina deve ser otimizada devido à diferente sensibilidade entre tipos de células, dependendo do tempo de geração. Por exemplo, células de hamster tem 16 h de tempo de geração e são tratadas com timidina por 11 h para sincronização ideal17. Neste estudo, tratamos as células HeLa para 16-18 h com timidina. Além disso, a timidina excesso não só impede a síntese de DNA, mas também pode matar importantes fracções do células11,12,18 e fechar atenção precisa ser pago para monitorar esta perda. A solução estoque de timidina utilizada neste estudo deve ser preparada em água destilada estéril e deve ser misturada completamente nos meios de cultura de células para evitar a sua precipitação após adicioná-lo à mídia de siRNA transfectadas células e também para garantir sua homogeneidade distribuição ao redor das células cultivadas.

Para estudar a função de uma proteína do alvo mitótica durante progressão mitótica, as células idealmente seria tratada com siRNA para nocaute os níveis da proteína de interesse durante o bloco de timidina 1st ou durante o lançamento da 1ª bloco de timidina, dependendo o tempo necessário para obter a proteína eficiente knockdown19,20,21. Por outro lado, para estudar o papel das proteínas multifunctional como Cdt1 durante a mitose, é necessário tratar as células com siCdt1 durante o lançamento do bloco 2nd timidina obter depleção específica G2/M. Cdt1 é um jogador fundamental no licenciamento de DNA replicação origens15. Para compreender seu papel especializado durante a mitose, sem interferir com o seu papel no licenciamento, Cdt1 precisa ser empobrecido especificamente na fase G2/M, que pode ser eficientemente conseguida pela sincronização de timidina dobro, evitando assim a necessidade de recorrer a outros abordagens específicas de mitose das perturbações que são difíceis de executar. Depleção de Cdt1 em culturas assíncronas induzir resposta de dano de DNA devido a interrupção do licenciamento das origens de replicação de DNA, que por sua vez iria ter atrapalhado a análise de uma função possível para esta proteína durante a mitose. Assim, a técnica de sincronização de timidina duplo oferece uma abordagem experimental única para gerar células que passou por uma fase normal de G1 e S, mas faltavam Cdt1 função durante a fase G2 e M. O significado especial do nosso protocolo de sincronização reside na sua inibição das proteínas multifunctional para a fase específica (G2/M) para estudar as suas funções romance durante a mitose. Assim, este método será útil não só para estudar o papel das proteínas que têm múltiplas funções durante estágios do ciclo de célula diferente, mas também do que de qualquer proteína mitótica no processo de alinhamento de cromossomo, anexos de kMT e segregação do cromossomo.

Para a imagem latente da célula viva, após o lançamento do bloco duplo timidina, as células devem ser incubadas em Leibovitz pré-aquecido (L-15) suplementado com 10-20% FBS até o início da imagem latente. As células entram mitose em pontos de tempo variável, após o lançamento do bloco de timidina, dependendo do tipo de célula. O horário de início da captura de imagem ou fixação precisa ser otimizado, dependendo do tipo de célula. Para tratamento de imagens de células vivas, a utilização de microscopia confocal convencional pode causar fotobranqueamento durante a imagem latente a longo prazo. Por outro lado, o microcopy confocal de alta resolução dá uma imagem clara e de alta resolução com a menor dimensão dos efeitos de fotobranqueamento.

Os passos críticos no presente protocolo são a duração do tratamento de timidina, lavagem adequada da timidina, o timing de transfeccao siRNA e o momento de início da imagem.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm nenhum interesse financeiro concorrente.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Kozo Tanaka, da Universidade de Tohoku, Japão por compartilhar as células HeLa estàvel expressando mCherry-histona H2B e GFP-α-tubulina. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NCI para DV (R00CA178188) e por fundos de start-up da Universidade de Northwestern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (1x) Life Technologies 11965-092 Store at 4 °C
DPBS (1x) Life Technologies 14190-144 Store at 4 °C
Leibovitz’s (1x) L-15 medium Life Technologies 21083-027 Store at 4 °C
Serum reduced medium (Opti-MEM) Life Technologies 319-85-070 Store at 4 °C
Penicillin and streptomycin Life Technologies 15070-063 (Pen Strep) 1:1,000 dilution
Dharmafect2 GE Dharmacon T-2002-02 Store at 4 °C
Thymidine MP Biomedicals LLC 103056 Dissolved in sterile distiled water
Cdt1 siRNA Life Technologies Ref 10
Hec1 siRNA Life Technologies Ref 13
HeLa cells expressing GFP-H2B
HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich Corporation F8775 Toxic, needs caution
DAPI Sigma-Aldrich Corporation D9542 Toxic, needs caution
Mouse anti-α-tubulin Santa Cruz Biotechnology Sc32293 1:1,000 dilution
Rabbit ant-Zwint1 Bethyl A300-781A 1:400 dilution
Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) Upstate Biotechnology 05-626, clone JBW301 1:300 dilution
Alexa 488 Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
Rodamine Red-X Jackson ImmunoResearch 1:250 dilution
BioLite 6 well multidish Thermo Fisher Scientific 130184
35 mm Glass bottom dish MatTek Corporation P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE inverted microscope Nikon Instruments
Spinning disc for confocal Yokagawa CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Camera Andor iXon Ultra EMCCD
4 wave length laser Agilent Technologies
Incubation System for Microscopes Tokai Hit TIZB
NIS-elements software Nikon Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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